Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Снижение инфильтрации иммунных клеток и увеличение провоспалительных медиаторов в головном мозге модели диабетической мыши типа 2, инфицированной вирусом Западного Нила

Reduced immune cell infiltration and increased pro-inflammatory mediators in the brain of Type 2 diabetic mouse model infected with West Nile virus
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4001407/

Диабет является важным фактором риска развития вируса, связанного с вирусом западного Нила (WNV), энцефалита (WNVE) у людей, главной причиной арбовирусного энцефалита в Соединенных Штатах. Используя модель диабетической мыши (db / db), мы недавно продемонстрировали, что диабет усиливает репликацию WNV и восприимчивость мышей к WNVE. Здесь мы рассмотрели иммунологические события в головном мозге мышей дикого типа (WT) и db / db после инфекции WNV. Мы предположили, что индуцированная WNV миграция защитных лейкоцитов в мозг ослабляется в присутствии диабета, что приводит к высокой вирусной нагрузке в головном мозге и тяжелой болезни у диабетических мышей.

Девятинедельные мыши C57BL / 6 WT и db / db инфицировали WNV. Инфильтрацию лейкоцитов, экспрессию молекул клеточной адгезии (CAM), нейровоспалительные реакции, активацию астроцитов и гибель нейронов анализировали с использованием иммуногистохимии, qRT-ПЦР, проточной цитометрии и вестерн-блоттинга.

Мы демонстрируем, что инфильтрация CD45 + лейкоцитов и CD8 + T-клеток была значительно снижена в мозге мышей db / db, что коррелировало с ослабленной экспрессией CAM, такой как E-селектин и ICAM-1. Инфекция WNV у мышей db / db была связана с усиленным воспалительным ответом в головном мозге. мРНК и белков основных хемокинов, таких как CXCL10, CXCL1, CCL2, CCL5, CCL3 и G-CSF, и цитокины, такие как IL-1β, TNF, IL-6, IFNγ и IL-1α, были значительно увеличены в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT. Повышенные уровни цитокинов также коррелировали с увеличением активации астроцитов и повреждением нейронов в мозге мышей db / db.

Эти данные свидетельствуют о том, что сокращение набора лейкоцитов, частично из-за более низких уровней САМ, приводит к неспособности очистить WNV-инфекцию от головного мозга, что приводит к увеличению продуцирования воспалительных молекул, что опосредует увеличение гибели нейронов и смертности у мышей db / db. Это первое исследование для выяснения экспрессии CAM и их корреляции с миграцией лейкоцитов, в частности цитотоксических CD8 + T-клеток, в увеличении тяжести заболевания в модели диабетической мыши.

Диабет типа 2 связан с нарушением иммунного ответа и повышенной восприимчивостью к различным патогенам [1,2]. Диабет подавляет важные аспекты лейкоцитарной функции, включая адгезию, хемотаксис и фагоцитоз, окислительный взрыв и внутриклеточное убийство [2-5]. Диабет также связан с усиленным воспалительным ответом на инфекции [6,7]. Известно, что диабет отрицательно влияет на приверженность лейкоцитов и трансэндотелиальную миграцию. В нескольких исследованиях показано, что адгезия и миграция нейтрофилов и моноцитов в ответ на различные хемотаксические стимулы значительно снижаются у пациентов с диабетом по сравнению с недиабетическими контролями [3,8,9]. Было также продемонстрировано, что диабет приводит к ослаблению регуляции молекул клеточной адгезии (CAM) и их лигандов, таких как молекула адгезии межклеточных клеток 1 (ICAM-1), E-селектин и макроген антигена-1 после различных стимулов, таких как липополисахариды (ЛПС) [3,10,11]. Однако влияние диабета на экспрессию САМ и миграцию лейкоцитов, особенно через гематоэнцефалический барьер (ВВВ), в ответ на вирусные инфекции, такие как вирус Западного Нила (WNV), остается в значительной степени неизвестным. Более того, влияние диабета на миграцию цитотоксических CD8 + Т-клеток, важных клеток в защиту против вирусных инфекций, никогда не изучалось.

WNV, комариновый флавивирус, принадлежащий к семейству Flaviviridae, который вызывает смертельный энцефалит, стал важной причиной вирусного энцефалита в Соединенных Штатах [12]. С момента своего появления в Северной Америке в 1999 году вспышки гриппа WNV (WNF) и энцефалита (WNVE) произошли в регионах по всей территории Соединенных Штатов. До 70% выживших из нейроинвазивных заболеваний WNV испытывают стойкие неврологические дефициты после инфицирования [13]. Не существует терапевтических агентов или вакцин, одобренных для использования против инфекции WNV у людей. WNVE встречается чаще у пожилых людей и у людей с нарушенной иммунной системой, гипертонией и диабетом типа 2 [14]. Эпидемиологические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что диабет связан с повышенным риском WNVE [15-19], и что у пациентов с диабетом в четыре раза чаще развивается WNVE, чем WNF, что значительно больше, чем другие факторы, такие как старость, мужчины пола и гипертонии [20,21]. Сообщалось, что более высокая доля пациентов с инфекцией WNV имела гипергликемию при поступлении в больницу. Более того, у людей с диабетом также наиболее вероятны постоянные симптомы после инфекции WNV [22,23]. Несмотря на важность общественного здравоохранения, невропатогенез инфекции WNV в диабетической популяции в значительной степени неизвестен.

WNVE характеризуется гибелью нейронов, активацией глиальных клеток и инфильтрацией лейкоцитов в периваскулярном пространстве и паренхиме [24-26]. Прочная индукция противовирусных иммунных реакций имеет решающее значение для контроля инфекции WNV на периферии и головном мозге. Производство противовирусного типа I (IFN-α и -β) имеет важное значение для подавления вирусных титров в мозге и периферических органах [27]. Индукция WNV-специфических иммуноглобулинов (IgM и IgG) необходима для подавления виремии и распространения вируса [28]. Миграция лейкоцитов в мозг необходима для контроля инфекции WNV в головном мозге [25,29]. CD8 + Т-клетки необходимы для защиты от инфекции WNV путем очистки вируса в головном мозге [30]. Отсутствие CD8 + T-клеток приводит к неограниченной репликации WNV и увеличению гибели нейронов из-за высокого цитопатического потенциала WNV [24,30]. Экспрессия CAM, индуцированная WNV, такая как ICAM-1, и провоспалительные молекулы, такие как фактор некроза опухоли (TNF) и CXCL10, способствуют распространению лейкоцитов в мозг [29, 31, 32].

Ранее мы продемонстрировали, используя диабетическую модель мыши db / db, что диабет повышал восприимчивость мышей к заболеванию WNV и подавлял вирусный клиренс в сыворотке, периферических тканях и мозгах мышей db / db по сравнению с мышами дикого типа (WT) [19]. Эти наблюдения были связаны со значительной задержкой в ​​индукции противовирусных иммунных реакций (IFN-α, IgM и IgG) и увеличением провоспалительных реакций в сыворотке мышей db / db. В этом исследовании мы проанализировали иммунологические события в мозге мышей WT и db / db после инфекции WNV, чтобы понять иммунные механизмы, лежащие в основе повышенной тяжести заболевания WNV у диабетиков.

Мужской девятинедельный C57BL / 6 J-Lepr
децибел
/ Lepr
децибел
(db / db) и мышей C57BL / 6 J (WT) были приобретены в Лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США). Животных размещали по четыре на клетку и позволяли свободно есть и пить. Животный набор поддерживали при 72 ° F, при 45% влажности и 12-часовом световом и темном цикле. Были установлены постельные принадлежности из опилок вместе с бумажными полотенцами. Обученный и сертифицированный персонал проводил все эксперименты на животных. Это исследование было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Гавайских островов (IACUC) (протокол № 10-948) и проводилось в строгом соответствии с руководящими принципами, установленными Национальными институтами здравоохранения и Университетом Гавайских островов IACUC.

После акклиматизации в течение одной недели мышей WT и db / db инокулировали по пути лапы с помощью 10 единиц образования бляшек (PFU) WNV (NY99) или забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, mock) и в дни 4, 6 и 8 после инфекционное заболевание. Мышей анестезировали с использованием изофлурана и перфузировали с помощью холодного PBS, как описано ранее [19,33,34]. Мозги собирали и замораживали в 2-метилбутане (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) и хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки. WNV впервые обнаруживается в головном мозге между 4 и 6 днями после инокуляции подножки и пиковая вирусная нагрузка наблюдается на 8-й день после заражения [34], поэтому мозг собирают в дни 4, 6 и 8 после заражения.

Альтернативно, мышей перфузировали с помощью PBS, а затем 4% параформальдегида (PFA), и мозги собирали, криозащиты в 30% сахарозе (Sigma, St. Louis, Missouri, United States) и внедряли в оптимальную температуру резки (OCT), как описано ранее [34]. Одна половина замороженных тканей головного мозга взвешивалась и гомогенизировалась в пулевом блендере с использованием стеклянных или циркониевых шариков, а анализ бляшек проводили, как описано ранее [19].

Одна половина замороженных тканей мозга была напудрена на сухом льду, чтобы получить гомогенный отбор проб, а аликвоту замороженного порошка мозга использовали для извлечения полной РНК и белка. Уровни мРНК множественных генов-хозяев определяли с использованием qRT-PCR, а сгиб-изменение в инфицированных мозгах по сравнению с маточным мозгом рассчитывали после нормализации к генам β-актина, как описано ранее [34-36]. Праймерные последовательности и температуры отжига, используемые для qRT-PCR, перечислены в таблице 1. Полный клеточный белок экстрагировали из головного мозга и 20-30 мкг белка отделяли на SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали в течение ночи с использованием поликлональных антител против ICAM -1, E-селектин, молекула адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1) (Санта-Крус, Даллас, Техас, США) и β-актин (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), как описано ранее [34, 35,37]. После инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с IRDye 800 и IRDye 680 (Li-Cor Biosciences, Lincoln, Nebraska, США), мембраны сканировали с использованием инфракрасного тепловизора Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, Nebraska, США).

Последовательности праймеров, используемых для qRT-PCR

* bp, базовая пара;
#
Tm, температура плавления.

Сагиттальные срезы толщиной 10 мкм были вырезаны из тканей головного мозга, замороженных в ОКТ, и целые участки сагиттальной ткани были окрашены анти-CD45-FITC и анти-CD8-APC (eBiosciences, Сан-Диего, Калифорния, США) в течение ночи при 4 ° С, как описано ранее [34,37]. Кроме того, срезы тканей также инкубировали с первичными антителами против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (DakoCytomation, Carpinteria, California, United States), NeuN (Millipore, Billerica, Massachusetts, United States), E-selectin, ICAM-1, VCAM -1 (Санта-Крус, Даллас, Техас, США) и фон Виллебранда (vWF) (Abcam, Cambridge, Massachusetts, США) в течение ночи при 4 ° C, а затем с Alexa Fluor 546 или Alexa Fluor 488 с конъюгированным вторичным антителом, как описано ранее [34]. Окрашивание концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL) окрашивание проводили с использованием набора для обнаружения смерти на месте in situ (Roche, Indianapolis, Indiana, United States), как описано ранее [38]. Изображения были получены с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiovert 200 (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, New York, United States).

Мозги и селезенки от трех мышей WT и db / db (два независимых эксперимента, в общей сложности шесть мышей на группу) выделяли, объединяли и гомогенизировали с использованием миксериального мягкого диссоциатора MACS (Miltenyi Biotec, San Diego, California, United States) , Инфильтрированные лейкоциты выделяли прерывистым центрифугированием градиента Percoll и количественно определяли из мозга мышей WT и db / db, как описано ранее [34,37]. Клетки подсчитывали и промывали 1 × флуоресцентно активированным буфером для сортировки клеток (0,5% BSA и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты). Чтобы идентифицировать популяции клеток CD45 +, CD11b +, CD3 +, CD4 + и CD8 +, клетки окрашивали с использованием конъюгированного с флуоресцеином изотиоцианата (FITC) -конъюгированного анти-CD45, фикоэритрина (PE) Cy7-конъюгированного анти-CD11b, PE-конъюгированного анти-CD3, PE Texas Красноконъюгированные анти-CD4 и аллоцикоцианиновые (APC) -конъюгированные анти-CD8-антитела (eBiosciences, Сан-Диего, Калифорния, США) в течение 30 минут при 4 ° C, а затем фиксировали 4% PFA при 4 ° C в течение 15 минут. Флуоресценция минус один образец был подготовлен для обнаружения любого перелива с другого канала. Образцы анализировали с помощью многоцветной проточной цитометрии с использованием FACS Aria, и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (версия 9.4.11) (TreeStar, Ashland, Oregon, United States), как описано ранее [34,37].

Мозги взвешивали и гомогенизировали в пулевом блендере (Next Advance, Averill Park, New York, United States) с использованием стеклянных шариков, как описано ранее [19,34]. Уровни цитокинов и хемокинов измеряли в гомогенатах головного мозга с помощью мультиплексного иммуноанализа с использованием MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine / Chemokine kit (Millipore, Billerica, Massachusetts, United States), как описано ранее [34].

Профиль экспрессии множественных цитокинов, хемокинов и их рецепторов в мозге мышей с WN и WNV-инфицированными WT и db / db анализировали с использованием коммерческих воспалительных цитокинов и рецепторов RT2 Profiler PCR Array (SABiosciences, Valencia, California, United States, Номер каталога: PAMM-011Z), как описано ранее [34]. кДНК из четырех животных из каждой группы объединяли. Смена складок у инфицированных мозгов по сравнению с макетом была рассчитана после нормализации к генам домашнего хозяйства.

Для вычисления значений P различий использовался непарный t-тест ученика с использованием GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, Калифорния, США). Для мультиплексного иммуноанализа для расчета значений P использовался двухсторонний анализ дисперсии (ANOVA) с постходовым тестом Бонферрони. Различия p <0,05 считались значимыми.

Первоначально мозговые ткани мыши WT и db / db были исследованы на предмет гистопатологических изменений после инфекции WNV. Гематоксилин и эозин (H & E) окрашивание участков мозга у мышей WT продемонстрировали инфильтрацию лейкоцитов вдоль мозговых оболочек на 8-й день после инфицирования (рис. 1A). Напротив, меньшее количество лейкоцитов наблюдалось в мозговых оболочках мыши, инфицированных WNV db / db. Это наблюдение было дополнительно подтверждено прямым иммуногистохимическим анализом антигена CD45 и CD8, который показал заметно уменьшенное окрашивание CD45 и CD8-положительных клеток в мозге мыши db / db по сравнению с мышами WT на 8-й день после заражения (рис. 1A). Мы дополнительно количественно оценивали CD45 и CD8-позитивные клетки в срезах мозга у четырех независимых мышей в каждой группе. Среднее общее количество клеток из 15 различных участков головного мозга в каждом участке (всего 2 отдела мозга на мышах) показано на рисунке 1B. Количество CD45 и CD8-положительных клеток у мышей db / db было значительно ниже, чем у мышей WT (P <0,05). Затем мы измеряли вирусную нагрузку WNV в мозге мышей WT и db / db, используя анализ налета. В отличие от инфильтрации лейкоцитов в мозге мышей db / db наблюдался значительно более высокий титр вируса по сравнению с мозгом мышей WT на 8-й день после заражения (рис. 1C, P> 0,05).

Инфильтрация лейкоцитов и вирусная нагрузка в мозге мышей WT и db / db после инфекции WNV. (A) Криоконсервированные отделы головного мозга от WNV-инфицированных мышей WT и db / db на 8-й день после инфицирования окрашивали гематоксилином и эозином (H & E) и антителами против CD45 (зеленые, белые стрелки и увеличенная вставка стрелочной коробки) и CD8 (красные, белые стрелки и увеличенная вставка стрелочной коробки). Черные стрелки и увеличенная вставка стрелочной коробки на окрашенных участках H & E идентифицируют лейкоциты, проникающие в мозговые оболочки мозга WT. Микрофотографии демонстрируют репрезентативные изображения, полученные из двух независимых экспериментов (n = 4 на группу). Бары, 20 мкм. (B) Количественное представление общих количеств CD45 и CD8-положительных клеток из 15 различных участков головного мозга на каждую секцию (всего 2 участка мозга на мышей) из двух независимых экспериментов (n = 4 на группу). * P <0,05. (C). Вирусную нагрузку на мозг определяли у мышей WT и db / db на 4, 6 и 8 день после заражения с помощью анализа бляшек с использованием клеток Vero и сообщали как PFU на грамм ткани. Данные представляют среднее ± SEM, представляющее два независимых эксперимента (n = 7-11 на группу). * P <0,05. ПФУ, блоки формирования бляшек; SEM, стандартная ошибка среднего значения.

Кроме того, мы сравнивали уровни экспрессии мРНК CD45, CD4, CD8 и CD11b в мозгах мышей WT и db / db на 6-й и 8-й день после инфицирования с использованием qRT-PCR. Как и ожидалось, экспрессию мРНК CD45, CD8 и CD11b генов регулировали на 6-й день после заражения у мышей WT, которые далее увеличивались на 8-й день после инфицирования по сравнению с соответствующими контрольными средствами (фиг. 2А, 2С и 2D). Однако это увеличение было ослаблено в мозге инфицированных мышей db / db. Уровни экспрессии генов CD45, CD8 и CD11b были значительно ниже у инфицированных мышей db / db по сравнению с инфицированными мышами WT в оба дня 6 и 8 после инфицирования (P <0,05). Никакой существенной разницы в выражении CD4 не наблюдалось между обеими группами (рис. 2B).

WNV-индуцированная миграция лейкоцитов в мозг мышей WT и db / db. qRT-ПЦР проводили на РНК, экстрагированной из мокальных и WNV-инфицированных головных мозга у мышей WT и db / db в указанные моменты времени, чтобы определить изменение смены в (A) CD45, (B) CD4, (C) CD8 и (D ) Выражение гена CD11b. Изменения в уровнях каждого гена были сначала нормированы на ген β-актина, а затем изменение складки в WNV-инфицированном мозге было рассчитано по сравнению с соответствующим маточно-инфицированным мозгом. Данные представляют среднее ± SEM, представляющее два независимых эксперимента (n = 7 на группу). * P <0,05. SEM, стандартная ошибка среднего значения.

Для дальнейшей проверки этих результатов мы выделили лейкоциты из мозга мышей WT и db / db на 8-й день после заражения и проанализировали проточной цитометрией. Мы окрашивали клетки для CD45 +, CD11b +, CD3 +, CD4 + и CD8 + маркеров для анализа как Т-клеток, так и не-Т-клеточных субпопуляций. В соответствии с результатами исследований мРНК, гистологического анализа и иммуногистохимии было отмечено значительное снижение инфильтрации лейкоцитов в головном мозге мышей, инфицированных WNV db / db, по сравнению с мышами WT. Как показано на фиг. 3А, процент CD3 + CD8 + Т-клеток в головном мозге мышей db / db был ниже, чем у мышей WT (3,9 против 11,6%). Кроме того, процент CD45 + CD3-лейкоцитов был снижен у мышей db / db больше, чем у мышей WT (46,6 против 54,8%). Наконец, общее количество CD3 + CD8 + T и CD45 + CD3-клеток, переносимых в мозг инфицированных мышей db / db, было также значительно ниже, чем у инфицированных мышей WT (рис. 3C) (P <0,05). Не выявлено статистически значимой разницы между процентами или числами CD3 + CD4 + T и CD45 + CD11b + клеток в мозгах мышей WT и db / db.

Проточный цитометрический анализ инфильтрации лейкоцитов в мозге и селезенке WNV-инфицированных мышей WT и db / db. Мыши WT и db / db инфицировали 10 PFU WNV, а мозг и селезенку собирали после обширной перфузии на 8-й день после заражения. Лейкоциты мозга и селезенки выделяли и анализировали с помощью проточной цитометрии. (A и B) Репрезентативные проточные цитометрические профили, демонстрирующие процент CD3 + CD4 + Т-клеток, CD3 + CD8 + Т-клеток, CD45 + CD3-лейкоцитов и CD45 + CD11b + клеток в головном мозге и селезенке на 8-й день после инфицирования в WT и db / db мышей. Данные представляют два независимых эксперимента (n = 6 на группу). (C и D). Было рассчитано общее количество CD3 + CD4 + T-клеток, CD3 + CD8 + T-клеток, CD45 + CD3-лейкоцитов и CD45 + CD11b + клеток на мозг и селезенку. Данные представляют среднее ± SEM, представляющее два независимых эксперимента (n = 6 на группу). * P <0,05. ПФУ, блоки формирования бляшек; SEM, стандартная ошибка среднего значения.

Кроме того, мы изолировали лейкоциты от селезенки мышей WT и db / db на 8-й день после заражения. В отличие от мозга, в селезенках мышей WT и db / db (рис. 3B и 3D) наблюдали эквивалентный процент и количество CD3 + CD4 + и CD3 + CD8 + T-клеток, CD45 + CD3-клеток, а также CD45 + CD11b + клеток.

Миграция лейкоцитов в WNV-инфицированный мозг связана с повышенной экспрессией нескольких хемокинов и их рецепторов в мозге [25]. Было продемонстрировано, что индуцированная WNV экспрессия хемокинов, таких как CCL2, CXCL10 и хемокиновые рецепторы, такие как CCR5 и CCR2, способствует распространению лейкоцитов в мозг [25, 29, 39, 40]. Чтобы определить, может ли снижение накопления лейкоцитов в мозге мышей db / db косвенно объясняться уменьшенной экспрессией этих хемокинов в мозге мышей db / db, мы проанализировали дифференциальную экспрессию различных хемокинов и их рецепторов в мозгах WT и мышей db / db после инфекции WNV. уровни мРНК хемокинов и их рецепторов измеряли на 8-й день после заражения с использованием матрицы ПЦР. Инфекция WNV приводила к резкому увеличению уровней мРНК ключевых хемокинов и их рецепторов в головном мозге мышей WT по сравнению с соответствующими имитируемыми мышами (Таблица 2). У этих мышей максимальное увеличение 113-, 279-, 394- и 641-кратное наблюдалось на уровнях CCL5, CCL2, CXCL9 и CXCL10 соответственно. Более того, было отмечено почти 10-кратное увеличение уровней мРНК этих хемокинов в головном мозге инфицированных мышей db / db по сравнению с инфицированными мышами WT. Экспрессия мРНК рецепторов хемокинов, таких как CCR1, CCR5, CCR7 и CXCR2, также увеличивалась в мозге инфицированных мышей db / db по сравнению с инфицированными мышами WT (таблица 2). Подобно экспрессии мРНК уровни белка ключевых хемокинов, таких как CXCL10, CXCL1, CCL2, CCL5, CCL3 и G-CSF, были увеличены в мозге инфицированных мышей WT, измеренных мультиплексным иммуноанализом (фиг. 4A-F). Однако их уровни были значительно увеличены в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT на 8-й день после заражения (P <0,05). Очень малые уровни этих хемокинов были обнаружены у мышей, зараженных ложно инфицированными. Кроме того, не было существенной разницы в уровнях хемокинов между маточно-инфицированными мышами WT и db / db (рис. 4A-F).

* Экспрессия хемокинов и их рецепторов в мозге WNV-инфицированных WT и
децибел
/
децибел
мышей на 8-й день после заражения

* Изменения в уровнях каждого гена были сначала нормализованы для домашних генов, а затем смена складок в WNV-инфицированных мозгах была рассчитана по сравнению с соответствующими имитируемыми мозгами.

Уровень хемокинов в мозге мышей WT и db / db после инфекции WNV. Мозги собирали у мышей WT и db / db в указанные моменты времени и гомогенизировали, как описано в разделе «Материалы и методы». Уровни хемокинов, как указано на рисунке (A) CXCL10, (B) CXCL1, (C) CCL2, (D) CCL5, (E) CCL3, (F) G-CSF измеряли с использованием мультиплексного иммуноанализа и выражали в виде среднего концентрация (pg / г тканей) ± SEM, представляющая два независимых эксперимента (n = 7 на группу). * P <0,05. SEM, стандартная ошибка среднего значения.

Инфекция WNV индуцирует экспрессию CAM, такой как ICAM-1, VCAM-1 и E-селектин, для облегчения распространения лейкоцитов в мозг [31,36,41,42]. Поскольку наблюдались различия в миграции лейкоцитов, мы проанализировали экспрессию мРНК и белка E-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 в головном мозге мышей WT и db / db после инфекции WNV. Как и ожидалось, в мозге мышей WT наблюдалось 10-25-кратное увеличение экспрессии мРНК ICAM-1 и E-селектина по сравнению с соответствующими мышами-инфицированными мышами на 8-й день после заражения (рис. 5A). Напротив, умеренное трех-семикратное увеличение экспрессии мРНК ICAM-1 и E-селектина наблюдалось в мозге инфицированных мышей db / db по сравнению с соответствующими мышами-инфицированными мышами. Экспрессия мРНК как E-селектина, так и ICAM-1 была значительно меньше у инфицированных мышей db / db, чем у инфицированных мышей WT (P <0,05). Однако не было достоверного увеличения экспрессии VCAM-1 у мышей WT и db / db после инфицирования. Подобно экспрессии мРНК, вестерн-блоттинг также продемонстрировал увеличение экспрессии белка как E-селектина, так и ICAM-1 в мозге мышей WT на 8-й день после инфицирования. Однако это увеличение было заметно уменьшено в мозге инфицированных мышей db / db (Рисунок 5B). Как видно из рисунка 5C, увеличение экспрессии ICAM-1 и E-селектина составляло от 250 до 300% у мышей WT и от 120 до 130% у мышей db / db по сравнению с соответствующими мышами-инфицированными мышами. Уровни белка как E-селектина, так и ICAM-1 были значительно ниже у инфицированных мышей db / db по сравнению с инфицированными мышами WT (P <0,05). Более того, иммуногистохимический анализ показал заметно уменьшенное окрашивание E-селектина и ICAM-1 в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT на 8-й день после заражения (рис. 6). Кроме того, повышенная экспрессия CAM у мышей WT, локализованная с эндотелиальными клетками (рис. 6).

WNV-индуцированная экспрессия CAM в мозгах мышей WT и db / db. (A) qRT-ПЦР проводили на РНК, экстрагированной из мокко- и WNV-инфицированных головных мозга у мышей WT и db / db в указанные моменты времени, чтобы определить изменение складки в гене E-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 выражение. Изменения в уровнях каждого гена были сначала нормированы на ген β-актина, а затем изменение складки в WNV-инфицированных мозгах было рассчитано по сравнению с соответствующими имитируемыми мозгами. Данные представляют среднее ± SEM, представляющее два независимых эксперимента (n = 7 на группу). * P <0,05. (B). Уровни белка E-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 анализировали с использованием Вестерн-блот-анализа. Всего лизаты мозга разделяли SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и иммуноблоттировали антителами, специфичными к E-селектину, ICAM-1 и VCAM-1. Равная загрузка была подтверждена повторным зондированием анти-β-актиновым антителом, и полосы были обнаружены с использованием инфракрасного метода Li-Cor Odyssey. (C) Количественный анализ результатов вестерн-блотов. Изменения в уровнях каждого гена были сначала нормированы на ген β-актина, а затем процентное увеличение WNV-инфицированных головных мозгов было рассчитано по сравнению с соответствующими имитируемыми мозгами. Данные представляют среднее ± SEM, представляющее два независимых эксперимента (n = 7 на группу). * P <0,05. ICAM-1, молекула адгезии межклеточных клеток 1; VCAM-1, молекула адгезии сосудистых клеток 1; SEM, стандартная ошибка среднего значения.

Иммуногистохимический анализ САМ в мозге мышей WT и db / db после инфекции WNV. Криоконсервированные отделы мозга от WNV-инфицированных мышей WT и db / db на 8-й день после заражения окрашивали антителами против E-селектина, ICAM-1, VCAM-1 (красный) и vWF (зеленый). Микрофотографии демонстрируют репрезентативные изображения, полученные из двух независимых экспериментов (n = 4 на группу). Бары, 20 мкм. ICAM-1, молекула адгезии межклеточных клеток 1; VCAM-1, молекула адгезии сосудистых клеток 1; vWF, фактор фон Виллебранда.

По аналогии с данными мРНК достоверное увеличение экспрессии белка VCAM-1 у мышей WT и db / db после WNV-инфекции (рис. 5 и 6) не наблюдалось.

Инфекция WNV связана с повышенной экспрессией нескольких провоспалительных цитокинов в головном мозге [25,43]. WNV-индуцированная экспрессия провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β и TNF, регулирует трафик лейкоцитов в мозг и гибель нейронов после инфицирования [32,38]. Диабет также связан с усиленным воспалительным ответом на инфекции [6,7]. Следовательно, мы исследовали уровни экспрессии этих ключевых провоспалительных цитокинов в мозгах мышей WT и db / db после инфекции WNV. WNV-инфекция приводила к 3-10-кратному увеличению экспрессии мРНК цитокинов, таких как IL-1β, TNF и IFNγ, в мозге мышей WT на 8-й день после инфицирования по сравнению с соответствующими макроблочными мышами (таблица 3). Напротив, в экспрессии вышеупомянутых цитокинов в мозге инфицированных мышей db / db наблюдалось 11-11-кратное увеличение по сравнению с соответствующими мышами-инфицированными мышами. Мы также наблюдали 8-кратное увеличение экспрессии IL-1α у инфицированных мышей db / db. Повышенная экспрессия цитокинов в головном мозге мышей WT и db / db сопровождалась одновременным увеличением экспрессии их соответствующих рецепторов. Экспрессия мРНК IL1R2 и TNFRSF1B была увеличена в 4 и 2 раза соответственно у мышей WT на 8-й день после заражения (таблица 3). У мышей db / db, аналогичных повышенным уровням цитокинов, наблюдалась 4-9-кратная регуляция экспрессии мРНК их рецепторов (табл. 3). Подобно экспрессии мРНК уровни белка IL-1β, TNF, IL-6, IFNγ и IL-1α также значительно повышались в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT на 8-й день после инфицирования, как измерено мультиплексный иммуноанализ (фиг. 7A-F) (P <0,05). Однако уровни IL-13 не различались между мышами WT и db / db (рисунок 7F). Очень малые уровни этих цитокинов были обнаружены у мышей с матовым заражением, более того, не было существенной разницы в уровнях цитокинов между маточно-инфицированными мышами WT и db / db (рис. 7A-F).

* Экспрессия цитокинов и их рецепторов в мозгах WNV-инфицированных WT и
децибел
/
децибел
мышей на 8-й день после заражения

* Изменения в уровнях каждого гена были сначала нормализованы для домашних генов, а затем смена складок в WNV-инфицированных мозгах была рассчитана по сравнению с соответствующими имитируемыми мозгами.

Уровни цитокинов в мозге мышей WT и db / db после инфекции WNV. Мозги собирали у мышей WT и db / db в указанные моменты времени и гомогенизировали, как описано в разделе «Материалы и методы». Уровни цитокинов, как указано на фигуре (A) IL-1β, (B) TNF, (C) IL-6, (D) IFNγ, (E) IL-1α и (F) IL-13, измеряли, используя мультиплекс иммуноанализа и выражаются в виде средней концентрации (pg / g тканей) ± SEM, представляющей два независимых эксперимента (n = 7 на группу). * P <0,05. SEM, стандартная ошибка среднего значения.

Астроциты продуцируют широкий спектр хемокинов и цитокинов при воздействии провоспалительных стимулов. Поскольку изменения наблюдались в хемокинах и цитокинах и с учетом того факта, что активация астроцитов является одним из основных признаков инфекции WNV [26], мы в дальнейшем исследовали активацию астроцитов у мышей WT и db / db на 6-й день и 8 после заражения WNV. Экспрессия мРНК GFAP была увеличена у мышей WT на 8-й день после инфицирования по сравнению с соответствующими мышами-инфицированными мышами. Однако увеличение экспрессии GFAP было значительно выше у инфицированных мышей db / db по сравнению с инфицированными мышами WT (рисунок 8A) (P <0,05). Подобно экспрессии мРНК, иммуногистохимический анализ показал увеличение экспрессии GFAP у мышей WT на 8-й день после заражения. Однако иммунореактивность GFAP была более выраженной в мозге мышей db / db (рисунок 8B).

Активация астроцитов и апоптоз нейронов в мозгах мышей WT и db / db. (A) qRT-ПЦР проводили на РНК, экстрагированной из mock- и WNV-инфицированных головных мозга у мышей WT и db / db на 6-й и 8-й день после заражения, чтобы определить сглаживание в экспрессии гена GFAP. Изменение уровней гена GFAP было сначала нормировано на ген β-актина, а затем изменение складки в WNV-инфицированных мозгах было рассчитано по сравнению с соответствующими имитируемыми мозгами. Данные представляют среднее ± SEM, представляющее два независимых эксперимента (n = 7 на группу). * p <0,05. (B) Криоконсервированные отделы мозга от WNV-инфицированных мышей WT и db / db на 8-й день после заражения окрашивали для GFAP. Иммунореактивность GFAP была выше у WNV-инфицированных мышей db / db. Микрофотографии демонстрируют репрезентативные изображения, полученные из двух независимых экспериментов (n = 4 на группу). Бары, 20 мкм. (C) Криоконсервированные отделы мозга от WNV-инфицированных мышей WT и db / db на 8-й день после заражения окрашивались H & E. Черные стрелки идентифицировали нейроны. (D) Анализ TUNEL проводили на криоконсервированных участках мозга от WNV-инфицированных мышей WT и db / db на 8-й день после инфицирования для оценки апоптоза нейронов (зеленые, белые стрелки и увеличенная вставка стрелочной коробки). Микрофотографии демонстрируют репрезентативные изображения, полученные из двух независимых экспериментов (n = 4 на группу). Бары, 20 мкм. (E) Количественное представление TUNEL-положительных клеток из 15 различных областей мозга в разрезе (всего 2 отдела мозга на мышей) из двух независимых экспериментов (n = 4 на группу). Число TUNEL-положительных клеток было значительно выше в головном мозге мышей db / db. * P <0,05. (F) Совместное иммуноокрашивание TUNEL-положительных клеток с NeuN (маркер нейрональных клеток). Микрофотографии демонстрируют репрезентативные изображения, полученные из двух независимых экспериментов (n = 4 на группу). GFAP, глиальный фибриллярный кислый белок; TUNEL, маркировка концевых дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP; SEM, стандартная ошибка среднего значения.

Смерть нейронов является отличительной чертой WNVE [44]. Поэтому мы также оценили степень гибели нейронов в мозгах мышей WT и db / db после инфекции WNV. Мы исследовали H & E-окрашенные участки тканей мозга от мышей WT и db / db на 8-й день после инфекции WNV. Нейроны мышей db / db демонстрируют эозинофильную цитоплазму и ядерный кариоррексис, свидетельствующие о гибели нейронов, тогда как нейроны мышей WT из той же области мозга лучше сохраняются с базофильной цитоплазмой и круглыми ядрами (рис. 8C). WNV-индуцированный нейроновский апоптоз далее оценивали прямым окрашиванием TUNEL тканей мозга WT и db / db на 8-й день после заражения. Окрашивание TUNEL продемонстрировало заметно увеличенные TUNEL-позитивные клетки в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT (рис. 8D). Все TUNEL-позитивные клетки совместно локализованы с NeuN (маркер нейрональных клеток) (рисунок 8F). Кроме того, мы количественно определяли TUNEL-позитивные клетки в отделах мозга у четырех разных мышей в каждой группе. Число TUNEL-положительных клеток у уклонившихся мышей db / db было значительно выше, чем у инфицированных мышей WT (рис. 8Е) (Р <0,05).

Одним из отличительных признаков WNVE является накопление иммунных клеток. Инфильтрация иммунных клеток связана с увеличением производства нейровоспалительных молекул, таких как цитокины и хемокины, и требует регулирования CAM. Напротив, мы демонстрируем, что WNVE у мышей db / db характеризуется уменьшением накопления лейкоцитов, несмотря на увеличение продуцирования провоспалительных цитокинов и хемокинов, и связано с ослабленной экспрессией CAM, повышенной вирусной нагрузкой на мозг, активацией астроцитов, и усиленная гибель нейронов. Эти результаты, в сочетании с нашими ранее опубликованными данными, свидетельствуют о том, что нарушение миграции иммунных клеток приводит к сокращению вирусного разрыва из головного мозга, что приводит к высокой смертности у мышей, инфицированных WNV db / db [19].

WNVE характеризуется связанными с вирусом патологическими процессами, включая реакцию резидентных клеток мозга и инфильтрацию воспалительных лейкоцитов, прежде всего моноцитов и Т-клеток, в периваскулярном пространстве и паренхиме [25,29]. Хотя инфильтрация моноцитов является защитной, она также способствует WNV-ассоциированной патологии [39,40,45]. Т-клетки играют важную роль в защите хозяина от инфекции WNV. В то время как CD4 + Т-клетки реагируют преимущественно на периферии, CD8 + Т-клетки мигрируют в мозг и очищают WNV от инфицированных нейронов [43]. CD8 + Т-клетки используют липопротеиновые лиганд-зависимые цитолитические механизмы для ограничения инфекции WNV [46,47]. Эти цитолитические механизмы клиренса с помощью эффекторных CD8 + T-клеток ограничивают вирусную нагрузку и неврологическое заболевание и перевешивают возможные патологические эффекты иммунной целенаправленной травмы нейронов CD8 + T-клетками. Было продемонстрировано, что мыши, не имеющие CD8 + Т-клеток, увеличили вирусную нагрузку в мозге и уровень смертности при заражении WNV [30, 46, 47]. Как и ранее опубликованные данные, мы демонстрируем, что титр WNV мозга у мышей db / db был значительно выше, чем у мышей WT (рис. 1C) [19]. Хотя мы также наблюдали задержку в индукции ответа IFN-α в мозге мышей db / db, уровни IFN-α были одинаковыми в мозге мышей WT и db / db на 8-й день после инфицирования [19]. Более того, как описано выше, адаптивные иммунные ответы (в частности, опосредуемый Т-клетками иммунитет) являются преобладающим иммунным ответом и необходимы для контроля инфекции WNV в головном мозге. В этом исследовании мы использовали множество экспериментальных подходов, чтобы продемонстрировать, что мыши, инфицированные WNV-db / db, уменьшали уровни проникновения CD45 + и CD8 + клеток в мозг по сравнению с инфицированными мышами WT (рис. 1, 2, 3). Хотя несколько периферических ответов, включая противовирусные иммунные ответы (IFN-α, IgM и IgG) и провоспалительные реакции, были изменены у мышей WT и db / db [19], мы наблюдали аналогичное количество иммунных клеток, включая CD8 + T-клетки в селезенке WNV-инфицированных мышей WT и db / db (рисунок 3).

Известно, что диабетическое состояние снижает приверженность лейкоцитов и трансмиграцию [48,49]. Несколько исследований in vitro продемонстрировали значительно уменьшенную трансмиграцию нейтрофилов и моноцитов в ответ на различные хемотаксические стимулы через трансвезонную камеру in vitro или камеру Боудена у пациентов с диабетом по сравнению с недиабетическими контрольными [3,8,9,49,50]. В последнее время исследование in vivo с использованием мышей db / db показало снижение инфильтрации нейтрофилов в головном мозге после введения ЛПС [10]. Кроме того, было также продемонстрировано, что снижение прокатки, адгезии и миграции лейкоцитов в место заражения повышает восприимчивость диабетических мышей к полимикробному сепсису [49]. Аналогичным образом, в нашем исследовании наличие диабета значительно меняет вербовку лейкоцитов в головном мозге, что приводит к неспособности очистить WNV-инфекцию в мозге мышей db / db.

WNV-индуцированная экспрессия провоспалительных молекул, таких как CXCL10, CCL2 и TNF, имеет важное значение для торговли лейкоцитами в мозг [29,32,39]. Повышенная экспрессия цитокинов и хемокинов в WNV-инфицированном мозге обычно связана с усилением заражения лейкоцитов в мозг [43]. Мы наблюдали увеличение различных уровней хемокинов и цитокинов в мозге мышей db / db, несмотря на снижение инфильтрации лейкоцитов (рис. 4 и 7, таблицы 2 и 3). Этот эффект может быть обусловлен отсутствием CD8 + Т-клеток, которые могут приводить к неконтролируемой репликации вируса в резидентных клетках головного мозга, таких как нейроны и астроциты, что приводит к увеличению продуцирования цитокинов и хемокинов. Было продемонстрировано, что WNV-инфицированные нейроны непосредственно способствуют воспалению путем секреции различных хемокинов и цитокинов [29, 38]. Более того, активация астроцитов является одной из ключевых патогенных особенностей WNVE [26,51]. WNV-индуцированное увеличение продуцирования цитокинов и хемокинов было продемонстрировано в астроцитах [52-54]. В этом исследовании мы также демонстрируем увеличение активации астроцитов в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT (рис. 8A и B). Эти результаты показывают, что WNV-инфицированные нейроны и активированные астроциты являются потенциальным источником этих воспалительных молекул в мозге мышей db / db. Однако наши данные не исключают возможности продуцирования цитокинов путем проникновения NK-клеток и / или резидентных микроглиальных клеток в мозг мышей db / db. Более того, меньшее количество иммунных клеток, проникающих в мозг мышей db / db, может быть гиперреактивным и продуцировать увеличенное количество провоспалительных медиаторов в мозге этих мышей. Аналогичным образом, в нашем предыдущем исследовании мы также наблюдали увеличение продуцирования провоспалительных медиаторов в сыворотке мышей db / db по сравнению с мышами WT [19]. Эти данные в совокупности демонстрируют, что WNV-инфекция у мышей db / db приводила к увеличению продуцирования медиаторов воспаления, как на периферии, так и в мозге.

Другим возможным объяснением уменьшенной миграции лейкоцитов, наблюдаемой в мозге мышей с dn / db-инфицированными WNV, является экспрессия CAM. CAM необходимы для миграции лейкоцитов в мозг [55]. Инфекция WNV также увеличивает экспрессию CAM, таких как ICAM-1, VCAM-1 и E-селектин, для облегчения распространения лейкоцитов в паренхиму головного мозга [31,41,42]. Было продемонстрировано, что CAM важны для поддержания лейкоцитов в головном мозге после инфекции WNV. Более того, инфильтраты лейкоцитов и макрофагов были снижены в мозге мышей ICAM-1 — / — после инфекции WNV [31]. Аналогично, мы наблюдали повышенную экспрессию ICAM-1 и E-селектина в мозге мышей WT после инфекции WNV, что коррелирует с инфильтрацией лейкоцитов у этих мышей (рис. 5 и 6). Аналогичные результаты наблюдались и у других вирусов ЦНС-Тропика, таких как вирус лейкемического энцефаломиелита Тейлера (TMEV) [56]. Было продемонстрировано, что инфекция TMEV индуцирует экспрессию CAM, такой как ICAM-1 и VCAM-1, в мозге мышей, которая играет важную роль в опосредовании инфильтрации лейкоцитов в мозг [56-58].

В нашем исследовании значительное повышение регуляции САМ наблюдается на 8-й день после инфицирования в головном мозге мышей WT, что коррелирует с высокой репликацией вируса (рис. 1C) [19]. Напротив, уровни как E-селектина, так и ICAM-1 были значительно ниже в мозге инфицированных мышей db / db, несмотря на значительно большую вирусную нагрузку в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT (фиг.1C и 5) , Было продемонстрировано, что у пациентов с диабетом типа 2 наблюдается ослабленная регуляция ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина после различных стимулов, таких как LPS [3,11]. Недавнее исследование показало, что уменьшенная экспрессия ICAM-1 играет решающую роль в снижении вербовки нейтрофилов в мозг мышей db / db после индуцированного LPS системного воспаления [10]. Аналогично, у мышей, зараженных WNV db / db, снижение уровней САМ является недостаточным для эффективной миграции лейкоцитов во время WNVE, несмотря на высокие уровни хемокинов в головном мозге.

Известно, что индуцированные WNV провоспалительные цитокины модулируют проницаемость BBB, активируют глиальные клетки и опосредуют гибель нейронов, что приводит к индукции летального энцефалита [38,59,60]. В этом исследовании мы демонстрируем значительно повышенные уровни цитокинов, таких как IL-1β, IL-6, TNF, IL-1α и IFN-γ и их рецепторы в мозге мышей db / db на 6-й и 8-й день после инфекции WNV (Рис. 7, табл. 3), что коррелировало с увеличением уровней WNV в мозге мышей db / db [19]. Показано, что IL-1β и TNF индуцируют апоптоз нейронов после инфекции WNV [38]. Аналогично, мы наблюдали увеличение апоптоза нейронов в мозге мышей db / db по сравнению с мышами WT (рис. 8C-F). Нейронный апоптоз является отличительной чертой WNVE, и увеличение апоптоза нейронов связано с повышенной летальностью после инфекции WNV [24,44]. В совокупности эти результаты указывают на корреляцию между усиленным воспалительным ответом и увеличением апоптоза нейронов в мозге мышей db / db, что приводит к увеличению смертности. Эти данные согласуются с предыдущими наблюдениями о том, что мыши db / db демонстрируют большую воспалительную реакцию на различные патогены, такие как Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis и Trypanosoma cruzi, в которых повышенный воспалительный ответ коррелирует с повышенной тяжести заболевания [7,61,62 ].

Наши ранее опубликованные данные показали, что присутствие диабета ослабляет периферические антивирусные иммунные реакции, приводящие к увеличению нагрузки WNV в сыворотке, периферических тканях и головном мозге [19]. В этом исследовании мы демонстрируем, что присутствие диабета усиливает WNV-инфекцию в головном мозге, препятствуя миграции или накоплению защитных лейкоцитов в головном мозге, что коррелирует с уменьшенными уровнями САМ. Усиленная репликация вируса приводит к увеличению уровней хемокинов и цитокинов в мозге мышей db / db, что опосредует активацию астроцитов и вызывает гибель нейронов, что приводит к летальному энцефалиту и увеличению смертности у мышей db / db. В совокупности эти данные и наши ранее опубликованные данные [19] закладывают основу для разработки столь необходимого терапевтического вмешательства, чтобы ограничить прогрессирование WNVE среди диабетиков.

BBB: гематоэнцефалит крови; CAM: молекулы адгезии клеток; CCL: лиганд моноклонального антитела Chemokine; CCR: рецептор моноклонального антитела Chemokine, CXCL, лиганд монокристаллов Chemokine CXC; CXCR: рецептор монокристалла Chemokine CXC; ICAM-1: молекула адгезии межклеточных клеток 1; IL: Интерлейкин; IL1R: рецептор интерлейкина 1; IFN: интерферон; GFAP: глиальный фибриллярный кислый белок; ЛПС: липополисахариды; OCT: оптимальная температура резания; PBS: забуференный фосфатом физиологический раствор; PFA: параформальдегид; PFU: единицы формирования бляшек; TNF: фактор некроза опухоли; TNFRSF1: член суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли 1; TUNEL: маркировка концевых дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP; vWF: коэффициент фон Виллебранда; WNV: вирус Западного Нила; WNVE: связанный с WNV энцефалит; WT: Дикий тип.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

MK и VRN разработали и провели эксперименты, проанализировали результаты и написали рукопись. KR и BO провели эксперименты. SV и PVN участвовали в раннем экспериментальном проектировании и обсуждениях и обеспечивали интеллектуальный вклад. KST изучал и интерпретировал слайды гистопатологии и обеспечивал интеллектуальный ввод. Все авторы прочитали и утвердили окончательный вариант рукописи.

Это исследование частично поддерживалось грантами от Центров исследований биомедицинских исследований (P20GM103516), Национального института общих медицинских наук, Национальных институтов здравоохранения (NIH) и Институциональных фондов. Мы благодарим сотрудников Core of Core of the Histopathology Core и Imaging Core исследовательских центров в рамках Программы по меньшинствам (G12MD007601), Национального института по вопросам неравенства в отношении здоровья и здоровья людей NIH, за помощь в гистологии и использовании имиджера изображений LI-COR Odyssey, соответственно. Мы также благодарим г-жу Джанет Микс за помощь в создании биозащиты JABSOM, г-же Александре Гурари и д-ра Рави Тандоне за помощь в проточной цитометрии. Эта работа является частью докторской диссертации МК, представленной в Гавайский университет.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *