Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Эффективная доставка эндогенных антиоксидантов улучшает диабетическую нефропатию

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: YP HK LP DM. Выполняли эксперименты: YP HK LP DM MP. Анализировали данные: YP HK LP DM MP. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YP JP SC MP. Написал документ: YP HK LP DM. Обсуждались данные: JP SC MP.

Диабетическая нефропатия (DN), как полагают, частично связана с повреждением почечных клеток и почечной микро-окружающей среды свободными радикалами. Свободные радиальные очищающие агенты, которые ингибируют повреждение свободных радикалов, вполне могут препятствовать развитию таких основных состояний, как мезангиальное расширение (путем ингибирования экспрессии внеклеточного матрикса) у этих пациентов.

Используя методы внутриклеточной доставки пептидов, мы сделали металлотионеин (MT) и супероксиддисмутазу (SOD), мощные эндогенные антиоксиданты, легко трансформируемые в клеточную мембрану и протестировали их защитный эффект против развития DN у крыс OLETF. Здесь мы изучаем антиоксидантные пептиды для их способности предотвращать окислительное повреждение первичных крысиных мезангиальных клеток (МС), которые являются важными составляющими почечных клубочков.

Внутрибрюшинное введение этих антиоксидантов приводило к доставке в почку и уменьшению ROS и экспрессии сигналов ниже по течению в почечных клетках и откладывало обычную прогрессию до DN. В экспериментах in vitro MT и SOD эффективно переносили в MC, а увеличение удаления ROS с помощью MT и SOD было пропорционально степени доставки поглощающих ферментов. MT и SOD уменьшали три основных окислительных травмы (гипергликемия, воздействие AGE и ROS), а также травмы, непосредственно опосредованные ангиотензином II в МС, при изменении передачи сигнала ниже по течению.

Защитные эффекты MT и SOD для прогрессирования DN у экспериментальных животных могут быть связаны с очисткой ROS с помощью MT и SOD и коррелированными изменениями в передаче сигнала вниз по течению. Сопутствующее введение этих антиоксидантных пептидов может оказаться новым подходом для профилактики и лечения ДН.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Микрососудистые травмы, связанные с диабетической нефропатией (DN), являются первичной этиологией для терминальной стадии почечной недостаточности [1, 2]. Окислительные стрессы, связанные с метаболической дисрегуляцией при диабете, влияют на различные ткани, приводящие к различным диабетическим осложнениям [3-6]. Перепроизводство активных форм кислорода (ROS) приводит к окислительному повреждению клеточных и внеклеточных компонентов почек, особенно в мезангиальных клетках (МС) [3,4]. Это приводит к увеличению субстратов для конечных продуктов гликозилирования (AGE) и в прекурсорах продуктов гликозидирования и липоксидирования и ускоряет образование свободных радикалов, которые могут сопровождаться или вызваны дефицитом антиоксидантных и детоксикационных путей [5 -8]. Способ, которым повышенный окислительный стресс изменяет сигнальную передачу ниже по течению, ведущую к эволюции клинического DN, до сих пор не выяснен, и пока неизвестно, может ли антиоксидантная добавка помочь поврежденным тканам почки регенерировать и облегчить это опасное для жизни осложнение диабета [5, 8, 9].

DN характеризуется затуханием мезангиального расширения (ME) и клубочковой базальной мембраны (GBM) [4, 10]. ME является результатом скоординированных изменений не только регулятивных ферментов внеклеточного матрикса (ECM) (матричных металлопротеиназ (MMP)) и тканевых ингибиторов этих MMP, но также и пептидов ECM, таких как коллаген I и IV типа, фибронектин и ламинин, вместе с пролиферацией такие как TGF-β1, CTGF и ангиотензин II (AGII) [4, 9, 11]. MCs являются важными составляющими мезангиальных пространств и, по-видимому, выступают в качестве важных медиаторов ME, главным образом в результате окислительного повреждения [10]. Также доказано, что AGII является важной причиной прогрессирующей травмы в DN [7, 12]. Intrarenal AGII проявляет большую часть своих хорошо известных эффектов путем связывания с рецепторами AGII (AT1) типа 1, которые обильны в клетках клубочков, включая МС, канальцы, сосудистую сеть и интерстиций. Активация АТ1-рецептора вызывает увеличение сосудистого сопротивления и, как следствие, снижение почечного кровотока, приводящее к образованию ECM в мезангиуме и тубулоинтерстиуме [7, 9].

Как подробно описано выше, металлотионеин (MT) представляет собой высокоиндуцируемый белок, который связывает тяжелые металлы и играет важную роль в качестве мощного антиоксиданта из-за его многочисленных остатков цистеина [13-15]. Супероксиддисмутаза (SOD), еще один крупный класс антиоксидантного фермента, участвующий в контрольных уровнях ROS, катализирует разрушение O2-свободного радикала [14, 15]. MT и SOD, эндогенные антиоксиданты имеют потенциал для защиты клеток и тканей от окислительного стресса, таких как диабет и диабетические осложнения, но у них есть ограниченная способность пересекать липидные бислои, поэтому неясно, что они обладают аналогичным антиоксидантным действием in vivo. В последнее время применение белка ВИЧ-1 Tat, называемого клеточным проникающим пептидом (CPP) [16-18], нам удалось доставить эти антиоксиданты в живые клетки, включая поджелудочную железу и нервы, и предотвратить как развитие самого диабета, так и диабетическую невропатию [13 -15]. Используя эту же технологию CPP, было продемонстрировано, что сфазы в рамах Tat-MT и Tat-SOD эффективно трансдуцируют в MC через фосфолипидную мембрану, чтобы предотвратить гипергликемию, AGE-, ROS- и AGII-индуцированные клеточные повреждения. Мы также обнаружили, что внутрибрюшинно вводимые Tat-MT и Tat-SOD в комбинации могут переносить на почечную ткань in vivo, уменьшающую DN у крыс Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF).

Это исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здоровья (NIH, публикация № 85-23 м, пересмотренная в 1996 году). Протокол был одобрен Комитетом по институциональному уходу и использованию животных в Университете Ханьянга (номер разрешения: HY-IACUC-09-021). Были приняты все необходимые меры для сведения к минимуму страданий.

Путем вставки слияния Tat-нуклеотидной последовательности либо с генами SOD, MT или GFP в прокариотический экспрессирующий вектор pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA), мы продуцировали слитый пептид основного домена (аминокислоты 49-57 ) ВИЧ-1 Tat с каждой конструкцией, как описано ранее [13-15]. Продукты слияния Tat-MT, Tat-SOD и Tat-GFP были переведены в E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen, Madison, WI) и выделены иммобилизованной аффинной хроматографией металлов (IMAC) с использованием колонки Ni-NTA-смолы (Bio-Rad, Hercules, CA). Оставшиеся соли удаляли из очищенного 6-His-меченного белка с помощью колоночной хроматографии PD10 (Amersham, Buckinghamshire, UK). Каждый из этих продуктов экспрессии содержал последовательность, кодирующую шесть гистидиновых остатков и TAT (YGRKKRRQRRR). MT без Tat и SOD без Tat также были сделаны и очищены аналогично, как описано ранее [15]. Все конструкции были проверены путем секвенирования.

Научно-исследовательский институт Токусимы (Otsuka Pharmaceutical, Токусима, Япония) любезно предоставил нам крыс OLETF и Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) в течение 4 недель, которые поддерживались при контролируемой температуре (23 ± 2 ° C) и влажности (55 ± 5% ) с 12-часовым светом / темным циклом. Крысам был разрешен свободный доступ к стандартной крысиной чау. Требования к жидкости были обеспечены 30% раствором сахарозы, тем самым ускоряя начало диабета и диабетических осложнений. Органы управления LETO (n = 10) получали только питьевую воду без 30% раствора сахарозы. Примерно в возрасте 20-24 недель диабетическое состояние крыс OLETF было подтверждено путем получения последовательных случайных уровней глюкозы в крови, превышающих 13,9 ммоль / л. Сначала мы проверили почечное проникновение одного внутрибрюшинного введения для каждого из слитых белков у животных в возрасте 20 недель (через 4 дня после трансдукции) после подтверждения диабета сахарного диабета. Затем, поскольку антиоксиданты в комбинации превосходили либо антиоксидант в одиночку для повышения жизнеспособности клеток in vitro, все диабетические крысы OLETF были случайным образом разделены на три группы: крысы OLETF без группы трансдукции (n = 10), группа Tat-GFP (n = 9) и комбинацию Tat-MT-Tat-SOD (n = 8). Крысам Tat-GFP вводили 3 мг / кг Tat-GFP каждые 3 дня и группу антиоксидантов с 3 мг / кг Tat-MT и 3 мг / кг Tat-SOD каждые 3 дня. Лечение протеином протеина продолжалось в течение 16 недель. В заключение все животные умерщвляли с помощью кетамина с последующим быстрым удалением тканей почек для морфологии и биохимического исследования.

Метаболические клетки использовались для сбора мочи у каждого экспериментального животного в течение 3-дневного периода. Образцы мориной мочи центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g и супернатанты оценивали с использованием метода Брэдфорда для белка, и для количественного определения микроальбумина использовали метод ELISA (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Измерения проводились на каждой крысе непосредственно перед (0 неделя) и 16 недель после начала трансдукции. Анализы проводили в трех повторностях, выражающих средние значения белка и микроальбумина в виде суточного количества мочи, выделенной данной крысой.

Таб-слитую белкотерапию проводили в течение 16 недель, после чего почки тщательно отделяли от эвтаназированных животных, чтобы предотвратить какой-либо ущерб. Удаленные органы затем промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS, pH 7,2), взвешивали и фиксировали в 10% -ном буферном растворе формальдегида (рН 7,4). Затем почки дегидратировали с использованием серийно градуированных спиртовых растворов и устанавливали в парафине. 4 мкм срезы, полученные из микротома Leica RM 2145, окрашивали с использованием периодических кислот-Шифф (PAS) и масс-красок Массана для гистопатологических анализов. Затем участки фотографировались под фотомикроскопом Olympus (Токио, Япония) при увеличении X400 и проводились измерения клубочковой или мезангиальной области. Гломерулярную область измеряли в 20 полностью круглых клубочках из четырех животных на группу, случайным образом выбранных из всех почечных коры. Каждая область, положительно окрашенная для соответствующего окрашивания, вычислялась после ручного отслеживания каждого гломеруля с помощью автоматизированного программного обеспечения Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Сверхтонкие (70 нм) участки почки были также качественно исследованы с использованием просвечивающего электронного микроскопа Zeiss 10 (Zeiss, Oberkochen, Germany). Для ультратонкого секционирования ткани почек фиксировали в 4% глутаральдегиде и 0,1% фосфате натрия (рН 7,4) в течение 4 ч при 4 ° С. Затем образцы дважды промывали в фосфатном буфере и фиксировали в 1% тетроксида осмия в том же буфере при 4 ° С в течение ночи. Образцы дегидратировали в серии этанола и внедряли в смолу Spurr. Разделение проводили с помощью ультрамикротома Potter Blum MT1. Толщина GBM и ширина стоп-процессов вместе со степенью ME измерялись с электронных микрофотографий при увеличении × 20000, изученных на 20 различных случайно выбранных участках у четырех животных на группу. Измерения GBM проводились в каждой точке, где линия на сетке перехватывала интерфейс эндотелия-GBM, а толщину измеряли на линии, ортогональной к краю GBM на эндотелиальной стороне перехвата. Ширины стопных процессов на периферических GBM или фильтрационных поверхностях также измерялись на 20 различных случайно выбранных участках у четырех животных на группу и вычислялась средняя ширина стопы. Степень ME также измерялась с помощью автоматического анализатора изображений с использованием того же программного обеспечения Image-Pro Plus.

4 мкм парафиновые секции, смонтированные на силанизированных слайдах, депарафинизировали с использованием ксилола перед регидратацией в градуированном спирте. Получение микроволнового антигена проводили в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 10 мин. Секции инкубировали с 1% Н2О2 в течение 30 мин для блокирования остаточной эндогенной пероксидазы, а затем промывали водой, а затем блокировали нормальной сывороткой козы в течение 30 мин при комнатной температуре. После того, как слайды инкубировали в течение ночи при 4 ° С с использованием нитротирозинспецифических первичных антител (Millipore, Temecula, CA), α-SMA, коллагена IV (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ), TGF-β (V), VEGF ( A-20) и CTGF (H-55) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) при иммунной активности разведения 1: 200 анализировали путем инкубации с конъюгированным с конъюгированным с лошадью IgG-антителом против пероксидазы хрена в течение 30 мин при комнатной температуре. 3,3′-диаминобензидин (DAB) использовали для определения активности пероксидазы с использованием наборов DAB, полученных из Vector Laboratories (Burlingame, CA). Слайды устанавливали после контаминации гематоксилина, а затем промывали водопроводной водой. После обезвоживания с использованием ксилола секции были смонтированы, а затем сфотографированы под фотомикроскопом при увеличении X400. Было обнаружено и проанализировано по меньшей мере 20 гломерулей на секцию для процентного распределения.

Экстракты почки и цельные клетки инкубировали в буфере для лизиса (150 ммоль / л NaCl, 50 ммоль / л Tris-Cl, 1 ммоль / л ЭДТА, 1 ммоль / л PMSF, 1 ммоль / л Na3VO4, 1 ммоль / л NaF, 1% NP-40, 0,25% дезоксихолевой кислоты и 1 мкг / мл лейпептина) в течение 20 мин на льду с последующим 15-минутным центрифугированием при 1500 об / мин. Экстракты в загрузочном буфере подвергали электрофорезу на 8 ~ 12% акриламидных гелях и белки переносили на мембраны PVDF в буфер обмена в течение 1 часа при 120 В. Мембраны блокировали в течение 1 часа в TBST [20 ммоль / л Tris-HCl (pH 7,6); 137 ммоль / л NaCl; и 0,1% Tween 20] с 5% обезжиренным молоком и затем инкубировали в течение ночи при 4 ° С с одним из следующих антител: His-зонд (H-15), MT (N-19), SOD-1, NF-κBp65 (F-6), общий LRP6, общий GSK-3β (H-76), фосфо-GSK-3β (Ser 9), β-катенин (H-102), VEGF (A-20), CTGF (H-55 ), α-тубулин и β-актин (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); фосфо-p38, фосфо-ERK, фосфо-JNK, фосфо-AMPKα (Thr172), фосфо-LRP6 (технология клеточной сигнализации, Беверли, Массачусетс); фибронектин (Sigma, St. Louis, MO); RAGE от Abcam (Кембридж, Массачусетс). Мембраны тщательно промывали TBST, а затем инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена вторичным антителом при разведении 1: 20000 (HRP-связанный козий анти-кролич-IgG, Santa Cruz Biotechnology), промывали TBST и детектировали с помощью системы ECL (iNtRON Biotechnology, Ansan, Korea ).

РНК из первичных культивированных МС или целых почек выделяли с использованием TRI Reagent (iNtRON Biotechnology, Ansan, Korea). Два мкг реакционного объема РНК / 20 мкл объединяли со случайными гексамерными праймерами (2,5 мкмоль / л) и реакционными компонентами в течение 30 минут при 42 ° С, а затем нагревали до 95 ° С в течение 4 минут, чтобы инактивировать фермент и денатурировать РНК- кДНК-гибриды. амплификацию кДНК проводили при конечной концентрации реакционного буфера 1X ДНК-полимеразы, 1,5 ммоль / л MgCl2, 200 мкмоль / л дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), 10 пмоль / л целевых праймеров или β-актиновых праймеров и 1,25 U ДНК AmpliTaq полимеразы (Promega Co., Madison, WI) в общем объеме 40 мкл. Последовательности праймеров показаны в таблице S1. Процедура амплификации включала денатурацию при 95 ° С в течение 1 мин, отжиг праймера при 55 ° С в течение 45 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 30 секунд. Конечные продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозных гелях, содержащих 0,2 г / мл бромида этидия. Экспрессия β-актинового гена служила контролем для ОТ-ПЦР. Результаты RT-PCR определяли количественно с помощью денситометрического анализа с использованием одноразового аналитического программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA). Экспрессию целевой мРНК рассчитывали путем нормализации по отношению к экспрессии мРНК β-актина [19].

Как подробно описано ранее [13], активацию NF-κB анализировали с помощью анализов на сдвиг подвижности геля ядерных экстрактов. Концентрационный олигонуклеотид NF-κB (Promega, Madison, WI) использовали в тестах сдвига электрофоретической подвижности. Связанную и свободную ДНК разрешали электрофорезом на 6% нативного полиакриламидного геля в 89 ммоль / л Трис-HCl, 89 ммоль / л борной кислоты и 2 ммоль / л ЭДТА.

Для анализа желатинолитической активности аликвоты культуральной среды смешивали с 5 мкл 5X невосстанавливающего буфера для образцов (0,5 моль / л Трис-HCl (рН 6,8), 50% глицерина, 0,5% бромфенолового синего). Электрофорез проводили на 8% акриламидных гелях, содержащих 1 мг / мл желатина в качестве субстрата. Затем гели инкубировали в 2,5% Triton X-100 и 50 ммоль / л Tris-HCl (pH 7,5) в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 37 o C в буфере коллагеназы, содержащем 50 ммоль / л Tris -HCl (pH 7,5), 100 ммоль / л NaCl и 10 ммоль / л CaCl2. Затем гели окрашивали кумасси синим цветом и визуализировали зоны лизиса. Протеолиз был идентифицирован как белая зона на синем фоне, а система визуализации Kodak Gel Logic 100 использовалась для документирования результатов (Eastman Kodak, Rochester, NY).

В этом исследовании использовались первичные культивируемые МС. Почки с эфирно-анестезированных SD-крыс (весом 170 г) получали стерильной процедурой. Корни почек были выделены после удаления капсул, затем измельченных бритвенным лезвием до тонкой пасты, а затем прессуют через набор сит из нержавеющей стали (№ 140, 80 и 200, Fisher Scientific Co., Питтсбург, шт. Пенсильвания). Богатую часть клубочков собирали из верхней части 75 мкм сита, что приводило к образованию> 98% чистых клубочков. Слоуллеры гранулировали для ресуспендирования в DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), дополненной 20% FBS и антибиотиками (100 мкг / мл стрептомицина, 100U / мл пенициллина). Гломерулярную суспензию высевали в колбы для тканевой культуры и инкубировали при 37 ° С в 5% СО2. Первичным культурам МС разрешалось расти в течение 3-4 недель, достигнув слияния в это время. MC были использованы между 7-м и 10-м проходами. Для индивидуальных экспериментов клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 2 × 105 клеток на лунку в полной среде DMEM в течение 24 часов. Чтобы трансформировать белки слияния Tat в культивируемые MC, 1 ммоль / л соответствующего белка добавляли к культуральной среде в течение 1 часа. После трансдукции среду заменяли бессывороточной DMEM, содержащей один из различных экспериментальных агентов, вызывающих окислительный стресс.

Для исследования высокоинтенсивного, AGE- и 4-гидроксинонененального (4-HNE) (Calbiochem, La Jolla, CA) -индуцированного повреждения ROS клетки высевали в 6-луночные планшеты в бессывороточной DMEM и подвергали воздействию одного или другого повреждающий агент. Чтобы исследовать способность Tat-MT и / или Tat-SOD защищать от высокого уровня вызванного глюкозой травмы, гипергликемия была вызвана воздействием MC на высокий уровень глюкозы (30 ммоль / л) DMEM в течение 24 ч вместе с 1 мкмоль / л Tat слитый белок. Клетки, подвергнутые воздействию низкой глюкозы (5,5 ммоль / л), служили контролем. Чтобы исследовать способность Tat-MT и / или Tat-SOD для защиты от травмы, вызванной AGE, MCs подвергались воздействию 400 мкг / мл AGE в низкой глюкозе с 1 мкмоль / л слитого белка Tat. Контрольные клетки подвергали воздействию 400 мкг / мл BSA. Производство AGE было описано ранее [13]. Чтобы изучить способность Tat-MT и / или Tat-SOD защищать от 4-HNE-опосредованной травмы, клетки подвергали воздействию 40 мкмоль / л 4-HNE с 1 мкмоль / л белка слитого Tat в течение 24 часов.

Мы использовали косвенные иммунофлюоресцентные анализы и конфокальную микроскопию для локализации белков. Вкратце, MCs, выращенные на покровных клоках в 12-луночных планшетах, обрабатывали слитыми белками в течение 1 часа. После промывки в PBS клетки фиксировали 4% холодным параформальдегидом в течение 30 мин и проницали 0,2% Triton X-100. Кролильные полигистидиновые, MT и SOD антитела (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) применяли в течение 1 часа с последующей инкубацией с конъюгированным с флуоресцеином изотиоцианатом козлиным анти-кроличьим IgG в течение 1 часа. После инкубации клетки помещали в камеру микроскопа Olympus для наблюдения с помощью конфокальной лазерно-сканирующей системы. Флуоресцентные изображения (возбуждение 494 нм / излучение 518 нм) клеток регистрировали каждые 0,25 с (× 400).

Данные представлены как средства ± SEM. Различия в средних значениях были проверены t-критерием Стьюдента с использованием SPSS для Windows (версия 18.0; SPSS, Чикаго, Иллинойс). Различия в клинических параметрах, включая измерения белка в моче, анализировались односторонними или повторяющимися показателями дисперсии дисперсии (ANOVA). Значения P <0,05 считались статистически значимыми.

Как и в наших предыдущих экспериментах [13, 14], наши слитые белки Tat-MT, Tat-SOD и Tat-GFP (AC на S1 Fig) очищали хроматографией после трансляции в E. coli. Для изучения ли Tat-MT, Слитые белки Tat-SOD или Tat-GFP могут быть трансдуцированы в MC, мы добавили каждый белок в культуральную среду в течение 1 часа и исследовали внутриклеточную экспрессию полигистидина с помощью Вестерн-блоттинга и конфокальной микроскопии. Как показано в D-E на S1 Fig, Tat-GFP, Tat-MT и Tat-SOD были эффективно трансдуцированы в MC. После 1 ч инкубации с 1 мкмоль / л Tat-сплавленных белков исследование конфокального микроскопа показало, что почти все клетки были окрашены положительно для полигистидина. Инкубация только с МТ или СОД не приводила к клеточному поглощению. Тат-слитые белки сохранялись до 4 дней после трансдукции (данные не показаны). Внутриклеточное присутствие экзогенно вводимых Tat-MT и Tat-SOD внутри клеток MC было подтверждено окрашиванием MT и SOD антителами соответственно. Флуоресценция была обнаружена как в цитоплазме, так и в ядре.

Мы исследовали, может ли DN, разработанный почти у всех крыс OLETF, отсрочить или ингибировать путем введения белков Tat-fusion. Во-первых, была протестирована способность слитых белков Tat к почечным тканям. 3 мг / кг белков Tat-fusion получали через одну внутрибрюшинную инъекцию крысам OLETF в возрасте 20 недель. Во-первых, мы продемонстрировали успешную трансдукцию белка TT в тканях почек, рассеченных от крыс OLETF через 4 дня после внутрибрюшинной инъекции Tat-GFP или антиоксидантов в комбинации (F на S1 Fig). Затем мы исследовали влияние антиоксидантных белков на развитие DN, обработав отдельную группу крыс 3 мг / кг либо Tat-GFP, либо антиоксидантов в комбинации каждые 3 дня в течение 16 недель, начиная с 20-недельного возраста. В качестве гистологического контроля использовали крыс LETO или крыс OLETF без трансдукции. Масса тела, уровень глюкозы в плазме натощак или концентрация инсулина не различались между крысами OLETF с антиоксидантным лечением и без него. Важно отметить, что 24-часовая экскреция микроальбумина мочи увеличилась у крыс OLETF без трансдукции и крыс OLETF, обработанных Tat-GFP, тогда как у крыс OLETF, обработанных антиоксидантом, значительно уменьшилось. Изменения уровня 24-часовой экскреции белка мочи не отличались между различными методами лечения в соответствии с изменениями веса почки (таблица 1). На фиг.1 показаны типичные гистологические изменения, наблюдаемые у обработанных крыс. Контрольные крысы OLETF отображали обычную патологию ME, отмеченную аккрецией ECM и утолщением капиллярной стенки. Последующие анализы показали, что PAS-положительные области, важные показатели ME, были значительно больше у крыс OLETF, обработанных Tat-GFP (и в OLETF без трансдукции), чем у крыс OLETF, обработанных антиоксидантом (и в контроле LETO) , Мезангиальное расширение матрицы у крыс OLETF, обработанных Tat-GFP (и в OLETF без трансдукции), было уменьшено в группе, получающей антиоксиданты (фиг. 1A и 1C). Более подробные ультраструктурные результаты были получены из ультратонких разрезов с просвечивающим электронным микроскопом (рис. 1B). У крыс OLETF, обработанных Tat-GFP (и в OLETF без трансдукции), в дополнение к утолщению GBM и ME, носовые процессы подоцитов были слиты и демонстрировали типичные ультраструктурные признаки диабета, связанные с уширением стоп-процессов и сглаживанием подоцитов. Ширина толщины и толщины GBM значительно снижалась в группе, обработанной антиоксидантами, и почти одинакова по сравнению с крысами LETO контрольной группы (рис. 1D).

Диабетическим крысам OLETF в возрасте 20 недель вводили, в т.ч. либо с обработкой 3 мг / кг Tat-GFP, либо с таким же количеством антиоксидантов в комбинации раз в две недели. (A) типичные почечные гистологические данные, продемонстрированные окрашиванием Периодической кислоты Shiff (PAS) (увеличение X400); (B) электронная микрофотография клубочков (увеличение X20000); (C) количественный анализ изображений окрашенных PAS участков почек; (D) Количественный анализ изображений толщины GBM с помощью электронных микрофотографий. (E) Количественный анализ ширины стопы через электронные микрофотографии. Значения — это ± SEM (n = 8 крыс в каждой группе). bp <0,01 против группы, обработанной Tat-GFP. Сокращения; TGFP: Tat-GFP, TMTS: комбинация Tat-MT-Tat-SOD.

Диабетические крысы OLETF были случайным образом разделены на две группы: группу лечения Tat-GFP и группу комбинированной терапии Tat-MT-Tat-SOD. Первые вводили каждые 3 дня 3 мг / кг Tat-GFP, а второй — 3 мг / кг Tat-MT и 3 мг / кг Tat-SOD. Лечение протеином протеина продолжалось в течение 16 недель. Крыс LETO использовали в качестве гистологического контроля. Уровни мочевого белка определяли по методу Брэдфорда, а уровни микроальбумина измеряли с помощью набора ELISA для количественного определения микроальбумина (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX).

Значения выражаются как средства ± SEM.

* p <0,05 против OLETF

** p <0,01 против OLETF

† p <0,05 против OLETF + Tat-GFP

‡ p <0,01 против OLETF + Tat-GFP путем повторных измерений ANOVA.

#p <0,05 против OLETF

## p <0,01 против OLETF

$ p <0,05 против OLETF + Tat-GFP

$$ p <0.01 против OLETF + Tat-GFP односторонним ANOVA.

Сокращения; TGFP: Tat-GFP, TMTS: комбинация Tat-MT-Tat-SOD.

Количественные анализы также подтвердили, что не только пятнисто-положительные области трихрома, α-SMA и коллагена IV клубочкового массива, но и TGF-β, VEGF, CTGF и нитротирозина, важные показатели ME, воспаления, окислительного стресса и фиброза были больше у крыс OLETF, обработанных Tat-GFP (и в OLETF без трансдукции), чем у крыс OLETF, обработанных антиоксидантом (и в контроле LETO). Лечение крыс OLETF антиоксидантами в комбинации значительно уменьшало трихормическую положительность Массана и площадь клубочков, положительную для нитротирозина и окрашивания TGF-β (рис. 2).

Диабетические крысы OLETF обрабатывали, как на фиг.1. Крысы LETO или крысы OLETF без трансдукции использовали в качестве гистологического контроля. После 16 недель трансдукции ткани почек удаляли для соответствующего окрашивания. (A) Репрезентативные фигуры трихома Массона, α-SMA, коллагена IV и TGF-β1 (увеличение, × 400) с и без 16 недель антиоксидантной трансдукции; (B) Репрезентативные цифры окрашивания VEGF, CTGF и нитротирозина (увеличение, × 400) с и без 16 недель антиоксидантной трансдукции. Стрелки указывают на положительно окрашенные области. Гломерулярную область для соответствующих антител количественно определяли с помощью программного обеспечения Image Pro Plus. Значения — это ± SEM (n = 8 крыс в каждой группе). ap <0,05, bp <0,01 против группы, обработанной Tat-GFP. Сокращения; TGFP: Tat-GFP, TMTS: комбинация Tat-MT-Tat-SOD.

Почечные ткани выделяли через 16 недель после начала обработки Tat-слитым белком и обрабатывали для ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга (рис. 3). Почечные ткани крыс, подвергшихся воздействию антиоксидантов, выявили меньше доказательств воспаления и фиброза (снижение RAGE, ACE, ICAM-1, коллагена IV, фибронектина, экспрессии VEGF и CTGF), а также меньшая экспрессия NOX4, MAPK (p38, ERK и JNK) и NF-kB. Интересно, что почечная экспрессия AMPK, по-видимому, увеличивалась у крыс, обработанных антиоксидантом. Кроме того, экспрессия белков β-catenin и WNT, которые были активированы в почечных тканях крыс OLETF, обработанных Tat-GFP (и в OLETF без трансдукции), как правило, снижалась у крыс, обработанных антиоксидантом (фиг. 3Е). В совокупности наши результаты показывают, что структурные изменения почечных клубочков и тубулоинтерстития происходят в сочетании с физиологическими изменениями множественных избыточных ROS-опосредованных сигнальных механизмов, вызванных обработкой антиоксидантами.

Диабетические крысы OLETF обрабатывали, как на фиг.1. Крысы LETO или крысы OLETF без трансдукции использовали в качестве гистологического контроля. После 16 недель трансдукции ткани почек удаляли для RT-PCR (NOX4, RAGE, ACE, ICAM-1 и коллагена IV) (A, B) и анализа Вестерн-блоттинга (фибронектин, фосфо-p38, фосфо-ERK, фосфо- JNK, фосфо-AMPK, общее количество и фосфо-LRP6, β-катенин, общее количество и фосфо-GSK3, VEGF, CTGF) (CF). β-актиновая мРНК и α-тубулиновый белок служили в качестве контроля загрузки (n = 8 крыс в каждой группе). (G) Репрезентативный иммуноблот для NF-κB p65 с использованием ядерных белков из тканей почек и EMSA. Ядерные экстракты смешивали с двухцепочечным 32P-меченым олигонуклеотидом, кодирующим декамерную консенсусную последовательность NF-κB и разделяли PAGE. Значения — это ± SEM (n = 8 крыс в каждой группе). bp <0,01, cp <0,001vs. Группа, обработанная Tat-GFP. Сокращения; TGFP: Tat-GFP, TMTS: комбинация Tat-MT-Tat-SOD.

Затем мы продемонстрировали, что трансдукция белковых конструкций слияния, Tat-MT, Tat-SOD или Tat-GFP не показала значимой цитотоксичности (данные не показаны). Мы также тестировали их влияние на уровни экспрессии воспалительных молекул после травмы, вызванной высокой глюкозой, AGE или 4-HNE. Как показано на фиг. 4, было обнаружено, что различные типы травм увеличивают экспрессию уровней RAGE и AGII в МС, как показано выражением ACE и AT-1. Лечение Tat-MT, Tat-SOD, Tat-MT и Tat-SOD в комбинации резко уменьшало RAGE и AGII. Внутриклеточная активность MT и SOD увеличивалась дозозависимым образом (S2 Fig), а Tat-MT (1 мкмоль / л) и Tat-SOD (1 мкмоль / л) в комбинации превосходили либо только антиоксидант при уменьшении RAGE и AGII (рис. 4). Увеличение активации RAGE, экспрессии мРНК ACE и АТ-1 после воздействия высокой глюкозы, AGE или 4-HNE было полностью предотвращено путем трансдукции двух антиоксидантных белков. Экспрессия RAGE увеличилась в 3 раза при высоком уровне глюкозы в течение 24 ч, в то время как антиоксидантная терапия уменьшала экспрессию в 0,9-1,9 раза по сравнению с контрольным уровнем. Когда МС подвергали воздействию AGE в течение 24 ч, добавление антиоксидантов уменьшало экспрессию RAGE от 3,5 до 0,7-1,2 раза от контрольного уровня. Повреждение, вызванное 4-HNE, увеличивало экспрессию RAGE на 2,5 раза выше контрольного уровня, а комбинированное лечение антиоксидантами уменьшало его до 1,1-1,7 раза по сравнению с контролем (рис. 4). Как показано на рис. 5, все различные типы повреждений увеличивали экспрессию нижестоящих окислительных стрессов, воспалительных и фиброзных молекул (RAGE, TGF-β, фибронектин, коллаген IV, ICAM-1 и CTGF), в то время как антиоксидантная обработка уменьшала их в MC. Как и ожидалось, они уменьшили активность MMP-9, и лечение Tat-MT и / или Tat-SOD увеличило его экспрессию. Было также обнаружено, что повышенная экспрессия TNFα и коллагена III после различных повреждений, измеренная с помощью ПЦР в реальном времени RT, была заблокирована обработкой антиоксидантов. В целом, эффекты антиоксидантов в комбинации были выше, чем у антиоксиданта в одиночку. Мы также исследовали, могут ли антиоксиданты ослабить окислительный стресс и воспаление, вызванные самой AGII. Как и ожидалось, AGII дозозависимо увеличивало образование ROS и экспрессию воспалительных молекул в крысиных MCs, либо из-за гемодинамического возмущения, либо метаболического расстройства, в то время как Tat-MT значительно уменьшало эти эффекты (S3 Fig). В совокупности эти наблюдения показывают, что антиоксиданты, полученные путем трансдукции белка, эффективны в снижении ROS и защищают почечные клетки от воспаления, вызванного гипергликемией, AGE, 4-HNE и самой AGII.

Первичные культуры МС трансдуцировали 1 мкмоль / л Tat-GFP, Tat-MT, Tat-SOD или комбинацией Tat-MT (1 мкмоль / л) и Tat-SOD (1 мкмоль / л) и затем переносили к DMEM с высокой глюкозой (30 ммоль / л) в течение 24 ч, подвергали воздействию AGE (400 мкг / мл) в течение 24 часов или подвергали воздействию 4-HNE (40 мкг / мл) в течение 24 часов. Клетки в контрольной группе инкубировали в DMEM с низким содержанием глюкозы (5,5 ммоль / л), 400 мкг / мл BSA или нормальной глюкозы (11,1 ммоль / л) соответственно. (A) экспрессию RAGE и ангиотензина II в MCs исследовали с помощью Вестерн-блоттинга (RAGE) и RT-PCR (ACE, AT-1). Протеиновые клеточные экстракты исследовали для RAGE с использованием поликлонального антитела и α-тубулина, который служил в качестве контроля загрузки. Данные представляют собой три эксперимента, выполненных в разные дни. (B) Количественная оценка результатов Вестерн-блоттинга и RT-PCR. Вестерн-блоты определяли количественно денситометрией и выражали в виде изменений сложения относительно контролей. Результаты RT-PCR определяли количественно с помощью денситометрического анализа с использованием одноразового анализатора количественного анализа (Bio-Rad, США). Экспрессию целевой мРНК рассчитывали путем нормализации по отношению к экспрессии мРНК β-актина. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 9). ap <0,05, bp <0,01, cp <0,001%. Обработанная Tat-GFP группа. Сокращения; LG: низкий уровень глюкозы (5,5 ммоль / л), NG: нормальная глюкоза (11,1 ммоль / л), HG: высокая глюкоза (30 ммоль / л), TGFP: Tat-GFP, TMT: Tat-MT, TSOD: Tat-SOD , TMTS: комбинация Tat-MT-Tat-SOD.

(A) Воспалительную молекулярную экспрессию в MCs исследовали вестерн-блот-анализом (TGF-β, фибронектин, RAGE, CTGF) и зимографией (MMP-9). Протеиновые клеточные экстракты были исследованы для фибронектина с поликлональным антителом, а α-тубулин служил в качестве контроля загрузки. Данные представляют собой три эксперимента, выполненных в разные дни. (B) Экспрессия воспалительной молекулы в MCs была исследована с помощью RT-PCR (ICAM-1, коллаген IV) и (C) в режиме реального времени ПЦР (TNF-α, коллаген III). Сокращения; LG: низкий уровень глюкозы (5,5 ммоль / л), NG: нормальная глюкоза (11,1 ммоль / л), HG: высокая глюкоза (30 ммоль / л); TGFP: Tat-GFP, TMTS: комбинация Tat-MT-Tat-SOD. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 3). ap <0,05, bp <0,01, cp <0,001%. Обработанная Tat-GFP группа.

Затем мы продемонстрировали антиоксидантное действие на активность MAPK, например p38, ERK и JNK. ROS, продуцируемый различными разрушительными условиями, увеличивал фосфорилирование p38, ERK и JNK, в то время как Tat-MT, Tat-SOD и их комбинация почти ликвидировали это фосфорилирование. Мы также изучили влияние антиоксидантов на активность киназы AMP, важного датчика энергии в различных клеточных средах. Различные ROS-индуцирующие повреждения уменьшали экспрессию AMP-киназы и антиоксидантная комбинация, как представляется, противодействовали этому эффекту. Интересно, что все ROS-продуцирующие травмы активировали сигнализацию WNT, в то время как антиоксиданты ингибировали ее (S4 Fig). Единственным исключением был pGSK3β, который не изменялся при лечении антиоксидантами.

NF-κB также участвует в оскорблении клеток, подверженных окислительному стрессу, поэтому была проверена возможность того, что антиоксиданты были инактивированы NF-κB. Фактически мы обнаружили, что ROS, продуцируемый всеми тремя различными повреждениями, активировал NF-κB, в то время как Tat-MT, Tat-SOD и, тем более, антиоксиданты комбинировали, ингибировали активацию NF-κB (S4 Fig). Антиоксиданты также уменьшали экспрессию iNOS и приводили к увеличению NO (данные не показаны). В совокупности эти результаты показывают, что антиоксиданты, если они даны эффективно, противодействуют множественным избыточным ROS-опосредованным сигнальным механизмам, которые также связаны с увеличением экспрессии компонентов сигнальных путей RAGE и AGII.

Чтобы доказать, что эффективная доставка эндогенных антиоксидантов в почечные ткани может улучшить патофизиологию DN, мы решили применить технологии CPP для изучения мелиоративного эффекта наших Tat-fused белков MT и SOD у крыс OLETF. У крыс OLETF лечение слиянием-антиоксидантами, по-видимому, вызывало пониженную экспрессию ROS и последующие сигналы трансдукции в почечных клетках, включая MC, задерживающие клиническую прогрессию до DN. Хотя общая величина защиты от развития протеинурии оказалась небольшой, серия иммуногистохимических и биохимических тестов показала определенную защитную роль для этого лечения. Кроме того, MT и SOD, доставленные в MC, также ингибировали различные виды окислительных повреждений и уменьшали экспрессию сигналов ниже по течению. В соответствии с нашим экспериментом считается, что перепроизводство ROS, приводящее к окислительному стрессу в тканях почек, особенно в MC, является причинным фактором в этиологии DN [5, 8]. Таким образом, антиоксидантная терапия для диабета часто изучалась как потенциальная модальность для профилактики ДН, но результаты несовместимы, так как трудно поддерживать стабильный уровень циркулирующих антиоксидантов и адекватное распределение ткани, и существует нехватка подходящих антиоксидантов для терапевтического применения [20]. Вместо этого во многих исследованиях были изучены стратегии и варианты увеличения антиоксидантной активности в почечных тканях с целью снижения цитотоксического повреждения, вызванного повышенным уровнем ROS, NO и цитокинов, присутствующих при диабете [6, 21]. Стратегический план по обеспечению эндогенного антиоксиданта широкого спектра более эффективно или побуждать его преднамеренно может быть альтернативным вариантом. MT и SOD являются хорошими кандидатами на эндогенные акцепторы свободных радикалов, хотя и с ограниченной мембранной проницаемостью. Мы обнаружили, что непрерывное, продолжительное (16 недель) и периодическое (каждые 3 дня) воздействие белков МТ и СОД, использующих новую методику доставки, привело к значительному снижению уровней микроальбуминурии в соответствии с уменьшением положительной области нитротирозина. Хотя исключение гипергликемии как механизма предотвращения ДН путем лечения МТ и СОД из-за неспецифичности стратегии тат-слитого белка не могло быть исключено, это не было очевидным случаем в нашем реальном эксперименте in vivo (таблица 1) и мы предполагаем, что существует прямой защитный эффект антиоксидантов против почечной патологии. Поэтому стратегия, направленная на стимулирование неспецифического антиоксиданта в течение значительного периода времени и эффективного его доставки, может быть эффективным кандидатом для предотвращения ДН.

Потенциал Tat как носителя изучался в различных типах клеток и тканях [16-18]. Несмотря на недостаток неспецифичности, ВИЧ-1-производный Tat опосредует мембранную транслокацию многих пептидов как in vitro, так и in vivo, а функции Tat-сплавленных пептидов сохраняются [16, 17]. Применяя эту технологию трансдукции белка, мы продемонстрировали, что антиоксиданты были успешно введены в почечные клетки (MC) и способны защищать клетки от различных типов повреждений, связанных с окислением in vitro. Без помощи доставки Tat, антиоксидантные пептиды не могут получить существенный вклад в MC. Эта работа также подтверждает, что наша стратегия внутриклеточной доставки этих слитых белков сохраняет свою функциональность как антиоксиданты. Однако, несмотря на эффективную краткосрочную доставку, наша стратегия может страдать от генерации иммунного ответа на поставленный белок, тем самым снижая эффективность с течением времени. Чтобы обойти этот недостаток, мы провели несколько исследований, чтобы попытаться свести к минимуму количество потенциально иммуногенного продукта синтеза, который будет доступен. Наконец, мы считаем, что мы оптимизировали соответствующую концентрацию и количество вводимого белка, чтобы минимизировать иммунный ответ. Наши результаты показывают, что 16 недель длительной комбинированной терапии Tat-MT (3 мг / кг) и Tat-SOD (3 мг / кг) каждые 3 дня является достаточным для значительного снижения ME, в то время как увлажнение гломерулярного воспаления и фиброза и значительное ослабление микроальбуминурии у крыс с диабетом OLETF.

Помимо травм на туберкулине и сосудистой сети, окислительный стресс в основном приводит к мезангиальным повреждениям, характеризующимся утолщением ME и GBM у пациентов с DN [10]. Было показано, что это накопление мезангиальной матрицы индуцируется различными повреждениями ROS, вызывающими изменения количества и составляющих ECM, включая фибриллярные белки и гликопротеины, такие как коллаген I, III и IV типа, фибронектин и ламинин. Также влияют экспрессия и активность регуляторных ферментов ECM, таких как матриксные металлопротеиназы и тканевые ингибиторы матричных металлопротеиназ, а также факторы роста, такие как PDGF, TGF-β1 и CTGF [4, 8, 11]. Кроме того, MCs являются важными клеточными медиаторами межклеточного, межпозвоночного пространства в почках и играют решающую роль в посредничестве ME. Эксперименты с использованием первичных культур МС в качестве суррогатов показали, что окислительный стресс является основным фактором в этиологии ДН. Другие исследования показали, что функциональные и структурные изменения почек у пациентов с ДН также связаны с повышенной экспрессией TGF-β, CTGF и VEGF и что усугубленное воспаление, главным образом в МС, является патогенным для гломерулосклероза и протеинурии. Однако известно, что эндогенные антиоксиданты защищают MC от свободнорадикального окисления и цитотоксичности ROS.

В нашем исследовании ренопротективное действие белков MT и SOD Tat-fusion было связано с уменьшением постинфильных профибротических факторов (TGF-β, VEGF и CTGF), а также с уменьшением воспалительных молекул (ICAM-1, RAGE, коллаген, ламинин и фибронектин) через множественные избыточные ROS-опосредованные пути. Мы также обнаружили, что эти эндогенные антиоксиданты непосредственно уменьшают степень индуцированных AGII повреждений, которые либо вызваны гемодинамическим возмущением, либо метаболическим расстройством, и привели к подавлению NOX4 и снижению регуляции синтеза нескольких воспалительных молекул в культивируемых MC. В дополнение к своим хорошо известным метаболическим атакам на почках гипергликемия вызывает дисфункциональную ауторегуляцию в клубочках, стимулируя внутреннюю почечную ренин-ангиотензин-альдостеронную ось, что приводит к активации местного производства AGII [7, 12]. Это может увеличить кровеносное капиллярное давление, тем самым увеличивая механическое растяжение МС, которые затем активируют сигналы ROS, усиливая различные избыточные внутриклеточные пути и усиливая DN синергически. В нашем исследовании MCs, как и ожидалось, AGII, основной вклад в повреждение почек, дозозависимое увеличение образования ROS и экспрессию воспалительных молекул, включая AT-1, в то время как экзогенно вводимые Tat-сплавленные антиоксиданты значительно снижали эти эффекты. Мы также показали, что длительное лечение этими антиоксидантами привело к улучшению измерений экскреции и патологии мочевого альбумина у хронически гипергликемических крыс OLETF.

Биологические эффекты MT и SOD могут быть отнесены к их функции как акцепторы свободных радикалов, действующие как внутриклеточные антиоксиданты. Показано, что доставка рекомбинантного белка SOD (или миметиков SOD) в поврежденные почечные ткани способствует восстановлению почек и улучшению функциональной мелиорации после начала DN [5]. Однако, если SOD были просто предоставлены в растворе, он быстро рассеивался бы в жидкостях организма. Следовательно, потребуются непрактичные повторные инъекции, и в конечном итоге чрезмерные дозы могут вызывать нежелательные побочные эффекты. Чтобы обойти это, многие группы пытаются внедрить СОД в ткани почек через доступные системы доставки лекарств или трансплантацию клеток, применяющих инкапсуляцию. Эти маневры необходимо улучшить с точки зрения выпуска, дозирования, эффективности и безопасности. В наших экспериментах мы использовали новейшую технологию CPP, чтобы обойти эти препятствия. Чтобы обобщить полезные эффекты in vivo этих поглотителей ROS, мы изучили влияние этих новых антиоксидантов слияния пептидов на крысиные MCs в трех разных моделях in vitro опосредуемых ROS повреждений, гипергликемии, AGE и 4-HNE. В этих трех моделях in vitro эндогенные антиоксиданты значительно снижали экспрессию RAGE и AGII. Хотя точные дефекты в МС, возникающие в результате различных видов травм, не совсем понятны, активация NF-κB окислительным стрессом является вероятным ранним событием [22], и это мнение подтверждается нашими собственными экспериментами. Хотя точный вклад NFκβ может различаться в разных клинических ситуациях при развитии DN, ROS, по-видимому, играет решающую роль в активации NFκβ [23]. Ha et al. продемонстрировала повышенную активность NFκβ в МС с высокой концентрацией глюкозы и ROS, вырабатываемую в этом высоком состоянии глюкозы, играет важную роль в активации NFκβ [24]. NFκβ является редокс-чувствительным транскрипционным фактором, и его активация является начальным сигнальным событием, стимулирующим активацию других воспалительных путей, что приводит к различным микрососудистым повреждениям у пациентов с диабетом [25]. Дерегулирование клеточных нисходящих молекулярных каскадов и контроль вторичных по отношению к длительным гипергликемическим средам в клетке приводит к эндотелию, подоциту, МС, а также к повреждению трубчатых эпителиальных клеток, что может быть решающим фактором в патогенезе ДН. MAPK и фосфатидил-инозит-3-киназа также участвуют в индукции VEGF, и их последующие молекулярные события также связаны с активацией NFκβ. NFκβ индуцирует экспрессию большого количества генных продуктов, которые влияют на воспаление, пролиферацию клеток, ангиогенез и клеточную адгезию [26].

Мы также обнаружили, что повышенный окислительный стресс, возникающий в результате различных механизмов повреждения ROS, сопровождался активацией киназы MAPK, AMP и, возможно, сигнальных путей WNT. Помимо классического участия MAPK [19, 20], различные пути обнаружения питательных веществ также важны для развития DN [20, 27]. Киназа AMP влияет на различные клеточные и липидные метаболические пути, с помощью которых она может способствовать ренопротекции. У крыс OLETF часто обнаруживается дисфункциональный внутрипочечный липидный обмен, характеризующийся повышенным липогенезом и снижением β-окисления. Хотя у нас нет данных, снижение активности киназы почечной AMP в OLETF может объяснить изменения в метаболизме почек липидов и последующее повреждение почек почки, связанные с липотоксичностью. Активация АМФ-киназы антиоксидантом может превращать липогенный фермент, ацетил-СоА-карбоксилазу и активировать митохондриальное β-окисление, такое как карнитин-пальмитоилтрансфераза-1. Кроме того, как и наши собственные эксперименты, ROS также активирует сигналы WNT в почках диабетических животных, что будет способствовать обострению лечебных путей путем набора многочисленных факторов роста, связанных с дисрегуляцией фиброзного образования рубцовой ткани [28] , Обнаружено, что канонический сигнальный путь WNT модулирует воспаление, ангиогенез и фиброз посредством регуляции ICAM-1, VEGF, TNF-α и CTGF [29]. Блокирование сигнала WNT антиоксидантами может остановить прогрессирование окислительного стресса, воспаления, нарушения регуляции раны и фиброза.

Антиоксидантная терапия повышала устойчивость МС к ROS и изменяла активацию сигнальных путей NF-κB, MAPK, AMP-киназы и WNT, а также экспрессию воспалительных регуляторных цитокинов ниже по течению. Эти антиоксиданты почти ликвидировали повышенную экспрессию ICAM-1 и CTGF, а также ламинина и фибронектина, конечных составляющих расширения ECM в культивируемых МС. Кроме того, они уменьшили активность MMP-9. Все эти изменения in vitro в апоптозе и сигнальных путях поддерживались и подтверждались результатами иммуноблоттинга почечной ткани после 16 недель лечения комбинированными антиоксидантами Tat (см. Рис. 3). Эта комбинация значительно уменьшала различные ROS-опосредованные повреждения и результирующий почечный ущерб in vivo и in vitro путем ингибирования активации избыточных сигналов и их восходящих медиаторов.

Несмотря на то, что мы сосредоточились на МК, еще важными кандидатами для исследования являются еще одна важная дозорная, подоцитовая или клубочковая висцеральные эпителиальные клетки. Они являются высокоспециализированными и производят процессы ног, которые взаимодействуют между клетками клубочков, оставляя щели фильтрации [30]. Они также синтезируют матричные белки в GBM, включая коллаген типа IV, ламинин, энактин и агрин [4, 26]. Хотя мы не изучали влияние антиоксидантов на подоциты в диабетической модели крыс OLETF per se, гемодинамический стресс, приводящий к перепроизводству локальных факторов роста, индуцирует гломерулярную гипертрофию и увеличивает синтез коллагена типа IV в подоцитах, аналогично тому, что наблюдается у МС. Можно предположить, что активация подобных путей передачи сигнала и последующие аналогичные изменения в метаболизме подоцитов при развитии ДН могут быть похожими на те, которые продемонстрированы в МК [3, 4].

Таким образом, наши результаты показывают, что наши конструкции Tat-fusion с ферментативными антиоксидантами, MT и / или SOD, либо самостоятельно, но наиболее значительно в комбинированной терапии, ингибировали эффекты трех различных окислительных повреждений (гипергликемия, AGE и 4-HNE экспозиция), а также изменения в структуре сигнализации в нисходящем направлении в MC. Важно отметить, что ферментативная антиоксидантная терапия в сочетании в течение длительного периода значительно уменьшала окислительные повреждения и задерживала прогрессирование до DN и, по-видимому, почечная недостаточность у крыс OLETF. Ренозащитные эффекты этих новых гибридных полипептидов, ферментативно-функциональных, антиоксидантов в DN могут быть связаны с уменьшением концентрации самих внутриклеточных и внеклеточных ROS, а также с полезным изменением триггеров, представленных нижерасположенным сигнальным рецепторам и путям. Мы пришли к выводу, что этот эффективный новый механизм доставки комбинированной антиоксидантной терапии наглядно продемонстрировал роль антиоксидантной терапии, которая предлагает ренопротекцию и облегчает восстановление повреждений у пациентов с ДН. Диабет предрасполагает людей к чрезмерному окислительному стрессу, потому что системы антиоксидантной защиты перегружены гипергликемией, а полученные неконтролируемые травмы, вызванные ROS, являются вероятными причинными факторами при развитии грозных осложнений диабета. Эта работа демонстрирует, что это новое средство антиоксидантных добавок может ингибировать многие связанные с диабетом изменения, которые были связаны с повышенными концентрациями ROS и NO в гипергликемии. Поскольку эти антиокислители слияния и протеина, по-видимому, являются новым и перспективным подходом к изучению и, возможно, лечению последствий окислительного стресса для развития диабетических осложнений, таких как DN, дальнейшее исследование, безусловно, оправдано.

(A-C) Схематическое представление конструкций Tat-MT, Tat-SOD и Tat-GFP, субклонированных в экспрессирующих векторах и соответствующем блоке белка после экспрессии и очистки. (D). Первичные культивированные мезангиальные клетки (MCs) инкубировали в течение 1 часа с 1 мкмоль / л MT, Tat-MT, SOD, Tat-SOD или Tat-GFP. Экстракты, совместимые с белками MC, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антигибких полигистидиновых, анти-козьих MT, анти-кроличьих SOD и анти-кроличьих β-актиновых антител. (D) Клеточная локализация MT, Tat-MT, SOD, Tat-SOD и Tat-GFP в MC 1 час после лечения каждым белком. Показаны конфокальные микроскопические изображения клеток, окрашенных для полигистидинового (зеленого) и поликлонального MT или SOD антитела (красный) (масштабная шкала, 50 мкм, оригинальное увеличение, × 400). (E) Трансдукцию Tat-слитых белков в почечные ткани анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. Диабетическим крысам OLETF в возрасте 20 недель инъецировали i.p. с одной обработкой 3 мг / кг Tat-GFP или с таким же количеством антиоксидантов в комбинации. Ткани были вскрыты у крыс через 4 дня после трансдукции и обработаны для Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии с использованием анти-кролинового полигистидинового антитела и анти-мышиного β-актина. В качестве гистологического контроля использовали крыс LETO или крыс OLETF без трансдукции. Результаты представлены тремя отдельными экспериментами.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

MCs инкубировали с Tat-MT, Tat-SOD или антиоксидантами в комбинации при указанных концентрациях и затем обрабатывали 400 мкг / мл AGE. Контрольные клетки обрабатывали 400 мкг / мл BSA. В качестве стандарта служила экспрессия мРНК β-актина. Уровни RAGE и фибронектина были исследованы путем Вестерн-блоттинга. Протеин-подобранные клеточные экстракты зондировали поликлональными антителами и α-тубулин служили в качестве контроля загрузки. Данные представляют собой три эксперимента, выполненных в разные дни.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(А) Клетки инкубировали в отсутствие (контроль) или присутствие 1 ~ 1000 нмоль / л AGII в течение 24 часов. Экспрессию воспалительных молекул измеряли с помощью ОТ-ПЦР (RAGE, АТ-1 и коллагена IV) или вестерн-блоттинга (RAGE и фибронектин). (B) Ингибирование экспрессии воспалительных молекул Tat-MT. Клетки трансдуцировали с помощью MT или Tat-MT и затем обрабатывали 1000 нмоль / л AGII в течение 24 часов, а экспрессию воспалительной молекулы определяли, как в A. β-актине, служили в качестве контроля загрузки. Данные представляют собой три эксперимента, выполненных в разные дни. Сокращение; AGII: Ангиотензин II.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

A) Экстракты MCs были получены и проанализированы для активации MK-киназы и AMP-киназы иммуноблоттингом с использованием фосфоспецифических антител против белков MAPK (p38, ERK и JNK) и белков AMPK. α-тубулин служил в качестве контроля загрузки. (B) экспрессию сигнала Wnt в MCs исследовали путем Вестерн-блоттинга (общее количество и фосфо-LRP6, β-катенин, общее количество и фосфо-GSK3β и VEGF). (C). Ядерные и цитозольные экстракты из МС, сопоставленные с белками, были проанализированы с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела против мышиного p65 и антитела против кроликов α-тубулина. (D) Ядерные экстракты смешивали с двухцепочечным 32P-меченым олигонуклеотидом, кодирующим декамерную консенсусную последовательность NF-κB и разделяли PAGE. Данные представляют собой три эксперимента, выполненных в разные дни. Сокращения; LG: низкий уровень глюкозы (5,5 ммоль / л), NG: нормальная глюкоза (11,1 ммоль / л), HG: высокая глюкоза (30 ммоль / л), TGFP: Tat-GFP, TMT: Tat-MT, TSOD: Tat-SOD , TMTS: комбинация Tat-MT-Tat-SOD. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 3). ap <0,05, bp <0,01, cp <0,001 между различными группами травм.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы хотели бы поблагодарить доктора. Эрик Ричардсон и Джухюн Пьо за редакционную поддержку рукописи. Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования, науки и техники (2010-0010898) и Проектом исследований и развития здравоохранения Кореи 21, Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Кореи (A102065).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *