Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Relaxin улучшает множественные маркеры заживления ран и улучшает нарушенную схему заживления генетически диабетических мышей

Relaxin improves multiple markers of wound healing and ameliorates the disturbed healing pattern of genetically diabetic mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3906928/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Диабетические мыши характеризуются нарушенной моделью экспрессии VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и нарушением васкулогенеза во время заживления. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что RLX (релаксин) может улучшить несколько параметров, связанных с заживлением ран. Поэтому мы исследовали влияние RLX, полученного из свиней, на связанные с диабетом раневые исцеляющие дефекты у генетически диабетических мышей. Модель задней раны была создана на спине женских диабетических мышей C57BL / KsJ-m + / + Leptdb (db + / db +) и их нормальных однопометников (db + / + m). Животных ежедневно обрабатывали свиным RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно) или его носителем. Мышей убивали через 3, 6 и 12 дней после повреждения кожи для измерения мРНК VEGF и синтеза белка, экспрессии мРНК SDF-1α (стромальные клетки-1α) и eNOS (эндотелиальная NO-синтаза). Кроме того, мы оценили прочность на разрыв, гистологические изменения, ангиогенез и васкулогенез на 12-й день. Диабетические животные показали снижение экспрессии VEGF, eNOS и SDF-1α по сравнению с недиабетическими животными. На 6-й день администрация RLX приводила к увеличению экспрессии мРНК VEGF и содержания белка в ране, в экспрессии eNOS и в SDR-1α мРНК. Кроме того, гистологическая оценка показала, что RLX улучшает ослабленное заживление ран, усиливает окрашивание MMP-11 (матриксная металлопротеиназа-11) и повышает прочность на разрыв во время 12-го дня у мышей с диабетом. Иммуногистохимия показала, что RLX у диабетических животных увеличил образование новых сосудов, стимулируя как ангиогенез, так и васкулогенез. RLX значительно сократил время до полной нормализации кожи, и этот эффект был отменен путем одновременного лечения антителами против VEGF и CXCR4 (рецептор хемокина CXC 4), рецептора SDF-1. Эти данные настоятельно свидетельствуют о том, что RLX может иметь потенциальное применение при раневых заболеваниях, связанных с диабетом.

Пациенты, страдающие диабетом, обнаруживают нарушенный процесс заживления ран, который может повысить общую заболеваемость и смертность этой популяции [1,2]. Комплексная запрограммированная последовательность клеточных и молекулярных процессов, включая воспаление, миграцию клеток, ангиогенез, предварительный матричный синтез, осаждение коллагена и повторную эпителизацию, характеризует нормальный ремонт кожи [1,3]. Ангиогенез играет центральную роль в заживлении ран и связан с экспрессией нескольких цитокинов и ангиогенными факторами, такими как VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) [4,5].

Ухудшение исцеления у людей с диабетом характеризуется задержкой клеточной инфильтрации и образования грануляционной ткани, уменьшением организации коллагена и, что более интересно, уменьшением ангиогенеза [6,7]. Что касается ангиогенеза, то дефект в регуляции VEGF, характеризующийся измененной картиной экспрессии мРНК VEGF во время восстановления кожи, показан у диабетических мышей [8]. Кроме того, сообщалось, что ген AEG (аденоассоциированный вирусный вектор), связанный с переносом гена VEGF165 человека, стимулирует ангиогенез и заживление ран у генетически диабетических мышей [9].

Помимо ангиогенеза, васкулогенез может также играть решающую роль в процессе заживления. Показано, что васкулогенез, in situ-дифференциация примитивных эндотелиальных предшественников, известных как ангиобласты, в эндотелиальные клетки, которые агрегатируются в первичное капиллярное сплетение, отвечает за развитие сосудистой системы во время эмбриогенеза [10]. Тем не менее, васкулогенез присутствует также у взрослых и происходит через действие циркулирующих или резидентных клеток BM (костного мозга), называемых EPC (эндотелиальные клетки-предшественники), а также может быть загрунтован VEGF [11]. Дальнейшие клеточные линии, не полученные БМ, можно найти на разных участках и продемонстрировать, что они дифференцируются в эндотелиальные клетки в гипоксических условиях или во время физиологического пополнения кожи и кишечника [12]. Более того, васкулогенез более распространен и эффективен, когда ангиогенез разрушается: это случай исцеления диабетических язв, в которых наблюдается нарушение гемостаза, воспаления, осаждения матриц и, прежде всего, ангиогенеза [13]. Показатели циркулирующего и раневого числа EPC также снижаются при диабете, что указывает на аномалию в механизмах мобилизации и самонаведения EPC [14]. Недостаток мобилизации ЭПК, по-видимому, объясняется ухудшением каскада eNOS (эндотелиальной NO-синтазы) -NO в BM, а сбой EPC для достижения тканей раны частично является результатом нерегулируемого производства SDF-1α (стромальный клеточный фактор-1α) в ранах [14]. Фактически SDF-1α, связываясь с рецептором CXCR4 (рецептор 4 хемокинов CXC) на EPC, позволяет вводить и возвращать эти клетки в гипоксические ткани [14].

RLX (релаксин) представляет собой пептидный гормон суперсемейства инсулина, который имеет длинную историю как репродуктивный гормон с момента его открытия в 1926 году [15]. Подобно инсулину, RLX представляет собой белок 6 кДа, обработанный от преформы до зрелого гормона, содержащего пептиды A и B, связанные двумя межцепочечными дисульфидными мостиками и одним межцепочечным дисульфидом в цепи A. Существует несколько RLX-подобных пептидов. Два гена RLX присутствуют у людей, кодирующих белок, известный как H1 и H2 RLX, но циркулирует только H2 RLX. Было показано, что RLX индуцирует экспрессию VEGF и ангиогенез выборочно на участках раны в экспериментальной модели in vitro [16]. Кроме того, RLX может также увеличивать экспрессию eNOS, таким образом модулируя производство NO. Помимо ангиогенеза, RLX также может модулировать синтез коллагена и гомеостаз внеклеточного матрикса: фактически он увеличивает экспрессию MMP (матричных металлопротеиназ) и деградирует коллаген, тем самым противодействуя преувеличенному фиброзу ран (эффект против рубца) [17].

Все эти экспериментальные наблюдения делают RLX логичным кандидатом для лечения, чтобы ускорить закрытие раны. Действительно, внутрибрюшинное введение неочищенного препарата, содержащего свиной RLX, улучшало заживление ран и повышенную прочность на растяжение в модели грызунов [18] и улучшало заживление ран и рекомбинантного H2 RLX и предотвращало образование рубцов в модели раневой раны свиньи [19]. Тем не менее, эффекты RLX при ране, вызванном диабетом, не были полностью исследованы. Поэтому мы исследовали влияние RLX, полученного из свиньи, в модель раннего заживления ран у генетически диабетических мышей [6,7].

Все процедуры для животных проводились в соответствии с Принципами лабораторного ухода за животными (публикация NIH № 85-23, пересмотренная в 1985 году) и разрешена нашим национальным учреждением. Генетически диабетическая самка (30-35 г) мышей C57BL / KsJ-m + / + Leptdb (db + / db +) и их нормальных однопометников (22-25 г) (db + / + m) получали из лаборатории Джексона. Животным было 10 недель в начале экспериментов. Во время экспериментов животных поддерживали один на клетку в контролируемых условиях окружающей среды (12 ч светло-темного цикла, 23 ° С) и снабжали стандартным питанием и водой ad libitum. После общей анестезии с пентобарбиталом натрия (80 мг / кг массы тела, внутрибрюшинным) волосы на спине были выбриты, а два параллельных разреза 4 см были получены с использованием скальпеля (рис. 1А), на задней части всех мышей как описано ранее [20].

(A) Мультфильм представляет собой обратную сторону мыши с местом расположения двух ран и указанного имплантированного насоса; на правой стороне изображена вырезанная рана (эллиптическая форма), которая подразделяется на куски для выполнения всех анализов. Анализ прочности на разрыв выполняется на всей ране после удаления. Внизу представлена ​​временная шкала эксперимента. (B) экспрессию мРНК VEGF в образцах кожной раны, собранных у нормогликемических (db + / + m) мышей, обработанных различными дозами RLX (6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мышь в день) в день 6. Каждый бар представляет собой среднее ± S.D. из шести животных. * P <0,05 по сравнению с RLX 6.25; #P <0,001 по сравнению с RLX 6.25. Экспрессию VEGF (C) и SDF1-α (E) мРНК в образцах кожи, собранных либо с нормогликемической (db + / + m), либо с диабетическими мышами (db + / db +), либо с использованием RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно) (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) через 3, 6 и 12 дней. Каждая точка представляет среднее значение ± S.D. из шести животных. §P <0,001 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; * P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,001 по сравнению с транспортным средством db + / db ++. (D) Уровни белка VEGF, изученные с помощью ELISA в образцах кожи, собранных либо с нормогликемической (db + / + m), либо с диабетическими мышами (db + / db +), получая либо RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно), либо носитель (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) через 3, 6 и 12 дней. Каждая точка представляет среднее значение ± S.D. из шести животных. §P <0,001 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; * P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,001 по сравнению с транспортным средством db + / db ++.

В предварительных экспериментах дозу RLX (IBSA Rizhao-Lanshan) титровали против эффектов на экспрессию VEGF. Нормогликемические животные (n = 24), после разреза кожи, имплантировали подкожно осмотическими насосами, доставляя разные концентрации RLX (6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мышь в день). Насосы были имплантированы на шею прямо над средней лопаточной линией (рис. 1А), и лечение продолжалось 6 дней. Этот эксперимент выявил 25 мкг / мышь в день RLX в качестве оптимальной дозы, которая будет использоваться в дальнейших экспериментах, причем самая высокая доза (50 мкг / мышь в день) не показала дополнительных улучшений.

Животных (n = 72) делили на группы по 6 животных. Нормогликемические и диабетические мыши получали либо RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно), либо его носитель (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) в течение 12 дней. В общей сложности десять животных из каждого штамма погибали через 3, 6 и 12 дней после операции, а раны удалялись с помощью скальпеля, чтобы обрезать форму эллипса вокруг поражения. Из двух ран один из них использовался для продуктов NO (только на 6-й день) или прочности на растяжение (только на 12-й день), а другой — для другого анализа, как показано на рисунке 1 (A). Все животные, убитые на 12-й день, также тестировали на гликемический уровень крови, используя колориметрический анализ оксидазы глюкозы (One-Touch, Lifescan).

Чтобы лучше понять, влияет ли ангиогенетический или васкулогенетический путь на RLX, две дополнительные группы (n = 7 для каждой группы) диабетических животных подверглись ранению и получили RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) вместе с анти-VEGF мышиное антитело (10 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно ежедневно, Abcam) или с анти-CXCR4-антителом (0,4 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно ежедневно, Enzo Lifescience). Дополнительные нормогликемические (n = 18) и диабетические (n = 18) мышей подвергали ранению, имплантировали насосами и использовали для исследования времени, необходимого для завершения закрытия раны.

Вкратце, общая РНК была извлечена из образцов раны и количественно определена, как описано ранее [21]. РНК подвергали обратной транскрипции к кДНК и использовали для количественного определения количества мРНК VEGF и SDF-1 в ПЦР в реальном времени; β-актин использовали в качестве эндогенного контроля. Результаты выражаются как n-кратное различие относительно нормального контроля (относительные уровни экспрессии).

Выражение eNOS оценивали на 6-й день, по Western Blot, как описано ранее [21]. Первичные антитела для eNOS и фосфо-eNOS (Ser1177) были приобретены у Chemicon и Cell Signaling соответственно. Вторичные конъюгированные с пероксидазой антитела были получены от Pierce. Сигналы белка определяли количественно с помощью сканирующей денситометрии с использованием системы анализа биоизображения (Bio-Profil Celbio) и выражали как интегральную интенсивность по сравнению с β-актином (Cell Signaling), измеренным на разделенных блотах [21].

На 6-й день образцы раневых образцов удаляли и замораживали в жидком азоте до использования. Продукты NO были определены в раневых лизатах с использованием реакции Грисса, как описано ранее [22]. Все образцы и стандарты анализировали в трех экземплярах. Данные выражаются как средства ± S.D. NO2- / NO3-.

Количество VEGF в ранах определяли через 3, 6 и 12 дней с помощью коммерчески доступного VEGF-специфического набора для анализа ELISA (R & D Systems), как описано ранее [22]. Количество VEGF было выражено как pg / мг белка.

Образцы раны фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине и обрабатывали, как описано ранее [20]. Все слайды были исследованы патологом, ослепленным до предыдущего лечения, с помощью сетки для глаз под микроскопом от увеличения × 20 до × 100. Были оценены и оценены следующие параметры: повторная эпителизация, осаждение и регенерация дермальных матриц, образование грануляционной ткани и ремоделирование. Гистологические образцы оценивали по данным, указанным в литературе по поводу заживления ран в экспериментальных моделях [20, 22-24].

Время до завершения закрытия раны, о чем свидетельствует закрытый линейный исцеляющий гребень, контролировалось, как описано ранее [20].

Зараженные парафином ткани секционировали (5 мкм), регидратировали и извлечение антигена проводили с использованием 0,05 М буфера для цитрата натрия. Слайды инкубировали в течение ночи с использованием первичного антитела для обнаружения CD31, CD34, MMP-11, VE-кадгерина, VEGFR-1 (все от Abcam) и VEGFR-2 (Cell Signaling), как описано ранее [20]. DAB (3-3 ‘диаминобензидин, Sigma) использовали для выявления реакции, и контрастное окрашивание проводили при необходимости гематоксилин.

Для оценки нового образования кровеносных сосудов МВД (плотность микрососудов) оценивали после окрашивания CD31. Вкратце, были выбраны три горячие точки или районы с самой высокой видимой кровеносной емкостью (обозначенные маркером сосуда) на одну секцию в дерме, расположенной непосредственно вблизи места раны, и подсчитывалось количество сосудов малого калибра, имеющих видимый просвет на мощное поле (увеличение × 40) тремя патологами, слепыми к образцам. Чтобы оценить положительный CD34, VEGFR-1, VE-кадгерин и VEGFR-2, окрашивая шесть областей в разрезе, были случайным образом отобраны в дерме, и положительные эндотелиальные клетки подсчитывались на поле большой мощности (увеличение × 40) тремя патологами, ослепленными образцы. Для оценки положительного окрашивания MMP-11 в субэпителиальной ткани случайным образом выбирали пять областей в каждом разделе, а положительные пятна подсчитывали на поле большой мощности (увеличение × 40) тремя патологами, слепыми к образцам. Для отрицательных контролей первичные антитела заменялись цитратным буфером (рН 6,0).

На 12-й день максимальная нагрузка (разрывная прочность), переносимая ранами, была измерена слепо на закодированных образцах с использованием калиброванного тензометра (Sans), как описано ранее [20]. Концы полоски кожи выталкивались с постоянной скоростью (20 см / мин), а прочность на разрыв выражалась как средний максимальный уровень прочности на растяжение в Ньютонах перед разделением ран.

Все данные выражаются как средства ± S.D. Сравнение между различными методами лечения анализировали односторонним ANOVA с последующим множественным сравнительным тестом Tukey. Во всех случаях в качестве критерия статистической значимости была выбрана вероятность ошибки менее 0,05. Графики были составлены с использованием GraphPad Prism (версия 5.0 для Windows).

Нормогликемических животных лечили в течение 6 дней после ранения с помощью RLX в разных концентрациях (6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мышь в день), чтобы идентифицировать оптимальную дозу, которая будет использоваться в дальнейших экспериментах. Рисунок 1 (B) показывает, что наиболее эффективная доза RLX при увеличении экспрессии VEGF составляла 25 мкг / мышь в день. Большая доза не увеличивала экспрессию VEGF.

В ранах недиабетических животных сильная индукция мРНК VEGF (рис. 1C) была обнаружена на 3-й и 6-й день по сравнению с базальными значениями (неповрежденная кожа = 0,05 ± 0,001 n-fold / β-actin, P <0,001) , Уровни белка VEGF у неповрежденной кожи у недиабетических и диабетических мышей были очень низкими (результаты не показаны). В ранах недиабетических животных содержание VEGF увеличивалось на 3 и 6 дни по сравнению с базальными значениями (рис. 1D). После этого экспрессия VEGF и уровень белка снижались на 12-й день. Введение RLX улучшало мРНК VEGF и содержание белка в дни 3 и 6 у нормогликемических животных (рис. 1C и 1D).

Раны от диабетических мышей показали заметно сниженную экспрессию и уровни белка VEGF по сравнению с недиабетическими на 3-й и 6-й день после операции. Уровни мРНК и белка VEGF по-прежнему достоверно обнаруживались на 12-й день у диабетических мышей (рис. 1C и 1D). Ежедневное лечение с помощью RLX улучшало экспрессию VEGF и уровни белка в дни 3 и 6, таким образом восстанавливая нарушенную картину секреции VEGF (рис. 1C и 1D).

В ранах недиабетических животных SDF1-α-мРНК значительно увеличивалась в 3-й и 6-й дни по сравнению с базальными значениями (неповрежденная кожа = 0,02 ± 0,005 n-fold / βactin, P <0,001). Экспрессия SDF1-α оставалась устойчивой на 12-й день (рисунок 1Е). Введение RLX незначительно, но не значительно, улучшало SDF1-α мРНК в дни 3 и 6 у нормогликемических животных.

Раны от диабетических мышей показали заметно уменьшенную экспрессию SDF1-α по сравнению с недиабетическими на 6-й день после операции (рис. 1Е). Ежедневное лечение с добавлением RLX уровней SDF1-α; таким образом восстанавливая нарушенную структуру экспрессии мРНК SDF1-α (фиг. 1Е).

Необработанные образцы кожи показали очень низкое содержание фосфо-eNOS (0,7 ± 0,04 и 0,4 ± 0,06 интегральной интенсивности у нормогликемических и диабетических мышей соответственно). Раннее усиление экспрессии фосфо-eNOS у обоих штаммов животных на 6-й день (рисунок 2A), но это выражение было значительно ниже у диабетических животных. В ранах, обработанных RLX, большее увеличение фосфо-eNOS было обнаружено как у недиабетических, так и у диабетических животных по сравнению с животными, обработанными транспортным средством (рис. 2А).

eNOS (конститутивная и фосфорилированная форма) (A) и NO продукты (B) в образцах кожи, собранных либо с нормогликемической (db + / + m), либо с диабетическими мышами (db + / db +), получаемыми либо RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно) или носитель (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) в день 6. Каждый бар представляет собой среднее значение ± SD из шести животных. * P <0,01 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; §P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,05 по сравнению с носителем db + / db ++.

Ранение вызывало заметное увеличение содержания NO2- / NO3- по сравнению с контрольной неповрежденной кожей на 6-й день (1,3 ± 0,4 и 0,8 ± 0,04 нмоль / г ткани у нормогликемических и диабетических мышей соответственно). Однако уровни NO2- / NO3-уровня были значительно снижены в ранах диабетических животных. Значительное повышение уровня NO в ране наблюдалось у пациентов с диабетом и без диабета, которым вводили RLX, по сравнению с животными, обработанными транспортным средством (рис. 2B).

На рисунке 3 показаны гистологические оценки (A) и репрезентативные гистологические картины (B-E) нескольких экспериментальных групп на 12-й день. У нормогликемических животных завершались ремоделирование дермы и процессы закрытия крыс (рис. 3A и 3B). Однако введение RLX качественно улучшило заживление ран (рис. 3А и 3С).

(A) Гистологические оценки в образцах раны, собранных либо с нормогликемической (db + / + m), либо с диабетическими мышами (db + / db +), получаемые либо RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно), либо носитель (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) в день 12. Каждый бар представляет собой среднее значение ± SD из шести животных. §P <0,001 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,001 по сравнению с транспортным средством db + / db ++. (B-E) Гистологические микрофотографии, гематоксилин-эозин, нескольких экспериментальных групп на 12-й день. (B) Нормогликемические (db + / + m) раны, обработанные транспортным средством. Повторная эпителизация почти завершена. Грануляционная ткань хорошо сформирована без воспалительных инфильтратов. (C) RLX-обработанные нормогликемические (db + / + m) раны. Полная повторная эпителизация и восстановление нормальной структуры дермы. (D) Диабетические (db + / db +), обработанные автомобилем. Неполная реэпителизация и плохо сформированная грануляционная ткань. (E) RLX-диабетические (db + / db +) раны. Реэпителизация - это почти полная, хорошо организованная грануляционная ткань и отсутствие признаков воспаления, отеков или эритроррагий.

Диабетические раны мышей, которым вводили носитель на 12-й день, показали слабое повторное эпителиализацию с частично организованной грануляционной тканью (фиг. 3А и 3D). Напротив, умеренная до полной реэпителизации и хорошо сформированная грануляционная ткань наблюдались в диабетической ране мышей, обработанных RLX (фиг. 3A и 3E).

Время полного закрытия раны обозначалось замкнутым линейным гребнем, без открытых площадок между стежками. Полная нормализация кожи у необработанных нормогликемических животных произошла на 23-3 день после ранения, и RLX не изменил этот параметр (рисунок 4). Заболевание раны у диабетиков наблюдалось на 38-3 день после хирургической процедуры, а RLX заметно сокращало время до полного закрытия раны (рис. 4). Сопутствующая обработка антителами, вырабатываемыми против VEGF или CXCR4, уменьшала эти эффекты, тем самым подтверждая, что как VEGF, так и SDF1-α опосредуют полезные эффекты RLX на заживление ран.

Время заканчивать закрытие раны нормогликемическим (db + / + m) и диабетическим (db + / db +) мышей, получая либо RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно), либо носитель (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день). Две дополнительные группы диабетических животных вводили с RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) и обрабатывали антителом против VEGF мыши (10 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно ежедневно) или с анти-CXCR4-антителом (0,4 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно ежедневно). Каждая точка представляет среднее значение ± S.D. из шести животных. §P <0,001 по сравнению с транспортным средством db + / + m + или RLX; * P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,001 по сравнению с носителем db + / db ++; ° P <0,05 по сравнению с db + / db ++ RLX.

CD31-иммуноокрашивание исследовали на 12-й день для подтверждения образования нео-сосудов (рис. 5). Фактически, этот белок представляет собой высокоспецифический маркер для эндотелиальных клеток. Положительное окрашивание присутствовало в ранах животных, не обладающих диабетом, (фиг.5С). Это окрашивание заметно уменьшилось в ранах от диабетических животных, которым вводили транспортное средство (рис. 5А). Введение RLX увеличивало иммуноокрашивание CD31 в обоих штаммах мышей (фиг. 5B и 5C). Эффект был заметен при диабетических ранах, где положительное окрашивание в основном локализовалось в небольших сосудах и капиллярах (рис. 5Б). Используя изображения, полученные при окрашивании CD31, образцы ткани оценивали по МВД (рис. 5С). Лечение RLX заметно увеличивало MVD как у недиабетических, так и у диабетических животных (рис. 5C).

(A, B). Представительное иммуногистохимическое CD31-окрашивание образцов кожных ран от мышей с диабетом (db + / db +), обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) при день 12. Стрелки указывают на положительную окраску. (C) Сравнение полуколичественной оценки плотности микрососудов (MVD) между каждой группой. Каждый бар представляет среднее значение ± S.D. из шести животных. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; §P <0,01 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,01 по сравнению с носителем db + / db ++.

Чтобы подтвердить неоангиогенез, иммуноокрашивание CD34 и VEGFR-1 также изучали на 12-й день (рисунок 6). Положительное окрашивание было очевидным в ранах от введенных в транспортную среду недиабетических животных (рис. 6C и 6F). Это окрашивание было значительно уменьшено в ранах от диабетических животных, которым вводили транспортное средство (фиг. 6A и 6D). Введение RLX усиленных CD34 (фиг. 6B и 6C) и VEGFR-1 (фиг.6E и 6F) иммуноокрашивание в обоих штаммах мышей. У пациентов с диабетом, получавших RLX, наблюдалось заметное окрашивание в субэпителиальном слое, VEGFR-1 на самом деле существует также в растворимой форме, и диффузное окрашивание предполагает увеличение производства. Фигуры 6 (C) и 6 (F) представляют собой количественное представление этих результатов.

(A, B). Представительное иммуногистохимическое окрашивание CD34 образцов кожи с диабетической (db + / db +) мышей, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) в день 12. Стрелки указывают на положительную окраску. (D, E) Типичное иммуногистохимическое разложение VEGFR-1 образцов кожной раны от диабетических (db + / db +) мышей, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) на 12-й день. Стрелки указывают на положительную окраску. (C, F) Количественная оценка CD34- и VEGFR-1-положительных клеток на поле в нормогликемических (db + / + m) и диабетических (db + / db +) мышах, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или с RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно) на 12 день. Каждый бар представляет собой среднее значение ± SD из шести животных. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; §P <0,01 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,01 по сравнению с носителем db + / db ++.

На 12-й день иммуноокрашивание проводили для VEGFR-2 и VE-кадгерина, маркеров, которые идентифицируют клетки эндотелиальных предшественников. Эти клетки не только циркулируют, но и производятся БМ, но они также присутствуют в подкожной жировой ткани. Небольшое окрашивание для VEGFR-2 (фиг. 7A и 7C) и VE-кадгерина (фиг.7D и 7F) наблюдалось в обоих штаммах мышей, которым вводили носитель. Инъекция RLX значительно увеличивала окрашивание VEGFR-2 (рисунки 7B и 7C) и VE-кадгерина (рисунки 7E и 7F) у недиабетических и диабетических животных. На рисунках 7 (C) и 7 (F) показано количественное представление этих результатов.

(A, B) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание образцов кожных ран от диабетических (db + / db +) мышей, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) на 12-й день. Стрелки указывают на положительную окраску. (C, D). Представительное иммуногистохимическое окрашивание VE-кадгерина образцов кожных ран из диабетических (db + / db +) мышей, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) на 12-й день. Стрелки указывают на положительную окраску. (C, F) Количественная оценка клеток VEGFR-2- и VE-кадеринов на поле в нормогликемических (db + / + m) и диабетических (db + / db +) мышах, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день ) или с RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно) на 12 день. Каждый бар представляет собой среднее значение ± SD из шести животных. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; §P <0,01 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,01 по сравнению с носителем db + / db ++.

Чтобы выяснить, модулирует ли RLX синтез коллагена и гомеостаз внеклеточного матрикса, иммуноокрашивание MMP-11. Небольшое окрашивание для MMP-11 наблюдалось в обоих штаммах мышей, которым вводили носитель (фиг. 8A и 8C). Инъекция RLX значительно увеличивала окрашивание MMP-11 у недиабетических и диабетических животных (рис. 8B и 8C). В этой последней группе сильное положительное пятно проявлялось в субэпителиальной ткани и в эндотелиальных клетках из вновь образованных капилляров, что указывало на то, что RLX может противодействовать преувеличенному фиброзу ран. На рисунке 8 (C) показано количественное представление этих данных.

(A, B) Типичное иммуногистохимическое MMP-11 окрашивание образцов раны кожи от диабетических (db + / db +) мышей, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или RLX (25 мкг / мышь в день подкожно) на 12-й день. Стрелки указывают на положительную окраску. (C) Количественное определение окрашивания MMP-11 на поле в нормогликемических (db + / + m) и диабетических (db + / db +) мышах, обработанных транспортным средством (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день) или с RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно) в день 12. Каждый бар представляет собой среднее значение ± SD из шести животных. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,01 по сравнению с носителем db + / db ++.

Рисунок 9 показывает прочность на разрыв раны (рис. 9A) и уровни глюкозы в крови (рис. 9B) для каждой группы в день 12. Прочность на разрыв у диабетиков была значительно ниже, чем у нормогликемических животных. Введение RLX существенно не меняло этот параметр у недиабетических животных (рис. 9A). Разрушающая прочность подкожных диабетических ран мышей, обработанных RLX, была выше, чем у диабетических мышей, обработанных транспортным средством (рис. 9A).

Прочность на растяжение ран (A) и уровней глюкозы в крови (B), полученных на 12-й день от нормогликемических (db + / + m) и диабетических (db + / db +) мышей, которым вводили либо RLX (25 мкг / мышь в день, подкожно) (6 мкл 0,9% NaCl / мышь в день). Каждый бар представляет среднее значение ± S.D. из шести животных. §P <0,01 по сравнению с транспортным средством db + / + m +; #P <0,05 по сравнению с носителем db + / db ++.

В конце эксперимента уровни глюкозы в крови (рис. 9В) у диабетических животных, обработанных носителем, составляли 660 ± 32 мг / дл. Уровень глюкозы в крови у недиабетических животных составлял в среднем 120 ± 12 мг / дл. Администрация RLX не изменяла гликемию у недиабетических животных (106 ± 10 мг / дл), но значительно уменьшала уровень глюкозы в крови у диабетиков (490 ± 60 мг / дл).

Существует комплексный каскад событий при восстановлении кожи, но ангиогенез считается ключевым процессом во время заживления ран. Враждебная микроэкология при диабете, главным образом из-за усиления продуцирования активных форм кислорода [8], вызывает дефект в ангиогенезе, вызванном VEGF, который нарушает последовательные и скоординированные фазы процесса заживления. Предполагалось, что конечный результат заживления кожи улучшится только тогда, когда микро-среда соответствующим образом модифицирована, чтобы быть благоприятной для нового образования сосудов [9,20-24].

Кровеносные сосуды образуют два различных процесса: васкулогенез и ангиогенез [7]. В васкулогенезе EPC дифференцируют de novo от мезодермальных предшественников, тогда как в ангиогенезе новые сосуды генерируются из ранее существовавших. Ангиогенез и неоваскуляризация могут быть нежелательными процессами при определенных заболеваниях, включая рак. Однако формирование новых кровеносных сосудов также может помочь облегчить некоторые состояния, как при образовании коллатерального кровообращения в ишемическом миокарде и конечностях, а также во время заживления ран. Также у диабета имеется хорошо документированное нарушение механизмов, лежащих в основе васкулогенеза, включая измененную экспрессию SDF-1α, затупленный каскад eNOS-NO и снижение мобилизации и самонаведения EPC [14].

Настоящие данные свидетельствуют о том, что комбинированная стимуляция как ангиогенеза, так и васкулогенеза может представлять собой рациональный подход для лечения индуцированных диабетом нарушений заживления ран и оправдывать поиск соединений, способных достичь этого. В этом отношении может представлять интерес полипептидный гормон RLX. RLX оказывает соответствующее влияние на периферическую и коронарную сосудистую сеть [25], способствует росту кровеносных сосудов [26] и индуцирует ангиогенез на раневых участках [20]. Он также способен регулировать иммунную систему [27,28].

В нашем эксперименте RLX улучшил измененный процесс заживления, увеличил новое образование сосудов и увеличил прочность на разрыв раны у страдающих ожирением диабетических животных. RLX также улучшил нарушенную картину экспрессии VEGF. Интересно, что RLX также стимулировал экспрессию CD31, CD34 и VEGFR-1 в новых сосудах, близких к месту раны у генетически тучных диабетических мышей. При диабете потребность в неоваскуляризации возникает из-за неадекватного производства VEGF и высвобождения в ранах; таким образом, классический ангиогенетический процесс чрезвычайно задерживается и является плохим, и, как следствие, терапевтически ценные подходы были оценены с целью стимулирования экспрессии нарушенного ангиопоэтического фактора. Наши результаты ясно показывают, что RLX эффективно индуцирует активный ангиогенез, в свою очередь, улучшает нарушенный процесс заживления. Тем не менее, васкулогенез также нарушается при диабете и может способствовать уменьшению структуры нового образования сосудов [14].

EPC представляют поверхностный маркер VEGFR-2 (или flk-1), специфичный как для конечных, так и для молодых эндотелиальных клеток, и, управляемый факторами роста, мигрируют из мезодермы боковой пластинки к дорзальной аорте к месту неоваскулогенеза [11 ]. Кроме того, VE-кадгерин, специфичный для эндотелия клеточный адгезионный белок комплекса адгезионного перехода, может представлять собой дополнительный маркер васкулогенеза [29]. Мы обнаружили значительное снижение экспрессии VEGFR-2 и VE-кадгерина в ранах страдающих ожирением диабетических животных, обработанных транспортным средством, тогда как введение RLX заметно увеличивало окрашивание VEGFR-2 и VE-кадгерина в сосудах, близких к хирургическому повреждению. Интересно, что мы обнаружили, что экспрессия SDF-1α и каскад eNOS-NO выражены на низком уровне на участке раны у мышей db + / db +; Обработка RLX позволила обратить вспять эти дефекты. Эти наблюдения подтверждают, что при заживлении диабетической раны есть также дефект в васкулогенезе, который также может способствовать нарушению восстановления кожи. Кроме того, настоящие результаты привели нас к гипотезе о том, что RLX может иметь возможность генерировать новое образование сосудов двойным механизмом действия, включающим как ангиогенез, так и васкулогенез. Эти эффекты могут представлять основные механизмы, с помощью которых RLX улучшает процесс восстановления кожи. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы оценили время завершения закрытия раны, которое представляет собой «основной результат» любого терапевтического вмешательства, направленного на улучшение лечения депрессии раны при диабете. RLX заметно сократил время, необходимое для нормализации состояния кожи. Интересно отметить, что одновременное введение нейтрализующих анти-VEGF [30] и SDF-1-рецепторов CXCR4-антител [31] (прервать сигнальные события, связанные с рекрутированием и возвращением EPC в ишемическую ткань), уменьшило эффекты RLX на закрытие раны, подтверждая нашу гипотезу. Взятые вместе, иммуногистохимическое наблюдение и эксперимент по нейтрализации показывают, что RLX действует через оба этих пути для развития ангиогенеза и васкулогенеза.

Однако хорошо скоординированный процесс заживления не должен приводить к возникновению чрезмерного фиброза, который может способствовать «нарушениям» процесса восстановления кожи, таким как гипертрофические раны и, наконец, образование рубцов [32]. Было предложено терапевтически использовать RLX для регулирования чрезмерного осаждения коллагена и содействия ремоделированию тканей при заболеваниях, характеризующихся фиброзным отложением [33,34]. Механизм, лежащий в основе антифибротического действия RLX, еще далек от понимания; однако показано, что полипептидный гормон снижает активность некоторых профибротических факторов (т. е. трансформирует фактор роста-1 и интерлейкин-1β) [35,36] и вызывает образование ММР в некоторых тканях [37]. В соответствии с этим предыдущим наблюдением мы обнаружили, что обработка RLX заметно увеличивала окрашивание MMP-11 в ранах. Это может представлять собой еще одну положительную особенность лечения RLX, которая может хорошо сбалансировать оборот коллагена, что позволяет избежать неконтролируемого фиброза, наблюдаемого при гипертрофическом заживлении. Благотворное влияние RLX на нарушенное заживление диабетической раны также сопровождалось снижением уровня глюкозы в крови. Этот эффект может принести пользу в общем лечении пациентов с диабетом, даже если маловероятно, что это значительное, но не «клинически значимое» снижение уровня глюкозы в крови может способствовать улучшенному восстановлению кожи, вызванному RLX.

В заключение, результаты настоящего исследования показывают, что введение RLX может улучшать изменение диабетической раны, вызванное не только ускорением нового образования сосудов посредством «двойного» механизма действия, но также путем регулирования экспрессии MMP, что позволяет избежать нежелательного и раздраженного фиброза. Поскольку рекомбинантная форма человеческого RLX была изучена в клинических испытаниях фазы II / III и продемонстрировала многообещающие результаты, особенно при лечении острой сердечной недостаточности [38], которая чаще встречается у пациентов с диабетом [39, 40], мы считают, что наше исследование может пролить свет на возможное использование RLX у пациентов с диабетом с периферическими заболеваниями и местной недостаточностью кровообращения, таких как язвы стопы.


            Пациенты, страдающие диабетом, демонстрируют нарушенный процесс заживления ран, который может повысить общую заболеваемость и смертность этой популяции. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что RLX (релаксин) может улучшить несколько параметров, связанных с заживлением ран. Поэтому мы исследовали влияние RLX, полученного из свиней, на связанные с диабетом раневые исцеляющие дефекты у генетически диабетических мышей.

Результаты настоящего исследования показывают, что RLX способен улучшать как ангиогенез, так и васкулогенез путем стимуляции специфических молекулярных мишеней, включая VEGF и SDF1-α.

Эти данные свидетельствуют о том, что при изменении заживления ран, как и во время диабета, введение RLX может представлять собой альтернативную терапевтическую стратегию. Применение в клинических условиях может быть далеко не так, поскольку у RLX не было побочных эффектов, и положительные эффекты были заметны после нескольких дней лечения.

Алессандра Битто, Наташа Иррера и Letteria Minutoli задумали и разработали исследование. Маргерита Кало, Патриция Ло Кашио, Паоло Качча, Антонио Микали, Габриэле Пиццино, Джованни Паллио, Антонио Микали, Марио Ваккаро и Антонино Сайта проанализировали и интерпретировали данные. Франческо Сквадрито и Доменика Алтавилла возглавили дизайн и подготовили документ.

Это было поддержано либеральным пожертвованием от IBSA и ведомственным финансированием.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *