Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Полиморфизм гена глюкокиназы в неинсулинозависимом сахарном диабете

Polymorphism of Glucokinase Gene in Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4532057/

Несколько строк доказательств свидетельствуют о сильном генетическом компоненте для NIDDM.

Чтобы прояснить роль гена глюкокиназы в развитии NIDDM, полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) гена глюкокиназы и 3′-микросателлиновый анализ полиморфизма с помощью полимеразной цепной реакции — однонитевый конформационный полиморфизм (PCR-SSCP) были выполнены в NIDDM и контрольных субъектах ,

По сравнению с NIDDM с 1,3 kb аллелем / Pvu I перевариванием глюкокиназы, 10% NIDDM не продемонстрировали аллель 1,3 kb, и эти пациенты были отмечены усиленной секрецией инсулина. В 3 ‘микросателлитном анализе полиморфизма авторадиография продуктов ПЦР выявила три разных аллеля, включая Z, Z + 2 и Z + 4. Z был наиболее распространенным аллелем как для NIDDM, так и для недиабетического контроля. Не было значительного аллеля, связанного с NIDDM. Частота генотипа гомозиготы Z / Z была значительно ниже у субъектов NIDDM (16,7%) по сравнению с нормальным контролем (46,7%) (p <0,05).

Не было различий в клинических данных по 3′-микросателлитным генотипам в NIDDM. Эти данные свидетельствуют о том, что не существует значимого аллеля глюкокиназы, связанного с NIDDM, но генотип Z / Z может играть супрессивную роль в патогенезе определенного типа NIDDM в Корее. Дальнейшие исследования могут потребоваться для определения молекулярной основы этой ассоциации.

Несмотря на десятилетнее исследование, патогенным механизмом неинсулинозависимого сахарного диабета (NIDDM) остается одна из неразгаданных тайн. В нормальных условиях глюкозный гомеостаз представляет собой баланс между выработкой глюкозы в печени и клиренсом глюкозы в периферические ткани, главным образом мышцы. Бета-ячейка является регулятором этой системы; высвобождение инсулина постоянно корректируется, так что производство глюкозы и клиренс изменяются способами, которые поддерживают нормогликемию. В NIDDM все три компонента системы являются дефектными: зазор глюкозы от циркуляции падает, высвобождение инсулина после еды замедляется, а производство глюкозы возрастает1).

Несколько строк доказательств свидетельствуют о сильном генетическом компоненте для NIDDM. Отмеченные различия в распространенности были отмечены среди различных расовых групп. Кроме того, исследования идентичных близнецов с NIDDM ясно показали, что болезнь является генетической, хотя модель наследования еще не определена2).

Поиск диабетических генов в NIDDM усилился с конца 1990-х годов. В первую очередь внимание было сосредоточено на поиске мутаций у лиц с редким синдромом диабета, у которых способ наследования предполагал наличие отдельных генных дефектов. Мутантные инсулины были обнаружены в семьях с экстремальной гиперинсулинемией или гиперпроинсулинемией. Более 40 различных мутаций в рецепторе инсулина были выявлены у пациентов с синдромами резистентности к инсулину. Совсем недавно мутации в ключевом регуляторном ферменте бета-клеток, глюкокиназы глюкозы, были обнаружены в семьях с сахарным диабетом созревания молодого (MODY), формы болезни, отличной от типичного NIDDM, в том, что она имеет начало на ранней стадии жизни и наследуется аутосомно-доминантным образом3). Теперь внимание переключилось на поиск мутаций в общей форме NIDDM. Кандидированные гены выбираются на основе аномалий метабоксизма, которые, как известно, происходят в этом расстройстве.

Глюкокиназа является ключевым ферментом регуляции гомеостаза глюкозы. Глюкокиназный ген экспрессируется исключительно в бета-клетках печени и поджелудочной железы. В гепатоците этот фермент играет роль в облегчении поглощения и метаболизма глюкозы и в бета-клетке поджелудочной железы, при определении глюкозы и в инициировании глюкозоиндуцированной секреции инсулина4). Таким образом, дефекты гена глюкокиназы могут способствовать развитию NIDDM.

Недавно структура гена глюкокиназы была охарактеризована и, как было установлено, содержит две различные области контроля транскрипции. Одна область регулирует транскрипцию гена в печени, тогда как другая область, которая находится по меньшей мере на 20 килобазах, расположенных дальше по течению, контролирует транскрипцию в бета-клетке поджелудочной железы. Нахождение двух различных областей контроля транскрипции в одном геном глюкокиназы обеспечивает генетическую основу специфической для ткани дифференциальной регуляции глюкокиназы. И была предложена возможность обратной связи с использованием глюкокиназы печени и бета-клеток. Печеночная глюкокиназа, которая стимулируется увеличением концентрации инсулина в плазме, влияет на скорость использования глюкозы в печени, тем самым помогая снизить концентрацию глюкозы в плазме. С другой стороны, повышенная глюкоза в плазме вызывала бы экспрессию глюкокиназы в бета-клетке, что вызывало увеличение гликолиза бета-клеток и большую секрецию инсулина4).

Для выяснения роли гена глюкокиназы в развитии NIDDM был выполнен полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) гена глюкокиназы и 3-микросателлиновый анализ полиморфизма.

Лейкоциты периферической крови были получены у 30 пациентов с диабетом в соответствии с критериями Национальной группы данных по диабету и 30 здоровых контролей. У пациентов с NIDDM сывороточный инсулин, c-пептид и 24-часовой c-пептид мочи измеряли методом радиоиммуноанализа.

Основные молекулярные лабораторные процедуры проводились в соответствии со стандартными протоколами этой лаборатории.

Анализ RFLP гена глюкокиназы выполнялся, как в ранее описанных методах5). Короче говоря, геномную ДНК экстрагировали из лейкоцитов крови методами фенол-хлороформ и переваривали рестрикционным ферментом Pvu II. Фрагменты ДНК отделяли в соответствии с размером в электрофорезе на агарозном геле и переносили в нитроцеллюлозный фильтр по методу Южного переноса. Усиленная и очищенная кДНК глюкокиназы крысы (pGK, Z9: любезно предоставленная доктором Магнусоном М.А., Университетом Вандербильта, Нэшвилл Теннесси) была радиоактивно меченая для использования в качестве ДНК-зонда. После гибридизации нитроцеллюлозного фильтра с радиоактивным изотопом ДНК-зонда подвергали воздействию рентгеновской пленки для получения авторадиограммы.

Был проведен следующий эксперимент для идентификации связи между NIDDM и микросателлитным полиморфизмом гена глюкокиназы. Анализ PCR-SSCP (полимеразная цепная реакция — одновязовый конформационный полиморфизм) проводился для 8 kb нисходящей микросателлитной области.

Для амплификации ПЦР использовали набор олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих микросателлитную область. Чувствительный праймер составлял 5′-конец, помеченный в течение 45 мин при 37 ° С в 25 мкл реакции, содержащей 25 пмоль праймера. T4 полинуклеотид-киназу. Каждый ПЦР-анализ содержал 250 нг интактной геномной ДНК, 10 пмоль антисмысловой праймер, 9 пмоль немеченого и 1 пмоль 32P концевой меченый смысловой праймер, 200 мкМ каждый dNTP, 1,5 мМ MgCl2 и 1 единицу Taq-полимеразы в 50 мкл объема реакции с буфером поставляемый в комплекте Gene AMP (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT). Образец обрабатывали путем начальной денатурации в течение 3 мин при 95 ° С, 30 циклов амплификации, который состоял из 50 с при 95 ° С (денатурация) и 50 с при 66 ° С (отжиг-удлинение) и конечном удлинении при 72 ° С в течение 5 мин в термоциклере Perkin-Elmer-Cetus. После денатурирования при 75 ° С в течение 2 мин в растворе для остановки формамида (50% формамид и 10 мМ ЭДТА) аликвоты амплифицированных образцов проводились на альтернативных дорожках на стандартном геле секвенирования ДНК, содержащем 6% акриламида и 7 М мочевины в 27 мМ Трис-борат, 0,6 мМ буфера EDTA в течение 2,5 ч при 70 Вт. Затем гели фиксировали, сушили и обрабатывали для авторадиографии.

Различия между группами в количественных переменных оценивались по непарному тесту. Ассоциацию между аллельными и генотипическими частотами у пациентов с диабетом и недиабетикой оценивали по критерию независимости.

У пациентов с NIDDM отрицательный аллель 1,3 т.п.н. был более распространенным, чем у нормальных субъектов (таблица 1). Клинические проявления в соответствии с RFLP гена глюкокиназы, возраст начала, уровень сахара в крови натощак, уровень сывороточного инсулина натощак и уровень c-пептида не отличались между аллелями с отрицательной и положительной группой 1,3 kb. Однако 24-часовая экскреция мочи c-пептидом мочи была значительно более высокой в ​​отрицательной группе 1,3 kb, чем в положительной группе 1,3 kb. Кроме того, инсулин и с-пептидный ответ на оральную глюкозу были более выражены в отрицательной группе 1,3 т.п.н., чем в положительной группе 1,3 т.п.н. (таблица 2).

Этот результат может предложить следующую гипотезу. У пациента NIDDM отрицательного 1,3 kb аллеля гена глюкокиназы может быть дефект гена глюкокиназы печени.

Аллельные и генотипические частоты повторов динуклеотидов в локусе глюкокиназы показаны в таблице 3 и таблице 4. Авторадиография продуктов ПЦР нормального контроля выявила три разных аллеля, включая Z (73,3%), Z + 2 (16,7%) и Z + 4 (10,0%) (фиг.2). В NIDDM частота повторов аллелей микросателлитов была следующей: Z, 58,3%, Z + 2, 25,0%, Z + 4, 16,7%. Z был наиболее распространенным аллелем как для NIDDM, так и для недиабетического контроля. Не было значительного аллеля, связанного с NIDDM.

Наблюдался генотип микросателлитных полиморфных маркеров, включая Z / Z, Z / Z + 2, Z + 4 (табл. 4). При нормальном контроле Z / Z (46,7%) был наиболее распространенным генотипом. По сравнению с обычным контролем частота генотипа Z / Z (16,7%) была значительно ниже у субъектов NIDDM (P <0,05). Не было отмечено различий между частотой других генотипов в контрольной группе и NIDDM (Z / Z + 2, 33,3% против 50,0%, Z / Z + 4, 20,0%, против 33,3%).

Не было различий в клинических результатах по 3′-микросателлитным генотипам в NIDDM (таблица 5).

NIDDM является одним из наиболее распространенных метаболических заболеваний, которые поражают 5% населения мира, но его причины остаются в значительной степени неизвестными. Вклад наследственности в развитие NIDDM был признан на протяжении многих лет6,7). Ряд различных генетических механизмов, которые способствуют восприимчивости NIDDM, были исследованы в некоторых расовых группах с использованием RFLP, включая инсулин8,9), гены рецептора инсулина10), митохондрии11,12), изоформы транспортера глюкозы13,14) и различные гены аполипопротеина15 , 16). Однако окончательные выводы не были получены, и этот вывод предполагает, что эти локусы не являются основными причинами заболевания.

Генетические исследования семей с ранним началом NIDDM показали плотную связь с полиморфизмами ДНК в гене аденозиндезаминазы на хромосоме 2017) и с полиморфизмами ДНК в гене глюкокиназы на хромосоме 718,19). Хотя ген диабетической восприимчивости на хромосоме 20 не был идентифицирован, ген глюкокиназы считается основным кандидатом на ген чувствительности к диабету на хромосоме 73). Недавно Froguel et al. 20 также сообщали, что ген глюкокиназы плотно связан с геном, ответственным за раннее начало NIDDM. Глюкокиназа является ключевым компонентом при определении глюкозы клетками панкреатического островка и диабетом из-за мутации глюкокиназы может быть одним из наиболее распространенных одно-генных расстройств, описанных на сегодняшний день.

В нашем исследовании RFLP гена глюкокиназы фрагмент 1,3 кб не был обнаружен у 10% пациентов с NIDDM. Эти результаты свидетельствуют о том, что у пациентов с NIDDM отрицательного 1,3 kb аллеля гена глюкокиназы может быть дефект гена печеночной глюкокиназы. таким образом, ген печеночной глюкокиназы может аномально выражать количественно или качественно. Поглощение печени и метаболизм снижаются, что приводит к повышению уровня глюкозы в плазме. Повышенная глюкоза в плазме вызывала бы экспрессию бета-клеточной глюкокиназы с последующим усилением секреции инсулина. Несмотря на повышенную концентрацию инсулина в плазме, печеночная глюкокиназа не вызывалась из-за ее дефекта. Концентрация глюкозы в плазме будет еще больше увеличена. Пациенты NIDDM, не содержащие 1,3 кб аллелей / Pvu II, расщепляли ген глюкокиназы, характеризовались повышенной секрецией инсулина по сравнению с NIDDM с аллелем 1,3 т.п.н. Последовательный анализ и дальнейшая характеристика фрагмента 1,3 кб следует использовать для получения ответов на патофизиологическое значение аллеля 1,3 т.п.н.

Недавно Tanizawa et al. 21) показали, что ген глюкокиназы человека состоит из 12 экзонов, которые охватывают область в 50 000 пар оснований хромосомы 7, полоса р13. Этот ген транскрибируется из двух тканеспецифических промоторов, один из которых активен в В-клетке, а другой — в гепатоците. Эта функция позволяет независимо регулировать ген в этих двух тканях. β-клеточная глюкокиназа мРНК является продуктом экзона 1a и экзонов 2-10, являясь основной мРНК глюкокиназы печени, полученной из экзона 1b и экзонов 2-10. Информация о последовательности для гена глюкокиназы позволила прояснить молекулярную основу потенциальных дефектов глюкокиназы у пациентов с NIDDM и может дополнительно объяснить характер генетической восприимчивости к NIDDM.

Было описано несколько различных типов RFLP. В дополнение к замещениям нуклеотидной последовательности, которые изменяют сайт расщепления для рестрикционной эндонуклеазы и вализуемого числа тандемных повторов, полиморфизм ДНК типа VNTR и полиморфизм поли (А) полипептида Alu характеризуются. Было показано, что в геноме человека вкрапленная повторяющаяся последовательность (dC-dA) n (dG-dT) n является обильной. Эти так называемые (CA) n микросателлитные повторяющиеся элементы часто имеют размерные полиморфизмы, которые легко обнаруживаются с помощью тестов на основе ПЦР22,23). Tanizawa et al. 21) ранее идентифицировали (СА) n микросателлитный повтор около 8 kb ниже гена глюкокиназы человека, который был высоко полиморфным.

Исследования ассоциации популяций основаны на предположении, что мутация, вызывающая заболевание и генетический маркер, связана с неравновесностью сцепления или что маркер является локусом заболевания24).

В нашем исследовании с использованием ПЦР-SSCP-анализа для 8-килограммовой микросателлитной области ниже по течению наблюдалось три различных аллеля, включая Z, наиболее распространенный аллель, Z + 2 и Z + 4. Значительного аллеля, связанного с NIDDM, не отмечалось. Наиболее распространенным генотипом был Z / Z, который был более распространен в недиабетическом контроле, чем у пациентов с NIDDM. В аналогичных исследованиях, проведенных во многих расовых группах, Chiu et al., 25) сообщалось, что аллель Z чаще встречается у американских чернокожих с недиабетическими субъектами, чем у пациентов с диабетом, а аллель Z + 4 чаще встречается у пациентов с диабетом. Noda et al., 26) также сообщали, что аллель Z + 4 был обнаружен более часто на японском языке с диабетом, чем у недиабетических субъектов и -2 аллеля, 5′-фланкирующий участок, был распространен в диабетике, чем у недиабетических субъектов. Поскольку некоторые из контрольных субъектов могут развиться диабет в более позднем возрасте, это будет фактором, который был бы взвешен против нахождения разницы в частотах аллелей глюкокинсов между этими двумя группами. В исследовании с мавританскими креолами27) Z + 2 сообщалось как важный фактор риска для NIDDM, но не у маврикийских индейцев. В нашем исследовании частоты Z + 2 и Z + 4 аллелей существенно не различались в обеих группах. Эти расовые расхождения могут представлять генетические неоднородности NIDDM в разных расовых группах, и для определения распространенности мутаций глюкокинза среди субъектов с NIDDM и определения характера этого дефекта необходимы дальнейшие исследования.

Глюкокиназа является основным ферментом, который фосфорилирует глюкозу при вхождении в печень и островковую β-клетку. Поэтому снижение клеточных уровней активности глюкокиназы, как следствие пропущенных, бессмысленных и сплайсирующих мутаций, может увеличить порог глюкозы для секреции инсулина β- клеток, а также ухудшают усвоение глюкозы и метаболизм в печени. Было высказано предположение, что умеренное снижение активности глюкокиназы на 15% может привести к изменению уставки для индуцированной глюкозой секреции инсулина с 5 до 6 мМ4,28). Клинические исследования субъектов с глюкокиназной мутацией согласуются с пониженной чувствительностью β-клетки к глюкозе29). Также может быть корреляция между эффектом мутации на активность глюкокиназы и тяжести непереносимости глюкозы20). Мутации в глюкокиназе приводят к форме NIDDM, которая имеет очень ранний возраст при начале, часто в детстве. Более того, NIDDM из-за мутаций глюкокиназы, как правило, является относительно мягким, и многие субъекты с такими мутациями не имеют открытого NIDDM. У диабетиков с положительными полиморфными микросателлитными повторными маркерами, Z + 4 и -2 аллелей, не было обнаружено различий в возрасте диагноза, положительном семействе, способе терапии, текущем HbA1c или ежедневной экскреции иммунореактивности C-пептида по сравнению с диабетом без этих маркеров26) , В этом исследовании также не было различий в клинических данных по 3′-микросателлитным генотипам в NIDDM.

В заключение, пациенты NIDDM, без 1,3 kb аллеля / Pvu II переваривания гена глюкокиназы, характеризовались повышенной секрецией инсулина. Геномный гомозигот Z / Z был более распространен у обычных субъектов, чем у пациентов с NIDDM. Эти данные свидетельствуют о том, что, по-видимому, не существует значительного аллеля глюкокиназы, связанного с NIDDM, но генотип гомозигот Z / Z может играть супрессивную роль в патогенезе определенного типа NIDDM на корейском языке. Хотя следует быть осторожным в отношении потенциальных ложных наблюдений в исследованиях ассоциации, значение результатов следует также признать в генетическом анализе гетерогенных нарушений, таких как NIDDM. Дальнейшие исследования могут потребоваться для определения молекулярной основы этой ассоциации.

Это исследование было поддержано грантами Корейского научного и инженерного фонда (91-07-00-16) и Корейской диабетической ассоциации.

ПЦР для анализа полиморфной (CA) n области повторения.

Alleles PCR амплифицировали из 3′-микросателлитной области в NIDDM.

Частота 1.3 kb Аллела гена глюкокиназы

Клинические проявления в соответствии с Глюкокиназой Gene RFLP в NIDDM

НС: незначительный

Аллельные частоты микросателлитного полиморфного маркера для гена глюкокиназы

Z vs не-Z X2 = 3,001 DF = 1 p <0,1

Генотипические частоты микросателлитного полиморфного маркера для гена глюкокиназы

Z / Z vs Z / Z X2 = 6,428 DF = 1 p = 0,01123

Клинические результаты NIDDM по генотипу

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *