Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Воздействие избыточного инсулина (гларгин) индуцирует сахарный диабет 2 типа у мышей, которым кормили диету чау

Exposure to excess insulin (glargine) induces type 2 diabetes mellitus in mice fed on a chow diet
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4045231/

Ранее мы показали, что инсулин играет важную роль в индуцированной питательными веществами резистентности к инсулину. В этом исследовании мы протестировали гипотезу о том, что хроническое воздействие избыточного инсулина длительного действия (гларгин) может вызвать типичный сахарный диабет 2-го типа (T2DM) у нормальных мышей, которых кормят на диете чау. Мышей C57BL / 6 лечили гларгином один раз в день в течение 8 недель, а затем оценивали потребление пищи, массу тела, уровни глюкозы в крови, инсулин, липиды и цитокины, сигнализацию инсулина, гистологию поджелудочной железы, накопление эктопического жира, окислительный стресс уровня и содержания холестерина в митохондриях в тканях. Также изучалось содержание холестерина в митохондриях и его связь с окислительным стрессом в культивируемых гепатоцитах и ​​β-клетках. Результаты показывают, что хроническое воздействие гларгина вызывает резистентность к инсулину, гиперинсулинемию и относительный дефицит инсулина (T2DM). Лечение избытком гларгина приводило к потере островков поджелудочной железы, накоплению эктопического жира в печени, окислительному стрессу в печени и поджелудочной железе и увеличению содержания холестерина в митохондриях печени и поджелудочной железы. Длительное воздействие культивируемых первичных гепатоцитов и β-клеток HIT-TI5 на индуцированный инсулином окислительный стресс в зависимости от синтеза холестерина. Вместе наши результаты показывают, что хроническое воздействие избыточного инсулина может вызывать типичный T2DM у нормальных мышей, питающихся диетой чау.

Сахарный диабет 2 типа (T2DM) стал основным экономическим и экономическим бременем для индустриализованных обществ. Его негативное воздействие на общее здоровье и экономику все еще быстро растет из-за продолжающейся индустриализации. Совершенно ясно, что корень T2DM в большинстве случаев является избыточным количеством калорий из-за переедания и / или отсутствия физической активности. Однако точный механизм, с помощью которого избыточные калории превращаются в T2DM, остается неустановленным.

T2DM состоит из трех ключевых компонентов: резистентности к инсулину, гиперинсулинемии и относительной недостаточности инсулина. Относительная инсулиновая недостаточность (overt T2DM) обычно возникает через 10 лет после резистентности к инсулину и гиперинсулинемии (Kendall et al., 2009). Другими словами, резистентность к инсулину / гиперинсулинемия является предшественником T2DM. Это по-прежнему очень спорно относительно того, как питательные вещества вызывают резистентность к инсулину / гиперинсулинемии, а затем T2DM. Было показано, что воспаление, эндоплазматический ретикулярный стресс и окислительный стресс, вызванный митохондрием, участвуют в развитии резистентности к инсулину / гиперинсулинемии (Hotamisligil 2010, Samuel et al., 2010, Gregor & Hotamisligil 2011). Наличие этих многочисленных механизмов само по себе свидетельствует о том, что первичный механизм резистентности к инсулину не установлен. Основной причиной или исходным корнем резистентности к инсулину и T2DM является «избыток калорий», который происходит из трех основных диетических компонентов: глюкозы / углеводов, жиров / жирных кислот и белков / аминокислот. Таким образом, мы недавно рассмотрели несколько простых вопросов. Во-первых, сам ли глюкоза вызывает резистентность к инсулину в отсутствие инсулина? Наши результаты показывают, что животные с необработанной гипергликемией при сахарном диабете 1-го типа (T1DM) реагируют на острый вызов инсулином намного лучше, чем диабетические животные, получающие инсулин, что указывает на то, что гипергликемия сама по себе не вызывает резистентность к инсулину, но лечение T1DM инсулином (Liu et al. 2009a
). В отсутствие инсулина высокий уровень глюкозы не вызывает резистентности к инсулину в культивируемых гепатоцитах (Liu et al., 2009a)
). Во-вторых, действительно ли жир вызывает резистентность к инсулину без инсулина? Наши результаты показали, что индукция резистентности к инсулину жирами из диеты с высоким содержанием жиров (HFD) предотвращается, когда секреция инсулина нарушается стрептозотоцином (Ning et al., 2011), предполагая, что сам диетический жир не вызывает резистентность к инсулину без инсулина. В отсутствие инсулина или при подавлении инсулиновой сигнализации свободные жирные кислоты (FFA) не вызывают резистентности к инсулину в культивируемых гепатоцитах (Ning et al., 2011). В-третьих, действительно ли добавление аминокислот обязательно вызывает резистентность к инсулину? Результаты других и нас показывают, что добавление аминокислот, таких как лейцин, к животным, питаемым HFD, повышает чувствительность к инсулину, а не вызывает резистентность к инсулину (Zhang et al., 2007, Guo et al., 2010, Yang et al., 2013). Поэтому сами макронутриенты не вызывают резистентность к инсулину без инсулина. Другими словами, инсулин играет важную роль в превращении питательных веществ в резистентность к инсулину, а затем в T2DM. Ранее мы показали, что притупляющая сигнализация инсулина может фактически предотвратить индуцированную HFD резистентность к инсулину / гиперинсулинемию (Liu et al., 2009b
). Тем не менее, до сих пор неизвестно, может ли постоянное воздействие избыточного экзогенного инсулина, сходное с тем, которое наблюдается у пациентов с резистентностью к инсулину и гиперинсулинемией, может вызвать T2DM у нормальных мышей, которых кормят на диете чау. В этом исследовании мы рассмотрели этот вопрос и обнаружили, что хроническое воздействие избыточного инсулина вызывает резистентность к инсулину, гиперинсулинемию и относительную недостаточность инсулина, то есть T2DM, у мышей, которых кормят на диете чау.

Холестерин, симвастатин и DCF-DA были приобретены у Sigma. Антитела против фосфорилированного Akt или общего Akt, рецептора инсулина, серина636- или тирозин-612-фосфорилированного субстрата рецептора инсулина 1 (IRS1) получали из Cell Signaling Technologies, Inc. (Беверли, Массачусетс, США). Антитела против β-актина, мышиного иммуноглобулина G (IgG) и IgG кроликов были приобретены у Sigma. Набор для анализа красного холестерина был приобретен у Invitrogen. Набор для измерения уровней глутатиона (GSH) и глутатиондисульфида (GSSG) был приобретен у OxisResearch (Фостер-Сити, Калифорния, США).

Мышей C57BL / 6 (B6) (самцов, 6-9-недельных) из реки Чарльз обрабатывали либо физиологическим раствором, либо инсулиновым реагентом с длительным и медленным действием, гларгином (50 ед. / Кг массы тела, sc инъекцией, день), в течение 8 недель. Дозу гларгина определяли в соответствии с нашими предыдущими экспериментами (Liu et al., 2009a
) и трансгенной экспрессии гена человеческого инсулина (32 раза от нормального уровня инсулина) у животных, определенных Marban et al. (1989). Мышей размещали индивидуально при обычной комнатной температуре, позволяли кормить обычную диету чау-чау (Prolab RMH 3000) ad libitum и выдерживали при 12-часовом освещении: 12-часовые циклы темноты. Еженедельные измерения уровня глюкозы в крови проводились через 8 часов с глюкометром (Abbott Diabetes Care, Inc.) с небольшой каплей хвостовой крови. Через 8 ч в конце 8-недельного эксперимента мышам вводили седативный препарат с пентобарбиталом (50 мг / кг массы тела) и убивали с помощью диссекции шейки матки, а митохондрии из печени, икроножной мышцы и поджелудочной железы выделяли, как описано ранее. Митохондриальный холестерин был определен количественно. Все исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованием в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилле и полностью соответствовали указаниям национальных институтов здравоохранения.

HIT-T15 клетки инсулиномы поджелудочной железы хомяка были приобретены у АТСС (Manasas, VA, США) и культивировали в среде F12K, содержащей 10% лошадиной сыворотки, 2,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° С в атмосфере 5% СО2. Клетки HIT-T15 (2 × 104 клеток / лунку) высевали в 96-луночный планшет и предварительно инкубировали в течение 24 ч перед любыми экспериментами.

Триглицерид сыворотки (TG) и FFA измеряли с помощью наборов, приобретенных у Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) (Cat No: 10010303 и 700310). Лептин, адипонектин и фактор некроза опухолей α (TNFα) измеряли наборами, полученными из Abcam (Cambridge, UK) (Cat No: ab100718, ab108785 и ab46105). Эндогенный инсулин и гормон роста были обнаружены с помощью наборов ELISA, приобретенных у Millipore (Billerica, MA, США) (Cat No: EZRMI-13K и EZRMGH-45K).

Мышечные первичные гепатоциты были выделены у самцов B6-мышей (6-9 недель), как мы описали ранее (Cao et al., 2005, Xiong et al., 2006, Collins et al., 2007, Liu et al., 2009c
). Жизнеспособные гепатоциты суспендировали в антибиотиках Williams E (Invitrogen), содержащих антибиотики (50 мкг / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 100 мкг / мл неомицина). Клетки высевали с плотностью 3,5 × 105 клеток на 100 мм чашку Петри (BD Falcon), предварительно покрытую 0,02% коллагеновым типом I.

Уровни пероксидированных липидов косвенно определяли путем измерения уровней малонового диальдегида (MDA), побочного продукта перекисного окисления липидов коммерческим комплексом (Northwest Life Science Specialties, Ванкувер, штат Вашингтон, США), как описано ранее (Aust et al., 1985). Уровень MDA измеряли путем количественной оценки поглощения при 532 нм.

Активность маргинальной супероксиддисмутазы (MnSOD) определяли с использованием коммерчески доступного набора (Cayman Chemical Company) (Papazzo et al., 2011). Вкратце, ксантиноксидазу и гипоксантин использовали для получения супероксидных радикалов, которые затем детектировали солью тетразолия и количественно определяли при 540 нм с помощью микропланшет-ридера (Cell Biolabs, США). Одна единица SOD определялась как количество фермента, необходимое для ингибирования дисмутации супероксидного радикала на 50%. Цианид калия (KCN, 1 мМ)) использовали для ингибирования Cu- и Zn-SOD.

Щиты поджелудочной железы (толщина 5 мм) фиксировали в 10% нейтральном буферированном формалине / жидкости Буина в течение ночи. Все образцы тканей подвергались стандартной обработке и процедурам окрашивания. Введенные парафином участки 5 микрон были окрашены гематоксилином и эозином и исследованы под легким микроскопом (Leitz Diaplan, USA).

Уровни GSH и GSSG в тканевых лизатах определяли с помощью набора, приобретенного у OXIS International, Inc. (Foster City, CA, USA) и нормированного на уровни белка. Измерения GSH и GSSG и расчет отношения GSH: GSSG выполнялись в следующие четыре этапа: i) определение скорости реакции по времени; ii) построение калибровочной кривой; iii) расчет концентраций; и iv) расчет отношения GSH: GSSG как GSH: отношение GSSG = (GSH-2GSSG) / GSSG.

Полные РНК экстрагировали из тканей с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) и обратной транскрибировали в кДНК, которые были количественно определены с помощью ПЦР реального времени TaqMan с конкретными зондами и праймерами и нормированы на уровни m36B4.

Чтобы изолировать митохондрии, образцы тканей собирались быстро. Митохондрии выделяли, как описано ранее (Palmer et al., 1977). Затем ткани лизировали 1 мл ледяного лизирующего буфера путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, инкубировали в течение 10 мин на льду на шейкере и затем осаждали путем центрифугирования (при 1000 г в течение 10 мин). Супернатанты удаляли и гранулы ресуспендировали в 1,5 мл MSE-буфера, содержащем 225 мМ маннита, 75 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA, 5 мМ HEPES, pH 7,4 и 1 мг / мл BSA с последующим центрифугированием при 1000 г в течение 3 мин. Затем супернатанты переносили в чистую пробирку объемом 1,5 мл с последующим центрифугированием при 6000 г в течение 10 мин. Супернатанты удаляли и гранулы, митохондрии, ресуспендировали в 1 мл MSE.

Липиды в изолированных митохондриях экстрагировали изопропанолом. Бесплатный холестерин определяли количественно с использованием набора для анализа красного холестерина Amplex. Между тем уровни белка в одних и тех же образцах измеряли стандартными анализами Bio-Rad.

Белки (30 мкг) денатурировали при 95 ° С в течение 5 мин в загрузочном буфере (60 мМ Трис, 2,5% SDS, 10% глицерина, 5% меркаптоэтанола и 0,01% бромфенолового синего) и подвергали 10% SDS-PAGE. Белки в гелях переносили на мембраны PVDF и блокировали TBS, содержащим 0,05% Tween 20 (TBS-T) и 5% обезжиренного молока в течение 1 часа. После промывания TBS-T мембраны зондировали специфическими первыми антителами против целевых белков (кроликов) или β-актина (мышь) (1: 1000) в течение ночи при 4 ° C. Мембраны затем промывали TBS-T и инкубировали с поликлональными вторичными антителами (1: 5000) в течение 1 часа при комнатной температуре. После трех промывок TBS-T мембраны обрабатывали субстратами ECF (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания, США). Флуоресцентные полосы визуализировались, а затем количественно определяли методом денситометрического анализа с использованием программного обеспечения ImageQuant версии 5.2, полученного от GE Healthcare.

Внутриклеточный реактивный кислород (ROS) был обнаружен с использованием флуоресцентного DCF-DA, как описано ранее (Palmer et al., 1977, D’Alessandro et al., 2011). Короче говоря, не флуоресцентный краситель свободно проникает в клетки, где он деэтерифицируется с образованием ионизированной свободной кислоты (дихлорфлуоресцеин) и реагирует с ROS с образованием флуоресцентного 2 ‘, 7’-дихлорфлуоресцеина (DCF). Клетки промывали три раза PBS и затем загружали 20 мкМ H2DCF-DA в течение 30 мин при 37 ° С. Флуоресценцию DCF анализировали с помощью планшетного ридера (Spectramax Gemini EM, Molecular Devices) на длинах волн возбуждения и излучения 490 и 530 нм соответственно.

Данные представлены как среднее ± s.d. / s.e.m. Данные сравнивались по t-критерию Стьюдента с GraphPad Prism версии 4.0 для Windows (Сан-Диего, Калифорния, США). Различия при значениях P <0,05 считались значимыми.

Во время 8-недельного лечения гларгином еду и вес тела измеряли еженедельно. Как показано на фиг.1А, мыши, обработанные гларгином, потребляли немного больше диеты в первую неделю, а затем, как правило, потребляли немного меньше диеты по сравнению с контрольными мышами, хотя изменения не достигли статистической значимости. Мыши, получавшие гларгин, получали немного большую массу тела, чем контрольные мыши, хотя коэффициент усиления достиг статистического значения только на 7 неделе (рис.1B). Однако процентное содержание жиров эпидидима (белая жировая ткань, WAT) по всему массе тела было значительно увеличено у мышей, получавших гларгин. Лечение гларгином не изменяло уровни лептина, адипонектина, TNFα, TG и FFA в плазме, но повышало уровень холестерина в плазме (таблица 1). Эти результаты вместе демонстрируют, что хроническое воздействие гларгина увеличивает уровень ВАТ и уровень холестерина в крови.

Уровни глюкозы в крови натощак измерялись еженедельно во время эксперимента. Знаки гипогликемии, такие как плохой уход и дрожь, тщательно контролировались, особенно в течение первых 2 дней лечения гларгином. Никаких признаков гипогликемии не было. Как показано на фиг.2А и В, уровень глюкозы в крови натощак у мышей, обработанных гларгином, начал увеличиваться на 1-й неделе и значительно увеличивался (150 мг / дл) на 8 неделе. Уровень натощак плазменного эндогенного инсулина был значительно увеличен при лечении гларгином (Фиг.2С). Следует отметить, что антитела против инсулина, используемые в ELISA, в этом исследовании признавали только обычный инсулин, но не гларгин. Следовательно, обнаруженный здесь инсулин был эндогенным или регулярным инсулином. Кроме того, введение регулярного инсулина во время толерантности к инсулину равномерно увеличивало уровень обычного инсулина на мышах с помощью лечения гларгином или без него (рис.2C). Увеличение уровней как глюкозы крови натощак, так и эндогенного инсулина показало, что хроническое воздействие избыточной инсулинорезистентной резистентности к инсулину у животных, получавших гларгин. Эти результаты вместе демонстрируют, что хроническое воздействие избыточного индуцированного инсулином / гларгином T2DM характеризуется резистентностью к инсулину, гиперинсулинемией и относительной недостаточностью инсулина.

Для определения влияния хронического воздействия избыточного инсулина на чувствительность к инсулину определяли уровни инсулиновых рецепторов, сериновых и тирозиновых фосфорилирования IRS1 и фосфорилирования акта в печени и скелетных мышцах (икроножных конечностей) с использованием метода иммуноблоттинга. Как показано на фиг.3А, уровни инсулинового рецептора и фосфорилирование тирозина IRS1 не были изменены, очевидно, при лечении гларгином как в печени, так и в икроножной мышце. IRS1-серинфосфорилирование было увеличено как в печени, так и в гастронемии, но гораздо более резко в печени, при гларгине. Острая инсулина в течение 15 мин не изменяла сериновые и тирозиновые фосфорилирования IRS1 в печени или икроножной мышце. Однако острая инсулиновая недостаточность повышала фосфорилирование Akt как печени, так и икроножной мышцы у контрольных мышей (фиг.3А и В). Лечение гларгином повышало базальный уровень фосфорилирования акта как в печени, так и в икроножной мышце. Острая проблема с инсулином стимулировала фосфорилирование акта у икроножных мышц, но не в печени мышей, леченных гларгином (рис.3А и В). Эти результаты вместе показывают, что хроническое воздействие избыточного инсулина / гларгина индуцирует резистентность к инсулину в основном в печени.

Чтобы определить влияние хронического воздействия избыточного инсулина (гларгина) на β-клетки поджелудочной железы, осколки поджелудочной железы были исследованы гистологической оценкой. Как показано на фиг.4, как количество, так и размер островков поджелудочной железы резко уменьшались при лечении гларгином. Эти результаты показывают, что хроническое воздействие избыточного инсулина, по-видимому, уменьшает массу островков поджелудочной железы.

Известно, что накопление эктопического жира связано с резистентностью к инсулину, как было рассмотрено ранее (Cao et al., 2011), уровень TG определяли в печени и икроножной мышце. Как показано на фиг.5, содержание ТГ было значительно усилено гларгином в печени, но не в гастронемии. Точно так же лечение гларгином увеличивало экспрессию ключевого липогенного гена, синтазы жирных кислот (Fas), очевидно, в печени, но не в гастронемии (таблица 2). Эффект гларгина на экспрессию генов, участвующих в окислении жиров, по-видимому, различен между печенью и икроножной мышцей. В частности, экспрессия длинноцепочечного ацил-CoA-дегидрогеназы (Acadl) гена была уменьшена при гларгине в мышцах, но не в печени (таблица 2). Эти результаты вместе показывают, что хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) увеличивает накопление эктопического жира в печени.

Известно, что окислительный стресс играет критическую роль в индукции резистентности к инсулину и повреждении тканей, как было рассмотрено ранее (Cao et al., 2011). Таким образом, уровень окислительного стресса изучали в печени, икроножном и поджелудочной железе. Как показано на фиг.6А, отношение GSH: GSSG уменьшалось при лечении гларгином в печени, но не в гастронемии и поджелудочной железе. Активность MnSOD резко возрастала как в печени, так и поджелудочной железе, но не в гастронемии (фиг.6В). Чтобы исследовать механизм, с помощью которого масса островка поджелудочной железы была уменьшена гларгином, был определен уровень окисленных липидов. Как показано на фиг.6C, обработка гларгином значительно повышала уровень окисленных липидов (MDA) в печени и поджелудочной железе, но не в гастронемии. Эти результаты вместе показывают, что хроническое воздействие избыточного инсулина вызывает окислительный стресс в печени и поджелудочной железе.

Для дальнейшего изучения механизмов индуцированной гларгином резистентности к инсулину и уменьшения массы поджелудочной железы было определено количественно содержание холестерина в митохондриях печени, икроножной мышцы и поджелудочной железы. Как показано на фиг.7А, обработка гларгином значительно повышала содержание холестерина в митохондриях в печени и поджелудочной железе, но не в гастронемии. Активность ограничивающего скорость фермента синтеза холестерина, HMG-CoA-редуктазы, была увеличена путем лечения гларгином как в печени, так и поджелудочной железе и неизменной при икроножном кровообращении (фиг.7В).

Чтобы дополнительно исследовать влияние холестерина на индуцированный инсулином окислительный стресс, эффект длительного воздействия инсулина на продукцию ROS и соотношение GSH: GSSG исследовали в культивируемых клетках. Как показано на фиг.8А и В, длительное воздействие инсулина повышало уровень РОС как в гепатоцитах, так и в β-клетках, а увеличение было предотвращено ингибированием синтеза холестерина с симвастатином. Эти результаты вместе демонстрируют, что избыточное воздействие инсулина может индуцировать окислительный стресс как в печени, так и поджелудочной железе в зависимости от синтеза холестерина.

Точный механизм, с помощью которого питательные вещества вызывают T2DM, интенсивно исследован, но остается неустановленным. Недавно мы показали, что инсулин играет важную роль в опосредовании индуцированной питательными веществами резистентности к инсулину, предшественнике T2DM (Liu et al., 2009b
, Cao et al. 2011, Ning et al. 2011). В этом исследовании мы проверили гипотезу о том, что хроническое воздействие избыточного инсулина может вызвать T2DM и сделать несколько новых результатов.

Во-первых, хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) вызывало резистентность к инсулину, гиперинсулинемию и относительную инсулиновую недостаточность (рис.2). Это ключевые особенности T2DM. Давно известно, что введение избыточного количества инсулина людям может вызвать гипергликемию, которая была названа феноменом Сомогьи (Somogyi 1959). Считалось, что гипогликемия, вызванная избытком инсулина, приводит к увеличению секреции глюконеогенных гормонов, таких как гормон роста и повышенный глюконеогенез (Somogyi 1960). Однако в недавних исследованиях не сообщалось о каком-либо гипогликемическом состоянии, когда уровень глюкозы в крови постоянно контролировался в течение 24 часов у субъектов с феноменом Сомогий (Hoi-Hansen et al., 2005). Во время этого исследования мы измеряли уровень глюкозы в крови натощак в неделю и не наблюдали никакого гипогликемического состояния. Тщательный контроль за поведением животных не выявил признаков гипогликемии. Напротив, уровень глюкозы в крови натощак начал увеличиваться на 1-й неделе лечения гларгином. Мы не наблюдали никакого увеличения уровня гормона роста в плазме в этом исследовании (табл. 1). Другие не обнаружили предполагаемых изменений гормонов (Gale et al., 1980). Следовательно, гипергликемия, вызванная хроническим воздействием избыточного инсулина, вряд ли будет вызвана эффектами, индуцируемыми гипогликемией, как было предложено Somogyi. Marban et al. (1989) ранее показали, что гиперинсулинемия (32 раза от нормального уровня инсулина), индуцированная трансгенной сверхэкспрессией гена человеческого инсулина, приводит к сухому фенотипу у мышей с тяжелой резистентностью к инсулину и нормальной гликемией. В этом исследовании уровень глюкозы в крови натощак начал увеличиваться через 1 неделю после воздействия избыточного инсулина. Причина разницы между этим исследованием и исследованием Марбана неясна, но, скорее всего, из-за используемых типов инсулина. В исследовании Марбана регулярный ген человеческого инсулина был сверхэкспрессирован. Регулярный инсулин быстро действует, и избыточное количество его может мгновенно вызвать глобальную инсулиновую резистентность. В противном случае избыточный регулярный инсулин вызывает смертельную гипогликемию. Тяжелая резистентность к инсулину была точно такой же, как и у этих животных. В этом исследовании использовался инсулин медленного и длительного действия. Хотя количество гларгина, используемого в этом исследовании, было большим, оно не вызывало подавляющей гиперинсулинемии и тяжелой глобальной резистентности к инсулину. Вместо этого хроническое воздействие избыточного гларгина приводило к умеренной резистентности к инсулину в основном в печени. Мы считаем, что по сравнению с подавляющей глобальной резистентностью к инсулину, вызванной трансгенной сверхэкспрессией регулярного инсулина, гиперинсулинемия и связанная с ней инсулинорезистентность, индуцированная введением гларгина, имитируют гиперинсулинемию и резистентность к инсулину, вызванные питательными веществами лучше. Кроме того, инсулин у мышей с трансгенной сверхэкспрессией гена инсулина происходит от трансгенной избыточной экспрессии. Таким образом, эти мыши всегда будут давать достаточное количество инсулина для преодоления резистентности к инсулину и не будут развиваться дефицит инсулина (относительный), который вызван потерей панкреатических β-клеток и является необходимым компонентом T2DM. Аналогично, хотя было показано, что инсулинома ассоциирована с T2DM у пациентов с болезненным ожирением (Wildbrett et al., 1999), у субъектов с инсулиномой в основном не развивается типичный T2DM, потому что инсулин выделяется у этих субъектов из опухоли, которая всегда будет продуцировать достаточное количество инсулина для преодоления сопротивления инсулину. Вот почему, в целом, инсулинома редко связана с T2DM (Ishii et al., 1993, Kane et al., 1993, Lei et al., 2007).

Во-вторых, хроническое воздействие избыточного количества инсулина медленного и длительного действия, гларгина, индуцирует умеренную и тканеспецифическую резистентность к инсулину. Нет сомнений в том, что воздействие избыточного инсулина может вызвать глобальную резистентность к инсулину через петлю обратной связи, которая включает тирозинфосфорилированные IRS1 / 2, PI3K, Akt, mTOR, S6K и серинфосфорилированный IRS1 / 2 (Accili 2004). Однако резистентность к инсулину, наблюдаемая в этом исследовании, может быть не такой простой. Во-первых, резистентность к инсулину, вызванная избытком инсулина, наблюдаемая в этом исследовании, наблюдалась главным образом в печени, о чем свидетельствует повышенный уровень серинфосфорилированного IRS1 и отсутствие фосфорилирования Akt в ответ на острую инсулиновую проблему в печени, но не в мышцах (рис.3). Во-вторых, другие ключевые особенности резистентности к инсулину, такие как накопление эктопического жира и окислительный стресс, наблюдались в печени, но не в мышцах (рис. 5 и 6). В-третьих, содержание холестерина в митохондриях было увеличено в печени, но не в мышцах (рис.7), а повышенный митохондриальный холестерин и синтез холестерина, вызванный длительным воздействием инсулина, связаны с повышенным образованием ROS и окислительным стрессом в гепатоцитах (рис.8) , Поэтому представляется, что резистентность к инсулину, вызванная гларгином в этом исследовании, более вероятно вызвана увеличением содержания холестерина в митохондриях.

В-третьих, хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) уменьшает количество и размер островков поджелудочной железы. Overt T2DM встречается только у некоторых пациентов, когда определенное количество островки поджелудочной железы теряется после длительного периода инсулинорезистентности и гиперинсулинемии (Accili 2004). Механизм, который вызывает потерю β-клеток поджелудочной железы у пациентов с T2DM, остается неустановленным, но обычно считается, что он связан с окислительным стрессом (Cao et al., 2011). В этом исследовании как количество, так и размеры островков поджелудочной железы резко уменьшались при хроническом воздействии избыточного инсулина (фиг.4), хотя животные все еще продуцировали в четыре раза больше инсулина, чем контрольные животные (рис.2), что указывает на то, что резерв секреция инсулина, как правило, очень высока, и только небольшая часть ее обычно используется. Результаты этого исследования показывают, что хроническое воздействие индуцированного инсулином окислительного стресса в поджелудочной железе (рис.6). Повышенный окислительный стресс связан с повышенным содержанием холестерина в митохондриях (рис.7). В культивируемых β-клетках повышенное продуцирование ROS и окислительный стресс, вызванные длительным воздействием инсулина, могут быть предотвращены ингибированием синтеза холестерина (фиг.8). Таким образом, потеря островки поджелудочной железы, наблюдаемая в этом исследовании, скорее всего, вызвана окислительным стрессом. Эти результаты имеют важные последствия для понимания того, почему пациенты T2DM постепенно становятся зависимыми от инсулина после использования инсулина. В настоящее время считается, что они становятся более устойчивыми к инсулину и поэтому нуждаются в большем количестве инсулина для контроля уровня глюкозы в крови после использования инсулина. Однако, основываясь на наших выводах в этом исследовании, вполне возможно, что те пациенты могут быстрее потерять островки поджелудочной железы после использования инсулина, особенно тех, кто использует относительно большое количество реагентов инсулина длительного действия.

Наши результаты в этом исследовании имеют большой уровень важности, поскольку в настоящее время широко используются различные инсулиновые реагенты, включая реагенты для инсулина длительного действия, в настоящее время широко используются у пациентов с T2DM. Теоретически невозможно правильно использовать инсулин, если инсулиновые реагенты вводят только пациентам, потому что уровень инсулина идет вверх и вниз линейным образом после инъекции вместо пульсирующего способа, обычно происходящего у людей. Известно, что потеря пульсирующей секреции инсулина вызывает резистентность к инсулину (Shanik et al., 2008). Другими словами, применение реагентов инсулина с помощью инъекций в качестве общей практики у пациентов с T2DM в настоящее время связано с усугублением резистентности к инсулину в T2DM и увеличивает использование инсулина, что приводит к хроническому воздействию избыточного инсулина. Воздействие избыточного инсулина может не только усугубить резистентность к инсулину и привести к потере эндогенных островков поджелудочной железы, как это наблюдается в этом исследовании, но и привести к многим другим тяжелым последствиям. Например, во многих исследованиях показано, что агрессивный контроль уровня глюкозы в крови с помощью инсулиновых реактивов или стимуляторов секреции инсулина, таких как сульфонилмочевины, связан с увеличением смертности вследствие различных сердечно-сосудистых расстройств или рака (Eurich et al., 2007, Anselmino et al., 2008, Currie et al., 2009, Baur et al., 2011, Buchs & Silverman 2011, La Vecchia 2011, Lebovitz 2011, Nandish et al., 2011, Sehra et al., 2011, Currie & Johnson 2012). Таким образом, существующая практика использования инсулиновых реагентов у пациентов с T2DM требует более осторожных и более тщательных и долгосрочных оценок.

X Y и S M проводили эксперименты вместе и в равной степени способствовали этому исследованию. H G и H G проводили некоторые оценки, включая иммуноблоттинги. L Z, J C и X L помогали писать и корректировать рукопись. Z L предоставил рекомендации для планирования и проведения экспериментов. W C контролировал все эксперименты и писал рукопись. Д-р W C является гарантом этой работы, имеет полный доступ к данным и несет полную ответственность за целостность данных и точность анализа данных.

(X Yang и S Mei внесли одинаковый вклад в эту работу)

Авторы заявляют, что нет конфликта интересов, который можно было бы воспринимать как предвзятое отношение к беспристрастности данных исследований.

Эта работа была поддержана Американской диабетической ассоциацией (7-09-BS-27 и 1-14-BS-026) (до WC), Национальными институтами здравоохранения (R01DK076039) (до WC) и Национальным научным фондом Китая (№: 30800907) (к XY).

Хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) увеличивает отношение белого жира к массе тела, не изменяя при этом потребление пищи и массу тела. Мышей C57CL / 6 (B6) ежедневно обрабатывали либо гларгином, либо физиологическим раствором в течение 8 недель. Потребление пищи (А) и массу тела (В) измеряли еженедельно. Жировая ткань эпидидимида была собрана в конце эксперимента. (C) Было рассчитано соотношение жирового отложения жиров к массе тела. Результаты представляют среднее ± s.d. от шести до восьми мышей / группы. ** P <0,01 против контроля.

Хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) индуцирует T2DM у нормальных мышей, питающихся диетами чау. Через 8 часов измеряли уровень глюкозы в крови (А и В) и сывороточный инсулин (С) мышей, описанных на фиг.1. Некоторых животных обрабатывали обычным человеческим инсулином в течение 15 мин (0,75 ед. / Кг массы тела, внутрибрюшинно) через 8 ч после последующего измерения сывороточного инсулина. Результаты представляют среднее ± s.d. от шести до восьми животных / группы. * P <0,05 против контроля. ** P <0,01 против контроля.

Хроническое воздействие инсулина (гларгин) индуцирует специфическую для тканей резистентность к инсулину у нормальных мышей, которых кормят на диете чау. Через 8 ч некоторые мыши, описанные на фиг.1, как указано, обрабатывали обычным человеческим инсулином (0,75 ед. / Кг массы тела, внутрибрюшинно) в течение 15 мин с последующим измерением уровней инсулинового рецептора, фосфорилированием IRS1 серина, фосфорилированием IRS1 тирозина , Фосфорилирование Akt, общее Akt и β-актин с использованием метода иммуноблоттинга с конкретными антителами. Актовое фосфорилирование определяли количественно и представляли как среднее ± s.d. из трех животных. * P <0,05 против отсутствия острой обработки инсулином в контроле. Δ P <0,05 против острой обработки инсулином у животных, получавших гларгин.

Хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) приводит к потере островков поджелудочной железы у животных, которых кормят диету в чау. Поджелудочную железу мышей, описанную на фиг.1, собирали из пяти мышей на группу, фиксировали, секционировали, окрашивали гематоксилином и эозином и визуализировали с помощью микроскопии (А). Были представлены типичные виды. Размер и количество островков были количественно определены и проанализированы (B). Результаты представляют среднее ± s.d. от шести до восьми мышей на группу. * P <0,05 против контроля. ** P <0,01 против контроля. Полноцветная версия этого рисунка доступна через http://dx.doi.org/10.1530/JOE-14-0117.

Хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) приводит к накоплению эктопического жира в печени у мышей, кормящих диету чау. Содержание триглицеридов (ТГ) в печени (А) и мышцах (В) мышей, описанных на фиг.1, исследовали, как описано в «Материалах и методах». Результаты представляют среднее ± s.d. от шести до восьми мышей на группу. * P <0,05 против контроля.

Хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) приводит к окислительному стрессу в печени и поджелудочной железе у мышей, кормящих диету чау. GSH: отношение GSSG (A), активность MnSOD (B) и малоносный альдегид (MDA) (C) в печени, поджелудочной железе и икроножной мышце мышей, описанных на фиг.1, были измерены и нормированы на уровни белка тех же образцов, которые подробно описаны в ‘Материалы и методы’. Результаты представляют среднее ± s.d. из шести животных на группу. * P <0,05 против контроля. ** P <0,01 против контроля.

Хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) приводит к увеличению содержания холестерина в митохондриях печени и поджелудочной железы у мышей, кормящих диету в чау. Митохондрии были недавно выделены из печени, поджелудочной железы и икроножной мышцы мышей, описанных на рисунке 1. Уровни митохондриального холестерина (А) и HMG-CoA-редуктазы (HMG-CoA-R) (B) в отмеченных тканях были измерены как детализированные в «Материалы и методы». Результаты представляют среднее ± s.d. из шести животных на группу. * P <0,05 против контроля. ** P <0,01 против контроля.

Хроническое воздействие избыточного инсулина (гларгин) приводит к окислительному стрессу в культивируемых гепатоцитах и ​​β-клетках в зависимости от синтеза холестерина. Первичные мышиные гепатоциты (A) и HIT-T15 β-клетки (B) обрабатывали инсулином (5 нМ) в присутствии или в отсутствие симвастатина (10 мкМ) в течение 24 часов с последующими измерениями ROS, как описано в разделе «Материалы и методы ». Результаты представляют собой среднее значение ± с. трех независимых экспериментов. ** P <0,01 против инсулина. # P <0,05 против инсулина. ## P <0,01 против инсулина.

Уровни сыворотки цитокинов, гормонов и липидов. Результаты представляют среднее ± s.d. от шести до восьми мышей

По сравнению с контрольной группой * P <0,05.

Уровни мРНК генов, участвующих в липогенезе и окислении жира. Результаты представляют среднее ± s.d. от шести до восьми мышей

По сравнению с контрольной группой * P <0,05; † P <0,01.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *