Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Продвинутые конечные продукты Glycation индуцируют апоптоз клеток эпителия роговицы человека путем генерации реактивных видов кислорода и активации JNK и p38 MAPK Pathways

Advanced Glycation End Products Induce Human Corneal Epithelial Cells Apoptosis through Generation of Reactive Oxygen Species and Activation of JNK and p38 MAPK Pathways
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3680386/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: LS XMY XYW. Выполнял эксперименты: LS XMY HLY XYW. Проанализированы данные: LS XMY XYW. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: LS XMY HLY XYW. Написал газету: LS XMY XYW.

Продвинутые конечные продукты Glycation (AGE) были вовлечены в прогрессирование диабетической кератопатии. Однако детали, касающиеся их функции, не совсем понятны. В настоящем исследовании мы исследовали влияние внутриклеточных реакционноспособных видов кислорода (ROS) и JNK, p38 MAPK на модифицированный AGE альбумин бычьей сыворотки (BSA), индуцированный человеческим теломеразой-иммортализованным апоптозом эпителиальных клеток роговицы (HUCL). Мы обнаружили, что апоптоз HUCL, индуцированный AGE-BSA, и повышенная экспрессия белка Bax, уменьшают экспрессию белка Bcl-2. AGE-BSA также индуцирует экспрессию рецептора для конечного конечного продукта гликирования (RAGE). AGE-BSA-RAGE индуцировала внутриклеточную генерацию ROS посредством активированной оксидазы NADPH и увеличивала фосфорилирование p47-фокса. Апоптоз HUCL, индуцированный AGE-BSA, ингибировался предварительной обработкой ингибиторами NADPH-оксидазы, ROS-тушителем N-ацетилцистеином (NAC) или нейтрализующими антителами против RAGE. Мы также обнаружили, что AGE-BSA индуцирует JNK и p38 MAPK фосфорилирование. JNK и p38 ингибитор MAPK эффективно блокировали апоптоз HUCL, индуцированный AGE-BSA. Кроме того, NAC полностью блокировал фосфорилирование JNK и p38 MAPK, вызванное AGE-BSA. Наши результаты показывают, что апоптоз, индуцированный AGE-BSA, индуцирует апоптоз HUCL путем генерации внутриклеточного ROS и активации путей JNK и p38 MAPK.

Диабет стал проблемой общественного здравоохранения значительной величины [1].

Диабетическая кератопатия была признана серьезным осложнением диабета [2], таким как постоянные эпителиальные дефекты роговицы, рецидивирующая эрозия роговицы, острый отек роговицы и отсроченный ремонт эпителиальной раны роговицы. В частности, для пациентов с диабетической ретинопатией, подвергающихся витрэктомии, удаление эпителия роговицы во время процедуры приводит к значительной задержке заживления эпителиальных ран роговицы [3]. Правильное лечение эпителиальных ран роговицы жизненно важно для поддержания четкой роговицы и сохранения зрения. Отсроченное заживление эпителиальной раны роговицы может вызвать угрожающие зрению осложнения, такие как неровность поверхности глаз, микробный кератит или даже слепота. До сих пор нет эффективной стратегии лечения диабетической кератопатии в клинической практике [4]. Механизм заболевания не полностью понят. Поэтому определение основных механизмов диабетической кератопатии будет иметь большую клиническую ценность.

Было обнаружено, что расширенные конечные продукты Glycation (AGE) играют важную роль в развитии диабетических осложнений, таких как диабетическая нефропатия, ретинопатия и атеросклероз [5], [6]. AGE представляют собой гетерогенную группу необратимых аддуктов из реакций конденсации глюкозо-белков, а также липидов и нуклеиновых кислот, подверженных воздействию сахаров [7]. Первоначально происходит образование обратимых промежуточных продуктов Шиффа-основания (продукт Амадори), который подвергается сложной серии химических перестроек, чтобы получить необратимые ВОЗРАСТЫ [8]. Было продемонстрировано, что образование и накопление AGE ускоряются в условиях диабета [9]. Широко признано, что ВОЗРАСТЫ играют важную роль в диабетической кератопатии [10], [11]. Накопление AGE было обнаружено на месте эпителия роговичного и эпителиального подвальных мембран у крыс с диабетом [12], [13], обезьян [14] и пациентов [10]. Было показано, что AGEs были подняты в слезах пациентов с диабетом [15]. Кроме того, лечение аминогуанидином, ингибитором AGE, предотвращало структурные аномалии роговицы у крыс с диабетом [11], [16]. Хотя эти наблюдения свидетельствуют о том, что накопление AGE играет важную роль в развитии диабетической кератопатии. Однако детали, касающиеся их функции, не совсем понятны.

Биологические свойства AGE были связаны с их способностью взаимодействовать с рецептором для AGE (RAGE) [17]. RAGE представляет собой рецептор передачи сигнала надсемейства иммуноглобулина [18]. Возбужденный AGE трубчатый эпителиально-мезенхимный переход (EMT) и почечный фиброз были зависимыми от RAGE [19]. Ось-RAGE, как представляется, играет центральную роль в воспалении, нейродегенерации и микрососудистой дисфункции сетчатки, возникающей во время диабетической ретинопатии [20]. В предыдущем исследовании было обнаружено, что экспрессия RAGE больше в эпителиальных клетках роговицы диабетических крыс, чем в контрольных крысах [21].

Апоптоз — это потенциальный механизм, с помощью которого ВОЗРАСТы оказывают влияние. Было показано, что AGE индуцировали апоптоз в почечных мезангиальных клетках, сосудистых эндотелиальных клетках и перицитах сетчатки [22], [23], [24]. Апоптоз в эпителии роговицы продемонстрирован у диабетической крысы [12], [13], [25], в которой участвует накопление AGE. Увеличение апоптоза эпителиальных клеток роговицы способствует задержке заживления эпителиальных ран в диабетической роговице. Было показано, что генерация внутриклеточных реактивных видов кислорода (ROS) опосредует клеточные ответы на AGE [26]. ROS, такие как супероксидный анион, гидроксильные радикалы и пероксид водорода, могут инициировать неправильные или измененные пути передачи сигнальной клетки и вызывать токсичность [27]. Чрезмерное производство РОС играет важную роль в апоптозе [28]. Сообщалось, что AGE индуцировали апоптоз перицита сетчатки через перепроизводство внутриклеточного ROS [24]. Сообщалось, что ВОЗ активирует митоген-активированные протеинкиназные пути (MAPK) [29]. Пути MAPK представляют собой семейство серин-треониновых протеинкиназ [30]. C-jun N терминальная киназа (JNK) и p38 MAPK составляют два основных подсемейства MAPK-путей, которые могут участвовать в апоптозе [31]. Имеются данные о том, что AGE индуцировали апоптоз остеобластов через JNK и p38 MAPK [32].

Основываясь на этих выводах, было высказано предположение, что взаимодействие AGE-RAGE индуцирует внутриклеточную генезу ROS и активирует JNK и p38 MAPK, которые способствуют апоптозу эпителия роговицы. В настоящем исследовании мы исследовали, может ли AGE-модифицированный бычий сывороточный альбумин (BSA) индуцировать апоптоз в теломеразе-иммортализованных эпителиальных клетках роговицы (HUCL) и определял влияние внутриклеточного ROS и JNK, p38 MAPK на индуцированные AGE-BSA HUCL апоптоз.

Бычий сывороточный альбумин (BSA) был получен от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Антитела против Bax и Bcl-2 были приобретены у Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Санта-Крус, Калифорния). Антитела против JNK, p38 MAPK, фосфо-JNK (Thr183 / Tyr185) и фосфо-p38 MAPK (Thr180 / Tyr182) получали из Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). Антитела против RAGE были получены от R & D Systems (Abingdon, U.K.). SP600125 был получен от A. G. Scientific, Inc (San Diego, CA), SB203580 был приобретен у Calbiochem (San Diego, CA).

AGE-BSA был подготовлен, как описано ранее с небольшими изменениями [33]. Вкратце, 50 мг / мл BSA инкубировали в стерильных условиях с 0,5 моль / л D-глюкозы в 0,1 моль / л забуференного фосфатом физиологическом растворе (PBS, pH 7,4) при 37 ° C в течение 10 недель в темноте. После инкубации препараты интенсивно диализовали против PBS для удаления свободной глюкозы. Немодифицированный BSA инкубировали в тех же условиях без глюкозы в качестве контроля. Концентрации белка определяли по методу Брэдфорда. Концентрации эндотоксинов измеряли с помощью анализа лизата лимузного амебоцита (EToxate, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) и не было обнаружено эндотоксина.

AGE-BSA характеризовался на основе модификаций остатков лизина и их флуоресцентных свойств. Фракцию модифицированных остатков лизина измеряли с помощью метода 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), который оценивает долю немодифицированного лизина в препарате AGE-BSA по сравнению с фракцией немодифицированный BSA. По этому методу мы показали, что степень модификации лизина в нашем препарате AGE-BSA составляет 84% по сравнению с немодифицированным BSA. Степень образования флуоресцентных AGE оценивалась спектрофлуорометрически. AGE-BSA и немодифицированный BSA разбавляли PBS, и интенсивность флуоресценции регистрировали при возбуждении 360 нм, излучение 450 нм. Характеристическая флуоресценция гликирования AGE-BSA была увеличена примерно в 12 раз по сравнению с немодифицированным BSA. Это действительно решило, что AGE были сформированы.

Nе-карбоксиметил-лизин (ХМЛ) был основным формам ВПС in vivo. Концентрацию CML измеряли с помощью ELISA (Uscn Life Science Inc., Ухань, Китай). После гликирования AGE-BSA характеризовалась более высокой концентрацией ХМЛ в 59 раз по сравнению с немодифицированным BSA (11,8 нмоль / мг белка в AGE-BSA против белка 0,2 нмоль / мг в немодифицированном BSA). Поэтому мы исследовали влияние 50, 100 и 200 мкг / мл AGE-BSA на HUCL, так как эти концентрации ХМЛ являются типичными для пациентов с диабетом [34], [35].

HUCL были любезно предоставлены профессором Фу-Шин X. Ю (Школа медицины, Уэйнский государственный университет, США) [36]. HUCL культивировали в определенной свободной от кератиноцитов сыворотке (Invitrogen, CA, USA) в увлажненном 5% -ном СО2-инкубаторе при 37 ° C. Клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 2 × 105 клеток на лунку в нормальной среде роста.

Апоптоз исследовали с помощью набора для обнаружения апоптоза инфинита V-флуоресцеина изотиоцианата (FITC) (BioVision Inc., Mountain View, CA, США), следуя инструкциям производителя.

Вестерн-блоттинг продолжался, как описано ранее [37]. Вкратце, культивированные клетки собирали в указанное время и лизировали путем встряхивания при 4 ° С в течение 30 мин в буфере RIPA (50 мМ Трис-HCl, 0,25% Na-дезоксихолата, 1% NP-40 и 150 мМ NaCl, NaF и 1 мМ Na3VO4), содержащего ингибиторы протеазы. Клеточные лизаты центрифугировали при 12000 г в течение 15 мин при 4 ° С. Супернатант кипятили в течение 5 мин. Общий белок определяли количественно, а образцы белка подвергали электрофорезу в 10% -ном додецилсульфат-полиакриламидном геле, а затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в забуференном Трисом физиологическом растворе в течение 2 ч при комнатной температуре перед инкубацией в течение ночи при 4 ° С с первичными антителами. Нитроцеллюлозные мембраны интенсивно промывали забуференным триссом физиологическим раствором и инкубировали с вторичными антителами в течение 2 ч при 37 ° С. Полосы протеина были визуализированы с использованием улучшенной хемилюминесценции, как описано поставщиком. Денситометрический анализ был проведен с помощью программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad, CA, USA).

Уровни внутриклеточного ROS определяли путем измерения DCFH-DA, как описано ранее [38]. Вкратце, клетки инкубировали в течение 30 мин с 10 мкМ DCFH-DA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) при 37 ° C в темноте и затем обрабатывали, как указано. Внутриклеточные уровни ROS анализировали с использованием флуориметра с возбуждением 485 нм и длиной волны излучения 535 нм. Неконтролируемая BSA использовалась в качестве контроля. Данные являются средствами из экспериментов, выполненных в трех экземплярах. Внутриклеточное накопление ROS также было отображено на конфокальной системе лазерного сканирования на инвертированном флуоресцентном микроскопе.

Активность никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) -оксидазы определяли, как описано ранее [39]. Вкратце, HUCL обрабатывали, как указано, а затем суспендировали в буфере для гомогенизации (20 мМ Hepes, pH 7,0, 1 мМ EDTA и 100 мМ KCl, содержащие смеси ингибиторов протеазы). Активность оксидазы НАДФ измеряли методом люминесценции в 50 мМ PBS, pH 7,0, содержащем 150 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA, 5 мМ люцигенин в качестве акцептора электронов и 100 мМ НАДФН в качестве субстрата. Анализы проводили в темноте при комнатной температуре.

Результаты были выражены как средства ± SEM. Пареальные сравнения оценивались по методике Студент-Ньюман-Кельс или в процедуре Т3 Даннета, когда предположение о равных отклонениях не выполнялось. P <0,05 считалось статистически значимым. Анализ данных проводился со Статистическим пакетом для социальных наук (SPSS версия 11.0).

Мы исследовали, может ли AGE-BSA индуцировать апоптоз в HUCL. HUCL инкубировали с 200 мкг / мл AGE-BSA в течение 6, 12, 24 и 48 ч или обрабатывали 50, 100 и 200 мкг / мл AGE-BSA в течение 24 часов. Апоптоз определяли проточным цитометром. Как показано на рисунке 1, воздействие HUCL на AGE-BSA индуцировало увеличение апоптоза в зависимости от времени и дозы.

Апоптоз определяли проточным цитометром. (А) HUCL инкубировали с AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 6, 12, 24 и 48 ч. (B) HUCL обрабатывали 50, 100 и 200 мкг / мл AGE-BSA в течение 24 часов. Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по сравнению со средой, находящейся отдельно.

Для исследования потенциальных медиаторов апоптоза, индуцированного AGE-BSA, проапоптотическая молекула Bax и антиапоптотическая молекула Bcl-2 экспрессии анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на фиг. 2, AGE-BSA значительно увеличивает экспрессию белка Bax. Напротив, AGE-BSA заметно ингибирует экспрессию белка Bcl-2. Эти результаты свидетельствуют о том, что апоптоз HUCL, индуцированный AGE-BSA, был связан с увеличением экспрессии Bax и уменьшением экспрессии Bcl-2.

HUCL инкубировали с AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 6, 12 и 24 ч, вестерн-блот-анализ уровней Bax и Bcl-2 во всех клеточных экстрактах. Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по сравнению со средой, находящейся отдельно.

Затем мы исследовали влияние AGE-BSA на экспрессию RAGE в HUCL. HUCL инкубировали с 200 мкг / мл AGE-BSA в течение 6, 12, 24 и 48 ч или обрабатывали 50, 100 и 200 мкг / мл AGE-BSA в течение 24 часов. Экспрессию белка RAGE определяли вестерн-блот-анализом. Как показано на рисунке 3, воздействие HUCL на AGE-BSA вызывало зависящее от времени и дозу увеличение экспрессии белка RAGE.

Экспрессию белка RAGE определяли вестерн-блот-анализом. (А) HUCL инкубировали с AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 6, 12, 24 и 48 ч. (B) HUCL обрабатывали 50, 100 и 200 мкг / мл AGE-BSA в течение 24 часов. Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по сравнению со средой, находящейся отдельно.

AGE-BSA оказывает проапоптотический эффект, индуцируя внутриклеточное продуцирование ROS в различных типах клеток [24]. Для выяснения механизма апоптоза HUCL, индуцированного AGE-BSA, были оценены эффекты AGE-BSA на внутриклеточное производство ROS. Уровень внутриклеточного ROS был обнаружен на основе флуоресценции DCFH-DA. Как показано на рисунке 4 A, AGE-BSA вызвала острый рост внутриклеточной генерации ROS, и самое раннее значительное увеличение внутриклеточного ROS-продуцирования было достигнуто через 3 часа обработки AGE-BSA в HUCL. Выраженное в AGE-BSA внутриклеточное ROS-продуцирование в HUCL было подтверждено лазерной сканирующей конфокальной микроскопией. Как показано на рисунке 4 B, AGE-BSA значительно увеличивало количество клеток с высокой интенсивностью флуоресценции по сравнению с клетками, культивированными только в среде. Более того, индуцированное AGE-BSA внутриклеточное производство ROS почти полностью блокировалось путем предварительной обработки HUCL ингибиторами оксидазы NADPH, дифениленйодония (DPI) или апоцинина, но не ингибиторами других потенциальных ферментов, что свидетельствует о том, что AGE-BSA индуцирует внутриклеточное ROS-продуцирование в HUCL был зависим от оксидазы НАДФН (рисунок 4С). Затем мы исследовали, может ли сигнал AGE-BSA через RAGE индуцировать генерацию ROS. Мы использовали нейтрализующее антитело против RAGE для блокирования взаимодействия AGE-RAGE. Как показано на фиг. 4C, анти-RAGE-антитела полностью блокируют усиленное генерирование ROS AGE-BSA, демонстрируя, что AGE-BSA связывает RAGE с целью индуцирования генерации ROS.

Внутриклеточное продуцирование ROS оценивали с использованием флуоресценции DCFH-DA. (A) HUCL обрабатывали AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 3, 6, 12 и 24 ч, пероксид водорода (1 мМ) добавляли в клетки в качестве положительного контроля. (B) Внутриклеточная генерация ROS была визуализирована под конфокальным микроскопом с лазерным сканированием. Шкала шкалы = 50 мкм. (C) HUCL предварительно обрабатывали DPI (ингибитор оксидазы NADPH, 10 мкМ), апоцинин (ингибитор оксидазы НАДФ, 300 мкМ), аллопуринол (ингибитор ксантиноксидазы, 10 мкМ), ротенон (ингибитор митохондриального электронного транспорта I, 5 мкМ) или нейтрализующих анти-RAGE антитела (20 мкг / мл) в течение 1 часа. и затем инкубировали с AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 12 часов. Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по отношению к среде отдельно; #, P <0,05 против группы AGE-BSA.

Чтобы дополнительно исследовать механизмы, лежащие в основе индукции внутриклеточного образования ROS AGE-BSA, мы исследовали влияние AGE-BSA на активность оксидазы NADPH. Как показано на рисунке 5 A, AGE-BSA приводило к зависящему от времени увеличению активности оксидазы НАДФ в HUCL. p47phox является основной субъединицей NADPH-оксидазы, она фосфорилируется и стимулирует ферментативную активность. Как показано на рисунке 5 B, уровни p-p47фокса были значительно увеличены в HUCL за 1 ч после лечения AGE-BSA.

HUCL обрабатывали AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 1, 3 и 6 часов. (A) активность оксидазы НАДФ. (B) Вестерн-блот-анализ использовали для определения экспрессии p-p47phox. Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по сравнению со средой, находящейся отдельно.

Затем мы исследовали необходимость внутриклеточной генерации ROS для апоптоза, индуцированного AGE-BSA, в HUCL. Как показано на фиг.6, предварительная обработка HUCL с помощью ингибиторов NADPH-оксидазы (DPI или апоцинин) значительно подавила экспрессию белка и апоптоза молекулы Bax-протеина, индуцированную AGE-BSA. Предварительная обработка HUCL с помощью ROS-поглотителя N-ацетилцистеина (NAC) значительно ингибировала апоптоз, вызванный AGE-BSA. Эти результаты показывают, что внутриклеточная генерация ROS через оксидазу NADPH была необходима для апоптоза, индуцированного AGE-BSA, в HUCL. Кроме того, апоптоз HUCLs, индуцированный AGE-BSA, может быть блокирован анти-RAGE антителами, что указывает на то, что апостеоз, индуцируемый AGE-BSA, в основном опосредуется RAGE.

(A) HUCL предварительно обрабатывали DPI (10 мкМ) или апоцинином (300 мкМ) в течение 1 часа, а экспрессию белка Bax анализировали через 24 часа после обработки AGE-BSA (200 мкг / мл) с помощью Вестерн-блоттинга. (В) HUCL предварительно обрабатывали DPI (10 мкМ), апоцинином (300 мкМ), NAC (20 мкМ) или нейтрализующими антителами против RAGE (20 мкг / мл) в течение 1 часа, а апоптоз анализировали через 24 часа после AGE-BSA (200 мкг / мл) с помощью проточного цитометра. Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по отношению к среде отдельно; #, P <0,05 против группы AGE-BSA.

Известно, что окисляющее напряжение активирует семейство MAPKs, в частности JNK и p38 MAPK, путем фосфорилирования [40]. Поскольку AGE-BSA индуцирует внутриклеточную генерацию ROS, мы предположили, что JNK и p38 MAPK могут участвовать в апоптозе, вызванном AGE-BSA. Таким образом, мы исследовали, может ли AGE-BSA индуцировать фосфорилирование JNK и p38 MAPK в HUCL. HUCL обрабатывали 200 мкг / мл AGE-BSA в течение 6, 12 и 24 ч с последующей экстракцией клеточного белка. Выражения общего и фосфорилированного JNK и p38 MAPK определяли вестерн-блот-анализом. Как показано на рисунке 7, HUCL, стимулированные AGE-BSA, индуцировали увеличение фосфорилирования JNK и p38 MAPK.

HUCL инкубировали с AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 6, 12 и 24 ч. Общее и фосфорилирование JNK (A) и p38 MAPK (B) анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по сравнению со средой, находящейся отдельно.

Чтобы определить, необходимы ли JNK и p38 MAPK для апоптоза, вызванного AGE-BSA, HUCL обрабатывали в отсутствие или в присутствии ингибитора JNK (SP600125) или ингибитора MAPK p38 (SB202190) в течение 1 часа, соответственно. AGE-BSA затем добавляли к культуре в течение 24 часов. Наши результаты показали, что ингибиторы JNK (SP600125) или p38 MAPK (SB203580) почти блокировали экспрессию белка Bax (рисунок 8 A) и апоптоз (рис. 8B), индуцированные AGE-BSA. Эти результаты показали, что JNK и p38 MAPK были связаны с апоптозом, индуцированным AGE-BSA, в HUCL. Для выяснения механистического порядка внутриклеточной продукции ROS и JNK, p38 MAPK фосфорилирования. HUCL инкубировали с NAC, поглотителем ROS, до лечения AGE-BSA. NAC почти блокировал фосфорилирование JNK (рис. 8 C) и p38 MAPK (рисунок 8 D) в HUCL, индуцированных AGE-BSA. Эти результаты свидетельствуют о том, что внутриклеточный РОС играет важную роль как регуляторная молекула восходящего потока в апоптозе, индуцированном AGE-BSA, в HUCL.

HUCL предварительно обрабатывали ингибитором JNK (SP600125, 20 мкМ) или ингибитором p38 MAPK (SB203580, 20 мкМ) в течение 1 часа соответственно. Затем их обрабатывали AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 24 часов. (A) Экспрессия белка Bax анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. (B) Апоптоз анализировали с помощью проточного цитометра. HUCL предварительно обрабатывали поглотителями ROS NAC (20 мкМ) в течение 1 часа. Затем клетки стимулировали AGE-BSA (200 мкг / мл) в течение 24 ч с последующим вестерн-блот-анализом для общего и фосфорилированного JNK (C) и p38 MAPK (D). Данные представляют из трех независимых экспериментов. *, P <0,05 по отношению к среде отдельно; #, P <0,05 против группы AGE-BSA.

Диабетическая кератопатия была признана серьезным осложнением диабета. Клинически диабетическая кератопатия может вызывать опасные для зрения осложнения, такие как неровность поверхности глаз, микробный кератит или даже слепота. Однако лечения болезни все еще не хватает. Механизм, который ведет к заболеванию, не полностью понят. Недавно сообщалось, что ВПК способствуют прогрессированию диабетической кератопатии [14].

AGE представляют собой гетерогенную и сложную группу продуктов, которые участвуют в осложнениях, связанных с диабетом [41]. Сообщалось, что усиление накопления AGE способствует диабетическим окулярным осложнениям, таким как диабетическая ретинопатия и дисфункция слезных желез [21], [42]. Сообщалось, что ингибитор AGEs, Аминогуанидин, ослабляет структурные изменения роговицы у крыс с диабетом [11], [16]. Исследования показали, что увеличение апоптоза эпителиальных клеток роговицы способствует задержке заживления эпителиальных ран в диабетической роговице [12], [25]. Администрация ингибитора KIOM-79, AGEs предотвратила апоптоз эпителиальных клеток в роговице крыс диабетических жирных Цукеров [13]. Итак, мы постулируем, что AGE-BSA может индуцировать апоптоз эпителиальных клеток роговицы и способствует диабетической кератопатии. В нашем исследовании HUCL стимулировали AGE-BSA, индуцировали увеличение апоптоза в зависимости от времени и дозы (рис. 1).

Широко признано, что митохондрии играют ключевую роль в апоптотическом процессе [43]. Сигналы апоптоза сходятся на митохондриях посредством активации проапоптотических членов семейства Bcl-2, таких как Bax, тогда как Bcl-2 служит в качестве антиапоптотического белка [44]. Bcl-2 может нейтрализовать проапоптотическую активность Bax во время апоптоза. Повышенное соотношение Bax / Bcl-2 может вызвать апоптоз. Для изучения потенциальных медиаторов апоптоза, вызванного AGE-BSA, HUCL инкубировали с AGE-BSA в течение 6, 12 и 24 ч, вестерн-блот-анализ уровней Bax и Bcl-2. Наши данные показали, что AGE-BSA значительно увеличивает экспрессию белка Bax. Напротив, AGE-BSA заметно ингибирует экспрессию белка Bcl-2 (рисунок 2). Эти результаты свидетельствуют о том, что апоптоз HUCL, индуцированный AGE-BSA, был связан с увеличением экспрессии Bax и ингибированием экспрессии Bcl-2.

RAGE является членом надсемейства IG [45]. Известно, что AGE оказывают влияние через взаимодействие с RAGE, которое активирует множество различных биохимических путей [46]. Взаимодействие AGE-RAGE связано не только с диабетом, но и с такими параметрами, как воспаление, гипоксия и повреждение ишемии / реперфузии [47], [48]. В нашем исследовании HUCL стимулировали AGE-BSA, индуцировали зависящее от времени и дозу увеличение экспрессии белка RAGE (рисунок 3). Эти результаты показывают, что AGE-BSA может оказывать патобиологический эффект через RAGE на HUCL.

Обширные доказательства подтверждают идею о том, что перепроизводство внутриклеточного ROS, вызванного AGE, играет важную роль в апоптозе [49]. АГП индуцирует апоптоз фибробластов путем перепроизводства внутриклеточного ROS [31]. В нашем исследовании AGE-BSA вызвало резкое увеличение внутриклеточной генерации ROS, и самое раннее значительное увеличение внутриклеточного ROS-продуцирования произошло после 3-х летней терапии AGE-BSA в HUCL (рисунок 4 A). Более того, индуцированное AGE-BSA внутриклеточное производство ROS было подтверждено лазерной сканирующей конфокальной микроскопией. AGE-BSA значительно увеличило количество клеток с высокой интенсивностью флуоресценции по сравнению с контролем (рисунок 4 B). Исследования показали, что существуют множественные внутриклеточные источники для генерации внутриклеточного ROS. NADPH-оксидаза, митохондрия и ксантиноксидаза были предложены в качестве основных источников внутриклеточного ROS, индуцированного AGE [50], [51]. Однако внутриклеточные источники внутриклеточного ROS, вызванного AGE-BSA, в эпителии роговицы неясны. Мы исследовали источники внутриклеточного ROS путем оценки внутриклеточной генерации ROS при лечении различных ингибиторов различных ферментативных систем. Наши результаты показали, что ингибирование NADPH-оксидазы с DPI или апоцинином заметно подавляет внутриклеточное перепроизводство ROS в обработанных AGE-BSA HUCL. Напротив, ингибитор ксантиноксидазы (аллопуринол) и ингибитор транспорта I митохондриального транспорта I (ротенон) не влияли на продукцию внутриклеточного ROS (рисунок 4 C), что указывает на то, что оксидаза NADPH может быть самым важным источником внутриклеточного ROS-продуцирования, индуцированного AGE -BSA в HUCL. Эти результаты согласуются с результатами Yanan H [52], в которых индуцированный EGF внутриклеточный ROS был получен из NADPH-оксидазы в эпителиальных клетках роговицы. Чтобы узнать об участии RAGE в генерации ROS, индуцированной AGE-BSA, в HUCL, мы предварительно инкубировали обработанные AGE клетки с анти-RAGE-антителами для блокирования RAGE. антитела против RAGE полностью блокируют усиленную генерацию ROS AGE-BSA (рисунок 4 C), что указывает на существенность взаимодействия AGE-BSA-RAGE в этом процессе.

NADPH-оксидаза переносит электроны из NADPH на молекулярный кислород и производит внутриклеточный ROS [53]. Чтобы дополнительно исследовать механизмы, лежащие в основе индукции внутриклеточного образования ROS AGE-BSA, мы исследовали влияние AGE-BSA на активность оксидазы NADPH. Наши данные показали, что воздействие HUCL на AGE-BSA индуцировало зависящее от времени увеличение активности оксидазы НАДФН (рис. 5А). p47phox является ключевыми цитозольными регуляторными субъединицами NADPH-оксидазы [54]. Фосфорилирование p47фокса требуется для активации индуцированной AGE-BSA оксидазы NADPH и получения ROS. Кроме того, мы показали, что уровни p-p47-фокса были значительно увеличены в HUCL за 1 ч после лечения AGE-BSA (рис. 5 B), что подтверждает активацию NADPH-оксидазы в AGU-BSA-запускаемых HUCL.

Было также обнаружено, что HUCL были предварительно обработаны ингибиторами NADPH-оксидазы (DPI или апоцинином), значительно подавляли экспрессию белка и апоптоза молекулы Bax-протеина, индуцированного AGE-BSA (фиг. 6). Более того, предварительная обработка HUCL с акцептором ROS NAC значительно ингибировала апоптоз, вызванный AGE-BSA. Эти результаты показывают, что внутриклеточная генерация ROS через оксидазу NADPH была необходима для апоптоза, индуцированного AGE-BSA, в HUCL. Кроме того, апоптоз HUCLs, индуцированный AGE-BSA, может быть блокирован анти-RAGE антителами, что указывает на то, что апостеоз, индуцируемый AGE-BSA, в основном опосредуется RAGE.

JNK и p38 MAPK сильно реагируют на различные сигналы стресса и участвуют в опосредовании апоптотических ответов [55]. Сообщалось, что AGE индуцируют апоптоз остеобластов через JNK и p38 MAPK [32]. AGE стимулировали апоптоз фибробластов через JNK и p38 MAPK [31]. Исходя из этих предыдущих данных, мы предположили, что апоптоз, индуцированный AGE-BSA, включает в себя пути JNK и p38 MAPK. Наши данные показали, что HUCL стимулируются AGE-BSA индуцированной активацией JNK и p38 MAPK (рис. 7). Предварительная обработка HUCL с JNK и специфическими ингибиторами p38 MAPK (SP600125 или SB203580) почти блокировала экспрессию белка Bax (рисунок 8 A) и апоптоз (рисунок 8 B), индуцированный AGE-BSA. Эти результаты показывают, что JNK и p38 MAPK были связаны с апоптозом, индуцированным AGE-BSA, в HUCL. ROS являются известными медиаторами внутриклеточных сигнальных каскадов [56]. Мы также обнаружили, что присутствие NAC ингибирует активацию JNK (рис. 8 C) и p38 MAPK (рис. 8 D). Эти данные свидетельствуют о том, что внутриклеточная генерация ROS предшествует активации JNK и p38 MAPK после стимуляции AGE-BSA. В соответствии с этим находкой предыдущее исследование показало, что NAC почти ликвидировал активацию JNK и p38 MAPK в клетках SW620, индуцированных берберином [57].

Таким образом, настоящее исследование продемонстрировало, что взаимодействие AGE-BSA-RAGE индуцирует NADPH-оксидаза-зависимую внутриклеточную ROS-генерацию, что приводит к активации путей JNK и p38 MAPK, что в конечном итоге привело к апоптозу в HUCL. Учитывая, что апоптоз эпителиальных клеток роговицы может способствовать патологиям, связанным с диабетической кератопатией, понимание эффектов и механизмов ВОЗРАСТОВ на апоптозе эпителиальных клеток роговицы может обеспечить терапевтические цели, которые в конечном итоге являются клиническими.

Мы благодарим профессора Фу-шин X Ю в Университете штата Уэйн за клеточные линии. Мы благодарим доктора Эдварда К. Миньо в Университете Шаньдуна за лингвистические консультации.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *