Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Новый метод оценки коллагеновой архитектуры в коже

Текстура в биологических образцах может выявить критические идеи, хотя их очень трудно оценить. Это особая проблема гистологического анализа. Например, кросс-полярные изображения окрашенной кожи пикрозириуса обнаруживают изысканную структуру, позволяющую оценивать изменения в консистенции basketweave здорового коллагена. Существующие методы измеряют грубые патологические изменения, такие как фиброз, но недостаточно чувствительны для выявления более тонких и прогрессирующих патологических изменений в дерме, таких как те, которые наблюдаются при старении. Кроме того, методы скрининга для кожных терапевтических средств требуют точных, неконтролируемых и высокопроизводительных методов анализа изображения.

Анализируя спектры изображений после фильтрации Габора и быстрого преобразования Фурье, мы смогли измерить тонкие изменения в ориентации коллагенового волокна, не поддающиеся существующим методам. Мы обнаружили прогрессирующую потерю структуры коллагена basketweave в серии хронологически старых образцов кожи, а также в коже, полученной из модели сахарного диабета 2-го типа.

Мы описываем новый подход к биоизображению с последствиями для оценки патологии в более широком диапазоне биологических ситуаций.

Кожа состоит из трех основных слоев; внешний защитный эпидермальный барьер, состоящий в основном из кератиноцитов; более глубокий слой соединительной ткани дермы, который придает силу и эластичность; и основное энергохранилище, суб-кутикулярный жир. Дерма в основном состоит из белков внеклеточной матрицы (ECM), собранных в сетку из прежде всего коллагеновых волокон [1]. На сегодняшний день известно 28 различных типов коллагена, которые подразделяются на восемь подсемейств на основе функции, сборки и гомологии доменов [2,3]. Фибриллярные коллагены являются основным компонентом ECM, причем коллаген I и IV являются преобладающими кожными компонентами [4]. Дерму можно далее подразделить на два дискретных ретикулярных и папиллярных слоя. Ретикулярная дерма состоит из крупных, зрелых, хорошо организованных волокон коллагена в нижнем слое дермы, взаимодействующих с подкожным жиром. Папиллярная дерма примыкает к базальной мембране, с более тонкими коллагеновыми волокнами и отчетливой коллагеновой организацией [5].

В здоровом состоянии кожный коллаген образует структуру «basketweave», причем перпендикулярные волокна коллагена пересекаются под углом 90 ° [6,7]. Эта структура basketweave обеспечивает текстурную информацию о коже и как потерю организации коллагена характеризует многие различные физиологические ситуации, включая старение [8,9], диабет [10], рубцевание [11-13], фиброз [14] и более специфические заболевания соединительной ткани, такой как синдром Элерса-Данлоса [15], поэтому методы оценки текстуры в биологических изображениях имеют непосредственное применение в дерматологических исследованиях.

Способность количественно определять конформацию коллагена в отношении здоровья и болезни имеет важные последствия для фундаментальных исследований, разработки лекарств и клинической диагностики. Например, методы, позволяющие точно измерять фото-ущерб, рубцевание, восстановление раны или другие возрастные повреждения, имеют ценность при определении эффективности процедур восстановления коллагена. Гистологические пятна, такие как пикрозириус, эффективно идентифицируют коллаген в образцах тканей, и можно сделать качественную оценку целостности ECM от микрофотографий. Однако предпочтительными являются методы объективного анализа изображений. Описаны методы на основе сегментации для оценки толщины и ориентации пучка коллагена, хотя требуется вмешательство пользователя [16]. Более сложные непредвзятые методы используют методы трансформации частотной области или инструменты спектрального анализа мощности.

Спектральный анализ мощности оценивает изменение мощности / энергии изображения в разных частотных поддиапазонах и непосредственно связан с автокорреляцией изображения тем, что он описывает, как тесно связанные две точки изображения являются функцией их расстояния и ориентации , Трансформация Фурье, в частности быстрое преобразование Фурье (БПФ), использовалась для оценки спектра мощности изображений, и этот подход сообщался несколькими группами в измерениях толщины и расстояния пучка, а также ориентации коллагенового волокна [9, 11,12,14,17-19].

Для определения ориентации коллагеновых волокон была использована одна конкретная вариация этого подхода — максимальный анализ нулевого порядка Фурье [14]. Этот метод широко применялся во множестве различных клинических ситуаций, включая выявление фиброза в склеродермии [14], оценку новых методов лечения гипертрофических рубцов и келоидов [11,12] и оценку эффективности дермальных заменителей в клинических испытаниях [18]. Первоначальные попытки использовать максимальный анализ Фурье первого порядка потребовали значительного ввода наблюдателя [14], но этот подход был уточнен, так что пользователь просто выбрал интересующую область для анализа и оценку ориентации коллагена, рассчитывая путем определения растяжения или удлинения БПФ спектра [19]. Таким образом, были измерены различия в толщине пучка, расстоянии и ориентации в рубцовой ткани по сравнению с нормальной кожей.

Хотя описанные выше методы идентифицируют грубые изменения коллагена, связанные с патологическими состояниями, они недостаточно чувствительны для измерения инкрементных изменений в архитектуре, наблюдаемых, например, в прогрессирующей утрате basketweave с хронологическим возрастом. Поэтому необходим способ, облегчающий количественную оценку текстурной информации. Фильтры Gabor известны своим сходством с моделями визуальной системы человека (HVS) при интерпретации текстуры изображения, поскольку они обеспечивают многоканальный банк фильтров, способный анализировать изображения на разных узких пространственных частотах и ​​ориентациях. Связь между фильтрами HVS и Gabor была установлена ​​благодаря новаторской работе Даугмана по анализу / сжатию изображения и распознаванию радужной оболочки [20,21]. С тех пор он успешно используется для представления текстуры, сегментации и дискриминации. Поэтому мы стремились использовать эти опубликованные методы, объединяя фильтры Габора и методы преобразования Фурье для измерения ориентации коллагенового волокна в серии изображений, полученных из кожи, окрашенной пикоризиусом. Поляризованная световая микроскопия четко показывает структуру basketweave дермы [22] и первоначально применяя фильтр Габора по восьми углам к нашим изображениям перед созданием спектра Фурье, мы можем создать метрику для структуры коллагена, что указывает на целостность коллагеновой основы. Это обеспечивает повышенную чувствительность и уменьшенный пользовательский ввод, который подвержен ошибкам и предвзятости человека. Для тестирования платформы анализа мы измерили влияние хронологического старения у мышей дикого типа (WT) и оценили целостность дермы на мышиной модели диабета типа 2. Улучшенная производительность анализа Габора на коже мыши, который, как известно, трудно анализировать по сравнению с кожей человека, подтверждает превосходную природу этой платформы для анализа структуры кожи.

Все процедуры проводились в соответствии с Законом 1986 года о правительственных животных Великобритании (научных процедурах) и одобрены Советом по этическому обзору Университета Букингема. C57Bl6, диабетом типа 2 диабета Leprdb / Leprdb (db / db) на фоне C57BLKS / J и контроле мышей C57BLKS / J (Misty) поддерживали на диетах для кормления чау-батов в стандартных условиях (BeeKay Number 1, B & K Universal Ltd, Leeds , ВЕЛИКОБРИТАНИЯ). Мышей получали из Charles River (Manston, UK) в возрасте 5-6 недель. Мышей дикого типа C57 убивали на 3-м, 8-м, 12-м и 20-м возрасте, а мыши Misty и db / db были убиты в 6wk, 3m, 5m и 6m. В 12wk db / db животные были гипергликемическими и содержательной моделью диабета типа II человека. Для всех исследований использовались свободно кормящие самцы, и изучались ткани от по меньшей мере 3 животных на группу.

После того, как животные были подвергнуты эвтаназии, биопсии дорзальной кожи были немедленно взяты и замораживались в жидком азоте до хранения при -80 ° C, пока все образцы не были готовы к одновременной обработке для сведения к минимуму артефактов. Образцы переносили в холодный (4 ° C) 10% нейтральный буферный формалин, затем фиксировали в течение 7-8 ч при комнатной температуре. За этим последовало обезвоживание, очистка и восковое погружение в автоматизированный тканевый процессор в качестве стандарта. Прямоугольные кусочки кожи были размещены на боковых сторонах в форме, так что срезы были бы разрезаны ортогонально к эпидермальной поверхности, прежде чем встраиваться в парафиновый воск. 4 мм толщины разрезались с использованием вращающегося микротома с углом ножа 35 ° и углом зазора от 1 ° до 5 °, перед тем как перейти на положительно заряженные стеклянные слайды. В качестве стандарта проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H & E), чтобы подтвердить целостность и ориентацию ткани во всех образцах.

Организация коллагена изучалась с использованием метода пикрозириуса, как описано ранее [22-24]. Вкратце, слайды окрашивали в течение 1 часа при комнатной температуре в 0,1% Direct Red 80 в насыщенной пикриновой кислоте перед дифференцировкой в ​​0,5% уксусной кислоте, обезвоживании, очистке и установке. Слайды отображались в ярком поле, в темном поле и под флуоресценцией с инвертированным микроскопом Nikon Eclipse Ti-E, оснащенным кросс-полярной оптикой (Nikon, Kingston, UK) и QImaging CCD-камерой, подключенной к программному обеспечению Nikon NIS Elements (версия 4.10 +0,01). Изображения с каждого слайда были захвачены при 90-кратном увеличении по меньшей мере в 3 разных местоположениях на одно животное и усреднены для обеспечения среднего значения для каждого животного. Изображения с автофлуоресцентным и ярким полем выявили грубую структуру коллагена в дерме (рис. 1), в то время как темно-полевая (скрещеннополярная микроскопия) визуализация окрашиваемой пикрозирием кожи выявила базовую структуру кожных коллагенов (рис. 1). Качественно релаксация basketweave наблюдалась в старении и в патологических состояниях [8-10].

Пикрозириус окрашивает кожу мыши. C57Bl6 мышь, окрашенная пикрозириусом и видимая под ярким полем (левая панель), флуоресценция (абс / em ~ 581/644 нм, центральная панель) или темно-полевая поперечная поляризация (правая панель, оригинальное увеличение 90X, шкала шкалы = 10 мкм).

Анализ данных выполнялся с использованием GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA). Поскольку данные демонстрировали нормальное распределение (как определено критерием нормальности D’Aostino и Pearson omnibus), двухгрупповые тесты между db / db и Misty или папиллярным и ретикулярным отделениями проводились с использованием t-теста студентов, в противном случае однонаправленные ANOVA, за которыми следует пост-hoc-анализ Dunnett, где ANOVA продемонстрировала значимость. При необходимости проводился корреляционный анализ Пирсона (p <0,05). Для всех тестов: * p <0,05; ** p <0,01; *** р <0,001; **** р <0,0001.

Обработка изображений выполнялась с использованием MATLAB R2011a (Mathworks, Cambridge, UK) с помощью инструмента обработки изображений. Быстрое преобразование Фурье (FFT) является эффективным алгоритмом для вычисления Дискретного преобразования Фурье (ДПФ) сигнала и его обратного. ДПФ изображения извлекает силу различных форм колебаний частоты, вносящих вклад в значения пикселей всего изображения. ДПФ изображения f для любой частотной пары (u, v) является комплексным числом, которое зависит от всех значений пространственных пикселей f (x, y), вычисленных по формуле:

(1)

f

u
,
v

=

1
MN

X
=
0

M

1

Y
=
0

N

1

f

x
,
y

e


j
2
π

ux
M

+

vy
N

Амплитуда (модуль) значений ДПФ для всех пар частот формирует полный спектр Фурье изображения. Функции изображения / шаблоны в спектре используются для определения относительной организации или направленности исходной текстуры изображения. Спектральный анализ мощности изображения можно интерпретировать как усреднение спектра БПФ на разных частотных поддиапазонах. DFT был рассчитан с помощью функции FFT в MATLAB и применен к кросс-полярным изображениям коллагена. Для каждого спектра были сделаны эллиптические измерения картины рассеяния, из которых был сформирован индекс ориентации коллагена, как описано в уравнении 3. Мы исследовали зарегистрированное качественное снижение целостности кожного покрова с использованием реализации БПФ, аналогичного описанной ранее для оценки валового коллагенное возмущение. Таким образом, мы смогли измерить структурные изменения, выделяющие молодую (3-м) и старую (20-м) дерму (рис. 2). Однако до этого момента мы не смогли обнаружить изменения, связанные с возрастом, поэтому требовался более чувствительный подход.

БПФ Анализ хронологического старения кожи. Репрезентативные изображения кожи мышей 3mth, 8mth, 12mth и 20m C57Bl6, окрашенных пикрозириусом и рассматриваемых в поперечной полярной оптике (оригинальное увеличение 90X, шкала шкалы = 20 мкм). На графике показан индекс ориентации коллагена, полученный из БПФ, бар соответствует среднему, а линии волос — стандартной ошибкой среднего (S.E.M.). Статистические сопоставления были достигнуты путем сравнения значений с помощью одного метода ANOVA с постходовым тестом Dunnett по сравнению с 3-м животным, n> 3 животных на группу.

БПФ не могут предоставлять одновременную информацию о пространственном и частотном содержании изображения, то есть в то время как БПФ могут показывать частотное содержание изображения, оно не локализует разные частоты. Анализ текстуры текстуры требует многоканальных преобразований, которые анализируют изображение на разных пространственных частотах и ​​ориентации. Семейство фильтров Gabor, ориентированное на ориентацию и направление, предоставляет такой инструмент с многоканальным / многорежимным разрешением, который может представлять как пространственную, так и частотную информацию, содержащуюся в изображении. Функция Габора в пространственной области является синусоидальной модулированной гауссовой. Для двумерной гауссовой кривой с разбросом σx и σy в направлениях x и y соответственно и модулирующей частотой ω реальная импульсная характеристика фильтра определяется по формуле:

(2)
              
                
                  г
                  
                    
                      Икс
                      ,
                      Y
                      ,
                      ω
                    
                  
                  знак равно
                  
                    1
                    
                      2
                      π
                      
                      
                        σ
                        Икс
                      
                      
                        σ
                        Y
                      
                    
                  
                  
                    е
                    
                      —
                      
                        1
                        2
                      
                      
                        
                          
                            
                              Икс
                              2
                            
                            
                              
                                σ
                                Икс
                              
                              
                                
                                2
                              
                            
                          
                          +
                          
                            
                              Y
                              2
                            
                            
                              
                                σ
                                Y
                              
                              
                                
                                2
                              
                            
                          
                        
                      
                    
                  
                  соз
                  
                    
                      2
                      πωx

Мнимая импульсная характеристика фильтра имеет аналогичную формулу, но косинус заменяется синусоидальной функцией. БПФ такой функции Габора представляет собой двусменные гауссианы в месте модулирующей частоты ω (более подробно см. [21]). Эти свойства сообщают о совместном использовании семейства фильтров Габора, параметризованных в восьми направлениях, а затем БПФ для исследования количественной оценки искажений в структуре basketweave структуры коллагена, наблюдаемой при старении или патологических состояниях.

Основные этапы комбинированного метода Габора и БПФ обобщены на блок-схеме на рисунке 3А. Репрезентативный кросс-полярный образ кожи мыши, окрашенный пикрозириусом, показан на рисунке 3B. Изображения были преобразованы в монохромную шкалу серого и 3 × 3 срединный фильтр, применяемый для удаления фотонного шума, генерируемого при захвате изображения. На входном изображении (x, y) был применен 8-направленный фильтр Габора с использованием значений ω 45 ° + 225 °, 90 ° + 270 °, 135 ° + 315 ° и 0 ° + 180 ° для обнаружения и выделения коллагенового волокна кромки. На рисунке 3C показано наложение изображений, созданных различными восемью направленными фильтрами. Чтобы улучшить количественную оценку, оконное изображение было выполнено на фильтрах с фильтром Габора перед преобразованием Фурье для удаления вертикальных и горизонтальных линий, которые появляются в частотной области в результате вертикальных и горизонтальных разрывов на краю стандартного изображения. Измерения, полученные из эллиптической формы диаграммы рассеяния в каждом из восьми углов, использовались для количественной оценки целостности коллагенной основы в состояниях старения (рисунок 3D). В качестве примера, спектры FFT, полученные из B) в каждой ориентации, показаны на рисунке 3E-G. Для каждого энергетического спектра мы создали индекс ориентации коллагена из результирующего эллипса. Каждый эллипс количественно определяется как функция (Nωn) длины его младшей и основной осей (рис. 3F и уравнение 3). Чтобы сформировать общий индекс ориентации коллагена, для каждого изображения вычисляются отношения максимального и минимального значений Nωn (уравнение 4).

(3)
              
                
                  Nωn
                  знак равно
                  1
                  —
                  
                    
                      короткая
                      
                      ось
                    
                    
                      длинный
                      
                      ось

(4)
              
                
                  N
                  
                    
                      ориентация
                      
                      индекс
                    
                  
                  знак равно
                  
                    
                      Максимум
                      
                      Nωn
                    
                    
                      Min
                      
                      Nωn

Количественная оценка целостности дермы из спектров, полученных из фильтрации Габора и БПФ. A) Блок-схема, изображающая различные этапы анализа. B) Типичная 3-м мышь C57Bl6, окрашенная пикрозириусом и рассматриваемая в поперечной полярной оптике (оригинальное увеличение 90X, шкала шкалы = 20 мкм). C) Иллюстрация измерений эллипса, созданных для получения индекса ориентации коллагена (N) от эллиптических осей, генерируемых из значений ω N1-N4. D) Изменения в целостности кожи с возрастом. Чтобы проиллюстрировать процедуру количественного определения спектров, исходное изображение после предварительной обработки и фильтра Gabor показано в E (i-iv в каждом направлении ω) и спектрах FFT в F (i-iv в каждом направлении ω) преобразование полученные спектры к двоичным эллипсам для количественной оценки в G (i-iv в каждом направлении ω).

Это порождает количественную оценку целостности basketweave. Если эллипсы во всех направлениях равны, в basketweave будет меньше порядка, а уравнение 4 приведет к более низкому значению, ближе к 1. Однако, если basketweave будет неповрежденным, будет непропорциональное количество коллагена в 45 ° + 225 ° и эллипсов 135 ° + 315 °. Это приведет к большим различиям в значениях Nωn и, как следствие, увеличению значения индекса ориентации (N).

Путем количественного определения спектров, полученных в результате изображений БПФ, либо с восьми направленным фильтром Габора, либо без него, мы стремились оценить способность нашей методологии предоставить индекс организации коллагена. Известно, что коллаген basketweave расслабляется от среднего возраста у людей, а in vivo анализ ориентации коллагена в мышиной коже с помощью многофотонной конфокальной микроскопии продемонстрировал заметные изменения в структуре коллагена с 6-12 м [9]. Кроме того, возрастное снижение содержания коллагена, поперечное сшивание волокон ECM и измерение глубины дермы также обнаруживаются на 12-м [25-27].

Мы оценили структуру коллагена в образцах кожи, полученных от мышей возрастающего возраста. Поверхностно, потеря basketweave очевидна к 20-м возрасту (рис. 2A), и эта разница может быть определена в FFT-изображениях с фильтрацией Габора или без него (рис. 2 и 3D). Однако только FFT не выявляло постепенного снижения целостности с 8-го уровня, как можно было бы ожидать из опубликованных наблюдений за структурой стареющей кожи [8,10], скорее тенденция обнаруживалась только с введением этапа фильтрации Gabor (рисунок 3D) , Однако мы смогли продемонстрировать значительную обратную корреляцию между временем и организацией коллагена (табл. 1). По сравнению с использованием только FFT корреляция между возрастом и коллагеновой организацией увеличивалась с фильтрацией Габора, причем значения R2 составляли 0,872 и 0,95 соответственно.

Корреляция старения с коллагеновой структурой

Дерма разделена на поверхностные папиллярные и более глубокие ретикулярные слои, отличающиеся организацией коллагена. Мы продолжили оценивать различия в возрастных изменениях в этих двух отделениях. Ретикулярная дерма последовательно демонстрировала более низкий индекс ориентации в присутствии или отсутствии фильтра Габора (рис. 4), и хотя эта разница не достигла значимости (р = 0,07), это наводит на мысль о более высоком уровне организации в папиллярной дерме , В то время как только FFT смог обнаружить изменения на 20-м, не было доказательств постепенного снижения в любом отсеке (рис. 4C и 4D). Что еще более важно, использование фильтра Габора выявило дифференциальные скорости разложения коллагена в двух слоях с постепенным снижением целостности как в папиллярных, так и в ретикулярных отделениях с использованием фильтра Габора (рис. 4А и В). Папиллярная дерма поддерживала постоянную организацию коллагена до 8-го числа, при этом снижение средней целостности на 12 м, что усугублялось 20-м (рис. 4А). В ретикулярном отделении наблюдалась более прогрессирующая потеря структуры, причем изменения между 8 и 20 м были менее заметными. Значительное изменение структуры ретикулярного коллагена между 3 и 20 м наблюдалось только с помощью БПФ (р = 0,039) и с включением фильтра Габора (р = 0,039) с помощью t-теста непарных студентов. Оба метода количественной оценки продемонстрировали корреляцию между возрастом и ориентацией коллагена, но только с добавлением фильтра Габора была корреляция, значительная как в папиллярном, так и в ретикулярном дерме. В целом, с фильтром Габора ретикулярная дерма имеет более высокий коэффициент корреляции (R2 = 0,956) по сравнению с папиллярным дермом (R2 = 0,920), предполагая, что последнее отделение немного более устойчиво к возрастному повреждению.

Возрастающий возраст соответствует дифференциальным закономерностям упадка в организации коллагена в разных слоях дермы. Прогрессивное снижение целостности наблюдалось как в папиллярных, так и в ретикулярных отделениях по нашему методу (А и В). В то время как только FFT смог обнаружить изменения к 20-м, не было доказательств постепенного снижения в любом отсеке (C и D). Бар соответствует среднему, а линии волос — стандартной ошибкой среднего (S.E.M.). Один метод ANOVA с пост-hoc-тест Dunnett по сравнению с 3-м группой был выполнен для всех тестов: ** p <0,01 (n> 3 животных на группу).

У диабета много кожных осложнений, причем подавляющее большинство людей, страдающих диабетом типа 2, испытывают осложнения кожи во время естественной истории их заболевания [28]. Проблемы варьируются от субклинических, таких как изменение коллагена, до потенциально катастрофических событий, в первую очередь отсроченного заживления ран. Мыши, у которых отсутствует рецептор лептина регулятора сытости, являются гиперфагическими и демонстрируют увеличение веса послеродового веса, что способствует гиперинсулинемии и, в конечном итоге, гипергликемии [29]. Ранее мы сообщали о резком снижении кожной глубины у этих мышей [10], что было связано с качественным изменением ориентации коллагенового волокна. Эти параллельные некоторые из изменений сообщаются в процессе старения человека [8]. Поэтому мы также решили оценить коллагеновые basketweave в образцах спинной кожи, окрашенных пикрозириусом у мышей db / db (модель сахарного диабета 2-го типа), по сравнению с животными с умеренным WT в разные возрасты (рис. 5).

Дермальная коллагенная организация у диабетической мыши. Репрезентативные изображения A) Misty и B) db / db диабетической кожи у мышей при 6wk, 3mth, 5mth и 6mth, окрашенных пикрозириусом. Количественная оценка с использованием методологии Gabor / FFT (C) или только FFT (D), бар соответствует среднему, а линии волос — стандартной ошибкой среднего (S.E.M.). Т-критерий для учащихся использовался для сравнения диабетических и сухих мышей в каждый момент времени, а сравнение временных курсов в группах db / db и Misty сравнивали с односторонним ANOVA и пост-hoc-анализом Dunnett с использованием 6wk старых животных в качестве контрольная группа: ** p <0,01; *** p <0,001 (n> 3 животных на группу, первоначальное увеличение 90X, шкала шкалы = 20 мкм в каждом случае).

Анализ окрашиваемой пикрозириусом кожи только с помощью FFT показал снижение целостности basketweave, что определялось увеличением Индекса Ориентации между 6wk и 3mth (к тому времени мыши были гипергликемическими). После 3-х месяцев этот анализ предположил, что никакой дальнейшей потери структуры не произошло. Тем не менее, никакие статистически значимые различия в целостности кожи не различали диабетическую и белую мышь в любой момент времени (рис. 5C). Применение фильтра Габора показало прогрессирующую потерю целостности кожи, а деградация, наблюдаемая на 6-м, соответствовала потере целостности кожи, которую можно было бы ожидать у диабетических животных. Что еще более важно, включение фильтра Габора допускало дискриминацию между постной и диабетической структурой кожи в каждый момент времени (рис. 5D). Интересно, что Misty skin, по-видимому, имеет более упорядоченную структуру basketweave по сравнению с мышами C57Bl6, и эта неожиданная деформация является текущим методом исследования в нашей лаборатории.

Наш метод также позволил нам определить тонкие изменения структуры кожи db / db с возрастом. Структура структуры коллагена уменьшилась в организации на -3,1% (3 м, p = 0,1337), -5,9% (5 м, p = 0,0176) и -7,8% (6 м, p = 0,1833) по сравнению с 6wk. Кроме того, мы обнаружили, что индексы ориентации, рассчитанные по методу Габора плюс Фурье, демонстрировали значительную обратную корреляцию с увеличением возраста диабетической кожи (R2 = 0,9936), но не с контрольной кожей (R2 = 0,3737), в то время как корреляция или существенные различия между возрастом наблюдались только с помощью метода Фурье (табл. 2).

Расчеты коагуляции диабетической корреляции

Методы анализа изображений, которые используют частотную область, привлекательны, поскольку они генерируют спектры, проинформированные текстурой. Мы разработали методологию, которая может количественно определять организованную структуру или текстуру в изображениях. Из-за высокоорганизованной консистенции базальтовой ткани здоровой грыжи млекопитающих, утраченной или, по крайней мере, скомпрометированной в патологических условиях или с хронологическим возрастом, исследование этих патологических состояний должно быть приемлемым для анализа изображений. Действительно, потеря как фибриллярных коллагенов, так и хорошо организованной структуры коллагена с возрастом уже давно известна [8,9,30], а потеря организации коллагена в грубых патологических состояниях, таких как фиброз (по методу БПФ), была ранее документально [6,13,19,31]. Однако они непроверены в отношении более тонких изменений в структуре (которые все еще имеют много патологических осложнений). Более того, они также непроверены в ткани мыши, в которых более тонкая структура коллагена значительно сложнее различить, чем у людей. Сообщалось о количественной оценке многофотонных микроскопических изображений мышечного дермы на основе FFT, но это не было специально для оценки basketweave, и эта технология является дорогостоящей и недоступной для многих лабораторий [9]. Необходим широкий спектр терапевтических и косметических вмешательств, нацеленных на структуру, текстуру и функцию кожи, и, следовательно, необходимы инструменты для определения поэтапных изменений в целостности коллагенового basketweave. Эти аналитические инструменты были бы особенно привлекательными, если бы они могли извлекать информацию из изображений, созданных рутинным или недорогим лабораторным оборудованием, а не электронными микрофотографиями или конфокальными изображениями.

Простые H & E окрашенные изображения являются информативными (особенно если используется эозиновая автофлуоресценция), но они не показывают коллагеновые basketweave. Кросс-полярные изображения гистологических участков кожи, окрашенных пикрозириусом, способны выявлять коллагеновую архитектуру, а соответствующая оптика является недорогой и ретро-пригодной для многих стандартных микроскопов. Мы обнаружили, что, применяя БПФ к кросс-полярным микрофотографии, мы смогли количественно оценить сдвиг в организации коллагена в крайнем возрасте (то есть в коже у 20-летних мышей). Однако начальные изменения коллагена не обнаружены в образцах от однолетних мышей. Чтобы улучшить чувствительность, мы решили развернуть фильтр Gabor для улучшения обнаружения края до применения БПФ. Это дает более сложный спектр, но, количественно распределяя пиксельные распределения в четырех плоскостях, мы смогли создать чувствительный индекс ориентации коллагена. Таким образом, мы смогли обнаружить тонкие изменения в коллагене, которые не были обнаружены только FFT. Дальнейшее тестирование показало, что 5 ° вращения изображений, используемых в этом исследовании, все еще способствовали дискриминации между биологическими группами, хотя большие вращения, которые выходят за пределы фазы с фильтром Габора (т.е. 20-30 °), приводят к потере чувствительности (не показано). Это говорит о том, что для обеспечения оптимальной работы алгоритма все изображения должны быть ориентированы в одной плоскости, насколько это возможно. В целом, наш улучшенный метод позволил нам оценить тонкие возрастные различия в субпартментах дермы и, что более важно, количественно оценить повреждение коллагена в моделях диабета.

Наши улучшенные измерения текстуры и расхождения с регулярной структурой в нескольких плоскостях обеспечивают превосходное измерение ориентации коллагена в коже и, таким образом, широко применимы к дерматологическим исследованиям. Кроме того, комбинация фильтра Габора и БПФ, вероятно, будет иметь полезность помимо количественного определения текстуры в коже и биологической визуализации, поскольку основной принцип измерения расхождения с регулярной формой имеет более широкую полезность в научных и математических дисциплинах.

Полная версия с примерами изображений и полными инструкциями для нашей платформы анализа доступна для загрузки с: http://webspace.buckingham.ac.uk/klanglands/.

mth: month; wk: неделя.

Все авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

OSO разработала технику анализа изображений и помогла разработать рукопись. JLS захватил изображения, выполнил статистический анализ, создал графики и составил рукопись. PEH выполнил гистологию. CJS и ETW подняли и предоставили животных для исследования. MAC и CJS помогли подготовить рукопись. KL и SJ задумали исследование, участвовали в его разработке и координации и помогли подготовить рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Эта работа стала возможной благодаря гранту Cotswold Trust.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *