Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Несвязанный белок-2 ослабляет секрецию инсулина, стимулированную глюкозой, в клетках инсулиномы INS-1E путем снижения митохондриальных реактивных видов кислорода

Uncoupling protein-2 attenuates glucose-stimulated insulin secretion in INS-1E insulinoma cells by lowering mitochondrial reactive oxygen species
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3036803/

Глюкозо-стимулированная секреция инсулина (GSIS) с помощью панкреатических β-клеток регулируется митохондриальным расцепляющим белком-2 (UCP2), но сообщалось о противоположных фенотипах, улучшении GSIS и нарушениях поведения для разных моделей мыши с Ucp2-ablated. Измеряя митохондриальную биоэнергетику в прикрепленных клетках инсулиномы INS-1E с и без UCP2, мы показываем, что UCP2 способствует утечке протонов и ослабляет индуцированные глюкозой повышения как в респираторной активности, так и в эффективности связывания окислительного фосфорилирования. Поразительно, что улучшение GSIS, наблюдаемое при нокдауне UCP2 в клетках INS-1E, полностью аннулируется проницаемым для клеток антиоксидантом MnTMPyP. В соответствии с этим наблюдением, UCP2 снижает митохондриальные реактивные виды кислорода при высоких уровнях глюкозы. Мы заключаем, что UCP2 играет как регуляторную, так и защитную роль в β-клетках, резко снижая GSIS и хронически предотвращая окислительный стресс. Таким образом, наши результаты дают механистическое объяснение явно несогласованных выводов в этой области.

Диабет типа 2 — это пандемическое нарушение обмена веществ, которое проявляется при хронической гипергликемии. Дисфункциональные панкреатические β-клетки занимают видное место в этиологии этого расстройства, так как они в значительной степени способствуют ухудшению способности больных пациентов поддерживать гомеостаз глюкозы. У здоровых субъектов β-клетки реагируют на повышение уровня глюкозы в крови путем секреции инсулина, что является признаком для периферических тканей, таких как скелетные мышцы и печень, для приема или хранения глюкозы соответственно. Когда уровни глюкозы в крови повышаются, β-клетки увеличивают их окислительный катаболизм глюкозы, что приводит к увеличению митохондриальной протонной движущей силы и увеличению цитоплазматического отношения АТФ / АДФ. В канонической модели секреции инсулина, стимулированной глюкозой (GSIS) 2, усиленное АТФ / АДФ-пуаз закрывает каналы KATP плазматической мембраны, вызывая деполяризацию плазматической мембраны, открытие чувствительных к напряжению кальциевых каналов, приток кальция и секрецию инсулина [1]. Этот порядок событий отражает необычный биоэнергетический дизайн, поскольку реакция β-клетки на глюкозу подразумевает, что ее отношение АТФ / АДФ контролируется преимущественно с помощью АТФ, а не по требованию АТФ, как это имеет место в большинстве других типов клеток [2]. Более того, описанный сценарий указывает на то, что GSIS опирается на эффективность связывания окислительного фосфорилирования, поскольку, судя по всему, необходимо, чтобы окисление глюкозы и синтез АТФ митохондрий были тесно связаны.

Панкреатические β-клетки содержат митохондриальный расцепляющий белок, UCP2 [3]. Обычно ожидаемая молекулярная функция этого белка представляет собой частичную диссипацию движущей силы протона [4], которая (мягко) разоблачает окислительное фосфорилирование. Ожидается, что активность UCP2 будет ослаблять GSIS — это понятие, которое действительно поддерживается растущим объемом экспериментальных данных (см. [5]). Однако следует подчеркнуть, что функция прямого расцепления UCP2 не принимается универсально [6,7] и, кроме того, исследования влияния активности UCP2 на GSIS двусмысленны. Генетический нокаут Ucp2 у мышей был первоначально установлен на смешанном фоне 129 / SVJ × C57BL / 6 и привел к значительному улучшению GSIS [3,8]. Однако, если этот Ucp2-ablated штамм был скроен на три разных генетических фона, фенотип GSIS полностью потерялся [8]. Фактически, полученные чистые штаммы (C57BL / 6 J, A / J, и 129 / SvImJ) продемонстрировали затрудненную GSIS, что объясняется хроническим окислительным стрессом, наблюдаемым у этих нокаутных животных Ucp2 [8]. Аналогично, улучшенная толерантность к глюкозе, описанная Zhang et al. [3] не был реплицирован у Ucp2-нокаутом скрещенных мышей [9]. Из этих несогласованных наблюдений видно, что однозначная интерпретация исследований с Ucp2-ablated mice затруднена с учетом смешения эффектов генетического фона. Такая интерпретация еще более осложняется вероятными вторичными или системными эффектами, вызванными вездесущим и постоянным отсутствием белка UCP2 у нокаутных животных. Несогласованный эффект нокаута Ucp2 на GSIS в различных штаммах мыши, например, частично может быть обусловлен хроническим отсутствием UCP2 в макрофагах [10] и про-опиомеланокортин-нейронах [11]. Абэцептивное отсутствие UCP2 в этих тканях может иметь дифференциальное влияние, соответственно, на иммунный статус и чувствительность к глюкозе глюкозы для различных штаммов животных.

Интерпретационных трудностей исследований цельного животного можно избежать, используя менее сложные экспериментальные системы, такие как клональные β-клетки. Относительная прочность такого клеточного подхода подчеркивается нашими предыдущими исследованиями с инсулиномами INS-1E [12-14], широко используемой моделью β-клеток, которая сохранила наиболее важные характеристики первичных β-клеток, включая GSIS [15]. Мы показали, что острая siRNA-обработка клеток INS-1E может приводить к 80-90% нокдауна белка UCP2 в течение 48 ч трансфекции [13,14]. Этот относительно острый нокдаун белка UCP2 вызывает заметное улучшение GSIS [13], что хорошо согласуется с оригинальными исследованиями нокаута Ucp2 у мышей [3]. Наши эксперименты с RNAi также показали, что UCP2 вносит существенный вклад в исключительно высокую активность митохондриальной протонной активности клеток INS-1E [13]. Этот вывод привел нас к утверждению, что UCP2 регулирует канонический путь GSIS посредством модуляции эффективности связи окислительного фосфорилирования [5,13,14], понятие, которое действительно было выдвинуто многими другими (например, [3,16-18 ]). В свете недавнего наблюдения, что перекись водорода является важным неканоническим сигналом GSIS [19,20], однако мы решили изучить возможность того, что активность UCP2 влияет на GSIS путем модуляции митохондриальных реактивных видов кислорода (ROS).

В этой статье сообщается, что улучшение GSIS, наблюдаемое при нокдауне UCP2 в клетках INS-1E, полностью аннулируется в присутствии проницаемого для клеток антиоксиданта MnTMPyP. Кроме того, мы показываем, что нокдаун UCP2 в прикрепленных клетках INS-1E снижает активность митохондриальной дыхательной системы, усиливает индуцированное глюкозой увеличение эффективности митохондриальной связи и, неожиданно, улучшает респираторный ответ клеток на глюкозу. Важно отметить, что активность UCP2 снижает окисление гидроэфидина (DHE) при высоких уровнях глюкозы, но только тогда, когда этот зонд ROS нацелен на митохондрии. Мы заключаем, что UCP2 снижает GSIS, по крайней мере частично, путем снижения митохондриальной ROS.

Ячейки INS-1E были получены от Пьера Маэчлера и Класа Воллхайма (отдел внутренней медицины, Университетский медицинский центр, Женева, Швейцария) и выращивались, как сообщалось ранее [15], в среде RPMI, содержащей 11 мМ глюкозы и 2 мМ глутамина. 80-90% нокдауна белка UCP2 осуществляли путем трансфекции siRNA клеток INS-1E, выращенных на XF24 (Seahorse Bioscience) или 96-луночных (Costar 3595, Corning) планшетах для культивирования тканей. Ранее мы подтвердили этот уровень нокдауна UCP2 западным анализом [14] и также показали, что такое нокдаун достигается с помощью олигонуклеотидов siRNA, нацеленных на три разных экзона Ucp2 [13]. Клетки выращивали в течение ночи после посева до примерно 50% слияния, трансфицировали 200 нМ Ucp2-мишенью siRNA (предопределено Ambion, Huntingdon, UK, см. [14]) в комплексе с 1,7 мкг / мл липофектамина (Invitrogen, Paisley, UK), и подвергали GSIS, биоэнергетическому и ROS-анализу через 48 ч после трансфекции. Для выявления потенциальных неспецифических эффектов контрольные клетки трансфицировали параллельно с 200 нМ скремблированной сиРНК (Silencer Negative Control 1, Ambion).

Клетки, высеваемые (при 40 000 клеток на лунку) и трансфецированные на 96-луночных планшетах, голодали в течение 2 ч в RPMI, которые не содержали глюкозу и пируват, и содержали только 1% (об. / Об.) Эмбриональную сыворотку теленка (FCS). Клетки дважды промывали безбуферной буферной средой, содержащей Хепес Кребса-Рингера, состоящей из 135 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 10 мМ Hepes (pH 7,4), 0,5 мМ MgCl 2, 1,5 мМ CaCl 2, 0,5 мМ NaH2PO4, 2 мМ глутамина, и 0,1% (мас. / об.) бычьего сывороточного альбумина (KRH). Затем клетки инкубировали в KRH — 20 мкМ MnTMPyP (проницаемый для клеток супероксиддисмутазы миметик [21]) в течение 30 мин при 37 ° С с использованием инкубатора для встряхивания пластин (Labnet International, Oakham, UK), установленного со скоростью 100 об / мин. Следует отметить, что металлопорфирины, такие как MnTMPyP, обычно очищают не только супероксид, но и в разной степени, а также пероксид водорода, пероксинитрит и липидные пероксильные радикалы [21]. Затем среду заменяли KRH, содержащей 2, 5 или 30 мМ глюкозы, снова в присутствии или в отсутствие 20 мкМ MnTMPyP. После очередной 30-минутной инкубации при 37 ° С среду собирали и центрифугировали для осаждения любых отдельных клеток. Супернатанты анализировали на инсулин с помощью ELISA (Mercodia, Uppsala, Sweden) с использованием мышиного инсулина в качестве стандарта. Обратите внимание, что наша композиция KRH содержит 2 мМ глутамина для поддержания уровней белка UCP2 в контрольных клетках (см. [22]), но не содержит обычно включенный бикарбонат натрия для предотвращения подщелачивания среды во время анализа.

В экспериментах, предназначенных для измерения биоэнергетических параметров в условиях, идентичных тем, которые применялись при анализах GSIS (фиг.2 и 3), клетки высевали (40 000 клеток / лунку) и трансфецировали на планшетах Seahorse XF24. В день анализа клетки подвергались голоданию в течение 2 ч в RPMI, у которых отсутствовали глюкоза и пируват, и содержался только 1% (об. / Об.) FCS. Клетки дважды промывали без глюкозы KRH и инкубировали в этой среде ± 20 мкМ MnTMPyP в течение 10 мин в 37-градусном воздушном инкубаторе. Пластину XF24 затем переносили в анализатор Seahorse с контролируемой температурой (37 ° C) и подвергали 10-минутному периоду уравновешивания и 3 циклам анализа, включающему 1-минутную смесь, 2-минутное ожидание и 3-минутный период измерения каждый (см. [14]); затем путем автоматической пневматической инъекции добавляли глюкозу (2, 5 или 30 мМ в KRH). После 10 дальнейших циклов анализа добавляли олигомицин (1 мкг / мл) для ингибирования АТФ-синтазы и, таким образом, приблизили долю дыхания, используемого для синтеза АТФ (эффективность связи). Каждый экспериментальный след заканчивали добавлением смеси ротенон (1 мкМ) и миксотиазола (2 мкМ) для определения скорости немитохондриальной дыхательной системы, которая была вычтена из всех других показателей. Указанные концентрации ингибиторов дали максимальные эффекты, подтвержденные удвоением концентраций. Эффективность связи была рассчитана как чувствительная к олигомицину фракция стимулированной глюкозой митохондриальной дыхательной активности (последний показатель до добавления олигомицина). Митохондриальный респираторный ответ на глюкозу нормализуется как отношение активности, вызванной глюкозой и базальным поглощением кислорода (последние ставки до добавления олигомицина и глюкозы, соответственно).

В экспериментах, предназначенных для определения абсолютных скоростей потребления кислорода (рис.1), клетки также высевали (20 000 клеток / лунку) и трансфицировали на пластинах XF24. Однако в день анализа (т. Е. 48 ч после трансфекции) клетки не подвергались голоданию от глюкозы в RPMI, но инкубировали вместо этого в течение 1 часа в воздушном инкубаторе с температурой 37 ° C в KRH, содержащем 2 мМ глюкозы, но без альбумина бычьей сыворотки. После 10-минутного уравновешивания в анализаторе Seahorse и 4 цикла анализа для измерения базального дыхания клетки подвергали воздействию 30 мМ глюкозы. В параллельных экспериментах после 10 дополнительных циклов добавляли либо олигомицин (1 мкг / мл), либо смесь олигомицина (1 мкг / мл), ротенона (1 мкМ) и миксотиазола (2 мкМ) для оценки эффективности связывания и немихохондриального дыхательной активности, соответственно (подробнее см. легенду рис.1). Сразу же после анализа Seahorse клетки фиксировали 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом, а ядерную ДНК затем окрашивали 4′-6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, применяли при разведении 1: 5000). DAPI-окрашенные клетки были отображены с использованием широкопольного микроскопа (увеличение 10 ×), и поля зрения были собраны для построения изображений отдельных лунок XF24. Ячейки (ядра) подсчитывались с использованием программного обеспечения Image Analyst (http://www.imageanalyst.net), а удельные скорости потребления кислорода рассчитывались как наномолы, потребляемые атомным кислородом в минуту на 106 клеток.

Клетки, высеваемые (40 000 клеток / лунку) и трансфецированные на 96-луночных планшетах, голодали в течение 2 ч в RPMI, которые не содержали глюкозу и пируват и содержали только 1% (об. / Об.) FCS. Клетки дважды промывали без глюкозы KRH и инкубировали в этой среде — 20 мкМ MnTMPyP в течение 30 мин при 37 ° С с использованием инкубатора для встряхивания пластин (Labnet International), установленного со скоростью 100 об / мин. После этих двух периодов голодания глюкозы, которые были идентичны экспериментальным условиям GSIS, среду заменяли KRH, содержащей 2, 5 или 30 мМ глюкозы, снова в присутствии или в отсутствие 20 мкМ MnTMPyP и либо 5 мкМ MitoSOX ( Invitrogen M36008) или 100 мкМ DHE (Invitrogen D11347). Плиты немедленно переносили в спектрофлуориметрический считыватель микропланшетов (Molecular Devices Spectramax Gemini XPS), и флуоресценцию регистрировали без смешивания с интервалом 28 с в течение 1 часа. Флуоресцентные продукты окисления возбуждались при 510 нм, а световая эмиссия регистрировалась при 580 нМ (MitoSOX) или 610 нм (DHE).

Статистический анализ был выполнен с помощью GraphPad Prism версии 5.0a для Mac OS X (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com). Все средние различия между экспериментальными системами и условиями оценивали однонаправленным ANOVA с тестом Tukey, за исключением разницы, показанной на фиг.1D, которая была оценена непарным t-тестом. Уровень статистической значимости указан в цифрах звездочками.

Ранее сообщалось, что нокдаун UCP2 RNAi приводит к улучшению GSIS в клетках инсулиномы INS-1E [13]. Для оценки биоэнергетики клеток INS-1E в условиях, идентичных тем, которые были применены во время экспериментов GSIS, мы использовали анализатор внеклеточного потока Seahorse (см. [14]), который позволяет неинвазивное определение активности митохондриальной дыхательной системы в реальном времени и эффективность сцепления в прикрепленные клетки. Этот подход превосходит нашу предыдущую биоэнергетическую оценку трипсинизированных клеток INS-1E [13], поскольку он устраняет беспокойство о том, что фенотип нокдауна UCP2 облегчается вызванным трипсином стрессовым ответом.

Рис. 1A и 1B настоящие абсолютные респираторные активности с временным разрешением, проявляемые прикрепленными клетками INS-1E, которые были трансфецированы скремблированной или Ucp2-мишенью siRNA и которые были голоден в течение 1 часа перед анализом дыхания в KRH, содержащем только 2 мМ глюкозы и отсутствием бычьей сыворотки альбумин. После четырех измерений базальной скорости концентрация глюкозы повышалась до 30 мМ, а в параллельных экспериментах АТФ-синтаза (фиг.1А), а также митохондриальная дыхательная цепь (фиг.1В) затем ингибировались соответственно олигомицином или смесью олигомицина, ротенона и миксотиазола. Рис. 1A и 1B показывают, что повышенная концентрация глюкозы вызывает небольшие респираторные увеличения в клетках с UCP2 и без него. Хотя эти увеличения относительно скромны и частота дыхания несколько изменчива, можно отметить, что клетки, содержащие UCP2, достигают относительно быстрой активности, которая является более устойчивой, чем активность, проявляемая клетками, не обладающими UCP2. Фактически, стимулированные глюкозой клетки без UCP2 не достигают постоянной частоты дыхания до тех пор, пока не добавятся другие эффекторы (сравните нормализованные респираторные реакции с глюкозой, показанной на фиг.2C). Как и ожидалось, поглощение кислорода снижается как олигомицином (фиг.1А), так и смесью олигомицина, ротенона и миксотиазола (фиг.1В). При всех условиях и во всех точках времени абсолютная полная респираторная активность клеток, содержащих UCP2, выше, чем абсолютная их UCP2-абляция. На фиг.1C показаны эти респираторные активности, скорректированные для потребления немитохондриального кислорода и, хотя статистически не значительны, можно видеть, что нокдаун UCP2 имеет тенденцию к снижению митохондриального дыхания при 30 мМ глюкозе как в отсутствие, так и в присутствии олигомицина. Этот вывод согласуется с нашим предыдущим исследованием с трипсинизированными клетками INS-1E [13] и указывает, что активность UCP2 стимулирует митохондриальную протонную скорость утечки в прикрепленных клетках INS-1E. Наблюдение того, что немитохондриальное дыхание уменьшено нокдауном UCP2 (рис.1B), снова согласуется с данными трипсинизированных клеток, хотя характер этого эффекта остается неясным. Абсолютная митохондриальная дыхательная активность, показанная на фиг.1С, примерно на 70-80% выше, чем «трипсинизированная» активность [13], что, скорее всего, связано с другой экспериментальной конструкцией с точки зрения состава анализируемой среды и концентрации глюкозы. Снижающий скорость эффект нокдауна UCP2 более выражен в присутствии, чем в отсутствие олигомицина (рис.1C), что отражается на сравнительно высокой эффективности сцепления UCP2-истощенных клеток (рис.1D). Обратите внимание, что эффект нокдауна UCP2 на эффективность связи (нормализованный параметр) действительно статистически значителен.

Мы подчеркиваем, что мы определяем эффективность сцепления как долю митохондриального дыхания, которая используется для синтеза АТФ, то есть фракции дыхания, чувствительной к олигомицину. Таким образом, в принципе, повышенная эффективность сцепления может быть обусловлена ​​либо снижением скорости утечки протонов, либо увеличением скорости фосфорилирования АДФ. Снижение скорости утечки протонов уменьшало бы дыхание, тогда как увеличение скорости фосфорилирования увеличило бы его. Затухание UCP2 приводит к увеличению эффективности сцепления (рис.1D) и снижению активности дыхательных путей митохондрий (рис.1C), демонстрируя, что нокдаун UCP2 связан со сниженной скоростью протекания протонов через митохондриальную внутреннюю мембрану.

Затем мы исследовали эффективность сцепления в прикрепленных клетках в условиях, которые были идентичны тем, которые применялись во время анализа GSIS. Во-первых, мы провели статический эксперимент GSIS, бросающий вызов клеткам INS-1E с голодом, истощенными глюкозой, с и без UCP2 с 2, 5 и 30 мМ глюкозой. Данные GSIS, показанные на фиг.2А, подтверждают, что острое нокдаун UCP2 значительно увеличивает секрецию инсулина при 30 мМ глюкозе, тогда как это не влияет на высвобождение инсулина при низких уровнях глюкозы. Это улучшение GSIS несколько более выражено, чем сообщалось ранее [13], что, вероятно, связано с наличием глутамина во всех наших текущих буферах, чтобы гарантировать, что белок UCP2 сохраняется в контрольных клетках на протяжении всего анализа [22]. В параллельных экспериментах мы затем определяли влияние проблемы глюкозы на митохондриальную биоэнергетику из голодных клеток INS-1E с и без UCP2. На фиг.2B показано, что повышение концентрации глюкозы от 2 до 30 мМ увеличивает эффективность связывания клеток, содержащих UCP2, в среднем от 0,13 до 0,32. Это увеличение более значимо в клетках, обедненных UCP2, что приводит к эффективности связывания 0,41 в среднем при 30 мМ глюкозе. Из этих данных можно извлечь, что активность UCP2 уменьшает индуцированное глюкозой увеличение эффективности митохондриальной связи. Этот результат согласуется с нашим предыдущим заключением, что UCP2 ослабляет GSIS из-за его значительного вклада в утечку протонов митохондрий [13].

Рис. 1А и 1В показывают, что абсолютная респираторная активность клеток INS-1E увеличивается незначительно, когда концентрация глюкозы повышается от 2 до 30 мМ. Данные, показанные на фиг.2С, были получены в другом наборе экспериментов и количественно оценили этот респираторный эффект, нормализуя активность, стимулированную глюкозой, к базальной активности, измеренной в клетках INS-1E, истощенных глюкозой, с и без UCP2. Когда уровень глюкозы остается низким после базальных «голодных» измерений (т. Е. Когда KRH с добавлением только 2 мМ глюкозы), дыхание в клетках с и без UCP2 постепенно снижается, что приводит к темпам после 10 циклов анализа, которые составляют приблизительно 70% начальная активность (фиг.2C, G2). Это респираторное снижение может отражать реакцию клеток на длительную лихорадку глюкозы. Когда клетки, содержащие UCP2, оспариваются 5 или 30 мМ глюкозой, респираторная активность увеличивается до значений, которые соответственно на 10 и 30% выше, чем базальная активность (рис. 2C, G5 и G30, открытые бары). Нокдаун UCP2 улучшает этот нормализованный респираторный ответ как на 5, так и на 30 мМ глюкозы, что приводит к стимулированным скоростям, которые, соответственно, примерно на 25 и 70% выше базальной скорости (рис. 2C, G5 и G30, заштрихованные бары). Улучшение на 30 мМ глюкозы является статистически значимым, и поэтому можно сделать вывод, что UCP2, скорее всего, сдерживает индуцированное глюкозой увеличение митохондриального дыхания. Когда данные, показанные на фиг. 1А и 1В нормализуются к базальному митохондриальному дыханию, аналогичный, хотя и несколько менее выраженный, фенотип UCP2 проявляется (не показан). Изменение размера эффекта UCP2, вероятно, связано с различиями в экспериментальной конструкции, особенно в отношении головок глюкозы до соответствующих наборов измерений (см. Экспериментальные процедуры).

В свете растущих доказательств того, что ROS являются важными сигналами GSIS [19,20], мы исследовали возможность того, что регулирование GSIS UCP2 зависит не только от эффективности связи, но и от митохондриального ROS. Для этого мы повторили GSIS и биоэнергетические эксперименты, описанные в предыдущих двух параграфах, но теперь в присутствии MnTMPyP, мощного и проницательного для клеток антиоксиданта [21]. Поразительно, что опосредуемый UCP2 рост секреции инсулина, наблюдаемый при 30 мМ глюкозе, был полностью аннулирован, когда ROS были поглощены 20 мкМ MnTMPyP (фиг.2А). Это наблюдение связывает UCP2 с ROS в терминах регулирования GSIS, но не в соответствии с предложенным Krauss et al. [23], который сообщил о зависимой от дозы стимуляции индуцированной MnTBAP секреции инсулина островками поджелудочной железы. Поскольку эффект MnTBAP, антиоксидант, немного менее мощный, чем MnTMPyP [21], наблюдался исключительно в остриях, содержащих UCP2, его интерпретировали как предотвращение опосредованной супероксидом активации UCP2 [23]. Совершенно иначе, MnTMPyP не влияет на GSIS с помощью UCP2-содержащих ячеек INS-1E (рис. 2A). Вместо этого наши данные показывают, что отсутствие белка UCP2 может быть компенсировано наличием поглотителя ROS и поэтому предполагает, что активность UCP2 ослабляет GSIS, по крайней мере частично, за счет снижения уровней ROS.

Важно отметить, что присутствие 20 мкМ MnTMPyP во время измерений дыхания с клетками INS-1E с глюкозой-истощением не влияет ни на эффективность сочетания (фиг.2B), ни на нормализованное дыхание, вызванное глюкозой (фиг.2C). Абсолютная величина этих биоэнергетических параметров в ячейках как с UCP2, так и без него существенно не зависит от очистки ROS. Нечувствительность MnTMPyP эффекта нокдауна UCP2 на эффективность связи INS-1E несколько удивительна, поскольку активация супероксида UCP2-опосредованных эффектов в островках поджелудочной железы [23] привела к оживлению того, что MnTMPyP увеличит эффективность сцепления клеток, содержащих UCP2 при 30 мМ глюкозе.

Хотя эффект MnTMPyP на GSIS сам по себе показывает, что этот химикат активен при добавлении к клеткам INS-1E, мы хотели бы более прямо установить, что он очистил ROS. Если MnTMPyP действительно удаляет ROS (включая супероксид) в клетках INS-1E, тогда он должен снизить скорость окисления DHE, активность, которую можно контролировать флуориметрически и которая широко используется для определения супероксида в культивируемых клетках [24]. Отметим, что DHE окисляется не только супероксидом, но также перекисью водорода (в присутствии пероксидаз) и внутриклеточными оксидоредуктазами [24]. На фиг.3А показаны несколько типичных кривых хода флуоресценции, которые отражают окисление клетками INS-1E MitoSOX, производного DHE, который нацелен на митохондрии из-за его конъюгации с липофильным катионом трифенилфосфония. Наклон этих следов флуоресценции сообщает о митохондриальной ROS [24], которая подтверждается ожидаемыми ответами окисления MitoSOX на антимицин A и разрыхляющим агентом FCCP, которые увеличивают и уменьшают этот наклон соответственно (фиг.3A). Аналогичные следы, показанные на фиг.3В, качественно показывают, что MnTMPyP снижает скорость окисления MitoSOX как в отсутствие, так и в присутствии антимицина A. Этот эффект статистически значим только при наличии антимицина A (фиг.3C), но демонстрирует, что MnTMPyP эффективно снижает концентрацию ROS в присутствии MitoSOX. Из этого можно сделать вывод, что MnTMPyP действительно снижает уровни (ROS) митохондрий в клетках INS-1E. Кроме того, на рисунке 3D показано, что MnTMPyP снижает скорости окисления MitoSOX при низких и высоких уровнях глюкозы, когда непереведенные клетки INS-1E подвергаются условиям, применяемым во время экспериментов GSIS. Повышение концентрации глюкозы от 2 до 30 мМ может немного увеличить концентрацию ROS, но этот эффект статистически не значителен (рис. 3D). Из этих данных видно, однако, что анализ MitoSOX хорошо подходит для оценки того, как и как нокдаун UCP2 влияет на митохондриальный ROS в условиях, подобных GSIS.

На фиг.4А показано, что окисление MitoSOX трансфицированными клетками, содержащими UCP2 (скремблированный контроль) не изменяется заметно, когда клетки подвергаются повышению концентрации глюкозы. Нокдаун UCP2 приводит к статистически значимому увеличению скорости окисления MitoSOX при 30 мМ глюкозе, что фактически означает, что эта скорость имеет тенденцию проявлять зависимость глюкозы в клетках, окрашенных UCP2. Другими словами, данные свидетельствуют о том, что активность UCP2 предотвращает индуцированное глюкозой увеличение митохондриальной ROS. Важно отметить, что опосредуемое UCP2 увеличение окисления MitoSOX при 30 мМ глюкозе полностью отменяется в присутствии MnTMPyP (фиг.4А).

В отличие от MitoSOX, сам DHE не нацелен на митохондрии. Скорость окисления DHE не зависит от концентрации глюкозы в клетках как с UCP2, так и без него (фиг.4B). Более того, MnTMPyP не оказывает существенного влияния на окисление DHE на любом уровне глюкозы, в клетках ни с UCP2, ни без него (фиг.4B).

Возможность того, что UCP2 может быть соответствующим регулятором GSIS, вызвала значительный интерес (см., Например, [5,25-27] для обзоров), поскольку этот носитель митохондрий вполне может быть привлекательной терапевтической мишенью для лечения диабета типа 2. Тем не менее, различные генетически модифицированные мышиные модели, которые были установлены для изучения этой возможности, демонстрируют непоследовательные фенотипы: толерантность к глюкозе и GSIS у исходной мыши с дефицитом Ucp2 улучшаются [3], тогда как при более отдаленных штаммах они не подвержены влиянию [9] или препятствовали [8]. Неудивительно, что эти диаметрально противоположные наблюдения привели к весьма различным предложениям для функции in vivo UCP2. С одной стороны, была предложена патологическая роль в этиологии диабета 2 типа [26], а с другой стороны, была предложена физиологическая роль в защите от окислительного стресса [27]. Если UCP2 следует считать терапевтической мишенью при диабете типа 2, представляется необходимым пролить свет на эти разрозненные данные. Наши данные повышают понимание того, как GSIS регулируется UCP2 и, таким образом, обеспечивает механическое обоснование явно несоответствующих результатов в этой области. Поскольку все наши данные были получены с использованием клональной модели β-клеток, очевидная осторожность оправдана их физиологической интерпретацией.

Возможно, самым ярким замечанием является то, что улучшение GSIS после нокдауна UCP2 отменяется MnTMPyP (рис. 2A), что указывает на то, что UCP2 ослабляет GSIS, подавляя уровни ROS. Этот результат согласуется с недавним осознанием того, что ROS являются важным сигналом во время GSIS [19,20]. Пи и коллеги показали, что добавление 1-4 мкМ H2O2 к островкам мыши или к клеткам инсулиномы увеличивает секрецию инсулина при низких уровнях глюкозы. Секреция инсулина также повышается диэтилмалеатом, соединением, которое повышает внутриклеточные уровни H2O2 [20]. GSIS ингибируется поглотителями H2O2, но на него не влияет проницаемая клетками супероксиддисмутаза [20]. В соответствии с этими данными в наших клетках, содержащих UCP2, показана GSIS, которая нечувствительна к MnTMPyP (фиг.2A). Однако чувствительность MnTMPyP к обедненным UCP2 клеткам указывает на то, что H2O2 не является релевантным сигналом во время GSIS, чему способствует отсутствие UCP2. Таким образом, опосредованное ROS ослабление GSIS посредством UCP2, вероятно, происходит через механизм (возможно, с участием супероксида), отличный от того, который учитывает результаты Pi et al. [20].

Клетки INS-1E имеют тенденцию проявлять окисление MitoSOX, стимулированное глюкозой, но только в отсутствие UCP2 (фиг.4A). Важно отметить, что окисление DHE, не нацеленное на митохондрии, полностью нечувствительно к глюкозе даже в отсутствие UCP2 (фиг.4B). Более того, окисление MitoSOX уменьшается на MnTMPyP (фиг.4A), что аннулирует зависимость от UCP2, наблюдаемую при высокой глюкозе. Вместе эти данные свидетельствуют о том, что UCP2 снижает GSIS за счет снижения производства ROS, индуцированного глюкозой. Однако следует обратить внимание на два пункта осторожности.

Во-первых, MitoSOX уравновешивается через митохондриальную внутреннюю мембрану в соответствии с уравнением Нернста и, таким образом, накапливается в мембранном потенциале (Δψ) -зависимым образом [24]. Поэтому можно предположить, что концентрация MitoSOX, достигнутая в митохондриях, не имеющих UCP2, выше, чем концентрация, достигнутая в их UCP2-содержащих аналогах, на основе утверждения о том, что активность UCP2 частично рассеивает Δψ. Поскольку окисление MitoSOX зависит от концентрации зонда (зависимость дозы зависит от линейности до 50 нМ в культивируемых нейронах [28]), эффект UCP2 при 30 мМ глюкозе (фиг.4А) может быть формально обусловлен разностью накопления зонда. Однако это событие представляется маловероятным, потому что мы применили насыщающую концентрацию MitoSOX (5 мкМ). Что еще более важно, нокдаун UCP2 не должен увеличивать Δψ исключительно при 30 мМ глюкозе, но также (возможно, даже более того, учитывая кинетику окислительного фосфорилирования [14]) при 2 и 5 мМ глюкозе. Окисление MitoSOX на этих уровнях глюкозы не сильно зависит от нокдауна UCP2 (фиг.4A).

Второй проблемой, которая требует внимания, является очевидное отсутствие эффекта нокдауна UCP2 при окислении DHE (фиг.4B). Даже без определенного целевого фрагмента DHE, как ожидается, достигнет концентраций, достаточных для обнаружения митохондриальной ROS. В этом отношении важно оценить, что панкреатические β-клетки содержат NADPH-оксидазы, которые продуцируют значительное количество цитоплазматического супероксида [29]. Следует также отметить, что DHE окисляется не только супероксидом, но также H2O2 (в присутствии пероксидаз) и внутриклеточными оксидоредуктазами [24], что, вероятно, объясняет относительную нечувствительность окисления DHE к MnTMPyP (рис.4B). Мы утверждаем, что DHE в основном окисляется цитоплазматическими событиями INS-1E (поддерживается нечувствительностью окисления DHE до антимицина A, данные не показаны), которые маскируют любой эффект UCP2, который может иметь на продукцию митохондриального ROS. С другой стороны, при окислении MitoSOX доминирует митохондриальная ROS из-за огромного накопления этого зонда в матрице митохондрий, что подтверждается стимулирующими и ингибирующими эффектами антимицина А и FCCP соответственно (фиг.3А).

Дифференциальный эффект UCP2 на окисление MitoSOX и DHE (фиг.4) легко интерпретируется как исключительный эффект UCP2 на продукцию митохондриального ROS. Наши данные не объясняют, как эти ROS стимулируют GSIS. Предположительно это ослабление протонной движущей силы UCP2, которая снижает производство митохондриальных ROS (рис.4) и снижает эффективность связывания окислительного фосфорилирования (рис.2B). Сниженная эффективность сцепления ослабляет индуцированные глюкозой повышения в цитоплазматическом отношении АТФ / АДФ. Необходимы дальнейшие исследования для количественной оценки относительной важности эффектов UCP2 для ROS и ATP / ADP с точки зрения регулирования GSIS, хотя полная чувствительность к MnTMPyP (фиг.2A) настоятельно указывает на то, что фенотип UCP2 опосредуется в основном через ROS в наших экспериментах , Интересно отметить, что наши биоэнергетические данные раскрывают еще один новый механизм, при котором митохондриальная развязка может снизить GSIS, поскольку активность UCP2 также ослабляет дыхательный ответ клеток на глюкозу (фиг.2C). В настоящее время неясно, как осуществляется самоподкрепление окисления глюкозы, но все возможные сигналы ROS, ATP / ADP или Krebs являются промежуточными продуктами. Однако нечувствительность MnTMPyP к эффекту UCP2 (фиг.2C) подразумевает, что митохондриальная ROS является наименее вероятной репликой. Относительная задержка эффекта (фиг.1А и 1В) указывает на то, что может потребоваться биогенез митохондрий.

Хотя аттенуирующий эффект активности UCP2 на эффективность стимуляции глюкозы (фиг.2B) и продуцирование митохондриальной ROS (фиг.4) согласуется с функцией первичной протонной утечки, возможно, что для этих фенотипов учитывается другая активность UCP2. Например, предполагаемый экспорт пируватов по UCP2 [30] может в принципе объяснить, как UCP2 гасит глюкозозависимое дыхание, продукцию ROS и эффективность связывания, окисляя и замедляя цепь переноса электронов. Однако измерения абсолютной респираторной активности в клетках с и без UCP2 различаются просто между протонной утечкой и функцией экспорта пирувата. Как было показано ранее в остриях поджелудочной железы [31] и трипсинизированных клетках INS-1E [13], нокдаун UCP2 снижает частоту дыхательных путей митохондрий прикрепленных клеток INS-1E в отсутствие, но особенно в присутствии олигомицина (рис.1C). Этот вывод показывает, что UCP2 способствует утечке протонов митохондрий. Если бы UCP2 экспортировал пируват, то абсолютная активность дыхания увеличилась бы при нокдауне UCP2.

Предыдущие работы из нашей лаборатории привели к тому, что UCP ослабляют Δψ только тогда, когда они активируются, например, супероксидом [32]. Хотя функциональная регуляция новых ОГП является предметом текущих дебатов [6, 7, 33], некоторые экспериментальные данные подтверждают активацию UCP2 в клетках. В тимоцитах, например, активность UCP2 стимулируется аналогом ретиноевой кислоты TTNPB [34], а все опосредованные UCP2 патологические эффекты в остриях поджелудочной железы зависят от супероксида [23]. Однако наши текущие данные не способствуют активации UCP2 в клетках INS-1E супероксидом. ROS-продувка MnTMPyP в клетках INS-1E, содержащих UCP2, не приводит к улучшению GSIS (фиг.2A), эффективности связывания (фиг.2B) или повышенному нормализованному респираторному ответу на глюкозу (фиг.2C). Хотя MnTMPyP явно снижает митохондриальную ROS (фиг.3B, 3C, 3D и 4A), остается возможным, что концентрация, которую мы применяем (20 мкМ), недостаточна для резкого изменения уже активированного UCP2. В этом случае было бы удивительно, что 10-20 мкМ MnTBAP предотвращает активацию UCP2 в островках поджелудочной железы [23]. Аналогично, дыхание INS-1E существенно не влияет на TTNPB, даже когда соединение добавляют в присутствии олигомицина (C. Affourtit и M.D. Brand, неопубликованные данные). В наших руках TTNPB фактически блокирует GSIS, но не зависит от UCP2. Вместе с недавним наблюдением, что β-клеточный UCP2 не активируется жирными кислотами [35], наши данные могут указывать на то, что активность UCP2 не регулируется остро в культивируемых β-клетках, возможно, потому, что белок постоянно или конститутивно активируется. В этом случае активность в этих клетках будет контролироваться исключительно транскрипцией и трансляцией на фоне исключительно быстрой деградации белка UCP2 [22].

В работе, представленной в этом документе, подчеркивается относительная сила модели INS-1E, которая дает новое представление о функции и регулировании UCP2. Важно отметить, что мы показали, что UCP2 ослабляет GSIS таким образом, который имитирует антиоксидант MnTMPyP. Это открытие подтверждает, что UCP2 является острым регулятором GSIS, который согласуется с фенотипом GSIS, проявляемым оригинальной мыши Ucp2-нокаутом [3]. Более того, мы показали, что UCP2 снижает митохондриальную ROS в клетках INS-1E при высоких концентрациях глюкозы. Этот конкретный результат обеспечивает прямую механистическую основу фенотипа окислительного стресса, проявляемого недавно созданными Ucp2-дефицитными штаммами мыши [8]. Мы пришли к выводу, что посредством модуляции продукции митохондриального ROS UCP2 играет как регуляторную, так и защитную роль в клетках поджелудочной железы, поскольку ее активность будет очень сильно затухать GSIS и в долгосрочной перспективе также будет препятствовать окислительному стрессу.

Эта работа была поддержана Советом медицинских исследований Великобритании (C.A. and M.D.B.) и Национальными институтами здравоохранения (P01 AG025901, PL1 AG032118, P30 AG025708 и R01 AG033542), W.M. Фонд Кека, Медицинский фонд Эллисона (AG-SS-2288-09) (M.D.B.) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (JA 1884 / 2-1) (M.J.). Центральная Америка и M.D.B. являются консультантами Seahorse Bioscience. Мы благодарим доктора. Pierre Maechler и Claes Wollheim (отдел внутренней медицины, Университетский медицинский центр, Женева, Швейцария) за добровольную пожертвование клеток INS-1E.

Нокдаун UCP2 снижает скорость дыхания митохондрий и повышает эффективность сцепления прикрепленных клеток INS-1E. (A и B) Абсолютные частоты дыхания с временным разрешением (Jo), нормированные на число клеток, измеренные ядерным окрашиванием, клеток, трансфецированных Ucp2-таргетированными (закрытые символы) или скремблированной siRNA (открытые символы) и обработанные, как описано в экспериментальных процедурах , После четырех циклов анализа Seahorse при 2 ммоль глюкозы клетки подвергали воздействию 30 мМ глюкозы (G30) и в параллельных экспериментах либо олигомицин (O), либо смесь олигомицина, ротенона и миксотиазола (ORM). Каждая точка времени представляет среднее значение ± SEM (n = 8-12) из ​​8-12 отдельных скважин, взятых из семи независимых платформ Seahorse XF24. (C) Частота дыхания в присутствии смеси олигомицин / ротенон / миксотиазол усреднялась и вычиталась из всех других показателей, чтобы дать специфическую для митохондрий деятельность органов дыхания. Активность, стимулируемая глюкозой (G30), представляет собой среднее значение последних двух показателей скорости до добавления олигомицина, а активность, не связанная с олигомицином (олигомицин), является средним из двух показателей после этого добавления. (D) Эффективность сцепления рассчитывалась как доля стимулированного глюкозой потребления митохондриального кислорода, чувствительного к олигомицину, и, таким образом, отражает активность дыхательных путей, используемую для синтеза АТФ. Данные в (C) и (D) являются средними значениями ± SEM (n = 13-15) из 13 (скремблированная siRNA, открытые стержни) или 15 (Ucp2-ориентированные siRNA, заштрихованные полосы) отдельные лунки, взятые из семи независимых пластин XF24. * Р <0,05.

Нокдаун UCP2 улучшает GSIS чувствительным к MnTMPyP образом, усиливает индуцированное глюкозой повышение эффективности связи и улучшает респираторный ответ клеток на глюкозу. Клетки, трансфецированные Ucp2-нацеленной или скремблированной siRNA (заштрихованные и открытые стержни, соответственно), сначала были истощены глюкозой, как описано в экспериментальных процедурах, а затем подвергались глюкозе в отсутствие (G2, G5, G30) или присутствию (G5-PyP, G30 -PyP) 20 мкМ MnTMPyP; G2, G5 и G30 отражают соответственно 2, 5 и 30 мМ глюкозы. (A) Данные секреции инсулина являются средними ± SEM четырех независимых экспериментов с каждым условием, которое анализируется шесть раз. (B) Эффективность митохондриальной связи и (C) респираторные реакции клеток на глюкозу составляют средние ± SEM 4-11 отдельных прогонов XF24. Эти биоэнергетические параметры были рассчитаны по следам Seahorse, как описано в экспериментальных процедурах. ** p <0,01 и *** p <0,001.

MnTMPyP снижает скорость окисления MitoSOX клетками INS-1E. (A и B). Типичная флуоресценция с временным разрешением наблюдалась при окислении 5 мкМ MitoSOX непереходными клетками INS-1E, которые не подвергались периодам голодания глюкозы. Показаны следы, иллюстрирующие анализы, которые были сделаны без каких-либо эффекторных (кругов) или добавленного зонда (А, бриллианты) и анализов, которые были выполнены в присутствии 15 мкМ антимицина А (квадраты), 15 мкМ FCCP (А, треугольники), 20 μM MnTMPyP (B, алмазы) или 15 мкМ антимицина A и 20 мкМ MnTMPyP (B, треугольники). Данные представляют собой средние значения ± SEM 4-6 лунок, отобранных из одной 96-луночной планшеты, и для облегчения ясности символы отображаются только для каждого 10-го измерения. (C) Скорости окисления MitoSOX в присутствии (заштрихованные стержни) и отсутствие (открытые стержни) 20 мкМ MnTMPyP были рассчитаны из склонов (после первых 1000 с) кривых прогресса, приведенных в примерах (A) и (B). Данные представляют собой средние значения ± SEM 34-38 лунок, отобранных из семи пластин и 18-22 лунок, отобранных из четырех пластин в отсутствие и наличия MnTMPyP, соответственно. (D) окисление MitoSOX непереносированными клетками INS-1E, истощенными глюкозой (см. Экспериментальные процедуры), подвергнутыми 2, 5 и 30 мМ глюкозе (G2, G5 и G30 соответственно) в присутствии (заштрихованные полоски) и отсутствии ( открытые стержни) 20 мкМ MnTMPyP. Данные представляют собой средние значения ± SEM из 22-24 лунок, отобранных из трех пластин. RFU, относительные единицы флуоресценции. *** р <0,001.

Активность UCP2 снижает митохондриальный ROS при высоком уровне глюкозы. Клетки, трансфецированные Ucp2-нацеленными (заштрихованные) или скремблированные (открытые стержни) siRNA, сначала были истощены из глюкозы, как описано в экспериментальных процедурах, а затем подвергались глюкозе в отсутствие (G2, G5, G30) или присутствию (G2-PyP, G5 -PyP, G30-PyP) 20 мкМ MnTMPyP; G2, G5 и G30 отражают соответственно 2, 5 и 30 мМ глюкозы. (A) скорости окисления MitoSOX (5 мкМ) были получены, как описано для фиг.3, и (B) скорости окисления DHE (100 мкМ) были рассчитаны из склонов первых 500 с следов флуоресценции. Данные представляют собой средние значения ± SEM в 25-30 лунках, отобранных из шести 96-луночных планшетов. * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *