Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Трансплантация стволовых клеток из зубной целлюлозы подавляла воспаление в седалищных нервах путем содействия поляризации макрофагов в отношении антивоспалительных фенотипов и улучшенной диабетической полинейропатии

Transplantation of dental pulp stem cells suppressed inflammation in sciatic nerves by promoting macrophage polarization towards anti‐inflammation phenotypes and ameliorated diabetic polyneuropathy
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4931198/

Считается, что стволовые клетки зубной целлюлозы (DPSC) являются привлекательным кандидатом на клеточную терапию. Недавно мы сообщили, что трансплантация DPSC увеличивает скорость проводимости нерва и поток нервных кровотоков у крыс с диабетом. В настоящем исследовании мы исследовали иммуномодулирующий эффект трансплантации DPSC на диабетические периферические нервы.

DPSC были выделены из зубной целлюлозы крыс Sprague-Dawley и расширены в культуре. Через восемь недель после инъекции стрептозотоцина DPSC были пересажены в односторонние скелетные мышцы задней конечности. Через четыре недели после трансплантации DPSC были оценены нейрофизиологические измерения, выражения воспалительных генов и количество CD68-положительных клеток в седалищных нервах. Для подтверждения иммуномодулирующего эффекта DPSC были исследованы эффекты среды, кондиционированной DPSC, на клетки, экспрессируемые липополисахаридом, мышиные макрофаги RAW264.7.

У диабетических крыс наблюдались значительные задержки в скорости проводимости седалищного нерва и снижении кровотока седалищного нерва, все из которых были улучшены при трансплантации DPSC. В седалищных нервах диабетических крыс было увеличено количество CD68-положительных моноцитов / макрофагов и экспрессии генов экспрессированных макрофагами M1 цитокинов, фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-1β. Трансплантация DPSC значительно уменьшала моноциты / макрофаги и экспрессию рибонуклеиновой кислоты фактора фактора-α-α, а также увеличивала экспрессию гена маркера макрофагов M2 CD206 в седалищных нервах диабетических крыс. Исследование in vitro показало, что среда, кондиционированная DPSC, значительно увеличивает экспрессию генов интерлейкина-10 и CD206 в клетках RAW264.7, стимулированных липополисахаридом.

Эти результаты свидетельствуют о том, что трансплантация DPSC способствовала поляризации макрофагов в отношении противовоспалительных фенотипов М2, которые могут быть одним из терапевтических механизмов диабетической полинейропатии.

Диабетическая полинейропатия, наиболее распространенные диабетические осложнения при диабете типа 1 и типа 2, поражает до 50% таких пациентов1. Хотя препараты для симптоматической терапии болезненной диабетической невропатии эффективны для улучшения качества жизни, по-прежнему требуются фундаментальные методы лечения патогенеза диабетической полинейропатии. Клеточная терапия с использованием некоторых предшественников или стволовых клеток является одним из кандидатов. Мы и другие сообщали, что трансплантация прародителя / стволовых клеток, таких как клетки эндотелиальных предшественников, мезенхимальные стволовые клетки и эмбриональные стволовые клетки / индуцированные клетки с плюрипотентными стволовыми клетками, улучшенная диабетическая полинейропатия на животных моделях диабета2, 3, 4, 5 , 6, 7. Что касается механизмов терапевтической эффективности диабетической полинейропатии, то первыми кандидатами были ангиогенные и нейротрофические факторы, секретируемые предшественниками / стволовыми клетками.

Напротив, воспаление является основной целью ожирения и диабета, а также диабетических осложнений8. Взаимодействия между нервной и иммунной системами приводят к нейроэндокринной иммунной модуляции, участвующей в нейропатологии9. При диабетической полинейропатии наблюдается накопление доказательств того, что воспалительные процессы участвуют в патогенезе диабетической нейропатии9, 10, 11, 12. Ингибирование высвобождения цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), привело к улучшению (STZ) индуцированные диабетические крысы13, 14, 15. Среди прародителей и стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, как известно, обладают сильными иммунодепрессивными свойствами, которые подтверждают терапевтическую эффективность аллогенной трансплантации [16, 17].

Однако, как и другие зрелые клетки, не только диабет, но и старение нарушают функции клеток в этих предшественниках и стволовых клетках, что может снизить эффективность аутологичной клеточной терапии18, 19. Стоматологические стволовые клетки пульпы (DPSC), которые являются мезенхимальными стволовыми клетками, считаются привлекательным кандидатом на клеточную терапию, поскольку их легко получить из зубов, извлеченных по ортодонтическим причинам без дальнейших инвазивных процедур. DPSC имеют высокую скорость роста20 и способность к многоуровневой дифференциации 21, 22, которые сохраняются даже после долговременной криоконсервации23. Мы показали, что трансплантация криоконсервированных DPSC улучшает скорость проводимости седалищного нерва (NCV) и седалищного нервного кровотока (SNBF), а также плотность внутриэпидермального нервного волокна с использованием STZ-индуцированных диабетических крыс24. Кроме того, поскольку третий моляр извлекается у многих людей в раннем подростковом возрасте, мы можем получать и удерживать DPSC от молодой и преддиабетической зубной целлюлозы для пациентов с диабетом.

В настоящем исследовании мы изучили, оказывают ли DPSC иммуносупрессивные эффекты на ткани периферических нервов при индуцированной STZ диабетической полинейропатии. Здесь мы показали, что трансплантация DPSC значительно уменьшала количество макрофагов в диабетических седалищных нервах, уменьшая экспрессию гена макрофагов M1 и увеличивая экспрессию гена макрофагов M2. Эти данные свидетельствуют о том, что трансплантация DPSC может быть эффективной противовоспалительной клеточной терапией для диабетической полинейропатии путем модуляции пропорций макрофагов M1 / ​​M2.

Самцов крыс Sprague-Dawley (SD) получали от Chubu Kagakushizai (Nagoya, Japan) в возрасте 6 недель. Диабет был вызван внутрибрюшинной инъекцией STZ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, 60 мг / кг). Крысы с уровнем глюкозы в крови выше 14 ммоль / л считались диабетическими и были выбраны вместе с взрослыми крысами SD с возрастом. Это исследование было одобрено Институциональными комитетами по уходу и использованию животных Университета Айчи Гакуин.

Зубцы резцов тщательно расчленялись из челюстей 6-недельных мужских нормальных SD-крыс и зеленых флуоресцентных белков (GFP) -трансгенных SD-крыс (SD-Tg [CAG-EGFP] Cz-0040sb, Japan SLC Inc., Hamamatsu, Япония). Ткани зубной целлюлозы собирали и суспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем 0,1% коллагеназы и 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты. DPSC культивировали в альфа-модификации среды Eagle (GIBCO Lab Inc., Grand Island, NY, США), концентрация глюкозы которой составляла 5,5 ммоль / л, с 20% эмбриональной бычьей сывороткой (GIBCO) на пластиковых чашках при 37 ° C в 5% увлажненного СО2. Неадгезивные клетки смывали, а адгезивные клетки непрерывно расширяли до прохождения 3.

Культивированные DPSC инкубировали с конъюгированным с R-PE антителом хомяка против CD29 крысы (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), моноклональными антителами мыши с конъюгированным с R-PE антителом против CD90 крысы или моноклональными антителами мыши с конъюгированным с R-PE против крысы CD45 (Becton Dickinson) и характеризовались магнитной активированной сортировкой клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany).

Дифференциация на адипоциты, остеобласты и хондроциты культивированных DPSC проводилась в соответствии с инструкциями производителя (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). Для обнаружения адипогенной дифференцировки клетки окрашивали масляным красным O (Polysciences Inc., Уоррингтон, PA, США) и связывающим жирные кислоты белком-4 (R & D Systems). Для выявления остеогенной дифференцировки клетки окрашивали остеокальцином (R & D Systems). Кальцинирование остеогенных монослоев также визуализировали с использованием Alizarin Red S (Merck, Darmstadt, Germany). Для обнаружения хондрогенной дифференцировки клетки окрашивали аггреканом (R & D Systems), известным как основной протеогликан в суставном хряще.

Через восемь недель после индукции диабета мы трансплантировали DPSC от крыс SD или крыс GFP в скелетные мышцы задней конечности. Суспензию DPSC (всего 1,0 мл, 1 × 106 клеток) вводили в десяти точках в односторонних скелетных мышцах задней конечности. Транспорт (физиологический раствор, всего 1,0 мл) также вводили в контрлатеральные скелетные мышцы задней конечности в качестве контроля. Во время трансплантации и через 4 недели после трансплантации на двухстороннем уровне измерялись следующие параметры.

Крыс глубоко анестезировали пентобарбиталом, а температуру тела поддерживали при 37 ° С, используя нагревательную подушку, чтобы освободить животных от стресса от анестетика. Измеряли скорость проводимости двигательного нерва (MNCV) между лодыжкой и седалищным насекомым и скорость проводимости сенсорного нерва (SNCV) между лодыжкой и коленом. MNCV и SNCV оценивали с использованием инструмента Neuropak MEB-9400 (Nihon-Koden, Osaka, Japan).

SNBF измеряли с использованием лазерного доплеровского измерителя кровотока (FLO-N1, Omega Wave Inc., Токио, Япония). После того, как крыс анестезировали, кожа бедренной кости была разрезана, и в миофасции был сделан разрез, чтобы выявить седалищный нерв. Затем, через 5 минут после этой процедуры, лазерный зонд был помещен чуть выше открытого седалищного нерва. Все измерения проводились, когда крыс выкладывали на нагретую подушку в помещении, поддерживаемом при 25 ° С, чтобы поддерживать постоянную ректальную температуру 37 ° С.

Через четыре недели после трансплантации крыс убивали передозировкой пентобарбитала (15 мг / 100 г). Серийные нервы фиксировали в 4% -ном растворе параформальдегидфосфатного буфера в течение ночи и погружали в оптимальное соединение для резки (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan). Проксимальные части супральных нервов погружали в 2,5% глутаральдегида (Sigma) в течение ночи. Их откладывали в тетраксид осмия, обезвоживали и вставляли в Эпон для морфометрического анализа.

Семитинные участки проксимального сурватного нерва разрезались поперечно (участки толщиной 0,5 мкм), окрашивались толуидиновым синим и исследовались с помощью световой микроскопии (Leica microsystems, Wetzlar, Germany). Мы оценили общее количество миелолиновых волокон сурального нерва, как описано выше. Параметры были получены с использованием программного обеспечения для обработки изображений и анализа ImageJ (версия 1.49; NIH, Bethesda, MD, USA).

Для обнаружения моноцитов / макрофагов секции инкубировали с основным мышиным CD68-антителом (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). После промывки применяли антитело против мышиного антитела против мышиного иммуноглобулина G (IgG) Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол.

Чтобы охарактеризовать макрофаги, секторы были дважды окрашены основным мышиным CD68-антителом и кроличьим CD206-антителом (Santa Cruz). После стирки применяли антитело против мышиного IgG с антителом против IgA, связанное с Alexa Fluor 594, антитело IgG против IgA, содержащее антитело Alexa Fluor 488 (Invitrogen) и 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол. Слайды анализировали под флуоресцентным микроскопом.

Общая рибонуклеиновая кислота экстрагировалась из замороженных образцов седалищных нервов с использованием TRIzol Reagent (Invitrogen) и очищалась с использованием очищающей колонки (Qiagen, Valencia, CA, USA). Дополнительную дезоксирибонуклеиновую кислоту синтезировали с использованием ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) в соответствии с инструкциями производителя. Праймеры и зонды для TNF-α (Tnf), интерлейкина (IL) -1β (Il1b), IL-10 (Il10), CD68 (CD68), CD11c (Itgax) и CD206 (Mrc1) были приобретены из анализов экспрессии гена TaqMan ( Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР) проводили и измеряли с помощью ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Относительное количество рассчитывали по методу ΔΔCt с использованием β2 микроглобулина в качестве эндогенного контроля25.

DPSC поддерживали в модифицированной Dulbecco среде Eagle, концентрация глюкозы которой составляла 5,5 ммоль / л, содержащую 1% фетальной бычьей сыворотки (GIBCO). Через 24 ч культуральную среду собирали, концентрировали десять раз, используя центрифужные фильтры 10 кДа (Amicom Ultra-15, Nihon Millipore, Tokyo, Japan) и замораживали при -20 ° C до использования. Линию клеток мышиного макрофага, клетки RAW264.7 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), высевали в 12-луночные планшеты (5 × 105 клеток / лунку) и культивировали в модифицированной Dulbecco среде Eagle, содержащей 1% фетального бычьей сывороткой. Через 12 ч клетки заменяли на среду, не содержащую сыворотки, и предварительно обрабатывали однократным разбавлением DPSC-кондиционированной среды в течение 1 часа. После того, как клетки инкубировали с липополисахаридом (LPS, 50 нг / мл, Sigma) в течение 4 ч, экспрессию РНК-мРНК (мРНК) клеток RAW264.7 исследовали с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

Чтобы оценить влияние кондиционированных сред DPSC на состояние макрофагов M1 клеток RAW264.7, клетки RAW264.7 предварительно подвергали воздействию 50 нг / мл ЛПС для дифференциации в макрофаг M1. Через 48 часов добавляли одно-десятое разбавление среды, кондиционированной DPSC, и клетки инкубировали в течение 4 часов. Выражения мРНК были исследованы количественной ПЦР в режиме реального времени.

Влияние DPSC-кондиционированных сред на пролиферацию / жизнеспособность клеток RAW264.7 оценивали с помощью 3- (4,5) -диметилтиахиазо (-z-y1) -3,5-дифенилтетразолиуммида (MMT, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) и Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) в соответствии с процедурой изготовителя. Клетки высевали в 96-луночные планшеты (2 × 104 клеток / лунку) и культивировали в модифицированной Dulbecco среде Eagle, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки. Через 12 ч клетки инкубировали с 1-м разбавлением DPSC-кондиционированной среды в течение 3 дней.

Чтобы исследовать способность продуцировать биоактивный основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGFA), фактор роста нервов (NGF), нейротрофин-3 (NTF3), нейротрофический фактор линии глиальных клеток (GDNF), Tnf, IL1b, Il6 (IL-6), MCP1, Il10, Il4 (IL-14), Il13 (IL-13), CSF1 (также известный как M-CSF) и CSF2 (также известный как GM-CSF). Грунтовки были приобретены в анализах генов экспрессии генов TaqMan (Applied Biosystems). Выражения мРНК культивированных DPSC были исследованы количественной ПЦР в режиме реального времени. Логарифмические концентрации мишени (X) и домашнего хозяйства (β2-микроглобулин) были рассчитаны (Y) по стандартной кривой. Уровни экспрессии были стандартизированы и сравнивались (X / Y) между каждым образцом. Таким образом, стандартизация значений концентрации логарифма (X / Y) должна обеспечивать относительное количество культивируемой мРНК DPSC.

Результаты были выражены как средние значения ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводился односторонней ановой с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Различия считались значимыми при P <0,05.

DPSC показали типичную морфологию формы шпинделя и выражали маркеры поверхности клеток мезенхимальных стволовых клеток, такие как CD29 и CD90, и не выражали CD45, маркер гематопоэтических линий (рис. 1a). Клетки, индуцированные в хондроциты, проявляли окрашивание в аггрекан. Адипогенез подтверждают окрашиванием масляным красным O и жирным кислотно-связывающим белком-4. DPSC были также дифференцированы в остеобласты, окрашенные остеокальцином, и показали выраженную минерализацию окрашиванием Ализарином Red S (рисунок 1b).

Характеристика и дифференцировка зеленого флуоресцентного белка (GFP) — экспрессирующие стволовые клетки зубной целлюлозы (GFP-DPSCs). (a) GFP-DPSC, полученные от 6-недельных крыс Sprague-Dawley, были положительными для маркеров мезенхимальных стволовых клеток (CD29, CD90) и отрицательных для гемопоэтического маркера CD45 (черная область). ИСО-идентичные антитела служили контрольной группой (белая область). (б) GFP-DPSC могут дифференцироваться в адипогенные, остеогенные и хондрогенные линии in vitro. Для дискриминации масляный красный O и связывающий жирные кислоты белок-4 использовали для адипоцитов, красного ализарина и остеокальцина для остеоцитов и аггрекан для хондроцитов. Шкала шкалы, 50 мкм.

Через 12 недель после инъекции STZ у диабетических крыс наблюдалась тяжелая гипергликемия (нормальные крысы 6,1 ± 0,4 ммоль / л, индуцированные STZ диабетические крысы 26,6 ± 2,2 ммоль / л, P <0,01) и значительно сниженный вес тела (нормальные крысы 508,3 ± 16,4 г , Индуцированные STZ диабетические крысы 284,0 ± 34,3 г, P <0,01). Трансплантация DPSC не изменяла вес тела или уровень глюкозы крови в диабетических группах (вес тела: непересаженные диабетические крысы 294,3 ± 33,9 г, пересаженные диабетические крысы 284,0 ± 34,3 г, уровень глюкозы в крови: непересаженные диабетические крысы 23,8 ± 3,2 ммоль / л, трансплантированные диабетические крысы 26,6 ± 2,2 ммоль / л).

Диабетические крысы показали задержанные MNCV и SNCV и уменьшали SNBF по сравнению с контрольной стороной нормальных крыс (рис. 2). Задержка MNCV и SNCV и снижение SNBF были значительно улучшены трансплантацией DPSC у диабетических крыс.

Трансплантация стволовых клеток зубочелюстной цепочки (DPSC) улучшала задержку скорости проводимости седалищного нерва и снижение седалищного кровотока нерва у крыс с диабетом. (a) Скорости проводимости двигательного нерва с седалищным нервом (MNCV). (b) Скорости проводимости нервных сцинтилярных нервных нервов (SNCV). (c) Коротко-сосудистый кровоток (SNBF; n = 5). Результаты — средняя ± стандартная ошибка среднего. ** P <0,01, * P <0,05. DM, диабетические крысы; DM-D, трансплантированные диабетические крысы, перенесшие стволовые клетки зуба; DM-V, крысы с диабетом, инъецированные в транспорт; N, нормальная крыса; Нелечение, измерения в течение 4 недель после трансплантации у крыс без трансплантации; N-V, нормальные крысы с инъецированным транспортным средством; N-D, пересаженные нормальные крысы, пересаженные стволовыми клетками зуба; Последующая обработка, измерения в течение 4 недель после трансплантации у крыс, пересаженных стволовыми клетками зубочелюстной пульпы; Предварительная обработка, измерения во время трансплантации у нормальных и диабетических крыс.

Результаты морфометрии сухожильных нервов миелинизированного волокна показаны в таблице 1. Двенадцатинедельные STZ-индуцированные диабетические крысы не выявили изменений площади волокон, плотности миелиновых волокон, уровня заполняемости, средней площади миелина, средней площади аксонов, аксонов до -миелина, диаметра аксонов и толщины миелина по сравнению с нормальными крысами. Аксональная округлость сурватного нерва на контрольной стороне диабетических крыс была значительно снижена по сравнению с таковой у нормальных крыс. Трансплантация DPSC значительно улучшала аксоновую циркулярность у диабетических крыс.

Морфометрические данные миелинированных волокон в нервных нервах

Данные средние ± стандартная ошибка среднего. * P <0,05 против крыс нормального транспортного средства; ** P <0,05 против крыс с диабетом. DPSC, стволовые клетки пульпы.

Количество моноцитов / макрофагов в седалищных нервах было значительно увеличено на контрольной стороне диабетических крыс по сравнению с нормальными крысами (диабет 31,50 ± 2,41 / мм2, нормальный 16,81 ± 1,15 / мм 2, Р <0,01, фиг.3а). Трансплантация DPSC значительно уменьшала моноциты / макрофаги в седалищных нервах по сравнению с контрольной стороной диабетических крыс (21,89 ± 0,61 / мм2, P <0,01). Не было существенной разницы в количестве моноцитов / макрофагов между DPSC-трансплантированными сторонами по сравнению с участками, инъецированными носителем у нормальных крыс (рис. 3b).

Трансплантация зубной целлюлозы (DPSC) подавляла количество CD68-положительных моноцитов / макрофагов в седалищных нервах диабетических крыс. (a) Репрезентативные микрофотографии гистологических разрезов в инъецированном транспортным средством и DPSCs-трансплантированных сторонах седалищных нервов у нормальных и диабетических крыс. Моноциты / макрофаги были обнаружены путем иммуноокрашивания для CD68. Шкала шкалы, 50 мкм. (b) Количественный анализ для CD68-положительных клеток / мм2 в седалищных нервах нормальной и диабетической крыс (n = 5). Результатом являются средние значения ± стандартная ошибка среднего значения. ** P <0,01.

Чтобы исследовать корреляцию между воспалением седалищного нерва и нейрофизиологической активностью, мы оценили количество моноцитов / макрофагов и MNCV у каждой крысы. Мы обнаружили отрицательную корреляцию между количеством моноцитов / макрофагов в седалищных нервах и MNCV (рис. S1).

Диабетические крысы показали значительное увеличение выражений провоспалительных генов макрофагами M1, такими как TNF-α, IL-1β и CD11c, на контрольной стороне седалищных нервов по сравнению с нормальными крысами (рисунок 4). Трансплантация DPSC значительно уменьшала экспрессию гена TNF-α в седалищных нервах по сравнению с инъецированными на носитель сторонами диабетических крыс (P <0,01). Несмотря на то, что уровни генов, экспрессирующих макрофаг M2, CD206 и IL-10, не выявили существенных различий между нормальной и диабетической крысами, трансплантация DPSC значительно увеличила экспрессию мРНК CD206 у крыс с диабетом (P <0,01) вместе с повышенная тенденция к ИЛ-10.

Влияние трансплантации стволовых клеток зубочелюстной пульпы (DPSC) на проявления воспалительных мессенджеров рибонуклеиновой кислоты в седалищных нервах. Через четыре недели после трансплантации DPSC экспрессию рибонуклеиновой кислоты с выраженью фактора некроза опухоли-α (TNF-, Tnf), интерлейкина (IL) -1β (Il1b), IL-10 (Il10), CD68 (CD68), CD11c ( Itgax) и CD206 (Mrc1) в седалищных нервах оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (n = 8). Результатом являются средние значения ± стандартная ошибка среднего значения. ** P <0,01, * P <0,05.

Иммуногистологический анализ показал, что популяция клеток CD68 + CD206 +, которые, как считается, является иммунодепрессанной субпопуляцией макрофагов (макрофагов M2), была увеличена на DPSC-трансплантированной стороне седалищного нерва (рис. S2).

Для оценки влияния факторов, секретируемых DPSC (5), оценивали влияние среды, кондиционированной DPSC, на индуцированные LPS провоспалительные и противовоспалительные экспрессии генов цитокинов в клетках RAW264.7. Генетические экспрессии TNF-α, IL-1β и IL-10 были активированы во всех культурах с помощью стимуляции ЛПС в течение 4 часов. Уровень LPS-стимулированного IL-10 был значительно увеличен в присутствии среды, кондиционированной DPSC (P <0,01). Экспрессия гена CD206 не менялась при стимуляции ЛПС, тогда как она была значительно увеличена в присутствии среды, кондиционированной DPSC (Р <0,01). DPPS-активированные уровни TNF- и IL-1-LPS не влияли на среду с DPSC-кондиционированием. На уровень CD11c не влияли LPS или DPSC-кондиционированные носители. Эти результаты показывают, что предварительная обработка с помощью DPSC-предварительной обработки, сопровождаемая LPS-активацией, не влияет на поляризацию M1, но увеличивает поляризацию макрофагов M2.

Эффекты, связанные с кондиционированной средой (DPSCC) из зубной целлюлозы (DPSCCM) на клеточной линии макрофагов, клетками RAW264.7. (а) Выражения выраженной рибонуклеиновой кислотой недифференцированных клеток RAW264.7 путем предварительной обработки DPSCCM с последующим липополисахаридом (LPS). Спустя 12 ч клетки RAW264.7 заменяли средой без сыворотки и предварительно обрабатывали DPSCCM в течение 1 часа. Клетки инкубировали с LPS в течение 4 ч, экспрессию рибонуклеиновой кислоты в мессенджере фактора некроза опухоли-α (TNF-α, Tnf), интерлейкина (IL) -1β (Il1b), IL-10 (Il10), CD11c (Itgax) и CD206 (Mrc1) исследовали путем количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (n = 4). ** P <0,01. (b) Клетки RAW264.7 предварительно подвергали воздействию 50 нг / мл ЛПС для дифференцировки в макрофаг M1. Через 48 ч добавляли DPSCCM и клетки инкубировали в течение 4 часов. Выражения рибонуклеиновой кислоты посланника изучались в результате количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (n = 6). ** P <0,01. (c) Эффект DPSCCM на пролиферацию / жизнеспособность клеток RAW264.7 оценивали с помощью 3- (4,5) -диметилтиахиазо (-z-y1) -3,5-дифенилтетразолиумногом и анализа количества клеток-8 , После того, как клетки высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 12 ч, клетки инкубировали с DPSCCM в течение 3 дней (n = 6). Результатом являются средние значения ± стандартная ошибка среднего значения. a.u., произвольная единица.

Чтобы исследовать влияние кондиционированных сред DPSC на поляризацию M2 из макрофагов M1, мы добавили среду, кондиционированную DPSC, в предварительно обработанные LPS клетки RAW264.7 в виде M1-подобных макрофагов и оценили изменение выражений фенотипа M2 / M1. Как показано на фиг. 5b, среда, кондиционированная DPSC, значительно увеличивала поляризацию M2 из M1-подобных макрофагов (фиг. 5b).

Эффект DPSC-кондиционированной среды на пролиферацию / жизнеспособность RAW264.7 оценивали с помощью 3- (4,5) -диметилтиахиазо (-z-y1) -3,5-дифенитетразолиумногом и клеточного подсчета Kit-8. Как показано на фиг. 5с, пролиферация / жизнеспособность в клетках RAW264.7 не была улучшена средами с кондиционированием DPSC.

DPSC выражают ангиогенные факторы и нейротрофические факторы, такие как bFGF, VEGF, NGF, NT3 и GDNF (таблица 2). DPSC также экспрессировали маркеры макрофагов M1, такие как TNF-α и IL-1β, и маркер макрофагов M2, IL-10. В частности, DPSC выражали высокий уровень M2-макрофагообразующего фактора M-CSF (1,99 ± 0,42 × 10-1 уровень экспрессии) по сравнению с M1-макрофагом-индуцирующим фактором GM-CSF (1,20 ± 0,57 × 10-7 уровня экспрессии) , Другие факторы, индуцирующие макрофаги M2, такие как IL-4 и IL-13, не были обнаружены в культивированных DPSC, хотя DPSC-экспрессированный IL-10 также является одним из факторов, индуцирующих макрофаг M2.

Выражение выражений цитокинов выраженных в белках выраженных рецепторов в культивируемых стволовых клетках пульпы

Данные средние ± стандартная ошибка среднего. bFGF, основной фактор роста фибробластов; GDNF, нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток; GM-CSF, колониестимулирующий фактор 2; Il, интерлейкин; MCP1, моноцитарный хемоаттрактантный белок-1; M-CSF, колониестимулирующий фактор 1; ND, не обнаружено; NGF, фактор роста нервов; NTF3, нейротрофин-3; Tnf, фактор некроза опухоли; VEGFA, фактор роста эндотелия сосудов.

Настоящее исследование показало, что трансплантация DPSCs в скелетные мышцы задней конечности индуцировала иммуномодулирующее действие на седалищные нервы, что сопровождалось восстановлением от снижения скорости проводимости седалищного нерва, седалищного кровотока нерва и аксонной округлости сурватного нерва в STZ Индуцированных диабетических крыс. Кроме того, исследование in vitro показало, что среды, кондиционированные DPSC, увеличивают экспрессию генов, связанных с M2, в линии клеток с макрофагами, стимулированной LPS, клетками RAW264.7.

Накопленные данные указывают на участие воспалительных процессов в патогенезе диабетической полинейропатии9, 10, 11, 12. Локальное использование природных антагонистов, растворимых рецепторов, блокирующих антител и специфических сигнальных или блокаторов цитокинов может быть перспективным кандидатом на лечение15, 26. Yamagishi et al. .27 показал, что положительные макрофаги ED-1 были увеличены в седалищных нервах через 12 недель после инъекции STZ у крыс, что было подавлено с улучшением скорости проводимости нерва обработкой активированного пролифератором активированного γ-лиганда пероксисом. В настоящем исследовании мы показали, что моноциты / макрофаги и воспалительные генные экспрессии были увеличены в седалищных нервах диабетических крыс, что улучшилось с помощью трансплантации DPSC с увеличением экспрессии макрофагов M2-фенотипа / гена, а также для восстановления нерва скорость проводимости, поток нервного кровотока и морфология аксонов у диабетических крыс. Ши и др. 27 показали, что внутрибрюшная инъекция слитого белка рецептора ФНО-α рецептора II: IgG Fc улучшала скорость проводимости нерва и невропатологические изменения у диабетических крыс15. Эти результаты свидетельствуют о том, что противовоспалительное средство может стать важной мишенью для лечения диабетической полинейропатии.

Макрофаги состоят из двух разных фенотипов, классически активированных макрофагов M1 и альтернативно активированных макрофагов M2. M2 макрофаги показывают низкие уровни провоспалительных цитокинов, но высокий уровень противовоспалительных цитокинов, таких как IL-1028. Трансплантация DPSC в диабетических крыс показала значительное увеличение маркеров макрофагов M2 вместе со значительным уменьшением маркеров макрофагов M1 в седалищных нервах. Мы подтвердили эти эффекты с использованием системы культивирования, в которой среды с кондиционированным DPSC заметно увеличивали уровни CD206 и IL-10 в LPS-стимулированных клетках RAW264.7, что указывает на то, что предварительная обработка с помощью DPSC-предварительной обработки с последующей активацией LPS-активацией M2-поляризации макрофагов , Мы также показали, что среды, кондиционированные DPSC, увеличивают поляризацию M2 в LPS-предварительно обработанных M1-подобных макрофагах. Было показано in vitro, что макрофаги поляризованы в состояние M1 при стимуляции TNF-α, интерфероном-γ или другими бактериальными продуктами и в состоянии M2 при стимуляции IL-4, IL-13 и IL-1029. В частности, IL-10 уменьшал производство провоспалительных цитокинов, что предполагает, что IL-10 может иметь мощные противовоспалительные активности30, 31. GM-CSF и M-CSF также являются цитокинами, которые модулируют поляризацию макрофагов M1 / ​​M232. В настоящем исследовании мы определили, что культивированные DPSC выражают M2-индуцирующие факторы, такие как IL-10 и M-CSF, что указывает на то, что трансплантированные индуцирующие M2-индуцирующие DPSC факторы увеличивают M2-макрофаги. Эти результаты показали, что трансплантация DPSC привела к дифференцировке или рекрутированию макрофагов M2 в воспалительном состоянии диабетических периферических нервов.

Ангиогенные факторы, такие как bFGF и VEGF, могут быть полезны для лечения диабетической полинейропатии33, 34. Стебель / клетки-предшественники могут иметь возможность секретировать bFGF и VEGF, если они трансплантированы для лечения диабетической полинейропатии3, 4, 7, 24
, Мы показали здесь высокие мРНК-выражения VEGF и bFGF с другими цитокинами и нейротрофическими факторами в культивированных DPSC. Показано, что уменьшение нейротрофических факторов играет важную роль в патогенезе диабетической полинейропатии 35, 36, и показано, что лечение NGF оказывает благотворное влияние на структуру и функцию при развитии диабетической нейропатии37. Кроме того, NGF и рецептор NGF в клетках привлекают большое внимание в отношении их влияния на иммунный ответ38, 39. Взятые вместе, секретируемые DPSC ангиогенные и нейротрофические факторы должны были добавить положительные эффекты трансплантации DPSC с его иммуномодулирующими эффектами при диабетическом полинейропатия.

Guimarães et al.40 внутривенно трансплантировали DPSCs у индуцированных STZ диабетических мышей и показали, что трансплантация DPSC улучшает как раннюю диабетическую гипералгезию, так и позднюю диабетическую гипоальгезию. Поскольку они исследовали только термический порог, другие физиологические и патологические эффекты на внутривенную трансплантацию DPSC неизвестны. Поскольку внутривенная трансплантация DPSC уменьшала уровень глюкозы в крови в течение 5 дней после трансплантации, выздоровление от гипергликемии могло бы благотворно сказаться на тепловом пороге. Здесь мы показали, что трансплантация DPSCs в скелетные мышцы задней конечности уменьшала снижение скорости проводимости седалищного нерва, седалищного кровотока нерва и аксонной округлости сурватного нерва у индуцированных STZ диабетических крыс без изменения уровня глюкозы в крови. Различия в терапевтических эффектах трансплантации DPSC при диабетической полинейропатии должны оцениваться в будущем для клинического применения.

В настоящем исследовании мы трансплантировали недавно выделенные и расширенные культурой DPSC и показали увеличение NCV и SNBF у диабетических крыс. Хотя в предыдущих исследованиях уже сообщалось, что различные типы клеточной терапии были действительны для диабетической полинейропатии, важно разработать неинвазивные ресурсы клеточной терапии. Сообщалось также, что даже прародитель или стволовые клетки, взятые у пациентов с диабетом, проявили функциональную депрессию41, 42. DPSC могут быть взяты у молодых людей до начала диабета, поскольку экстракцию третьего моляра или премоляра обычно проводят в молодом возрасте. Мы предлагаем стратегию использования криоконсервированных DPSC для лечения диабетической полинейропатии.

Таким образом, мы впервые показали, что трансплантация DPSC в диабетических крыс обладает противовоспалительной способностью модулировать пропорции макрофагов M1 / ​​M2 в диабетических периферических нервах, что может иметь положительные эффекты в улучшении диабетической полинейропатии. Обильные иммуномодулирующие цитокины, продуцируемые DPSC, могут играть важную роль в противовоспалительном эффекте лечения диабетической полинейропатии.

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рисунок S1 | Связь между числом моноцитов / макрофагов в седалищных нервах и скоростью проводимости моторного нерва.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Рисунок S2 | Двойное окрашивание антителами CD68 и CD206 в седалищных нервах.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

 

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим Брент Белл за чтение рукописи. Это исследование было частично поддержано грантом в области научных исследований (21592506) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT), а частично — «Формирование стратегической разработки AGU-платформы» (2008 г.) -2012) «Проект для частного университета из MEXT.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *