Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Диабетическая pdx1-мутантная рыбка данио оставляет консервативные ответы на перегрузку питательных веществ и антигликемическое лечение

Diabetic pdx1-mutant zebrafish show conserved responses to nutrient overload and anti-glycemic treatment
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4585597/

Настоящее направление: отделение нейрохирургии, Инсбрукский медицинский университет, Инсбрук, Австрия.

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Сахарный диабет характеризуется нарушенным гомеостазом глюкозы из-за потери или дисфункции бета-клеток, продуцирующих инсулин. В этой работе мы характеризуем развитие и функцию островки поджелудочной железы у мудреца-даниоса для pdx1, гена, который у человека связан с генетическими формами диабета и связан с повышенной восприимчивостью к диабету типа 2. Pdx1-мутант рыбок данио имеет ключевые диабетические свойства восстановленных бета-клеток, снижение инсулина и повышенную глюкозу. Гипергликемия реагирует на фармакологическое антидиабетическое лечение и, как часто видно на моделях диабета млекопитающих, бета-клетки мутантов pdx1 проявляют чувствительность к перегрузке питательных веществ. Эта уникальная генетическая модель диабета является новым инструментом для выяснения механизмов гипергликемических патологий и позволит тестировать новые терапевтические вмешательства в модельном организме, которые поддаются высокопроизводительным подходам.

Сахарный диабет, характеризующийся нарушенной функцией бета-клеток поджелудочной железы, является одной из основных проблем со здоровьем, затрагивающих все возрастающую долю населения мира1. При сахарном диабете 1 типа происходит иммунное опосредованное разрушение бета-клеток, что приводит к полной зависимости от экзогенного инсулина. Сахарный диабет 2 типа (T2DM) является наиболее распространенной формой, составляющей более 90% всех случаев диабета2. Он имеет сложную, многофакторную этиологию и обладает нарушенной функцией бета-клеток в сочетании с периферической резистентностью к инсулину1. Дополнительные редкие подтипы диабета являются моногенными и являются результатом мутаций в факторах бета-клеток с важными ролями как в развитии поджелудочной железы, так и в зрелой функции3. Доминирующие генетические формы, которые становятся симптоматическими в подростковом возрасте или в раннем взрослом возрасте, также упоминаются как диабет молодости («МОДИ»), тогда как неонатальный диабет обычно проявляется в первые 6 месяцев жизни и может быть результатом как доминантных, так и рецессивных мутаций24 , Текущая терапия диабета включает добавку инсулина и препараты, которые усиливают секрецию инсулина или реакцию на ткани. Лечение обеспечивает некоторую защиту и улучшает острые эффекты, но многие из них имеют нежелательные побочные эффекты, и они, как правило, недостаточно предотвращают накопление повреждений основных систем органов, что имеет серьезные медицинские последствия.

Модели диабета животных являются незаменимым инструментом для анализа биологических механизмов и тестирования потенциальных новых терапевтических средств. Зебраист как модельный организм предлагает преимущества легкости обслуживания, способности к генетическим и фармакологическим манипуляциям и прозрачности, что позволяет визуализировать процессы болезни in vivo. Для многих медицинских проблем, включая диабет, существует настоятельная необходимость в экономичных методах обнаружения новых лекарств. Недавние исследования выявили сходство в физиологии органов и метаболизме между рыбой данио и млекопитающими56, подчеркнув потенциал для разработки новых моделей болезней.

Ранее описанные эмбрионы рыбок данио, истощенные для факторов, связанных с поджелудочной железой (с использованием антисмысловых морфолинов), включают примеры дефицита бета-клеток57, но эти подходы ограничены кратковременной и неполной эффективностью морфолиновых нокаутов или ранних летальных эффектов развития для других систем органов. Альтернативные методы для получения гипергликемических рыбок данио полагались на инкубацию в растворах с высоким содержанием глюкозы8910 и хирургическую или токсин-опосредованную абляцию1112131415. При таких вмешательствах часто наблюдается изменчивость ответов животных, а регенеративный ответ бета-клеток поджелудочной железы после абляции исключает долгосрочные исследования12131415.

Панкреатический и дуоденальный гомеобокс 1 (Pdx1, также известный как фактор-промотор инсулина 1, IPF1) имеет ключевое значение как для развития поджелудочной железы, так и для зрелой функции бета-клеток и выживаемости16. В человеческих случаях мутации PDX1 степень эндокринной дисфункции и характер гипергликемического заболевания зависят от точного генетического поражения17. Отсутствие PDX1 представляет собой генетическое поражение формы 4-го типа MODY (MODY4) в гетерозиготном состоянии и вызывает агонизацию поджелудочной железы в гомозиготном состоянии, в то время как частичные мутации с потерями функции повышают риск развития диабета типа 2, но не напрямую вызывают заболевание118192021. В последнее время гомозиготные гипоморфные мутации PDX1 были обнаружены в случаях неонатального диабета, который, как вариант, характеризуется субклинической экзокринной дисфункцией поджелудочной железы2223. Подобные фенотипические градации повторяются в моделях мыши с различными комбинациями мутаций Pdx117.

У рыбок данио, как у мышей, pdx1 экспрессируется поджелудочковыми предшественниками во время развития, а экспрессия сохраняется в зрелых бета-клетках. Недавние исследования подтвердили аналогичные требования к Pdx1 в развитии бета-клеток между рыбой данио и млекопитающими, в частности, что Pdx1 необходим для формирования более поздней популяции («второй волны») окончательных эндокринных клеток24. Zebrafish Pdx1 регулирует эмбриональный метаболизм глюкозы1025 и активирует экспрессию гена инсулина в репортерных анализах26.

В этой работе мы описываем pdx1-мутантную рыбу данио, недавно созданную в рамках проекта мутаций Zebrafish27, как новую модель диабета. Эти мутанты, которые имеют нулевую мутацию в pdx1, могут выживать до взрослой жизни как гомозиготы, но имеют уменьшенный размер тела и уменьшают жизнеспособность. Анализ фенотипа поджелудочной железы показал, что бета-клетки и уровни инсулина заметно снижены, а экзокринная поджелудочная железа указана, но ацинальная дифференциация нарушается. Важно отметить, что настойчиво повышенная глюкоза в pdx1-мутантах реагирует на лечение антидиабетическими препаратами. Наконец, используя протокол питания с высоким содержанием жиров, мы показываем, что бета-клетки мутантов pdx1 чувствительны к питательным веществам и подвергаются повышенному апоптозу. В целом, эта новая генетическая модель диабета позвоночных позволит провести тестирование новых терапевтических вмешательств и послужит новым инструментом для выяснения биологических механизмов, влияющих на токсические эффекты устойчивой высокой глюкозы.

Учитывая центральную роль Pdx1 в развитии и функционировании бета-клеток и многие преимущества рыбок данио для моделирования болезней человека, мы охарактеризовали данио с мутацией в pdx127. Мутантный аллель pdx1, обозначенный pdx1sa280, дает транскрипт с преждевременной остановкой в ​​кодоне 37 (Y37X), который находится в высококонсервативном N-концевом трансактивационном домене (фиг.1a). Генотипирование взрослых потомков (6 месяцев) из кроссовых гетерозигот pdx1sa280 выявило выживших гомозигот с ожидаемым нуклеотидным изменением (рис.1b), однако гомозиготный генотип присутствовал в сокращенных количествах по сравнению с ожидаемыми коэффициентами Менделя (рис.1c) ,

Мы также отметили, что гомозиготы уменьшали размер тела по сравнению с гетерозиготными и дикими братьями. В трехмесячный возраст показатели массы тела, массы тела и массы тела (масса / длина2) были значительно снижены у гомозигот относительно гетерозиготных и диких типов. Это наблюдалось для рыб-близнецов, поднятых в танках смешанного генотипа (дополнительный рис. 1a-c), а также для потомков от гомозиготных и родственных дивертированных интросов, возникающих параллельно при равной плотности (рис.1d, e). Поэтому разница в размерах не была связана с уменьшением способности мутантов конкурировать за пищу. Дефицит инсулина связан с уменьшением роста плода, которое обычно наблюдается при неонатальном диабете4. Однако анализ личинок свободного плавания через 12 дней после оплодотворения (dpf) показал нормальную морфологию и значительную разницу в длине тела (стандартная длина, SL) между диким типом и мутантами (4,7 ± 0,3 мм для WT и 4,5 ± 0,3 мм для MU, p = 0,17, дополнительная фиг.2a, b). Затем личинки вводят период (~ один месяц) высокого спроса на питание и быстрый рост1428. За это время мы обнаружили разницу в размерах между мутантами и дикими типами. Через 5 недель длина тела сильно варьировалась, но в среднем у мутантных рыб (SL11.2 ± 1.6 мм, n = 14) уменьшалась по сравнению с диким типом (SL12.8 ± 3.6 мм, n = 12, p <0,05 , Тест Манна-Уитни, дополнительный рисунок 2в).

У мышей нокаут Pdx1 характеризуется провалом развития поджелудочной железы293031. Чтобы определить, действительно ли это относится к мутанту pdx1 данио, мы выполнили иммуногистохимию для маркеров поджелудочной железы при 12dpf. Мы обнаружили, что экзокринная поджелудочная железа развилась у мутантов, как показано иммуноокрашиванием для CarboxypeptidaseA (CPA), как и эндокринный остров, как очерчено инсулиновыми (Ins) -положительными клетками в головке поджелудочной железы (дополнительный рисунок 2d).

Чтобы более подробно оценить экзокринную поджелудочную железу, мы провели гистологический анализ и иммуноокрашивание парафиновых отделов личиночной поджелудочной железы 12dpf. Как и у млекопитающих, поджелудочные ацинарные клетки у рыбок данио характеризуются базально расположенным ядром и эозинофильной апикальной областью, где сосредоточены секреторные гранулы, содержащие пищеварительные ферменты32 (фиг.2с, вставка, 2 м, вставка). Ацинарные клетки и их лобулярная организация были обнаружены у личинок дикого типа в окрашенных средах H & E (рис. 2c). В иммуноокрашенных срезах наблюдалось базальное выравнивание ядер, а сигнал CPA концентрировался апикально, колокализуясь экзокринными гранулами (рис. 2е, г). В pdx1 — / — мутантах эти гистологические особенности экзокринной ткани и ацинарной организации не были очевидными (рис.2d), а образец иммуноокрашивания CPA был неоднородным и прерывистым (рис.2f, h). У взрослых (8-18 месяцев) островка состояла преимущественно из экспрессирующих бета-клеток инсулина (Ins) с периферически расположенными глюкагонами (Gcga) -экспрессирующими альфа-клетками (рис. 2i-1). Поляризованные экзокринные клетки с ацинарной организацией могут быть идентифицированы в окрашенных H & E участках поджелудочной железы взрослых животных (рис. 2m). В pdx1 — / — мутантных взрослых экзокринные клетки не имели поляризации, а ацинальная организация была трудно различима (n = 7/7, фиг.2n).

Для оценки фенотипа эндокринного островка мутантной рыбы pdx1 были исследованы развитие и функция поджелудочной железы во время эмбриональных и личиночных стадий. У рыбок данио ранние «первые волны» образуют основной островка около 24 hpf через слияние дисперсных предшественников, в то время как клетки «второй волны» сначала появляются около 3 dpf и составляют большинство бета-клеток у взрослых 333435. Экспрессирующие островковые клетки могут быть обнаружены у мутантов pdx1 при 36 hpf (дополнительная фиг.3), хотя число клеток было уменьшено у мутантов по сравнению с контрольными (46-6 клеток / эмбрион в контроле по сравнению с 40 ± 5 клетками / эмбрионом в мутанты, р <0,05, t-тест).

Чтобы облегчить дальнейшие исследования, мы получили трансгенную форму, содержащую мутантный аллель pdx1sa280 в комбинации с трансгеном TgBAC (NeuroD: eGFP) nl136 (далее именуемым NeuroD: eGFP), который экспрессируется в эндокринных предшественниках и дифференцирует эндокринные клетки724. Иммуногистохимия эмбрионов 3,5 dpf с антителом, специфичным к N-концевой части белка Pdx1, в сочетании с антителом к ​​GFP, локализовала остров и продемонстрировала отсутствие обнаруживаемого белка Pdx1 у мутантов (дополнительная фиг.4). Для дальнейшей оценки образования эндокринной клетки у мутантов pdx1 мы провели окрашивание иммунофлюоресценции NeuroD: eGFP; pdx1 — / — мутант и NeuroD: eGFP; pdx1 + / + контролировали эмбрионы при 3 dpf. Общий размер островка был заметно снижен у мутантов, как и экспрессия инсулина (фиг.3а). Инсулин-продуцирующие клетки были снижены на 28%, из 36 ± 9 клеток / эмбриона в контроле по сравнению с 26 ± 5 клетками / эмбрионом у мутантов (фиг.3b).

Поскольку Pdx1 играет роль в распределении судьбы островковых клеток3738, а потеря Pdx1 связана с трансформациями идентификации клеток3940, мы оценивали мутанты pdx1 для продуцирующих альфа-клеток глюкагона (Gcga) при 72 hpf (дополнительная фиг.5a-d). Число альфа-клеток было снижено с 29 ± 4 в контроле до 23 ± 6 у мутантов (p <0,05, t-тест, дополнительный рисунок 5e). В то время как количество клеток было уменьшено у мутантов, отношение альфа-бета-клеток не было значительно изменено (0,81 в контроле против 0,93 у мутантов, p = 0,18, t-тест, дополнительный рис.5f).

Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что ранняя спецификация эндокринных клеток была в основном неповрежденной в мутантах pdx1, как ранее сообщалось в pdx1 knockdown2441. Тем не менее, большинство бета-клеток возникают после начала питания при 5 dpf14, таким образом, после того, как стадии развития доступны для инъекций морфолинонов. Затем мы спросили, могут ли поздние формы эндокринные клетки дифференцироваться в pdx1-мутантах. Чтобы посмотреть на образование новых клеток в ответ на питательные стимулы, контрольные и мутантные эмбрионы, трансгенные для NeuroD: eGFP, подавали личиночный порошок (SDS100 «жарящая пища») с 5 dpf до 7 dpf и исследовали при 8 dpf. Мы оценивали как вторичные островки eGFP-положительные клетки и кластеры, расположенные вне основного островка и хвоста поджелудочной железы (рис. 3в). Мутанты показали минимальную индукцию новых островковых клеток (0,5 ± 0,7) по сравнению с 5,6 ± 3,6 вторичных островков в контроле (рис. 3d).

Бета-клетки второй волны возникают из-за ассоциированных с панкреатикой протонов, которые поддерживаются в недифференцированном состоянии сигналом Notch3435. Чтобы проверить, можно ли непосредственно активировать дифференцировку этих предшественников, мы применили ингибитор Notch Ly411575 к дикому типу, гетерозиготным и мутантным эмбрионам, трансгенным для NeuroD: eGFP, чтобы индуцировать и визуализировать новые дифференцирующие эндокринные клетки, как описано ранее 2442. Мы лечили эмбрионы с 4 dpf до 6 dpf и изучали эмбрионы живым микрокроскопом для вновь образованных eGFP-положительных клеток и кластеров, как описано выше. Практически нет новых островковых клеток, образованных у мутантов (0,6 ± 0,5 клеток / эмбрион), по сравнению со средним значением 9,4 ± 5,2 вторичных островков у гетерозигот и 11,4 ± 6,2 у диких типов (рис.3е, f). Гетерозиготность Pdx1 не давала различий в потенциале формирования островковых клеток по сравнению с состоянием дикого типа (фиг.3е, f). Следует отметить, что гораздо большее количество клеток может быть индуцировано для дифференциации через фармакологическое ингибирование Notch по сравнению с дифференцировкой в ​​нормальных условиях кормления (рис.3f по сравнению с d).

Отсутствие дифференцировки эндокринной клетки, вызванной Notch, может быть связано с отсутствием чувствительных к Notch клеток протока или из-за неспособности этих клеток дифференцироваться в эндокринные клетки. Чтобы отличить эти возможности, мы проанализировали проток поджелудочной железы иммуногистохимией. Мы обнаружили, что мутанты pdx1 образовали проток поджелудочной железы, как определено окрашиванием антителом 2F1142 (дополнительная фиг.6а, b). Мы дополнительно проанализировали клетки протока, исследуя экспрессию Nkx6.1, которая, как было показано, колокализуется с клетками, чувствительными к поджелудочной железе43. В личинках 6 dpf обнаружены клетки, экспрессирующие Nkx6.1, окружающие островков и по всей длине хвоста поджелудочной железы (дополнительная фиг.6c, c ‘, e). Nxk6.1-позитивные клетки были одинаково распределены внутри головы поджелудочной железы и хвоста мутантов pdx1 (дополнительная фиг.6d, d ‘, f). В целом, это говорит о том, что Pdx1 не требуется для образования протоков, а скорее для дифференциации связанных с протоком, Notch-чувствительных клеток-предшественников к судьбе эндокринных клеток.

Свободная глюкоза в кровообращении поддерживается в узком диапазоне концентраций для обеспечения немедленных метаболических потребностей, а избыток глюкозы поглощается клетками через действие инсулина. Так как потеря функции Pdx1 у мутантов уменьшала число бета-клеток и блокировала образование новых островковых клеток, мы в дальнейшем рассмотрели, как это повлияло на метаболический гомеостаз во время дальнейшего развития. Мы использовали биохимическое измерение свободной глюкозы, чтобы указать на статус регуляторной активности глюкозы, как это было описано ранее у зебрафиша2544.

Сначала мы измеряли уровни глюкозы при 5 дпф, до которых питательные вещества преимущественно получали из эмбрионального желточного мешка28. При 5 dpf глюкоза в среднем увеличивалась в 2,3 раза у мутантов по сравнению с контролем (фиг.4а). При 15 dpf после 10 дней роста в статической системе воды и получения высокопитательной диеты (пища SDS100 и парамеций) уровни глюкозы были в 3,2 раза выше у мутантов по сравнению с контрольными (фиг.4b). Повышение уровня свободной глюкозы поддерживалось у мутантов при измерении в возрасте 5 недель (в 2,3 раза, фиг.4с). Уровень глюкозы в крови повышался в 2,7 раза у взрослых мутантов pdx1 (4-8 месяцев), составляя в среднем 219 мг / дл, по сравнению с 80 мг / дл в контроле (фиг.4d). Измерения уровня глюкозы в крови, полученные у взрослых дикого типа, были согласуются с ранее зарегистрированными значениями 845, тогда как значения выше 200 мг / дл, наблюдаемые у мутантов pdx1, были аналогичны показателям у рыбок данио после бета-клеточной абляции1113. Чтобы исследовать, как дисрегуляция глюкозы коррелирует с экспрессией инсулина, мы провели окрашивание антител инсулина поджелудочной железы при 15 дпф. Экспрессия инсулинового белка снижалась в среднем на 50% по сравнению с контролем (фиг.4е). Через 5 недель уровни транскрипта инсулина во всех экстрактах животных были снижены на 90% (p <0,005, фиг.4f). В целом, повышенные уровни глюкозы были обнаружены у pdx1 мутантов от эмбриональных через взрослые стадии, что указывает на стойкое гипергликемическое состояние.

Сульфонилмочевины являются антигликемическими агентами, которые связывают АТФ-зависимые калиевые каналы, вызывая деполяризацию мембраны, приток кальция и секрецию инсулина бета-клеток46. Они используются для лечения T2DM у пациентов, обладающих функцией остаточных бета-клеток, и особенно эффективны в случаях MODY из-за дефектов факторов транскрипции, важных для развития и функции бета-клеток3. Чтобы определить чувствительность гипергликемии к мутантам pdx1 к фармакологическим модуляторам глюкозы, мы обработали 5 dpf мутантных личинок с увеличением концентрации препарата сульфонилмочевины tolbutamide. 2-часовая обработка 250 мкМ имела незначительные эффекты, а 500 мкМ снижал уровень глюкозы на 36% (фиг.4g). Таким образом, эти данные также подтвердили сходство нашей модели диабета данио-рыбок с системой млекопитающих.

Перекармливание и ожирение способствуют и усугубляют диабетический фенотип у млекопитающих247. Предыдущие исследования показали, что перекорм может вызвать ожирение у взрослых рыбок данио 48, но подобные реакции у более молодых рыб не были продемонстрированы. Поэтому мы проанализировали реакцию личинок дикого типа и pdx1-мутантов на протоколы перекармливания. Дополнение стандартной личиночной диеты парамеция и личиночного порошка (55% белка, 14% липидов) с увеличением концентрации яичного желтка (17% белка, 31% липида, диета с высоким содержанием жиров, HFD) с 5 dpf до 11 dpf вызвало заметное изменение в появлении личинки и значительном увеличении длины тела по сравнению с личинками, кормящими только личиночным порошком (MIN) (дополнительная фиг.7a, b). В частности, длина тела личинки увеличивалась на 15-17% с ежедневным добавлением яичного желтка 5-25 мкг / мл. Затем мы определили, влияет ли HFD на pdx1-мутантов. При применении нашего протокола HFD (личиночный порошок, парамеций и 10 мкг / мл яичного желтка, 1 раз в день) в течение 7 дней (5dpf до 11dpf) оба контроля и мутанты pdx1 показали увеличение длины, а также вес при оценке при 12dpf ( Дополнительная фиг.7c, d). Разница в длине и весе между мутантными рыбами pdx1, выраженными между MIN и HFD, статистически не отличалась от аналогично обработанных контролей (дополнительная фиг.7c, d).

Пролиферация бета-клеток сообщается в моделях диабета мышей как ранний ответ на увеличение метаболического спроса49. Пролиферацию клеток в ответ на перегрузку питательных веществ изучали путем измерения включения EdU, по сравнению с личинками, оставшимися незаполненными или кормили порошком плюс 20 мкг / мл раствора яичного желтка (HFD) в течение 48 часов, начиная с 5 дпф. Оба регулятора и мутанты pdx1, которые не были поданы, показали редкие пролиферативные бета-клетки (дополнительный рисунок 8а, слева). Наблюдалась тенденция к увеличению распространения с кормлением, но это не достигало статистической значимости в любой из групп (Дополнительный рисунок 8а, справа, б).

В более поздних стадиях диабета типа 2 наблюдается снижение массы бета-клеток, что в значительной степени связано с увеличением апоптоза бета-клеток475051. У личиночных рыбок данио кратковременное перекармливание раствором яичного желтка активирует дифференцировку эндокринных прародителей, не вызывая апоптоза52. Отсутствие токсического эффекта после избытка питания, возможно, объясняется кратковременностью лечения и энергией нормальных бета-клеток. Поэтому мы исследовали, будут ли бета-клетки мутантов pdx1 проявлять измененную чувствительность к перекармливанию. NeuroD: eGFP +; pdx1 — / — мутант и NeuroD: eGFP +; Контрольные личинки pdx1 + / + кормили порошком плюс 20 мкг / мл раствора яичного желтка (HFD) в течение трех дней (5 dpf до 7 dpf), а островки исследовали на апоптотические клетки с помощью маркировки TUNEL при 8 dpf (фиг.5a). Мы количественно определяли клетки, ко-экспрессирующие GFP в островке, вместо того, чтобы искать инсулиновый белок, поскольку инсулин часто нарушается в бета-клетках, подверженных гипергликемии5354. Кроме того, области окрашивания инсулина могут быть трудно окончательно ассоциировать с фрагментированными клетками, идентифицированными с помощью теста TUNEL. Клетки TUNEL + идентифицировали в островке у 43% мутантных эмбрионов (n = 14) и реже у эмбрионов дикого типа (15%, n = 13, фиг.5b). В целом, мы обнаружили скорость 2% апоптотических клеток в островке мутантов, питаемых HFD, по сравнению с 0,4% в контроле дикого типа, питаемых HFD (рис.5c).

Чтобы оценить изменения в островке после длительного перекармливания, контрольные личинки NeuroD: eGFP +; pdx1 — / — и NeuroD: eGFP +; pdx1 + / + кормили 10 мкг / мл яичного желтка, дополненного HFD в течение 7 дней (от 5 dpf до 11 dpf ) или только личиночного порошка (MIN) и исследовали путем иммуноокрашивания для клеток GFP + островков и экспрессии инсулина (фиг.5а). Органы контроля дикого типа, которым вводили HFD, увеличивали положительные островковые клетки eGFP + и больше экспрессии инсулина по сравнению с личинками, питавшими диету MIN (рис.5d, e). Напротив, мутанты pdx1, получавшие HFD, имели меньше клеток eGFP + и уменьшали экспрессию инсулина по сравнению с мутантами, питавшими диету MIN (фиг.5d, e). Среднее количество клеток, экспрессирующих инсулин, составляло 30 ± 8 клеток в МИН, подаваемом по сравнению с 24 ± 6 клетками после кормления HFD (рис.5f). Эти наблюдения показывают, что бета-клетки личинок мутантов pdx1 уязвимы для перегрузки питательных веществ, что проявляется в увеличении апоптоза островковых клеток и снижении бета-клеток.

В этой работе мы демонстрируем, что мутант pdx1-данио представляет собой новую модель диабета позвоночных, так как рыбы показывают основные особенности уменьшенных бета-клеток и инсулина и настойчиво повышают уровень глюкозы. В соответствии с предыдущими исследованиями, в которых использовалось морфолино-нокдаун pdx12441, начальная популяция островковых клеток установлена ​​в отсутствие pdx1. Экзокринные ткани и клетки протоков указаны у pdx1-мутантов, но морфология ацинара нарушена, а протоносодержащие предшественники не способны дифференцироваться в поздние эндокринные клетки. Мы обнаружили повышенную глюкозу при 5 дпф, прежде чем начнется внешнее кормление, которое сохраняется у личиночных и юных рыб и сохраняется у взрослых. Кроме того, высокий уровень глюкозы был снижен с помощью антидиабетического препарата толбутамид, и мы обнаружили доказательства повышенной чувствительности бета-клеток к питательной нагрузке в островках мутантов.

В целом, гомозиготный фенотип pdx1-мутантного рыжих данио напоминает человеческий неонатальный диабет в раннем проявлении болезни и тяжелой эндокринной дисфункции. Обнаружение эндокринной недостаточности в сочетании с каким-то экзокринным возмущением, в отличие от отсутствия развития поджелудочной железы у млекопитающих с нулевой мутацией в Pdx1, свидетельствует о том, что экзокринная ткань данио редко отличается восприимчивостью к дефициту Pdx1. Аналогичное несоответствие в отношении дозы дозы транскрипции среди позвоночных проявляется при сравнении мутантов-даниофилов для hnf1ba с болезнью человека, вызванной мутациями в HNF1B, что вызывает MODY5. Гипоморфная мутация hnf1ba в ее гомозиготной форме у рыбок данио вызывает экзокринную гипоплазию и переменное нарушение формирования бета-клеток55, напоминающее человеческое заболевание, которое, однако, вызвано гетерозиготными мутациями.

Как у мышей, так и у данио, сложная пространственная и временная регуляция pdx1 в сотрудничестве с ptf1a, mnx1 (также называемая hb9 или hlxb9) и другими ключевыми факторами транскрипции поджелудочной железы важны для роста, дифференциации и распределения всех типов клеток поджелудочной железы56. Регуляторные взаимодействия и эффекты дозировки сохраняются, но не совсем идентичны среди видов позвоночных. У мышей единственный член семейства Mnx1 требуется рано для формирования дорзального бутона и имеет решающее значение для развития бета-клеток56. У рыбок данио, связанный с Mnx1 ген mnx2a, который не существует у млекопитающих, имеет предложенную роль в образовании экзокринной поджелудочной железы57, который потенциально может компенсировать потерю Pdx1 в некоторых аспектах развития вентрального бутона. Наши результаты аномальной экзокринной дифференциации в мутантах pdx1 согласуются с исследованиями мыши, демонстрирующими, что экспрессия Pdx1 требуется не только для развития бета-клеток, но и для полной дифференциации ацинарной ткани58.

Временная ранняя популяция клеток, экспрессирующих инсулин и глюкагон, наблюдается у мышей Pdx1 — / — мутантов29, что может быть эквивалентом островковых клеток у pdx1 мутантного данио. Роль этих клеток у млекопитающих остается неопределенной. Повышение уровня глюкозы в pdx1-мутантах менее выражено по сравнению с некоторыми моделями данио-бордюров с более полной потерей бета-клеток, что говорит о функциональной способности ранних клеток. Например, после абляции бета-клеток у взрослых рыбок данио уровень глюкозы повышается до 5-кратного1113, что больше, чем примерно в 2,5 раза больше, чем у pdx1-мутантов. Напротив, 2,5-кратное увеличение глюкозы наблюдается при 16,5 dpf в альтернативной трансгенной модели абляции бета-клеток, в которой повышение уровня глюкозы может быть ослаблено за счет преходящего производства инсулина14. В этих примерах регенеративный ответ является смешающим фактором в анализе.

Клетки с характеристиками экспрессии генов ассоциированных с каналом Notch-чувствительных клеток (положительный 2F11, положительный Nkx6.1) были обнаружены у мутантов pdx1, но они не образовывали эндокринные клетки, что указывает на то, что Pdx1 взаимодействует с сигналом Notch в регуляции дифференциации предшественников. Дальнейшая оценка этого вывода будет использовать конструкции репортера Notch34, которые могут быть введены в фон мутантов pdx1. У млекопитающих пролиферация бета-клеток, а также дифференциация предшественников могут вносить вклад в новые бета-клетки во время развития и в условиях метаболического стресса47. Мы обнаружили низкие уровни пролиферации бета-клеток у личинок, лишенных личинок, которые увеличивались как у диких типов, так и у мутантов в условиях высокого уровня жира, но не до уровня статистической значимости. Этот результат подразумевал, что мутанты использовали пролиферативный ответ на перегрузку питательных веществ, но это было перегружено потерей клеток, поскольку число бета-клеток фактически уменьшилось после одной недели кормления HFD. В диких типах остров был увеличен в размерах после кормления до такой степени, что означал вклад как от пролиферации, так и от новой клеточной дифференциации. Низкий уровень пролиферации бета-клеток согласуется с докладом Мэддисона и Чена, 201252, хотя в других исследованиях у рыбок данио обнаружены более высокие уровни пролиферации бета-клеток и устойчивая стимуляция путем кормления1459. Это расхождение возможно связано с изменением метода обнаружения или с различиями в анализируемой стадии и режимах кормления.

В нашем исследовании, после продолжительного времени подачи большого количества питательных веществ, мы обнаружили увеличение апоптоза островковых клеток и снижение бета-клеток у pdx1-мутантов во время личиночных стадий. Это согласуется с установившейся связью между функцией Pdx1 и поддержанием и выживанием бета-клеток у млекопитающих6061. Недостатки фактора транскрипции могут быть результатом не только унаследованных мутаций, но также и от экологических стрессов, связанных с глюкотоксичностью и реактивными кислородными видами62. Так как уменьшение PDX1 обычно наблюдается в T2DM62, анализ динамики бета-клеток в модели pdx1-мутантного диабета, которую мы описываем, может дать механистические идеи, которые применимы к более распространенным формам диабета.

Уменьшенная длина и вес тела у взрослых мутантов pdx1 могут иметь несколько патофизиологических происхождений. Уменьшение мышечной массы является признанной особенностью диабета63, поскольку инсулин способствует протеканию анаболических путей. Мы обнаружили, что личиночные мутанты увеличиваются в размерах при перекормлении, а дальнейшие анализы ответов, вызванных диетой на клеточном и молекулярном уровне, могут выявить важные новые сведения о патологиях метаболизма белков из-за недостаточности инсулина и могут также свидетельствовать о том, что экзокринная дисфункция способствует дефицит роста.

Для оценки активности инсулинорезистентных путей использования и хранения глюкозы мы оценивали содержание свободного глюкозы у всех животных из личинок на поздних ювенильных стадиях. Из-за более низких пределов чувствительности анализа биохимические измерения на ранних стадиях должны выполняться на пулах генетически предопределенных потомков. Рыба с мутацией pdx1 выживает и размножается как гомозиготы, что позволяет оценивать гомеостаз глюкозы у диабетических эмбрионов, а также личинок и юных рыб. Предыдущие исследования, применяющие диабетическую фармакологию для рыбок данио, должны были делать это в сочетании с агентами для повышения уровня глюкозы, чтобы увидеть значительные изменения4464. Напротив, сульфонилмочевина толбутамид непосредственно понизил уровни глюкозы в pdx1 мутантах. Это демонстрирует, что антидиабетические агенты могут быть оценены с использованием pdx1 мутантного данио в более прямом подходе.

Линия мутантных рыб, о которой сообщается в этом исследовании, особенно подходит для мониторинга in vivo ранних стадий гипергликемий-индуцированных патологий, которые могут быть визуализированы при их первых проявлениях и со временем наблюдаются у одного и того же животного. Мы продемонстрировали, что метаболические параметры, имеющие отношение к физиологии диабета, могут быть оценены в популяции мутантов, которая фенотипически и генетически согласована во время легкого манипулирования личиночными стадиями. Таким образом, с pdx1 мутантным рыбой данио, фармакологические эффекты и токсичность новых кандидатов на сахарный диабет могут оцениваться с относительно низкой стоимостью модели позвоночного животного, прежде чем перейти к дорогостоящим и трудоемким исследованиям млекопитающих.

Zebrafish (Danio rerio) поддерживали и выращивали в соответствии с установленными протоколами65. pdx1sa280 гетерозигот из проекта мутации Zebrafish27 были перечеркнуты, затем поддерживались как отдельные линии (обозначенные pdx1 + / +, pdx1 +/-, pdx1 — / -). Для получения pdx1 +/-; neuroD: EGFP-рыбы, pdx1 +/- гетерозиготы были пересечены к гемизиготам TgBAC (neurod: EGFP) nl136 (NeuroD: eGFP). Затем они были перекрещены с pdx1 — / — рыбой для получения гомозиготных мутантов pdx1 — / — NeuroD: eGFP. Sibling pdx1 + / +; NeuroD: рыбы eGFP использовались для создания контрольных эмбрионов. Рыбу, собираемую при 8 д.ф.ф. или моложе, поддерживали в яичной воде (0,3 г / л соли Coral Pro (Red Sea) в обратном осмосе H2O) в чашках Петри при 28 ° C (20 рыб / 25 мл) на протяжении эксперимент. Для изучения фенотипов, индуцированных диетой, рыбу перемещали в клетки мыши при 5 дпф при плотности 25 личинок / 500 мл яичной воды. Средняя длина и длина личинки во всем мире были измерены как расстояние от рыла до хвостового стебля, как описано66. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывали путем деления массы тела (g) на квадрат длины тела (см) 48. Влажную массу личинок измеряли в пулах 4-6 личинок, помещенных в предварительно взвешенные 2 мл пробирки эппендорфа, после удаления воды из труб. Рыбу постились за 16 часов до сбора и анализа. Это исследование было одобрено австрийским Bundesministerium für Wissenchaft und Forschung (GZ BMWFW-66.008 / 0004-WF / II / 3b / 2014), и все процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

Порошкообразный яичный желток (Backstars, Bellenberg, Germany) готовили в виде раствора 2000x в яичной воде и хранили при 4 ° C. Раствор энергично встряхивали перед добавлением к культурам рыбы для достижения конечных концентраций, как указано. Личинки на минимальной диете (МИН) питались SDS100 Fry Feed (Scientific Fish Food), состоящей из 55% белка и 14% липидов. Толбутамид готовят в виде исходного раствора 500 мМ в ДМСО и обрабатывают в среде E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4).

Геномную ДНК, полученную из эмбрионов и клипов для взрослых, были генотипированы с помощью ПЦР с последующим рестрикционным перевариванием DraI (ферментами) с использованием следующих праймеров:

Для CCCCAACGAAGACTACAGCC

Rev ATGGCCTGCAATCAGGAGTTA

Используемые условия ПЦР составляли 30 циклов 94 ° С в течение 30 с, 63 ° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 30 с, затем один цикл 72 ° С в течение 5 мин. Продукт ПЦР расщепляли в течение 5 часов при 37 ° С. Усиленный продукт дикого типа составлял 373 п.о. Сайт DraI, присутствующий в мутантном аллеле, продуцировал меньший продукт ПЦР 334 п.о. Продукты разделяли на 2% -ный гель.

Измерения глюкозы проводили с использованием набора для анализа красной глюкозы Amplex (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Экстракты личинок получали ультразвуком в 200 мкл холодного PBS. Одну 5-недельную рыбу сначала гомогенизировали, а затем обрабатывали ультразвуком в 500 мкл холодного PBS. Экстракты центрифугировали в течение 15 мин, 12000 об / мин при 4 ° С для удаления мусора и супернатант использовали немедленно или хранили в аликвоте при -80 ° С до тех пор, пока анализ не проводился. При каждом анализе генерировались стандартные кривые. Графики представляют собой данные, объединенные по меньшей мере из двух независимых экспериментов. Значения глюкозы были нормализованы до концентрации белка в экстракте и сообщаются относительно среднего контрольного значения. Чтобы измерить уровни глюкозы в крови у взрослых рыбок данио, рыба была анестезирована, и кровь была собрана в основном, как описано45. Кровь от разреза была непосредственно применена к тест-полоске для определения уровня глюкозы Freestyle Lite, а показания глюкозы были получены с помощью глюкометра Freestyle Lite (Abbott) в соответствии с инструкциями производителя.

Рассеянную кишку у личинок и взрослых фиксировали в 4% PFA в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре, промывали в PBS, последовательно дегидратировали в этаноле и вводили в Paraplast (Sigma). 8 мкм секций далее обрабатывали для иммуногистохимии или окрашивали гематоксилином и эозином. Исследуемые участки были отображены на возбудителе Zeiss LSM5, изображения H & E, обработанные пятнами, были отображены с использованием Leica DM5000B.

Иммуностойкость целых эмбрионов или личинок выполняли, как описано ранее24, с модификацией, которая для личинок старше 3 дфф, Phospholipase A2 (0,3 мкг / мл) добавляли к ProteinaseK (10 мкг / мл) для проницаемости для улучшения проникновения67. Секции иммуноокрашивания инкубировали в течение одного часа в блокирующем растворе (PBS / 1% ДМСО / 1% БСА / 1% Тритон), затем инкубировали в течение ночи при 4 ° С с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе. Разделы промывали PBS + 0,2% Тритоном. Первичные антисыворотки и разведения были: антиинсулин морской свинки (1: 200, Дако), кролик-антикарбоксипептидаза А (1: 200, химикон), кролик-анти-GFP (1: 200, Torrey Pines Biolabs) Pdx1 (1: 200, щедрый подарок от Chris Wright, Vanderbilt University), мышь anti-Nkx6.1 (1:50, DSHB), мышь против глюкагона (Sigma) (1: 100), мышь anti-2F11 (Abcam) , кролик против соматостатина (1: 200, ДАКО). Вторичные антитела (разведение 1: 1000) были присоединены Алекса от Invitrogen. Ядра были помечены инкубацией в течение 30 минут при комнатной температуре (секции) или в течение ночи при 4 ° C (целые эмбрионы или личинки) в 100 нг / мл DAPI. Маркировку TUNEL проводили как для иммуноокрашивания, описанной выше, с дополнительной инкубацией в реакторе обнаружения TUNEL (Roche) в течение 2 часов при 37 ° C до инкубации со вторичным антителом. Для маркировки пролиферирующих клеток с помощью EdU использовался набор Click-It 488 (Invitrogen). 5 нл 100 мкМ EdU (в 5 мМ лимонной кислоте, pH 5,0) вводили в кардинальную вену личинок 5 dpf, обезболивавших 0,003% трикаина. При 7 dpf эмбрионы фиксировали в течение 1 часа в 4% PFA, проницали в 1% ДМСО, затем реакцию обнаружения проводили, как описано33. Затем эмбрионы инкубировали в блокирующем растворе и окрашивали антителами, как описано выше.

Общая РНК была получена из расчлененных областей кишки 5-недельной рыбы с использованием Trizol (Ambion), кДНК была приготовлена ​​с использованием набора для синтеза кДНК First Strand (Thermo Scientific). qPCR выполнялся в системе реального времени CFX Connect (BioRad) с использованием HOT Fire-Pol EvaGreen qPCR Mix Plus (Solis BioDyne). Представленные данные представляют собой среднее число 4 биологических повторов, представленных в качестве уровня экспрессии генов относительно контролей, после нормализации генов домохозяйства rpl и ef1alpha. ПЦР-праймер для инсулина (от 5 ‘до 3’): GCCCAACAGGCTTCTTCTACAAC (F), GCAGATTTAGGAGGAAGGAAACCC (R).

Личинки для живого изображения подвергали анестезии с использованием 0,003% трикаина, иммобилизованного в 1,5% низкоплавкой агарозы и отображали на микроскопе Leica DM6000B, оснащенном цифровой камерой SPOT-RT3 (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI) с использованием 20-кратной воды задача. Флуоресцентный стек и изображения DIC были захвачены с использованием программного обеспечения Visiview (Visitron Systems, Puchheim, Germany). Флуоресцентные стеки обрабатывались с использованием ImageJ. Стеки были объединены с одним изображением, используя расширенную глубину фокусировки. Регулировка яркости и контрастности, одинаково применимая ко всем изображениям, переэкспонировала сигнал островка, чтобы выявить более слабый сигнал, присутствующий в отдельных ячейках, и небольшие кластеры, расположенные за пределами основного островка. Иммуностойкость целых опор была визуализирована с помощью конфокального лазерного микроскопа Zeiss LSM5 Exciter с использованием объектива для погружения воды 40X и z-шагом от 1-2 мкм. Стеки оптических секций объединялись с использованием проекции максимальной интенсивности (ImageJ). Инсулин +, Glucagon +, Hormone + и NeuroD: eGFP + определяли количественно с использованием инструмента PointPicker ImageJ. Сигналы антител исследовали в комбинации с DAPI-окрашиванием ядер для облегчения идентификации клеток. Конфокальные изображения обрабатывались медианным фильтром для удаления спекл-шума и собраны в композиты с использованием плагина FigureJ ImageJ и Adobe Illustrator. Объем сигнала инсулинов определяли количественно с использованием Imaris 7.3.0 (битплоскость). Короче говоря, изображения обрабатывались сглаживанием (0,5 мкм) и локальным вычитанием фона, затем создавалась контурная поверхность, которая закрывала флуоресцентный сигнал, и определялся объем в вокселях. Порог сигнала и фильтрация объектов были последовательно применены ко всем изображениям.

Были созданы графики, и статистический анализ был выполнен с использованием Prism (Graphpad). Значение было проверено с использованием t-теста или одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) и пост-теста, как указано, при p <0,05 считалось значимым. Если не указано иное, представленные данные являются репрезентативными по меньшей мере для двух независимых экспериментов. Шкалы ошибок представляют собой стандартную ошибку (с.е..м.).

Как процитировать эту статью: Kimmel, R. A. et al. Диабетическая pdx1-мутантная рыбка данио оставляет консервативные ответы на перегрузку питательных веществ и антигликемическое лечение. Sci. По донесению
5, 14241; doi: 10.1038 / srep14241 (2015).

Мы благодарим Криса Райта за антитело Pdx1, Тересу Николсон за линию рыб TgBAC (Neurod: eGFP) nl1, Petronel Tuluc для химических веществ, Dzenana Tufegdzic для специалистов по уходу за рыбой данио, Патрицию Шоттцнер и Маттиас Шмут за полезные обсуждения, Торстен Шверте и Вилли Сальвенмозер для помощь в создании изображений и всех членов Института молекулярной биологии для оказания технической помощи и консультаций. Этот проект был поддержан Университетом Инсбрука и Австрийским научным фондом (FWF): P25659-B19 (R.A.K.).

Авторские вклады Задуманные и разработанные эксперименты: R.A.K., D.M. Выполняли эксперименты: R.A.K., N.S., S.D., T.W., J.F. Анализировали данные: R.A.K., N.S., D.M. Написал рукопись: R.A.K. Отредактировал рукопись и дал общий совет: D.M.

(a) Схема белка Pdx1 рыбок данио и определение последовательности аминокислот Y37X в результате мутантного аллеля pdx1sa280. Мутированный тирозин в положении 37, расположенный в высококонсервативном N-концевом трансактивационном домене pdx1, вызывает преждевременный стоп-кодон. (б) Секвенирование геномной ДНК у 6-месячного взрослого потомства гетерозиготного по сравнению с выявленными выживающими гомозиготами. (c) Частота генотипа в течение 6 месяцев скрещенных гетерозигот. Выжившие гомозиготный мутант pdx1 — / — рыба присутствовали на более низкой, чем ожидалось, частоте. (Комбинированные данные из 4 независимых крестов). (D) В возрасте 3 месяцев взрослые мутанты (справа) имели нормальную морфологию, но уменьшали размер по сравнению с контролем дикого типа (слева). Масштабные бары, 0,5 см. (e) Гомозиготные мутанты уменьшали длину, вес и ИМТ по сравнению с дикими типами. n (pdx1 + / +) = 18, n (pdx1 — / -) = 19, *** p <0,0001 (t-тест).

(a-d) Морфология области кишки в продольно-косых участках мутантов дикого типа (a, c) 12 dpf и pdx1 (b, d), окрашенных гемотоксином и эозином (H & E). (a-d) Поджелудочная ткань расположена между кишечной колбой (ib) и желчным пузырем (gb). (li, печень) (c) У эмбрионов дикого типа экзокринные клетки (exo), прилегающие к островку (есть), проявляют ясную полярность и ацинарную организацию (желтый контур). Вставка, крупный план одиночной ацинарной клетки, показывающий базофильную базальную область (ba) и эозинофильную апикальную область (ap), где расположены секреторные гранулы. (d) В pdx1 мутантах полярность клеток и ацини не очевидны. В ярких изображениях соседнего региона экзокринные секреторные гранулы могут быть обнаружены в поджелудочной железе дикого типа (e, стрелки) в области, иммунизированной для CPA (зеленый) (g). (f, h) CPA-положительная экзокринная ткань у мутанта pdx1 оказывается дезорганизованной. Бета-клетки островка помечены иммуноокрашиванием для Ins (красный). Ядра контрастируют с DAPI (синий). ((a, b), шкала шкалы = 50 мкм, (c-f), шкала шкалы = 20 мкм). У взрослых клетки Ins + (красный) занимают ядро ​​островка, тогда как клетки Gcga + (голубые) находятся в основном на периферии в обоих элементах управления и мутантах pdx1 (i-l). Шкала шкалы = 50 мкм. (м) Поляризованные экзокринные клетки (экзо), расположенные в ацини (желтый контур), находятся рядом с островками в контрольных клетках, крупным планом одной ацинарной клетки, показывающей базально расположенное ядро ​​и эозинофильную апикальную область (ap) содержащих секреторные гранулы. (n) В pdx1 мутантах экзокринные клетки кажутся неполяризованными и не имеют ацинарной организации. ((m, n) шкала шкалы = 20 мкм)

(a) Иммуноокрашивание инсулина (Ins, пурпурного) и белка GFP (зеленого) у дикого типа и мутантных NeuroD: eGFP + эмбрионов при 3 dpf. Максимальная проекция интенсивности (MIP) конфокальных стеков. Шкала шкалы, 20 мкм. (b) Число клеток, экспрессирующих экспрессию эмбрионов, как показано в (a). (wt, n = 9; mu, n = 10) ** p <0,001 (t-тест). Линия указывает, что медиана, ящики охватывают от 25-го до 75-го процентиля, усы от 10-го до 90-го процентиля. (dpf, дни после оплодотворения) (c, top) Схема эксперимента для оценки индукции кормления вторичных островков. Эмбрионы снабжали питательным порошком (SDS100) с 5-го дня до 7-го дня и отображали в реальном времени на 8-й день для выявления вторичных островковых клеток. (c, bottom) NeuroD: эндокринные клетки eGFP + обнаруживаются за пределами островка в контроле pdx1 + / + личинок (слева), которые отсутствуют у pdx1 - / - мутантов (справа). Поджелудочная железа очерчена (серая) на основе одновременно приобретенного яркого изображения. (d) Количественное определение вторичных островков, сформированных в личинках дикого типа (n = 11) и мутантных (n = 11), обработанных как в (c), *** p <0,0001, t-тест. (д) Представитель 7 dpf NeuroD: eGFP + личинок, обработанных Ly411575, начиная с 4-го дня, и исследовали в реальном времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Гетерозиготные и контрольные личинки, но не мутанты, демонстрируют надежную индукцию новых эндогенных клеток GFP + в хвосте поджелудочной железы (стрелки). (f) Количественное определение островков островков второй волны из личинок NeuroD: eGFP +, обработанных как в (e). *** р <0,0001; ** р <0,001; n.s., не значимые (односторонний ANOVA, Tukey Multiple Comparison test). n (pdx1 + / +) = 8, n (pdx1 +/-) = 13, n (pdx1 - / -) = 7. В (c) и (e) флуоресцентный сигнал в первичном островке был переэкспонирован, клеток и кластеров в окружающей поджелудочной железе. Отдельные клетки и кластеры определяли как вторичные островки.

(а) Количественное определение уровней глюкозы из 5 дпф личиночных экстрактов (пулы из 10 эмбрионов). n = 4 биологических репликации, результаты объединены из 3 независимых экспериментов (*** p <0,0001, t-тест). (б) Уровни глюкозы, измеренные при 15 дпф в экстрактах из пулов из 3 рыб, нормированные на среднюю контрольную величину. n = 4 биологических репликации, результаты объединяются из 3 независимых экспериментов (** p <0,01, t-тест). (c) Уровни глюкозы относительно контроля от 5-недельной одиночной рыбы (дикий тип, n = 7, мутант, n = 10, *** p <0,0001, t-тест). На графиках ячеек показана медиана, коробка простирается от 25-го до 75-го процентиля, усы указывают 10-й и 90-й процентили. (d) Уровни уровня глюкозы в крови взрослого населения. Значения - среднее ± SEM. (pdx1 + / +, n = 13; pdx1 - / -, n = 9; ** p <0,01, t-тест.) (e) Поджелудочная железа дикого типа и мутантных рыбок данио при 15 dpf, иммуноокрашенная инсулиновым (Ins) антителом , ядра контрастируют с DAPI (слева). Шкала шкалы, 20 мкм. Количественное определение объема окрашивания инсулина (справа). Результаты объединены из 2 независимых экспериментов. (pdx1 + / +, n = 15; pdx1 - / -, n = 16) ** p <0,001 (t-тест). (f) Относительные уровни мРНК инсулина, определяемые qPCR у 5-недельных диких типов и pdx1 - / - мутантных рыб. ** p <0,01 (t-тест) (g) Обработка мутантов pdx1 при 5 dpf с помощью 500 мкМ толбутамида в течение 2 часов с пониженным уровнем глюкозы на 36%. * p <0,05 (односторонний ANOVA, тест множественного сравнения Tukey). Показанные результаты представляют собой 2 независимых эксперимента.

(a) Схема временной шкалы для кормления и анализа личинок. (б) MIP конфокальных изображений основного островка из личинок NeuroD: eGFP + (верхний) и pdx1 (нижний), которые получали HFD с 5-7 dpf, и анализировали при 8 dpf с помощью маркировки TUNEL и иммуноокрашивания для GFP. Ядра были контрастированы с DAPI (синий). Стрелки указывают ячейки eGFP + / TUNEL + островков. Шкала шкалы, 20 мкм. (c) Количественное определение процента апоптотических клеток (TUNEL + / GFP +) в основном островке личинок дикого типа и мутантов, как показано в (b). Линия указывает медианную. * p <0,05, Манн-Уитни, односторонний t-тест. (d) Репрезентативные конфокальные изображения MIP островков из 12 dpf Neurod: eGFP + дикого типа и мутантных личинок, которым кормили порошок (MIN) или диету с высоким содержанием жиров (HFD) от 5-11 dpf, с последующим иммуноокрашиванием для GFP и Ins (пурпурный). Ядра были контрастированы с DAPI (синий). Шкала шкалы, 20 мкм. (e) Число NeuroD: eGFP + островковых клеток у 12 dpf личинок, обработанных, как в (d). Для pdx1 + / + и pdx1 - / -, сравнивая MIN с обработанным HFD, * p <0,05, Mann-Whitney, двухсторонний t-тест. (f) Число клеток, экспрессирующих экспрессию мутантных личинок, как в (d) (** p <0,01, t-тест). В графах коробки показана медиана, коробки занимают от 25-го до 75-го процентиля, усы - от 10-го до 90-го процентиля. На всех графиках количество личинок, анализируемых на группу (в сочетании с двумя или более независимыми экспериментами), как показано.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *