Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Обновление на животных моделях диабетической ретинопатии: от молекулярных подходов к мышам и высшим млекопитающим

Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3380708/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу

Диабетическая ретинопатия (DR) является наиболее распространенным микрососудистым осложнением диабета и одной из основных причин слепоты во всем мире. Патогенез ДР был исследован с использованием нескольких моделей диабета на животных. Эти модели были созданы путем фармакологической индукции, питания диеты галактозы и спонтанно путем селективного инбридинга или генетической модификации. Среди доступных моделей животных грызуны были изучены наиболее широко из-за их короткого времени генерации и унаследованной гипергликемии и / или ожирения, которые влияют на определенные штаммы. В частности, мыши оказались полезными для изучения DR и оценки новых методов лечения из-за их способности к генетической манипуляции. Модели мышей, подходящие для репликации ранних непролиферативных стадий ретинопатии, были охарактеризованы, но ни одна модель животных пока не обнаружила, чтобы продемонстрировать все сосудистые и нейронные осложнения, которые связаны с продвинутыми, пролиферативными стадиями DR, которые происходят в люди. В этом обзоре мы обобщаем часто используемые модели животных DR и кратко описываем методы визуализации in vivo, используемые для характеристики DR в этих моделях. Благодаря освещению глазных патологических находок, клинических последствий, преимуществ и недостатков этих моделей мы предоставляем важную информацию для планирования экспериментальных исследований ДР, которые приведут к новым стратегиям профилактики и лечения.

Диабетическая ретинопатия (DR), основное осложнение сахарного диабета, является одной из ведущих причин слепоты во всем мире. Ранняя диагностика и профилактика ретинопатии у лиц с диабетом имеет решающее значение для предотвращения потери зрения. Длительная гипергликемия вызывает необратимые патологические изменения в сетчатке, что приводит к пролиферативной DR с реваскулярной неоваскуляризацией и диабетическим отеком макулы (DME) у некоторых людей (Mohamed et al., 2007; Cheung et al., 2010).

Лечение ДР может быть достигнуто только за счет более глубокого понимания патогенеза болезни; однако, поскольку большинство структурных, функциональных и биохимических исследований не могут проводиться у людей, модели животных необходимы для изучения патологии DR и, следовательно, для разработки новых и лучших методов лечения.

DR широко рассматривается как микрососудистое осложнение диабета. Клинически DR можно разделить на нераспространенные DR (NPDR) и пролиферативные DR (PDR) (Cheung et al., 2010). NPDR характеризуется офтальмоскопически наличием микроаневризмов и точечных и блоттинговых кровоизлияний (рис.1А). НПДР также подразделяется на прогрессивные этапы: умеренный, умеренный и тяжелый. Тяжелый NPDR (также называемый препролиферативным DR) показывает повышенное микрососудистое повреждение сетчатки, о чем свидетельствуют пятна ваты, венозные бисероплетения, венозные петли и микрорезистентные аномалии внутричерестии (IRMA). Капиллярная неперфузия и дегенерация сетчатки могут быть обнаружены у лиц с диабетом после внутрисосудистой инъекции флуоресцеина. При отсутствии лечения PDR (характеризующийся аномальной неоваскуляризацией сетчатки) может развиться (рис.1B). Клинически важным результатом PDR является ретинальное и стекловидное кровоизлияние и отслоение сетчатки сетчатки (Cheung et al., 2010).

DME может происходить на любой стадии (то есть вместе с NPDR или PDR), и теперь это самая распространенная причина потери зрения из-за DR (Cheung et al., 2010).

Диабет затрагивает более 300 миллионов человек во всем мире, и ожидается, что к 2030 году приблизится к 500 миллионам (Международная федерация диабета, 2011). Исследования показали, что почти у всех людей с диабетом 1 типа [также известный как инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM)] и более 60% людей с диабетом типа 2 (неинсулинозависимый сахарный диабет) имеют определенную степень ретинопатии после 20 лет. Текущие исследования, основанные на популяции, показывают, что около трети диабетической популяции имеют признаки ДР и примерно одна десятая имеют зрение, угрожающее стадиям ретинопатии, включая PDR и DME (Wong et al., 2006; Wong et al., 2008; Wang et al., 2009; Zhang et al., 2010).

Клинические особенности DR. Фотографии Фундуса пациентов, показывающие (A) раннюю непролиферативную диабетическую ретинопатию (NPDR) и (B) пролиферативную диабетическую ретинопатию (PDR).

Люди с диабетом в 25 раз чаще становятся слепыми, чем недиабетические. Фактически, сообщения показали, что 50% диабетиков станут слепыми в течение 5 лет после диагностики PDR, если их не лечить (Ciulla, 2004; Klein, 2008; Wong et al., 2009). Число людей с ДР быстро растет из-за резкого повышения распространенности диабета типа 2, что отражает увеличение распространенности ожирения и метаболического синдрома, наблюдавшихся в последние годы (Cheung et al., 2010; Raman et al., 2010) ,

Три основных фактора риска для ДР продлеваются (1) диабет, (2) гипергликемия и (3) гипертония, которые, как было показано, последовательно связаны с ДР в эпидемиологических исследованиях и клинических испытаниях (Wong et al., 2006; Wong et al., 2008; Wang et al., 2009; Cheung et al., 2010; Grosso et al., 2011). Дислипидемия и индекс массы тела могут также быть факторами риска для ДР, но ассоциации не были такими же последовательными (Lim and Wong, 2011; Benarous et al., 2011; Dirani et al., 2011; Sasongko et al., 2011). Новые данные подтверждают генетический компонент для DR, но специфические гены, связанные с этим заболеванием, не были четко идентифицированы, несмотря на крупные исследования (Liew et al., 2006; Abhary et al., 2009; Sobrin et al., 2011). До сих пор трудно предсказать, какие диабетические индивидуумы будут развиваться с НПДР до ПДР.

Патогенез развития DR очень сложный из-за участия нескольких взаимосвязанных механизмов, приводящих к повреждению клеток и адаптивным изменениям сетчатки (Frank, 2004). Следовательно, основная причина (ы) DR не была полностью выяснена, несмотря на годы клинических и лабораторных исследований. В прошлом ретинопатия характеризовалась в основном ее микрососудистыми аномалиями, включая дисфункцию эндотелиальных клеток, утечку сосудов и окклюзию сосудов и дегенерацию (Curtis et al., 2009). Однако недавние данные свидетельствуют о том, что осложнения диабета сетчатки являются составной частью функциональных и структурных изменений как в микрососудистых, так и в нейрогенных отделениях (Antonetti et al., 2006; Curtis et al., 2009; Villarroel et al., 2010; Barber et al., 2011). Точные механизмы, с помощью которых гипергликемия инициирует сосудистые или нейронные изменения в ретинопатии, не были полностью определены (Curtis et al., 2009; Villarroel et al., 2010). Предполагается, что повреждение клеток сетчатки вызвано несколькими механизмами, включая повышенный поток через полиольный путь, производство конечных конечных продуктов гликирования (AGE), повышенный окислительный стресс и активацию пути протеинкиназы C (PKC), но многие из этих гипотез еще не подтверждены в исследованиях человека или клинических испытаниях (Frank, 2004; Cheung et al., 2010).

DR также имеет сходство с хроническими воспалительными заболеваниями: он вызывает повышенную сосудистую проницаемость, отек, воспалительную клеточную инфильтрацию, разрушение тканей, неоваскуляризацию и экспрессию провоспалительных цитокинов и хемокинов в сетчатке. Повышенная экспрессия вазоактивных факторов и цитокинов, вероятно, играет важную роль в опосредовании структурных и функциональных изменений сетчатки (Khan and Chakrabarti, 2007; Wirostko et al., 2008). Недавние исследования убедительно свидетельствуют о том, что воспаление также важно в патогенезе ранних стадий экспериментального DR (Kern, 2007; Liou, 2010; Tang and Kern, 2011), хотя исследования на людях не нашли последовательной связи между системными маркерами воспаления и ретинопатия (Nguyen et al., 2009; Lim et al., 2010). Таким образом, остается неясным, играет ли воспаление также важную роль в развитии и прогрессировании ДР у людей. Некоторые из основных путей и факторов, участвующих в патогенезе DR, показаны на фиг.2.

В настоящее время доступными лечениями на продвинутых стадиях DR, включая PDR и DME, являются лазерная фотокоагуляция, хирургическая витрэктомия или внутриглазные инъекции стероидов и ингибиторы роста эндотелия сосудов (VEGF). Хотя у этих методов лечения были высокие показатели успеха, они не полезны для ранних стадий ДР и не полностью устраняют риск слепоты (Cheung et al., 2010). Лазерная терапия по своей сути разрушительна, с неизбежными побочными эффектами и неэффективна в обращении потери зрения. Новые подходы, связанные с анти-VEGF-терапией, также имеют потенциальные окулярные и системные риски (Cheung et al., 2010; Truong et al., 2011). Таким образом, необходимы новые стратегии лечения, которые являются профилактическими и / или могут обеспечить вмешательство ранее в диабете, чтобы задержать или предотвратить прогрессирование раннего НПДР.

В этой связи крайне важно более полно установить основополагающие механизмы и причины для ДР. Исследования показывают, что многофакторные подходы, влияющие на уровень гемодинамики, метаболизма и цитокинов, задерживают развитие ДР. Однако основной фундаментальный механизм (ы) гипергликемического воздействия или регуляции сосудов сетчатки не полностью понят. Несмотря на большое количество экспериментальных исследований по этиологии и лечению ДР в различных лабораториях, некоторые из важных вопросов, которые остаются без ответа, следующие: (1) механизмы, которые связывают нарушение нервной системы при раннем диабете с развитием сосудистых аномалий сетчатки; (2) потенциальная роль воспаления при индуцированной диабетом нейродегенерации сетчатки; (3) конкретные слои сетчатки, которые уязвимы к метаболическому дисбалансу в DR; и (4) генетическая основа ДР.

Дальнейшие исследования с использованием соответствующих моделей на животных необходимы для ответа на некоторые из этих вопросов, что послужит основой для новых подходов к лечению, которые предотвращают или задерживают начало ДР.

Блок-схема, показывающая основные ключевые факторы, участвующие в патогенезе ДР, и клинические симптомы, проявляющиеся на разных стадиях ДР. DR — многофакторное заболевание, включающее несколько патологических механизмов, включая повышенный окислительный стресс, воспаление, полиолиновый путь, приводящий к накоплению сорбита, производство продвинутых конечных продуктов гликирования (AGE) и активацию пути протеинкиназы C (PKC). Эти пути могут, в свою очередь, активировать производство цитокинов и многих вазоактивных факторов, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор пигментного эпителия (PEDF), которые жизненно важны для опосредования структурных и функциональных изменений DR. Клинически значимый диабетический макулярный отек (DME) может возникать на поздних стадиях DR с непролиферативной или пролиферативной ретинопатией и является наиболее распространенной причиной потери зрения.

В течение последних двух десятилетий были проведены обширные исследования с использованием диабетиков на животных. На сегодняшний день несколько видов, включая мышей, крыс, кошек, собак, свиней и нечеловеческих приматов, использовались в качестве моделей для предоставления ценной информации о клеточных и молекулярных аспектах патогенеза DR. Диабет у животных обычно индуцируется химическими веществами, такими как аллоксан или стрептозотоцин (STZ), хирургической панкреатетомией или спонтанно путем селективного размножения или генетической манипуляции. В большинстве экспериментальных исследований DR на сегодняшний день использовались модели животных диабета типа 1 (Cheta, 1998; Kern, 2009; Zheng and Kern, 2010). В последнее время многие трансгенные и нокаутные мышиные модели также были разработаны для изучения молекулярных путей, участвующих в патологии DR. В следующих разделах мы рассмотрим имеющиеся в настоящее время модели животных DR, начиная с описания различных методов, используемых для характеристики in vivo. Затем мы кратко обсудим исследования DR, проведенные с использованием каждой модели, прокомментируем их вклад в исследование патогенеза DR и выделим их преимущества и недостатки. Ретинальные поражения ДР, наблюдаемые на малых и более высоких моделях животных, суммированы в таблицах 1 и 2 соответственно.

Использование соответствующих методов визуализации для анализа моделей животных DR человека необходимо для экспериментального изучения и характеристики болезни. Глаза, собранные при вскрытии, могут быть подвергнуты чувствительным гистологическим методам (таким как переваривание трипсина) для детального изучения сосудистой сети сетчатки. Кроме того, для изучения экспрессии различных генов и белков в глазах могут быть проведены различные молекулярные и биохимические методы (такие как количественная ПЦР, микрочипы, вестерн-блоттинг, а также анализ белков, ферментов и цитокинов). В то время как животные живы, сосудистые и внесосудистые изменения DR (Cunha-Vaz, 2007) могут контролироваться одним и тем же животным с течением времени с использованием различных методов, включая электрофизиологическое тестирование, флюорографию (FP), флюоресцеиновую ангиографию (FFA) ) и оптической когерентной томографии (ОКТ); эти методы кратко обсуждаются ниже.

Электрофизиологические тесты функции сетчатки являются наиболее часто используемым неинвазивным методом для изучения зрительной функции на животных моделях. Эти тесты включают электроретинографию (ERG), модель ERG (PERG), многофокальную ERG (mfERG) и визуально вызванный потенциал. Исследования с использованием ERG выявили функциональные аномалии до появления сосудистых изменений в глазах диабетических крыс (Kohzaki et al., 2008). Изменения в электрических ответах сетчатки, которые возникают из нервной сетчатки, являются одним из ранних проявлений ДР. Исследования ERG на диабетических животных показали уменьшение амплитуды a- и b-волны (Li et al., 2002) и длительное неявное время в колебательных потенциалах (OPs) (Hancock and Kraft, 2004).

Фотографии сосудистой сети сетчатки, полученные с помощью FP, обеспечивают относительно нечувствительный инструмент для контроля прогрессирования DR, но являются достаточными для предоставления важной информации о тяжести ретинопатии у пациентов, включая изменения калибра судна, набухание сосудов, аномальный новый рост сосудов на поверхности сетчатки и извилистость. FFA, который контролирует поток флуоресцентного красителя через сосудистую сеть сетчатки, полезен для демонстрации сосудистых аномалий, неперфузии и сосудистой утечки. Ни FP, ни FFA широко не использовались в исследованиях на животных, из-за быстрого развития катаракты у многих видов и того факта, что глаза мелких животных — маленькие, сильно изогнутые глобусы, которые препятствуют лучу лучей фокусироваться на сетчатке. Кроме того, FFA не может быть легко использован у животных-альбиносов или в непигментированных частях сетчатки у животных, имеющих тапетум (собаки, кошки) (Hawes et al., 1999). На фиг.3 показано сравнение FFA, проведенного как у B6 дикого типа (пигментированных), так и у Balb / c albino (непигментированных) мышей.

Поражения сетчатки, представленные на небольших животных моделях DR

Ретинальные поражения DR сообщаются на более высоких моделях животных DR

Измерение толщины сетчатки использовалось как показатель прогрессирующей патологии нервной сетчатки на моделях дегенерации сетчатки животных, но степень дегенерации, которая возникает у диабетических животных, значительно меньше, чем в моделях дегенерации сетчатки, и ее трудно измерить воспроизводимо. Высокое разрешение OCT измеряет толщину сетчатки неинвазивно у грызунов (как у людей), а последние машины могут создавать изображения с некоторыми особенностями гистологии сетчатки. Исследования также показали, что потеря ERG-амплификации сильно коррелирует с истончением сетчатки, как измерено OCT (Li et al., 2001; Fischer et al., 2009). Аналогичным образом, снижение толщины сетчатки было продемонстрировано у диабетических мышей с использованием OCT (Rakoczy et al., 2010). Сетчатка сетчатки была обнаружена у OCT у обезьян (Sakurai et al., 2009) и собак (Panzan et al., 2004) и, используя магнитно-резонансную томографию, также у диабетических крыс (Berkowitz et al., 2007). Детальная валидация структурных и функциональных поражений DR у мышей доступна в обзоре Kern et al. (Kern et al., 2010a).

Человеческие эпидемиологические исследования показали, что измерение сосудистого калибра сетчатки на фотографиях может служить ключом к ранним патологическим процессам при диабете, диабете и DR (Nguyen et al., 2007; Nguyen et al., 2008; Rogers et al., 2008; Вонг, 2011). Таким образом, понимание изменений калибровки сосудов сетчатки на животных моделях DR могло бы потенциально помочь охарактеризовать структуру и патологию микроциркуляции и изучить ее связь с системными сосудистыми заболеваниями при диабете. В настоящее время нет общепринятых методов изучения изменений калибровки сосудов сетчатки в моделях животных. В последнее время появилась полуавтоматическая компьютерная количественная программа для измерения сосудистого калибра сетчатки из фотографий сетчатки грызунов, что идентично программе, используемой в крупных эпидемиологических исследованиях как диабетических, так и недиабетических популяций человека (фиг.4А, Б). Это новое программное обеспечение для визуализации измеряет тонкие изменения калибровки сосудов сетчатки у грызунов (рис. 4C, D), которые могут быть маркерами ранней микрососудистой дисфункции при диабете. Такие разработки откроют двери для передовых количественных оценок на животных моделях, что может существенно способствовать лучшему пониманию патогенеза и предсказания ДР.

Изображения флюоресцеиновой ангиографии Fundus (FFA) показывают сравнение между нормальными B6 (пигментированными) и швейцарскими альбиносодержащими (непигментированными) мышами. Нормальный (A) B6 (пигментированный) и (B) мышей швейцарских альбиносов (непигментированных). FFA не может использоваться у мышей-альбиносов из-за отсутствия пигмента, который вызывает сильные блики.

Различные модели грызунов были использованы для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза DR. Эти модели просты в обращении, относительно недороги, имеют короткие репродуктивные циклы и имеют аналогичный генетический фон для людей, надеясь, что экспериментальные результаты будут экстраполированы. Модели грызунов DR варьируются в зависимости от вида (преимущественно крысы или мыши), штамма, метода диабетической индукции и продолжительности диабета. Передовые методы генетической манипуляции, такие как тканеспецифическая трансгенная экспрессия и нацеливание на нокаут генов, увеличили относительную важность моделей мыши для экспериментов, которые специально требуют генно-инженерных моделей. Таким образом, эти животные представляют собой замечательную платформу для исследования патогенеза по крайней мере на ранних стадиях ретинопатии, поскольку теперь возможны генетические изменения выбранных метаболических и патофизиологических механизмов.

Однако серьезная критика использования грызунов для моделирования DR заключается в том, что они не могут точно отражать состояние человека, особенно в отношении степени патологии. Модели грызунов воспроизводят большинство аспектов ранних стадий ДР, но не были найдены для воспроизводимого развития поздней неоваскулярной стадии заболевания, вероятно, из-за короткого срока службы животных и, следовательно, более короткой продолжительности диабета.

Измерение сосудистого калибра сетчатки. Измерение калибровки сосуда сетчатки у человека (A, B) и мыши (C, D) с формированием изображения в основании, используя полуавтоматизированную компьютерную количественную программу (SIVA). Белая стрелка указывает на артерию, черная стрелка указывает на жилу, а звездочка (*) показывает головку зрительного нерва.

Диабет может быть вызван у животных с использованием STZ или аллоксана, которые разрушают β-клетки поджелудочной железы и тем самым индуцируют диабет 1 типа. Грызуны, которые были сделаны диабетиком таким образом, были изучены на срок до 24 месяцев в гипергликемическом, но здоровом состоянии, предоставляя им небольшое количество инсулина каждые несколько дней. Этот подход воспроизводит ранние симптомы ДР, такие как потеря перицитов сетчатки и капилляров, утолщение сосудистой базальной мембраны (ВМ), окклюзия сосудов и повышенная сосудистая проницаемость (Kern and Mohr, 2007; Kern, 2009; Zheng and Kern, 2010) , Физиологические и биохимические изменения сетчатки начинают появляться через 1-2 месяца после начала гипергликемии у индуцированных STZ диабетических крыс. Перед развитием изменений в сосудистых клетках наблюдаются диабетические невоенные изменения (нейрональные и глиальные) и могут способствовать патологии сосудистого заболевания в этой модели (Barber et al., 1998; Zeng et al., 2001; Kohzaki et al., 2008). Тем не менее, имеются изменения в биохимии сетчатки и гистопатологическом ответе на диабет между видами, а также в пределах одного и того же вида. Фактически в недавнем докладе изучались различия в скорости, с которой ранние стадии развития DR развивались у трех разных штаммов крыс (Sprague Dawley, Lewis и Wistar) с диабетом, вызванным STZ. После 8 месяцев диабета крысы Льюиса показали наиболее ускоренную потерю капилляров сетчатки и ганглиозных клеток сетчатки (RGCs), тогда как крысы Wistar показали дегенерацию капилляров без значительной нейродегенерации, а крысы Sprague Dawley не показали повреждений в этот момент времени (Kern et al. ., 2010b).

STZ-индуцированные мышиные модели часто не использовались для исследований DR в прошлом, потому что было труднее индуцировать диабет у мышей, чем у крыс, и было трудно удержать крошечных животных в живых после диабета. Эти проблемы были преодолены совсем недавно. STZ-индуцированные диабетические мыши B6 продемонстрировали ацеллюлярные капилляры, апоптоз сосудистых клеток и перицитарных призраков в сетчатке, отличительный признак ранних характеристик DR (Feit-Leichman et al., 2005), через ~ 6 месяцев после начала диабета. Расширенные пролиферативные изменения сетчатки не развивались у этих мышей в течение продолжительности исследования (18 месяцев диабета). Являются ли мыши причиной потери RGCs противоречивыми. Через 10-14 недель после лечения STZ эти мыши продемонстрировали потерю RGCs и значительное истончение внутреннего и наружного слоев сетчатки (Martin et al., 2004; Barber et al., 2005). Другие исследования, однако, не обнаружили признаков потери RGC у диабетических мышей (Asnaghi et al., 2003; Feit-Leichman et al., 2005; Gastinger et al., 2006). Эти диабетические модели в основном используются для демонстрации ранних изменений DR. Изучение передовых пролиферативных изменений сетчатки не может быть проведено в этих моделях, поскольку они погибают до того, как PDR может быть обнаружена.

В последнее время влияние отдельных генов на развитие DR оценивали путем индукции диабета с STZ у трансгенных или генов-нокаутных мышей. Например, Li et al. исследовали патогенную роль дисфункции эндотелиальной оксида синтазы (eNOS) в развитии DR путем индуцирования диабета с использованием STZ у мышей eNOS — / -) (eNOS — / -) (Li et al., 2010). В сетчатке сосудистая сеть мышей eNOS — / — развивается нормально и связана с увеличением сосудистой активности нейронов NOS, которая компенсирует дефицит eNOS в сетчатке. STZ-индуцированный диабет у этих мышей показал ускоренные осложнения сетчатки DR по сравнению с возрастными подобными STZ-индуцированными диабетическими B6 дикими типами мышей. Сложные осложнения сетчатки включали повышенную утечку сосудов, глиоз, качели и капилляры сетчатки сетчатки. Дальнейшие исследования с использованием этой модели будут полезны для исследования клеточных и молекулярных механизмов ДР, включая глиотические реакции в сетчаточных клетках Мюллера.

Zucker diabetic fatty (ZDF) — это генетические модели диабета типа 2 (неинсулинзависимый) и становятся гипергликемическими в возрасте 6-7 недель. Эти крысы обычно умирают в возрасте ~ 1 года, но могут поддерживаться без лечения, если они дополняются глюкозой более 500 мг / дл. Исследования продемонстрировали потерю перицита, более толстый капиллярный рак сетчатки и увеличенное количество эндотелиальных межклеточных соединений и очаговых конкреций у крыс ZDF. Считается, что эта модель полезна для исследований фармакологических вмешательств, потому что она является естественным и тяжелым диабетом типа 2, что свидетельствует о количественных изменениях сосудистых изменений сетчатки. Кроме того, однополые однопометники могут использоваться в качестве контроля (Danis and Yang, 1993; Ottlecz et al., 1993; Yang et al., 2000).

Крыса WBN / Kob также является спонтанным диабетом типа 2, в котором гипергликемия происходит в возрасте 9 месяцев. В этой модели сообщается об утолщенном капиллярном BM и качеллярном капилляре в сетчатке (Miyamura and Amemiya, 1998; Matsuura et al., 1999). Пролиферативные изменения были зарегистрированы в доретинальной стекловидности этих крыс, что выявило ангиопатию внутри ретиналя, сопровождаемую вновь образованными сосудами, и значительную гиалинизацию сосудов внутри сетчатки (Tsuji et al., 2009). Следовательно, это может быть полезно как животная модель для прогрессивного DR, но неоваскуляризация не подтверждена. Микроаневризмы, ранний клинический признак NPDR человека и артериовенозные шунты, которые связаны с тяжелыми стадиями человеческого NPDR, не наблюдались в этой модели (Bhutto et al., 1999).

Крысы Otsuka Long-Evans Tokushima fatty (OLETF) спонтанно развивают диабет типа 2 с тяжелым ожирением. Ультраструктурные изменения сетчатки, наблюдаемые у крыс OLETF, аналогичны наблюдаемым у диабетиков (Miyamura et al., 1999; Lu et al., 2003), но не включают кровоизлияния или экссудаты. Существует значительное истончение внутренних ядерных и фоторецепторных слоев сетчатки, уменьшение высоты эпителиальных клеток сетчатки (РПЭ), утолщенного капиллярного ВМ и слабо выраженных базальных нарушений у этих крыс. Аномальная ЭРГ также сообщалась у крыс OLETF, полученных из сахарозы (Hotta et al., 1997). Однако было высказано предположение, что крысы OLETF не подходят для изучения DR, потому что образование качелистых капилляров и перицитовых призраков, типичных для человеческого DR, не ускоряется у этих крыс (Matsuura et al., 2005).

Крыса Goto-Kakizaki (GK) является спонтанной моделью нежирного диабета типа 2 и развивает хроническую гипергликемию в возрасте 4-6 недель (Goto et al., 1988). Диабетические крысы GK продемонстрировали повышенное соотношение эндотелиальных клеток сетчатки к перицитам (Agardh et al., 1997) и уменьшили кровоток в сетчатке без изменений основных диаметров сосудов сетчатки на ранней стадии диабета (Miyamoto et al., 1996). Из-за умеренного и стабильного диабетического состояния эта модель крысы полезна для исследования изменений микроциркуляции сетчатки, вызванных диабетом 2 типа в течение длительного периода времени (Miyamoto et al., 1996).

Самопроизвольно диабетическая крыса Torii (SDT) представляет собой не страдающую ожирением модель диабета типа 2, которая развивает гипергликемию в возрасте 20 недель и может выживать в течение длительного времени без лечения инсулином. Крысы SDT демонстрируют оттяжку сетчатой ​​сетчатки с волокнистой пролиферацией и, возможно, неоваскуляризацию без ишемии сетчатки. Развитие неоваскуляризации в отсутствие ишемии делает эту модель значительно отличной от неоваскуляризации, которая наблюдалась у диабетиков (Yamada et al., 2005). Таким образом, модель нуждается в дополнительном изучении, прежде чем ее можно рассматривать как модель DR. Исследования показали уменьшение амплитуды b-волн ERG и OP. Поскольку ОП, возникающие из амакриновых клеток, являются чувствительной мерой ишемии сетчатки, эти исследования указывают на развитие внутренней ишемии сетчатки у этих крыс (Sasase, 2010).

Крыса для биообработки (ВВ) является спонтанной моделью диабета типа 1, которая развивает диабет в возрасте от 40 до 140 дней. У этих крыс наблюдаются поражения сетчатки, в том числе потери перицита, сгущение BM, дегенерация капилляров и отсутствие микроаневризмы после 8-11 месяцев диабета (Sima et al., 1985). Показано, что трансплантация поджелудочной железы препятствует развитию микрососудистых поражений сетчатки в этой модели (Chakrabarti et al., 1987). Тем не менее, очень мало исследований DR были представлены с использованием этой модели, поэтому его преимущества и недостатки нельзя судить.

Неживые диабетические (NOD) мыши спонтанно развивают диабет 1 типа из-за аутоиммунного разрушения инсулин-продуцирующих панкреатических β-клеток с помощью CD4 + и CD8 + T-клеток (Makino et al., 1980). Исследования показали потерю микрососудов сетчатки, снижение перфузии сетчатки и неупорядоченную фокальную пролиферацию сосудов у мышей NOD (Shaw et al., 2006; Lee and Harris, 2008). Сообщается, что ангиотензин II и тромбоксан опосредуют венузависимую артериолярную вазоконстрикцию. Только несколько отчетов по DR были опубликованы с использованием этой модели.

Мышь db / db (Leprdb) недостаточна для рецептора лептина и спонтанно развивает диабет типа 2, связанный с ожирением в возрасте 4-8 недель. Было показано, что шестимесячные мыши db / db демонстрируют ранние признаки DR, такие как гибель перицитов и эндотелиальных клеток (Midena et al., 1989), сгущение BM (Clements et al., 1998) и увеличение кровотока ( Tadayoni et al., 2003) в сетчатке. К 15 месяцам эти мыши продемонстрировали различные симптомы ДР, включая расщепление кровеносных сетчатки (BRB), потерю перицита, нейроретинальный апоптоз, глиальную реактивацию, возможную неоваскуляризацию и бесклеточные капилляры в сетчатке (Cheung et al., 2005). Сообщения показывают, что мыши db / db обладают определенными преимуществами для изучения микроциркуляции сетчатки. Эти мыши являются темно-пигментированными, и поэтому флуоресценция меченых элементов, циркулирующих в сосудистой оболочке, может быть замаскирована их пигментным эпителием.

Мышь Ins2Akita (Akita) содержит доминантную точечную мутацию в гене, кодирующем инсулин-2, который индуцирует спонтанный диабет типа 1 в штамме мыши B6. У гетерозиготных самцов мышей Акита развивается гипергликемия уже в 4 недели. После 12 недель гипергликемии было обнаружено, что сетчатки имеют повышенную сосудистую проницаемость, вырожденные капилляры и изменения морфологии астроцитов и микроглии с увеличением продолжительности диабета. Кроме того, был выявлен повышенный апоптоз клеток сетчатки, сопровождающийся заметным снижением толщины внутреннего плексиформного слоя и внутреннего ядерного слоя (Barber et al., 2005). Эти мыши показали потерю RGCs из периферической сетчатки в течение первых 3 месяцев диабета, а также заметные изменения морфологии выживших клеток (Gastinger et al., 2008). Другое исследование продемонстрировало значительное снижение общего количества холинергических и дофаминергических амакриновых клеток у мышей Akita (Gastinger et al., 2006). Эта модель изучалась до 15-18 месяцев, но смертность значительно увеличилась к концу этой продолжительности (Т. С. К., неопубликованные данные).

Эта модель может быть полезна для изучения молекулярных механизмов, участвующих в инициации и ранней прогрессии DR. Кроме того, это идеальная модель для оценки нейропротекторных эффектов лекарств из-за количественной потери RGC за относительно короткое время (4-5 месяцев). Использование этой модели растет среди исследователей, заинтересованных в DR.

Несмотря на многочисленные попытки создать подходящие модели, которые точно отражают особенности позднего человеческого ДР, очень немногие модели животных развивают тяжелый ДР с большими областями неперфузии сетчатки и неоваскуляризацией. Следовательно, исследователи обратились к недиабетическим животным для изучения пролиферативной ретинопатии. Широко распространенными моделями пролиферативной ретинопатии грызунов для изучения неоваскуляризации являются те, в которых VEGF сверхэкспрессируется в фоторецепторах (таких как мыши Kimba и мыши, в которых экспрессия VEGF обусловлена ​​промотором родопсина) (Okamoto et al., 1997; Tee et al. , 2008), мыши, сверхэкспрессирующие инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF1) в сетчатке (Ruberte et al., 2004), кислород-индуцированная ретинопатия (Gole et al., 1990; Holmes and Duffner, 1996) и ответвление ретинальной вены окклюзия (Zhang et al., 2007). Эти модели индуцируют возможную неоваскуляризацию и отслоение сетчатки при отсутствии диабета. Например, трансгенные мыши с повышенной экспрессией IGF1 в сетчатке обнаруживают признаки диабетоподобных глазных состояний, включая потерю перицита, утолщение капилляров сетчатки, расширение венулы, IRMA и, возможно, неоваскуляризацию сетчатки (Ruberte et al., 2004). Мыши Кимбы, продуцируемые сверхреакцией специфического к фоторецептору белка VEGF165 человека, демонстрируют неоваскулярные изменения сетчатки, повышенную проницаемость, потерю перицитов и эндотелиальных клеток, изверженность сосудов, лейкостаз и капиллярную блокировку, выпадение и кровоизлияние (Tee et al., 2008).

Недавно была разработана потенциальная модель трансгенной мыши DR под названием «Акимба», пересекая мышей Kimba с мышами Akita (Rakoczy et al., 2010). Эти мыши продемонстрировали ключевые особенности, проявляемые родительскими штаммами: сверхэкспрессия VEGF (как у мышей Кимбы) и спонтанный диабет типа 1 (как у мышей Акита). В этой модели расширенные поражения сетчатки, напоминающие PDR человека, были вызваны у диабетических мышей «сверху» альтернативными подходами (например, неоваскуляризация из-за трансгенной экспрессии человеческого VEGF165 в фоторецепторах). Интересно, что сосудистые изменения в этой модели включают в себя микроаневризмы, повышенную распространенность протекающих капилляров, венозные бисероплетения, извилистые сосуды, капиллярное выпадение и затухание сосудов. На рисунке 5 показано сравнение сетчатки сетчатки, FFA и гистологии мышей Kimba, Akita и Akimba.

Неоваскулярные изменения, наблюдаемые у мышей Акимба, обусловлены не долговременной гипергликемией, как в человеческом ДР, а обусловлены наличием трансгена VEGF165 человека в фоторецепторах. Следовательно, эта модель может оказаться непригодной для изучения этиологии DR или факторов, связанных с развитием неоваскуляризации перед сетчаткой. Механизмы изменения сосудистых и нейронных сетчатки, нейропротекция и роль воспаления у мышей Акимба еще не изучены. Эта недавно разработанная модель является важным инструментом для улучшения понимания сложных процессов, лежащих в основе прогрессии DR.

Галактоземические модели животных DR индуцируются у грызунов, дополняя диету, содержащую 30-50% галактозы. У крыс и мышей, получавших галактозу, развивается микроангиопатия сетчатки, которая напоминает ранние стадии DR (Kern and Engerman, 1995), включая потери перицита, качели, капилляры с утолщенным капилляром сетчатки, IRMA, а также у собак, а также микроаневризмы и кровоизлияния в сетчатку. У мышей с галактоземией была увеличенная ширина капилляра сетчатки и микроаневризмы в возрасте 8 месяцев. Сетчатые микроаневризмы, бесклеточные капилляры, перицитарные призраки и капиллярное BM-утолщение стали все более распространены у мышей на 30% галактозной диете для более длительной продолжительности. Развитие катаракты широко исследовали с использованием галактосемейных крыс и мышей (Kern and Engerman, 1996a). Галактосемейные грызуны испытывают недостаток в метаболических аномалиях, характерных для диабета, но развивают многие осложнения сетчатки диабета и, следовательно, могут считаться ценным инструментом для изучения патогенеза диабетических осложнений.

Ретинопатия, которая развивается у спонтанных или экспериментально индуцированных диабетических собак, морфологически сходна с человеческим DR (Kern and Mohr, 2007; Kern, 2009; Zheng and Kern, 2010). Исследования ретинопатии с использованием моделей собак использовали главным образом диабет типа 1, индуцированный аллоксаном, STZ, гормоном роста или панкреатэктомией. Исследования также проводились на длительных собаках с галактозой (Engerman and Kern, 1984). Поражения сетчатки у диабетических собак включают в себя микроаневризмы, дегенеративные (бесклеточные и неперфузионные) капилляры, потери перицитов, IRMA, более толстые капиллярные BM и точечные и блот-геморрагии (Gardiner et al., 1994; Kern and Engerman, 1996b). Подобно диабетическим собакам, у длительных галактоземических собак, получавших галактозу, наблюдаются поражения сетчатки, которые напоминают те, которые наблюдаются у человека DR (Takahashi et al., 1993; Kern and Engerman, 1996b, Kobayashi et al., 1998). Было показано, что собаки, полученные из галактозы, развивают диабетические изменения сосудов сетчатки, связанные как с ранними, так и с умеренно продвинутыми стадиями ретинопатии. Тем не менее, за 3-5 лет до развития сильной ретинопатии, сопровождающейся эпизодической неоваскуляризацией внутриретинальных клеток, в моделях собак (Engerman and Kramer, 1982; Engerman and Kern, 1984; Takahashi et al., 1992; Wallow and Engerman, 1997) , Кроме того, стоимость, отсутствие специфических антител или молекулярных реагентов, повышенные этические проблемы и трудности в поддержании означают, что модели собак менее полезны, чем малые животные модели для исследования DR (Kobayashi et al., 1998).

Сравнение сетчатки сетчатки, ФФА и гистологии мышей Кимбы, Акимбы и Акиты. Fundus, FFA и гистологии сетчатки мышей Кимба (A-C), Акимба (D-F) и Акита (G-I) (любезно предоставлено Институтом глаз Льва, Перт, Австралия). FFA показывает различия в сосудистой сети сетчатки между мышами Kimba (B), Akimba (E) и Akita (H). Мыши Kimba (B) и Akimba (E) имеют очаги утечек флуоресцеина (стрелки). Мышам Акиты (H) были четко определены сосуды сетчатки и сетчатка капиллярной сети с сосудами, излучающими головку зрительного нерва. Световые микрофотографии глаз с глазами с парафином глаз Кимбы (C), Акимба (F) и Акиты (I) показывают гистологию сетчатки. Секции были окрашены H & E. Стрелки в C и F указывают на разрывы в ячейках RPE глаз мыши Кимбы и Акимбы, тогда как стрелки в (I) указывают на неповрежденные клетки RPE в глазах Акиты. Слой ганглиозных клеток (GCL); внутренний ядерный слой (INL); внутренний плексиформный слой (IPL); наружный плексиформный слой (OPL); и внешний ядерный слой (ОНЛ).

Большинство исследований диабетических кошек включают диабет типа 1, индуцированный STZ и панкреатэктомией, с или без аллоксана. Поражения сетчатки включают капиллярное BM-утолщение, повышенную извилистость сосудов, неперфузию капилляров, микроаневризмы, утечку флуоресцеина и, возможно, неоваскуляризацию (Mansour et al., 1990; Hatchell et al., 1995; Linsenmeier et al., 1998; Budzynski et al. 2005). Диабетические кошки развивают только легкую катаракту, что позволяет использовать FFA и другие измерения in vivo в течение многих лет после индукции диабета (Salgado et al., 2000; Richter et al., 2002). Кошки также проявляют гипоксию сетчатки при диабете, что может быть вызвано капиллярным закупоркой или изменением потока через микроаневризмы (Linsenmeier et al., 1998). Однако стоимость, отсутствие специфических антител или реагентов молекулярной биологии и медленное развитие поражений сделали модели кошки менее подходящими, чем модели грызунов для исследований DR.

Структура сосудистой системы сетчатки у свиней очень похожа на структуру сосудистой системы сетчатки у людей, что делает их очень полезными для исследований заболеваний глаз. Свиньи развивали капиллярные капилляры ВТ с несколькими ультраструктурными особенностями, такими как ламелирование и разрежение в BM, уже через 18 недель после лечения STZ (Lee et al., 2010). Другое исследование диабетических свиней типа 1 показало довольно быстрое развитие признаков, характерных для ранних изменений микроциркуляции сетчатки (Hainsworth et al., 2002). Дальнейшие исследования с использованием этой модели могут улучшить наше понимание прогрессии DR и могут стать важной платформой для исследования новых методов лечения, которые будут многообещающими при небольших исследованиях на животных, прежде чем перейти к клиническим испытаниям на людях. Недостатки моделей свиней включают в себя высокую стоимость, отсутствие конкретных молекулярных реагентов и антител, трудности в обслуживании и тот факт, что методы генетической характеристики и манипуляции в настоящее время менее точны, чем на небольших моделях животных.

Структурное сходство глаз приматов с глазами человека делает их потенциальными моделями для исследований заболеваний глаз. Основным преимуществом моделей приматов над другими моделями, рассмотренными выше, является наличие макулы, важного места повреждения в DR. Наиболее распространенные модели приматов, используемые для исследований DR, включают обезьян-резус с диабетом, индуцированным аллоксаном, STZ или общей панкреатектомией. Обезьяны Cynomolgus (Macaca fascicularis) и тучные макаки-макаки (макака мулата), которые развивают диабет, также были использованы. Доказательства показывают, что ретинопатия развивается очень медленно у диабетических приматов, отличных от человека (как у людей). STZ- или поджелудочковые диабетические обезьяны, изученные на срок до 15 лет, показали ишемию сетчатки и дефекты BRB и макулы. Однако у этих моделей отсутствуют сосудистые поражения, наблюдаемые у человека DR (Tso et al., 1988). Исследования старых обезьян со спонтанным диабетом выявили ИРМА и макулярный отек. Микроаневризмы также были связаны с областями неперфузии (Johnson et al., 2005). Исследования по типам диабетического примата типа 2 выявили кровоизлияния, большие площади капиллярной неперфузии сетчатки, микроаневризмы, пятна ваты, кровоизлияния в сетчатке и твердые экссудаты в макуле (Kim et al., 2004). На сегодняшний день неваскуляризация сетчатки или дегенерация нейронов не сообщается у диабетических приматов, не относящихся к человеку.

Несмотря на структурное сходство глаза у людей и нечеловеческих приматов, эти модели не всегда предпочтительнее других животных моделей из-за нескольких ограничений. Нечеловеческих приматов трудно манипулировать генетически, а молекулярных реагентов для экспериментальных исследований не хватает. Они также имеют более длительный гестационный период и более низкие показатели рождаемости. Другие недостатки включают медленное прогрессирование ДР, увеличение расходов на обслуживание и этические проблемы использования приматов, не являющихся людьми, в качестве моделей животных.

Как указано в этой перспективе, животные модели DR являются важными инструментами, которые будут продолжать улучшать наше понимание патогенеза DR, а также разрабатывать новые терапевтические подходы. Тем не менее, ясно, что до сих пор нет идеальной модели для животных, которая повторяет все аспекты человеческого DR. Хотя большинство рассмотренных моделей продемонстрировали основные черты NPDR, ключевая особенность PDR человека — неоваскуляризация перед ретиналом, вторичная по отношению к диабету как таковая, не рекапилирована в диабетических моделях животных. Тем не менее, современные клинические инструменты для лечения существующей PDR являются относительно успешными, и поэтому основное внимание в будущих исследованиях должно заключаться в том, чтобы препятствовать развитию ранних стадий ретинопатии, тем самым предотвращая последующее прогрессирование до улучшенной ретинопатии. Примечательно, что утолщение сетчатки (в соответствии с DME) было обнаружено в небольшом количестве доступных моделей, таких как обезьяны. Потеря зрения или ухудшение зрения также изучается сейчас у мышей и крыс с использованием оптикокинетического ответа (Thomas et al., 2010); исследование причины индуцированного диабетом снижения зрительной функции может дать новое представление о причинах потери зрения у людей с диабетом.

Некоторые исследователи считают, что оставшаяся задача состоит в разработке моделей животных, которые имитируют прогрессирование DR с непролиферативной до пролиферативной стадии, как в человеческом DR (Rakoczy et al., 2010; Li et al., 2010). Это может быть достигнуто путем ускорения ретинопатии в моделях путем наложения определенной генетической или метаболической аномалии на диабет (например, как у мышей eNOS — / — или Akimba). Тем не менее, проблема, с которой основной патогенез ретинопатии в таких моделях имитирует человеческий ДР, будет важной проблемой для решения.

Применение соответствующих методов для характеристики ДР является столь же важной задачей для будущего. Существующие методы определения in vivo DR, включая ERG, FP, FFA и OCT, могут контролировать прогрессирующие патологические изменения (сосудистые и несосудистые) у одного и того же животного с течением времени, но новые методы, которые предоставляют дополнительную информацию (например, сосудистый калибр сетчатки измерения).

Что касается клинических проблем, многие области неопределенности остаются. Хорошо известно, что, несмотря на контроль системных факторов риска гипергликемии и гипертонии, многие пациенты по-прежнему развиваются, чтобы развить опасные для зрения стадии DR (PDR или DME). Нынешним стандартом медицинской помощи является лазерная терапия, которая по своей сути разрушительна, связана с побочными эффектами и неэффективна в обращении зрительной потери. Новые подходы, включая внутриглазное введение анти-VEGF-агентов, являются многообещающими, но имеют потенциальные риски (Cheung et al., 2010). Таким образом, желательно предотвращать DR и нацеливать ранние стадии DR. Например, способность предоставлять эффективные актуальные методы лечения, направленные на множественные пути, лежащие в основе неоваскуляризации сетчатки и отека, может еще больше улучшить существующие стратегии управления для ДР. Разработка таких методов лечения требует существенных фундаментальных и экспериментальных исследований, для которых необходимы соответствующие животные модели DR.

Крайне необходимы новые и экономически эффективные методы лечения ДР, особенно ранние стадии ДР. Модели животных, которые развивают поражения, характерные для человеческого DR, будут по-прежнему играть решающую роль в понимании патогенеза и для тестирования новых методов лечения до клинических испытаний. Успех каждого исследования во многом зависит от выбора подходящей модели животных, которая, в свою очередь, определяется экспериментальным дизайном и фокусом. К основным особенностям, которые следует учитывать при выборе модели DR для животных, относятся: структурные и биохимические особенности визуальной системы по сравнению с людьми; способность выполнять генетические манипуляции; наличие и стоимость модели; методы, доступные для характеристики болезни и валидации; временной ход патологических изменений; и этические, моральные и правовые вопросы. Преодоление текущих проблем в исследованиях DR требует более обширных экспериментов с наиболее перспективными моделями, включающими передовые методы для более точного фенотипирования. Этот подход в конечном итоге поможет определить лучшие системы для лучшего понимания, профилактики и лечения заболеваний человека.

КОНКУРИРУЮЩИЕ ИНТЕРЕСЫ

Авторы заявляют, что у них нет каких-либо конкурирующих или финансовых интересов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа финансировалась Национальным советом по медицинским исследованиям, грантом по поисковому развитию (NMRC / EDG / R797 / 53/2011 и NMRC / SERI-Retina Startup / R603 / 37/2008) В.А.Б.]; Биомедицинский исследовательский совет, Партнерство в области трансляционных клинических исследований (TCR) [TCRP0101672B / R826 / 2011 — T.Y.W.]; и Национальный совет по медицинским исследованиям, грант нового следователя [R751 / 35/2010, S.S.C.].

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *