Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Секреция микровезикулярных miRNAs в клеточном и органическом старении

Secretion of microvesicular miRNAs in cellular and organismal aging
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3695566/

Изменения факторов, циркулирующих в системной среде в процессе старения человека, были исследованы в течение длительного времени. Только недавно, однако, было обнаружено, что miRNAs секретируются в системной и тканевой средах, где они защищены от РНКов либо белками-носителями, либо упакованы в микропузырьки. Эти miRNAs затем поглощаются клетками-реципиентами, изменяя клеточное поведение классическим индуцированным miRNA глушителем мишеней-мишеней. Однако происхождение циркулирующих miRNAs в большинстве случаев остается неясным, но стареющие клетки появляются как возможный источник таких секретируемых miRNA. Поскольку различия в циркулирующих miRNAs были обнаружены во множестве связанных с возрастом заболеваний, а накопление стареющих клеток у пожилых людей становится возможным вредным фактором старения, вполне вероятно, что эти miRNAs могут способствовать функциональному снижению, наблюдаемому во время старение организмов.

Поэтому здесь мы даем обзор текущих знаний о микроверсительной секреции miRNAs, изменениях системной и тканевой среды во время старения клеток и организмов. Наконец, мы суммируем имеющиеся знания о miRNAs, которые, как установлено, являются специфическими для возрастных заболеваний.

► miRNAs секретируются в микропузырьках. ► Мало что известно о секреции miRNA в клеточном и органическом старении. ► miRNA-секреция изменяется при возрастных заболеваниях.

Редактор разделов: Курт Борг

Несмотря на значительный прогресс в исследованиях старения за последние десятилетия, индивидуальная гетерогенность процесса старения у людей по-прежнему остается загадочной и одной из основных проблем для наших обществ. Поэтому необходимо улучшить наше понимание процесса нормального старения, поскольку старение является субстратом, на котором возрастет возрастное заболевание. Такое функциональное понимание на молекулярном уровне могло бы помочь разработать стратегии профилактики и терапии возрастных потерь в функциональности клеток, тканей и организма.

Здесь мы суммируем имеющиеся знания о секреции miRNAs и их потенциальном воздействии на процессы старения клеток и организма.

Стеновые клетки широко изучались как модельная система старения с тех пор, как репликативный предел нормальных соматических клеток человека в культуре был описан Хейфлом более четырех десятилетий назад (Hayflick, 1965). Стеновые клетки характеризуются сочетанием изменений в поведении, структуре и функциях клеток, включая необратимый арест роста, устойчивость к апоптозу и изменение экспрессии генов (Campisi and d’Adda di Fagagna, 2007). Более того, фенотип стареющего возраста также индуцируется различными физико-химическими стрессорами, которые индуцируют повреждение ДНК и разрушение хроматина, а также онкогенные сигналы (Cabrera et al., 1992; Maruyama et al., 2009). Поскольку клетки-стареющие клетки никогда не возвращаются в клеточный цикл, предложено клеточное старение для предотвращения злокачественной трансформации потенциально мутированных клеток и, таким образом, способствует подавлению опухолей. В противоположность этому, стареющие клетки сохраняются в тканях и не устраняются апоптозом, а их измененный функциональный профиль изменяет микросреды тканей таким образом, который может способствовать как фенотипическим явлениям рака, так и старения (Krtolica and Campisi, 2002; Rodier et al., 2007). Недавно было показано, что предраковые эпителиальные клетки молочной железы, подвергнутые воздействию стареющих фибробластов человека у мышей, необратимо теряют дифференцированные свойства, становятся инвазивными и подвергаются полной злокачественной трансформации (Parrinello et al., 2005).

К настоящему времени было установлено, что присутствие и возрастное накопление стареющих клеток in vivo хорошо воспринято (Campisi and d’Adda di Fagagna, 2007; Campisi and Sedivy, 2009), и хорошо известно, что клетки стареющих клеток in vivo способствуют возрасту, ассоциированные заболевания, такие как атеросклероз (Erusalimsky, 2009; Erusalimsky and Skene, 2009; Minamino and Komuro, 2007). Кроме того, было показано, что клеточное старение ограничивает степень фиброза после повреждения печени и подчеркивает взаимосвязь между стареющими клетками и микроокружением тканей (Krizhanovsky et al., 2008).

Несмотря на эти различные хорошие и плохие последствия клеточного старения, недавние исследования подтверждают идею о том, что накопление стареющих клеток со старением организмов ускоряет возрастные заболевания и потерю функции тканей (Baker et al., 2011). Кроме того, реактивация теломеразы у мышей задерживает начало потери функциональности ткани (Jaskelioff et al., 2011) и даже увеличивает продолжительность жизни мыши (Bernardes de Jesus et al., 2012).

Помимо измененной функциональности самих клеток, вредные эффекты стареющих клеток могут быть связаны с измененным фенотипом секреции. Действительно, у стареющих клеток развивается связанный с старением секреторный фенотип (SASP), где были обнаружены цитокины, белки и протеазы внеклеточного матрикса, а также другие факторы, которые изменяют поведение соседних клеток. Секреторная секреция фибробластов была хорошо установлена ​​путем идентификации различных секретируемых факторов, которые способствуют старению, как инсулиноподобный белок 7, связывающий фактор роста (IGFBP7) (Wajapeyee et al., 2008), рецептор интерлейкина-8 (IL-8) (Acosta et al., 2008a, 2008b), IL-6 (Kuilman and Peeper, 2009), но и ключевые компоненты пути Wnt, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF1), трансформирующий фактор роста-β (TGFβ ) и плазмин (Kuilman and Peeper, 2009). SASP включает воспалительные цитокины, которые, как считается, приводят к старению и возрасту, связанным с болезнью (Finch and Crimmins, 2004). Действительно, некоторые факторы SASP, когда хронически присутствует, могут нарушать структуру ткани и дифференцировку (Parrinello et al., 2005), а другие могут способствовать развитию злокачественных фенотипов в соседних предраковых клетках (Bavik et al., 2006; Coppé et al., 2008; Krtolica et al., 2001; Liu and Hornsby, 2007). С другой стороны, некоторые факторы SASP могут быть полезными. Например, некоторые усиливают задержку роста старения аутокрином (Acosta et al., 2008b, Kuilman and Peeper, 2009; Kuilman et al., 2008). Другие могут позволить поврежденным клеткам сообщать о своем скомпрометированном состоянии (Rodier et al., 2009), чтобы стимулировать восстановление тканей или ограничение патологии (Krizhanovsky et al., 2008).

Накопление повреждений в клетках и тканях было принято как одна из основных движущих сил старения и связанных с возрастом заболеваний (Kirkwood, 2005). Было обнаружено, что с возрастом изменяются несколько системных факторов, среди которых хемокины, такие как хемокин (мотив C-C) лиганд 11 (CCL11), уровни которого коррелируют с нейрогенезом (Villeda et al., 2011) и гормонами, такими как гормон роста (Corpas et al., 1993), а также сульфатированную форму дегидроэпиандростерона (Baulieu, 1996).

В большинстве тканей наблюдается связанное с возрастом снижение функциональности стволовых клеток, но не истощение стволовых клеток. Их способность к самообновлению и дифференциации необходима для гомеостаза и регенерации тканей и органов. Функциональность этих клеток снижается с возрастом (Rando, 2006). Одним из факторов, способствующих этому функциональному снижению, является системная среда старых организмов (Conboy et al., 2005). Это снижение функциональности может быть связано либо с факторами, которые активно тормозят успешную регенерацию тканей, либо из-за отсутствия стимулирующих факторов у пожилых людей. Напротив, факторы, присутствующие в системной среде молодых животных, способствуют успешной регенерации тканей (Matsumoto et al., 2009).

Такие факторы по-прежнему в значительной степени неизвестны, но некоторые из них медленно появляются. Среди них протеины, Wnt, TGF-β (Carlson et al., 2009) и IGF-1 сигнальные молекулы (Mayack et al., 2010), которые, как предполагается, являются факторами, способствующими функциональному снижению. Однако источник таких факторов в настоящее время неизвестен. Можно предположить, что любые другие типы эндокринных и воспалительных сигнальных молекул по их наличию или отсутствию могут способствовать нарушению функциональности ткани.

Недавно такие «эндокринные» функции были приписаны miRNAs, поскольку miRNAs обнаруживаются не только внутри клетки, но также обнаруживаются вне клеток, включая различные биологические жидкости организма (например, сыворотка, плазма, слюна, моча и молоко) (Chen et al., 2012), где они беспрепятственно циркулируют по RNAs из-за ассоциации с защитными белками или путем упаковки в микропузырьки (Viaud et al., 2008). Но как генерируются miRNAs и как они попадают в микропузырьки?

MiRNAs содержат большое семейство РНК длиной в 21 нуклеотид, которые стали ключевыми посттранскрипционными регуляторами экспрессии генов и произвели революцию в нашем понимании посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. miRNAs обрабатываются из первичных транскриптов (pri-miRNAs), которые либо транскрибируются РНК-полимеразой II из независимых генов, либо представляют собой интроны белок-кодирующих генов. Pri-miRs затем обрабатываются в прекурсорные miRNAs (pre-miRs) эндонуклеазами РНК Drosha и Pasha и экспортируются в цитоплазму, где dicer разрезает pre-miRs в зрелые дуплексы miRNA. Способ действия при молчании зависит от распознавания мишеней-мишеней с помощью одноцепочечных микроРНК, которые включаются в комплекс глушителей, индуцированный РНК (RISC). Связывание может зависеть от «семенной» области, состоящей только из нуклеотидов 2-8 только miRNA. Одна miRNA способна регулировать до ста мишеней мРНК и поэтому, по-видимому, организует большое разнообразие клеточных процессов, подобных факторам транскрипции (Lim et al., 2005; Stefani and Slack, 2008), но также в сочетании с факторами транскрипции, (Shalgi et al., 2007).

В отличие от биогенеза miRNA, оборот miRNAs получил только ограниченное внимание на сегодняшний день. Обычно считается, что miRNAs представляют собой высокостабильные молекулы и, экспериментально используя ингибиторы РНК-полимеразы II или истощение ферментов, обрабатывающих miRNA, показали, что периоды полураспада miRNAs в клеточных линиях или в таких органах, как печень или сердце, соответствуют многим часам или даже дни (Gatfield et al., 2009; Großhans and Chatterjee, 2010; Krol et al., 2010; van Rooij et al., 2007).

На стабильность miRNA влияет мотив 3-мерной последовательности или модификация, которые маркируют miRNAs для деградации или защищают их от экзонуклеолитической активности, в зависимости от конкретных miRNAs и тканей. В клетках печени один адениновый остаток, добавленный к 3′-концу miR-122, предотвращает обрезку и защищает miRNA от экзонуклеолитической деградации (Katoh et al., 2009).

Долгое время считалось, что способ связи между клетками и тканями в значительной степени зависит от белковых систем сигнализации, примером которых являются растворимые секретируемые факторы, такие как цитокины, хемокины, нейротрансмиттер, ферменты и гормоны. В принципе было описано два класса систем сигнализации. Одна система зависит от прямого контакта соты (также известного как сигнализация juxtacrine), примером которой являются образование щелевых соединений, межклеточных мостов или синаптических связей. С другой стороны, была описана вторая независимая от контакта система. В последнем случае растворимые факторы либо секретируются в межклеточном пространстве, где они способны воздействовать на близлежащие клетки (также называемые паракринной сигнализацией), либо в циркуляцию, где они могут покрывать большие расстояния и влиять на отдаленные клетки-реципиенты (также известные как эндокринная сигнализация) ,

С недавним открытием микровыпучков был предложен новый механизм клеточной коммуникации, участвующий в контактно-независимой системе. Микровезикулы представляют собой везикулы, которые зарождаются от клеточной мембраны и содержат, в зависимости от их происхождения, белки, мРНК, miRNAs и / или ДНК (Mathivanan et al., 2010a). В отличие от вышеупомянутых и хорошо понятых систем сигнализации на основе белков, микропузырьки имеют то преимущество, что они доставляют не только одно, но и множественные (потенциально синергетические) сообщения, благодаря чему они могут влиять и изменять клеточное поведение на нескольких этапах экспрессии белка позволяя быстро контролировать целевые клетки.

Было обнаружено, что микроверсалки продуцируются различными клетками, например. дентиническими клетками, тучными клетками, В-клетками, Т-клетками, тромбоцитами, но также в нейронах, олигодентроцитах, эпителиальных клетках, эндотелиальных клетках, эмбриональных клетках фибропласта, микроглии, нейроглиальных клетках и нескольких линиях опухолевых клеток, но несколько (Ху et al., 2012; Mathivanan et al., 2010a). Кроме того, они были обнаружены в нескольких жидкостях организма, таких как сыворотка, плазма, моча, окулярные жидкости, амниотическая жидкость, асцит, бронхоальвеолярный лаваж, спинномозговая жидкость, семенная плазма, грудное молоко, слезы и слюна (Cocucci et al., 2009; al., 2012; Mathivanan et al., 2010a; Pant et al., 2012; Zhu and Fan, 2011).

На сегодняшний день три разных типа микропузырьков, по-видимому, кристаллизуются из множества названий (табл. 1): эктосомы, экзосомы и апоптотические пузырьки. В принципе они отличаются их размером, формой, плотностью, происхождением, а также композицией белковой мембраны (Mathivanan et al., 2010a; Thery et al., 2009).

Однако общепринятая номенклатура для микропузырьков еще не установлена, что приводит к запутанной и запутанной терминологии. Например, для смешанной популяции микропузыньков использовалось несколько названий, таких как микрочастицы, микропузырьки, наночастицы, проливающие микропузырьки, эктосомы, экзосомы, экзосомы-подобные везикулы, дексосомы, тектосомы, онкомы, апоптотические пузырьки, апоптотические тела. Совсем недавно мы начали понимать, что в жидкостях организма существуют разные виды везикул и что их необходимо изолировать на основе различий в составе, размере или форме, как это сделано в нескольких последних отчетах (Mathivanan et al., 2010b). Поэтому внимательно изучать метод изоляции везикул, настоятельно рекомендуется при чтении литературы и общепринятой терминологии.

Экзосомы представляют собой небольшие чашевидные мембранные везикулы диаметром 30-100 нм, которые происходят из эндосомального отделения (Simpson et al., 2008, 2009). Это название восходит к 1983 году, когда Пан и Джонстон описали микропузырьки, ответственные за экстернализацию рецепторов во время созревания эритроцитов, которые формируются путем подавления пузырьков везикулы в поздний эндосомальный отдел (Pan and Johnstone, 1983). Такое внутреннее почкование поздней эндосомной предельной мембраны в настоящее время известно для инкапсулирования цитозольного «груза» в внутрипросветные везикулы (ILV), в результате чего образуются крупные мультивезикулярные тела (MVB) (van Niel et al., 2006). MVB, обогащенные ILV, могут либо сливаться с лизосомами, если их содержание предназначено для деградации, либо с плазматической мембраной, при которой ILV высвобождаются во внеклеточное пространство как «экзосомы» (Simpson et al., 2009).

Хотя до сих пор неизвестно, как формирование MVB работает на молекулярной основе, были предложены механизмы.

Первый требует, чтобы механизм ESCRT (комплекс сортировки эндоскома, необходимый для транспорта) включал преимущественно монобиквитированный груз для лизосомальной деградации (Babst, 2005). Образование второго типа MVB ​​основано на альтернативном механизме, включающем липидные плоты, обогащенные сфинголипидным церамидом (Trajkovic et al., 2008). Третий механизм был предложен Rana et al. предполагая, что белки включены специальными мембранными доменами, устойчивыми к моющим средствам, из-за их липидного состава и обогащенного тетраспинаном (Rana and Zöller, 2011).

В зависимости от того, какой механизм или комбинация механизмов будет действовать, к настоящему времени было идентифицировано несколько необходимых компонентов для образования экзосомы, например Ras-связанное в мозге 27a (Rab27a), которое влияет на размер MVB (Ostrowski et al., 2010), Rab27b, который контролирует направление MVB (Ostrowski et al., 2010), Rab35, которое способствует стыковке экзосом с плазматической мембраной (Hsu et al., 2010), субстратом рецептора фактора роста гепатоцитов (Hrs), который необходим для формирования ILV (Razi and Futter, 2006), растворимые рецепторы присоединения N-этилмалеимид-чувствительных факторов (SNARE), которые играют роль в процессе слияния MVB и клеточной плазматической мембраны (Bobrie et al., 2011) и миозинов (Pant et al. , 2012).

Штейн и Луцио определяли эктосомы как правые боковые ориентированные везикулы, содержащие цитозольные компоненты, которые высвобождаются с поверхности полиморфноядерных лейкоцитов, атакованных дополнением (Stein and Luzio, 1991). Сегодня термин «эктосомы» используется более общим образом и определяется как микропузырьки, которые непосредственно зарождаются от клеточной плазматической мембраны. Эктозомы имеют неправильную форму и имеют размер от 100 до 1000 мкм (Mathivanan et al., 2010a). В отличие от плазматической мембраны, из которой они происходят, они вызывают фосфолипид фосфатидилсерин (PS) на их поверхности (Zwaal and Schroit, 1997). Кроме того, они содержат металлопротеиназы, которые, как было показано, влияют на внеклеточное пространство, тем самым способствуя метастазированию опухолей и инвазии, селектинам и интегринам (Coppé et al., 2008; Mathivanan et al., 2010a).

Эктозомы непрерывно продуцируются многими, если не все клетками in vitro, но стимулирующие агенты, способные улучшить их продукцию, различаются между различными типами клеток (Sadallah et al., 2011). Кроме того, они содержат белки, мРНК и miRNAs. Состав зависит от типа клеток, клеточного состояния и стимулирующего агента (Cocucci and Meldolesi, 2011).

Для выпадения эктосомы необходима локальная разборка цитоскелета, а также процесс абсцинирования везикулы (Cocucci and Meldolesi, 2011). Поэтому увеличение цитозольных концентраций Ca2 +, активированных p38 MAPK Curtis et al. (2009), кислотная сфингомиелиназа (Bianco et al., 2009) и ось Rho-ROCK (Pinner and Sahai, 2008), а также регуляторные ферменты calpain, кальцийзависимая цитозольная протеаза (Miyoshi et al., 1996), flipase, floppase, scramblase и gelosin (Enjeti et al., 2008).

Апоптотические пузырьки высвобождаются клетками во время поздней стадии апоптоза, вырываясь из клеточной плазматической мембраны (Beyer and Pisetsky, 2010). Осаждение апоптотических пузырьков осуществляется путем внутриклеточного увеличения гидростатического давления с последующим клеточным сокращением с помощью актомиозина (Charras et al., 2005, 2008). Они имеют диаметр более 50 нм и имеют неправильную форму (Mathivanan et al., 2010a). Они содержат белки, мРНК, miRNAs, а также ДНК и выставляют фосфатидилсерин (Théry et al., 2001).

В 2007 году Валади и его коллеги первыми показали, что miRNAs, помимо мРНК и белков, упаковываются в микропузырьки (Valadi et al., 2007). Удивительно, что содержание miRNA в микропузырьках не обязательно соответствует цитозольному репертуару miRNAs, так как профиль miRNA гепатоцеллюлярных раковых клеток и их микровезикулов отличается (Kogure et al., 2011). Только 134 из 424 клеточных детектируемых miRNAs также были обнаружены в экзосомах гепатоцеллюлярных раковых клеток. Из этих 134 везикулярных miRNAs 25 были выше и 30 miRNAs были менее выраженными по сравнению с уровнями внутриклеточной экспрессии miRNA. Интересно отметить, что 11 микроРНК были идентифицированы только в микропузырьках, что сильно указывает на то, что должен существовать специфический и контролируемый механизм упаковки (Kogure et al., 2011).

Пока что только первые показания к этому механизму известны из исследований с использованием человеческих моноцитов, где мРНК, miRNAs и компоненты RNA-индуцированных глушителей (RISC) сосредоточены в GW-телах, которые являются отличными очагами внутри цитоплазмы, где многие необходимые белки для замораживания гена miRNA накапливаются. Эти GW-тела накапливаются на мембране поздних эндосом и MVB, что может способствовать загрузке РНК в экзосомы, тем самым способствуя межклеточному транспорту или посттранскрипционному контролю внутриклеточных уровней miRNA (Gibbings and Voinnet, 2010). Хотя было обнаружено, что все компоненты RISC локализованы на мембранах поздних эндосом и MVB, только тринуклеотидный повтор, содержащий 6 (TNRC6), pre-miRNAs, фрагменты пре-miRNA-стволовых петель и miRNAs, были обнаружены в экзосомах (Chen et al., 2010; Gibbings et al., 2009). Известно, что TNRC6 непосредственно связывается с Argonaute (Ago), тем самым инициируя распад мРНК (Chen et al., 2009). Мутант TNRC6, отсутствующий на его С-конце, вызывал снижение активности miRNA и накопление miRISC (AGO, miRNA, мРНК и TNRC6), что указывает на то, что его C-конец может быть необходим для диссоциации miRISC (Zekri et al. , 2009). Показано, что связывание с поли (А) -вязывающим белком (PABP), который потенциально связывается на С-конце TNRC6, непосредственно связывается с геном 101 восприимчивости опухоли (TSG101), тем самым обеспечивая связь между комплексом RISC и экзосомами (Schlundt et al., 2009) ,

Интересно, что аналогичные ингибирующие эффекты на диссоциацию miRISC и уменьшенные уровни экзосомальной TNRC6 наблюдались при выкидывании ESCRT, предполагая, что ESCRT необходим для сортировки TNRC6 в экзосомы (Gibbings et al., 2009). Кроме того, ESCRT II может сыграть роль в сортировке miRNA в экзосомах, поскольку он способен напрямую связывать РНК (Irion and St Johnston, 2007). Было найдено суммирование функциональных связей между miRNAs и машиной ESCRT, где RISC, а также ESCRT-комплекс могут работать вместе в общем пути загрузки miRNAs в экзосомы.

Напротив, нейтральная сфингомиелиназа 2 (nSMase2), которая регулирует биосинтез церамида, но не механизм ESCRT, необходима для производства экзосом и их замкнутых miRNAs в человеческих Т-клетках (Mittelbrunn et al., 2011). Это указывает на то, что поглощение miRNAs с помощью механизма ESCRT может быть не единственным механизмом загрузки miRNA и может зависеть от типа и состояния ячейки.

Упаковка miRNAs в эктосомы в настоящее время еще менее понятна. Предполагается, что эктозомы прольются из областей плазматической мембраны, обогащенных липидными плотами, и что в этих регионах накапливаются белки, мРНК и miRNAs, которые должны быть упакованы в эктосомы (Cocucci and Meldolesi, 2011). Однако существует несколько независимых исследований, свидетельствующих о том, что эктозомы в основном содержат мРНК и показывают более низкие уровни miRNAs по сравнению с экзосомами. Skog et al. определяемый в 2008 году биоанализом, что эктосомы, происходящие из клеток глиобластомы, преимущественно содержат мРНК и едва ли miRNAs (Skog et al., 2008).

В любом случае упаковка miRNAs в везикулы является ключевым шагом для защиты miRNAs от вездесущих RNAses во внеклеточном пространстве, что явно необходимо для стабильности внеклеточных miRNAs, которые, как сообщается, более устойчивы к экстремальным температурам, экстремальным значениям pH, продолжительному хранению и (Chen et al., 2008; Mitchell et al., 2008).

После упаковки miRNAs в микропузырьки они могут транспортироваться через интерстиций или даже периферическую кровь (Hunter et al., 2008). Интересно, что микроверсикулярные miRNAs были обнаружены в сыворотке (Skog et al., 2008), грудном молоке (Kosaka et al., 2010) и слюне (Michael et al., 2010). Недавно было показано, что сконструированные микропузырьки, экспрессирующие специфический для нейронов пептид, слитый с поверхностным маркером CD107b, даже способны пересекать гематоэнцефалический барьер и доставлять siRNA мышиным нейронам, микроглиям и олигодендроцитам после их внутривенной инъекции (Alvarez-Erviti et al. ., 2011).

Первыми РНК, которые должны быть доказаны как функционально доставленные и переведенные микропузырьками, были мРНК, происходящие из мышечных тучных клеток. Их везикулярный перенос в человеческие тучные клетки приводил к экспрессии трех мышечных белков в клетках человека (Valadi et al., 2007).

Что касается miRNAs, то в настоящее время несколько независимых исследований показывают, что функциональные микровезикулярные miRNAs поглощаются целенаправленными клетками в достаточном количестве, чтобы подавить перевод целевых генов. Например, в 2010 году группа Pegtel наблюдала микровезикулярный перенос miR-150 из клеток THP-1 в HMEC-1 и последующее молчание его мишени c-Myb в клетках-реципиентах (Zhang et al., 2010).

Эти результаты также дают понять, что наши нынешние процедуры трансфекции могут работать так хорошо, поскольку они просто имитируют естественный перенос РНК и видов ДНК через микропузырьки. Но как микровезикулярные miRNAs поглощаются клетками-мишенями? До сих пор наблюдались два механизма.

Экзосомы могут переноситься между дендритными клетками (DC) и поглощаются слиянием мембран. Через экспрессию GFP-меченого белкового маркера-маркера с экскрементами клетками происхождения плазмидная мембрана-реципиент обнаруживала флуоресцирующие GFP-образцы после поглощения exosomal. Это делается доказательством того, что везикулы поглощаются мембранным слиянием (Montecalvo et al., 2012).

При помощи жидкостной клеточной микроскопии Tian et al. что микровезикулы из клеток PC-12 крысы могут эффективно поглощаться эндоцитозом и, следовательно, переноситься в перинуклеарную область, возможно опосредованную цитоскелетом (Tian et al., 2010). Аналогичным образом, мы недавно наблюдали снижение поглощения микроорганизмов, происходящих из эндотелиальных клеток мезенхимальными стволовыми клетками человека (MSC), когда эндоцитоз MSC блокировался сверхэкспрессией доминантной отрицательной динамин-конструкции (K44A) (Schraml et al., Неопубликованные данные) ,

В последние годы были продемонстрированы несколько функций микропузырьков, в том числе влияние на рост клеток, пролиферацию, развитие, дифференцировку и гибель клеток, а также на коагуляцию, иммунологические процессы, вирусные инфекции, прионные инфекции и прогрессирование рака (Janowska-Wieczorek et al., 2005) , Vlassov et al., 2012; Zhu and Fan, 2011). В настоящее время существует несколько примеров, свидетельствующих о том, что перенос miRNAs в клетки-мишени приводит к изменениям поведения клеток-мишеней, что указывает на то, что микровезикулярные miRNA действительно делают часть системы связи клетки с клеткой. Такие примеры приходят главным образом из исследований в области рака, где микровыпучки, выделенные из линии метастатического рака желудка AZ-P7a, выделяют повышенные уровни семейства miRNA let-7 по сравнению с низким метастатическим AZ-521. Известно, что miRNAs-7 могут функционировать при подавлении опухоли, поскольку они нацелены на онкогены RAS и HMGA2. Предполагается, что метастатические клетки AZ-P7a высвобождают let-7 miRNAs через микропузырьки, чтобы избавиться от этих опухолевых супрессивных miRNAs и сохранить свой собственный опухолегенез (Ohshima et al., 2010).

Аналогичным образом существует несколько примеров в иммунной системе. Было показано однонаправленное перенос miRNA в положительных экзосомах CD63, полученных из Т-клеток, в антиген-представляющие клетки (Mittelbrunn et al., 2011). Кроме того, miRNAs, циркулирующие в грудном молоке человека, могут поддержать развитие иммунной системы младенцев (Kosaka et al., 2010), а перенос miRNA микропузырьками также важен для вирусной инфекции или защиты (Pegtel et al., 2010).

Недавно сообщалось, что в обоих случаях репликативное и связанное с повреждением клеток старение клеток увеличивает общую секрецию, называемую SASP, которая характеризуется секрецией широкого спектра факторов, включая пептидные гормоны, а также высвобождение микропузырьков ( Acosta et al., 2008a, 2008b; Campisi, 2008; Campisi and d’Adda di Fagagna, 2007). Следует отметить, что эта секреторная активность и образование микроузлов в стареющих клетках также регулируется p53 (Yu et al., 2006).

Известно, что miRNAs оказывают определенное влияние на процесс старения (Gorospe and Abdelmohsen, 2011; Hackl et al., 2010), но мало что известно в отношении системной среды. До сих пор в нескольких исследованиях сравнивались образцы от молодых и здоровых пожилых людей разных видов от червя до тканей человека в отношении профиля внутриклеточной экспрессии miRNA. Действительно, разные уровни экспрессии нескольких miRNAs были обнаружены с возрастом, например, кластер miR-17-92 (Hackl et al., 2010) let-7 (Peng et al., 2012) и miR-34a (Li et al. ., 2011). Урегулирование специфических miRNAs, по-видимому, вызывает старение в клетках, в том числе miR-34a в клетках человека (Christoffersen et al., 2010), miR-203 в клетках меланомы (Noguchi et al., 2012) и miR-101, miR-137 и miR-668 в кератиноцитах (Shin et al., 2011).

Хотя в процессе старения было опубликовано мало информации о секреции miRNA, становится все более очевидным, что miRNAs могут быть биомаркерами нескольких возрастных заболеваний. Поскольку некоторые из этих заболеваний, по-видимому, связаны с увеличением количества стареющих клеток, мы суммируем следующие текущие знания о miRNAs, которые были обнаружены в сыворотке или плазме таких пациентов (рис.1).

Обещания miRNAs как диагностики и терапии очень высоки, даже если мы только в начале разработки этих видов РНК в биомедицинских инструментах. Тем не менее, мы убеждены в том, что потребность в персонализированной медицине будет способствовать поиску и идентификации одиночных миРНК и / или миРНК-сигнатур, характерных для конкретных пациентов, и, таким образом, поможет в руководстве терапией. Это кажется насущной необходимостью, учитывая, что 90% доступных препаратов эффективны только у 40% пациентов.

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти и являются причиной многих состояний, которые серьезно влияют на качество жизни в пожилом возрасте. Эндотелиальные клетки, по-видимому, противодействуют этому, поскольку они выделяют микропузырьки, содержащие miR-143 и miR-145, которые принимаются VSMC, предотвращающие де-дифференцировку VSMC (Hergenreider et al., 2012). Инъекция везикул, содержащих обе miRNAs в мыши ApoE — / -, действительно приводила к уменьшению образования атеросклеротических поражений (Hergenreider et al., 2012). Кроме того, было обнаружено, что дерегулирование обеих miRNAs способствует аберрантной пластичности VSMC, возникающей во время сосудистых заболеваний (Jakob and Landmesser, 2012).

Во время атеросклероза miR-126, как было установлено, секретируется через апоптотические пузырьки эндотелиальными клетками. Это, в свою очередь, усиливает продуцирование противовоспалительного хемокина CXCL12, а также его рецептора CXCR4 и способствует вербовке эндотелиальных клеток-предшественников, предположительно, в качестве защитного механизма, где клетки-предшественники помогают поддерживать тканевый гомеостаз (Zernecke et al., 2009) , Защитную роль miR-126 продемонстрировали также in vivo, когда апоптотические пузырьки, обогащенные miR-126, происходящие из эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), были введены в мышей с высоким содержанием жиров ApoE — / -, что приводило к уменьшенному размеру поражения и макрофагу накопление через экспрессию CXCR4 (Zernecke et al., 2005).

Сообщается о контринтуитивном снижении активности miR-126 в плазме пациентов, страдающих болезнью коронарной артерии (Fichtlscherer et al., 2011). Можно предположить, что целевой перенос везикулярных miRNAs на участки атеросклеротических поражений может привести к уменьшению обнаружения свободно циркулирующих уровней miRNA (Zhu and Fan, 2011).

Кроме того, микровезикулы также защищают от прогрессирования хронического повреждения почек за счет ингибирования капиллярной рефракции, гломерулосклероза и тубулоинтерстициального фиброза путем доставки проангиогенных miR-126 и miR-296 (Cantaluppi et al., 2012).

В любом случае, эти исследования, взятые вместе, указывают на то, что эндогенные производные miRNA, несущие микропузырьки, могут способствовать прогрессированию атеросклероза.

Болезнь Альцгеймера является наиболее частым нейродегенеративным заболеванием у людей. Он характеризуется случаем амилоидных бляшек, которые являются нерастворимыми внеклеточными отложениями, содержащими бета-пептид амилоида (Aβ) (Cai et al., 1993). У пациентов с болезнью Альцгеймера типичные экзосомальные маркеры были обнаружены в местах амилоидных бляшек (Rajendran et al., 2006), давая первое указание на то, что микровезикулы могут быть вовлечены в нейродегенеративные заболевания. Действительно, микровезикулы, как было показано, секретируются несколькими типами нейронных клеток, тем самым способствуя физиологии и синаптической пластичности центральной нервной системы (Bellingham et al., 2012). Следует также отметить, что микровезикулы были способны пропускать гематоэнцефалический барьер и доставлять функциональную сиРНК нейронам (Alvarez-Erviti et al., 2011), что открывает возможность перекрестного разговора через это обычно очень плотный и избирательный барьер.

Кроме того, было обнаружено, что микровезикулы от пациентов с болезнью Альцгеймера обогащены Aβ, его предшественником белка APP и некоторыми компонентами γ-секретазы и, таким образом, могут способствовать распространению болезни Альцгеймера (Vella et al., 2008). Удивительно, что микровыпучки, выделенные из спинномозговой жидкости больных пациентов, содержат около 60 дифференциально экспрессируемых miRNAs по сравнению с здоровыми контрольными группами (Cogswell et al., 2008). До сих пор неясно, могут ли эти miRNAs быть вовлечены также в патогенные механизмы болезни Альцгеймера, но результаты снова подтверждают важность микровезикулярных miRNAs, которые могут служить, по крайней мере, как биомаркеры таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера.

Число пациентов, страдающих T2DM, резко возрастает в развитых и развивающихся странах (Zimmet et al., 2001).

Имеются первые признаки нерегулируемых микровезикулярных miRNAs в плазме пациентов, страдающих T2DM, по сравнению с контролируемыми по возрасту и полуконтролируемому контролю и обеспечивают потенциальную диагностическую сигнатуру, содержащую 5 miRNAs, включая снижение уровня miR-126 (Zampetaki et al., 2010).

Интересно отметить, что уже было продемонстрировано, что увеличение уровня miR-126 способствует передаче сигналов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и оказывает положительное влияние на сосудистую защиту (Zernecke et al., 2009). Известно, что моноциты пациентов, страдающих T2DM, демонстрируют пониженную чувствительность VEGF, которая способствует ухудшению развития коллатерального сосуда. Этот эффект может быть связан с уменьшением микровезикулярного переноса miR-126 в моноциты (Zampetaki et al., 2010).

До сих пор ни одно исследование не рассматривало секретируемую миРНК при костных расстройствах у пожилых людей, однако, возможно, что miRNAs также будут связаны с этим заболеванием, так как известно, что несколько miRNAs регулируются во время остеогенной дифференцировки (обзор Schraml and Grillari, 2012).

Недавно наша группа могла показать, что микропузырьки, происходящие из стареющих эндотелиальных клеток, обрабатываются MSC, тем самым ингибируя остеогенез через miR-31, доставку Weilner, Schraml и Grillari, неопубликованные наблюдения. Кроме того, было обнаружено, что циркулирующие уровни miR-31 значительно увеличиваются в плазме доноров старше 55 лет, а также у пациентов, страдающих остеопенией, по сравнению с донорами моложе 25 лет Вайльнером, Шрамлом и Гриллари, неопубликованными наблюдениями.

Эти результаты могут обеспечить связь между возрастом, связанным с уменьшением костного исцеления или остеопенией, и накопления стареющих эндотелиальных клеток с возрастом in vivo.

Еще совсем недавняя идентификация секретируемых и / или микровезиковых miRNAs в системной среде, в интерстициальных жидкостях или других жидкостях организма представляет собой грозный инструмент для идентификации и использования miRNAs в качестве диагностических сигнатур. Разработка таких подписей вызывает большую озабоченность, поскольку персонализированные медикаменты и терапия зависят от «персонализированных» диагностических инструментов. Представленные здесь примеры miRNAs, которые связаны или иногда даже причинно связаны с возрастными заболеваниями, могут предоставить такой набор биомаркеров. Поскольку в настоящее время в клинических исследованиях используются небольшие некодирующие РНК, miRNAs, безусловно, также найдут применение в качестве терапевтических целей. Специально для тех miRNAs, которые циркулируют в системной среде, таргетирование на наркотики может быть сравнительно легко из-за хорошей доступности в крови.

Эта работа была поддержана проектом GEN-AU 820982 «Некодирующие РНК» и проектом FWF P 24498-B20 Австрийского научного фонда и CE.R.I.E.S. к JG, а также гранты от Герцфельдерского Familienstiftung до RGV.

Сенситивные донорные клетки способствуют секреторному фенотипу, ассоциируемому с пожизненным секретом (SASP), выделяя не только растворимые белки, но также микропузырьки либо в паракрин, эндокринную, либо синаптическую манеру. Эти пузырьки поглощаются клетками-реципиентами и могут вызывать или вносить вклад в возрастные патологии, такие как остеопороз, атеросклероз, болезнь Альцгеймера или сахарный диабет, тип 2.

Сравнение типов микропузырьков.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *