Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

β-клеточные метаболические изменения при хронической перегрузке питательных веществ в крысах и крысах человека

β-cell metabolic alterations under chronic nutrient overload in rat and human islets
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3605166/

Целью этого исследования было оценить мультифакториальные реакции β-клеток на метаболические нарушения в первичном крысе и островках человека. Обработка рассеянных клеток островков крысы с повышенной глюкозой и свободными жирными кислотами (FFAs, олеат: пальмитат = 1: 1 об. / Об.) Приводила к увеличению размера и количества липидных капель в β-клетках в течение времени и концентрации, зависимым образом. Глюкоза и FFAs синергически стимулировали мишень млекопитающих с датчиком питательных веществ рапамицинового комплекса 1 (mTORC1). Мощный ингибитор mTORC1, рапамицин (25 нМ), значительно уменьшал накопление триглицеридов в островках крыс. Важно отметить, что липидные капли накапливаются только в β-клетках, но не в α-клетках в зависимости от mTORC1. Питательная активация mTORC1 повышала экспрессию белка, связанного с дифференциацией жировой ткани (ADRP), который, как известно, стабилизирует капли липидов. Размер островков крыс и новый синтез ДНК также увеличивались при перегрузке питательных веществ. Секреция инсулина в культуральную среду неуклонно возрастала в течение 4-дневного периода без какой-либо существенной разницы между самой глюкозой (10 мМ) и комбинацией глюкозы (10 мМ) и FFA (240 мкМ). Однако содержание инсулина и биосинтеза инсулина были значительно уменьшены при сочетании питательных веществ по сравнению с только глюкозой. Повышенные питательные вещества также стимулировали образование капель липидов в островках человека в зависимости от mTORC1. Однако, в отличие от островков крыс, человеческие островки не увеличивались в размерах при перегрузке питательных веществ, несмотря на нормальный ответ на питательные вещества при высвобождении инсулина. Различные реакции роста островковых клеток при перегрузке питательных веществ, по-видимому, влияют на биосинтез инсулина и хранение по-разному на крысах и крысах человека.

Сахарный диабет 2 типа (T2DM) характеризуется резистентностью к инсулину и дефектами функции β-клеток, роста и выживаемости. Хроническая перегрузка питательных веществ, связанная с ожирением, связана как с резистентностью к инсулину, так и с дефектами β-клеток. Адаптивные ответы β-клеток в условиях резистентности к инсулину и перегрузки питательных веществ, включая накопление липидов и расширение массы β-клеток, широко наблюдались в различных экспериментальных моделях.1-5 Однако специфические молекулярные механизмы, с помощью которых питательные вещества способствуют накоплению липидов и расширение β-клеточной массы и причинно-следственная связь между этими адаптивными ответами и дефектами β-клеток четко не поняты. Более того, метаболические и морфологические изменения островков человека при перегрузке питательных веществ плохо изучены, несмотря на их потенциальное влияние на понимание этиологии T2DM.

Хранение ТГ в липидных каплях требует стимуляции двух путей: биосинтеза ТГ через путь этерификации6 и экспрессию липидных капель, связанных с белками, которые стабилизируют липидные капли, предотвращая липолиз. Липидные капли содержат нейтральные липиды (ТГ, сложный эфир холестерина) в сердцевине, окруженный монослоем фосфолипидов и оболочкой специфических белков.7 Эти белки, связанные с липидными каплями, обозначены как белки PAT [белки перилипина, адипофилина / жировой дифференцировки ( ADRP), TIP47 и другие родственные белки], которые играют структурную и функциональную роль в метаболизме клеточного липида.8 Как перилипин, так и ADRP были обнаружены в крысах и человеческих островках.9,10

Расширение массы β-клеток наблюдалось у генетически модифицированных тучных грызунов, 4,11 нормальных мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров5,12, и мышей, которым вводили повышенные уровни глюкозы или FFA 13,14. Увеличение массы β-клеток связанный с резистентностью к инсулину и перегрузкой питательных веществ, широко признан для корреляции с гиперсекрецией инсулина, обеспечивая компенсационный механизм для преодоления резистентности к инсулину. Однако недавние данные о том, что увеличение массы β-клеток в таких условиях, как хроническая диета с высоким содержанием жиров или 60% панкреатэктомии, не были связаны с соответствующим улучшением β-клеточной функции12,15-17, показывают, что увеличение массы β-клеток не всегда коррелирует с усиленной β-клеточной функцией. Поэтому причинно-следственная связь между расширением массы β-клеток и функцией β-клеток при перегрузке питательных веществ еще предстоит выяснить.

При хронической перегрузке питательных веществ β-клетки грызунов испытывают характерные метаболические адаптации, включая накопление липидов и расширение массы β-клеток. Мы предлагаем, чтобы млекопитающая мишень рапамицинового комплекса 1 (mTORC1), консервативная серин / треонинкиназа, которая функционирует в качестве питательного датчика, является распространенным медиатором, который регулирует оба ответа. Известно, что mTORC1 объединяет сигналы от факторов роста и питательных веществ, чтобы регулировать трансляцию белка, синтез ДНК, размер клеток и пролиферацию.18-23. Две видные нижестоящие мишени mTORC1 представляют собой рибосомальный белок S6K1 на 70 кДа (S6K1) и фактор инициации эукариот 4E-связывающий белок 1 (4EBP1), который регулирует трансляцию белка.20,24. Сигнальный путь mTORC1 был замечен как связь между избытком питательных веществ и развитием как ожирения, так и резистентности к инсулину25. Недавние данные показывают, что сигнализация mTORC1 также участвующих в регенеративных процессах β-клеток. 27-30 Кроме того, в настоящем исследовании предполагается, что mTORC1 играет ключевую роль в накоплении липидов в β-клетках.

Сохранение функции β-клеток и массы при хронической перегрузке питательных веществ представляет большой интерес как потенциальная стратегия терапевтического вмешательства для диабета типа 2. С этой целью мы изучили комплексные метаболические реакции β-клеток на перегрузку питательных веществ в крысах и островках человека с использованием комбинации микроскопии и биохимических методов. Сообщаем, что mTORC1 играет центральную роль в накоплении липидов, а также в расширении островковых клеток крыс, что, в свою очередь, связано с β-клеточными дефектами. Островки человека и крысы показали сходное накопление эктопических липидов и высвобождение инсулина в ответ на перегрузку питательных веществ. Однако, в отличие от островков крыс, человеческие островки не увеличивались в размерах при перегрузке питательных веществ, предполагая, что активация, опосредованная питательными веществами, mTORC1 сама по себе недостаточна для стимуляции роста островковых клеток человека. Отсутствие расширения островковых клеток при перегрузке питательных веществ, по-видимому, оказывает существенное влияние на биосинтез инсулина и его хранение в островках человека.

Липидное образование капель в рассредоточенных клетках островков крысы, обработанных 25 мМ глюкозой и 500 мкМ FFA (олеат: пальмитат = 1: 1 об. / Об.), Контролировали путем захвата цифровых изображений фазового контраста с интервалом 30 минут в течение 40 часов с использованием объектива 20 ×. На рисунке 1 показано, что липидные капли появляются через ~ 15 ч и увеличиваются по размеру и количеству в течение 40 часов. Со временем первоначально круглые островковые клетки стали более уплощенными и, как представляется, образовывали агрегаты. Затем мы количественно определяли капли липидов в кластерах (<5 клеток) β-клеток одной крысы путем локализации инсулина и красного нила, индикатора содержания ТГ. На фигуре 2А показан временной ход образования липидных капель в β-клетках, обработанных 25 мМ глюкозой и 500 мкМ FFA. Липидные капли были обнаружены через 1 день и неуклонно возрастали в течение 4 дней. На рисунке 2B показано количественное определение средней интенсивности красных нилей для ~ 80 кластеров β-клеток на состояние. На рисунках 2C и D показана доза-реакция глюкозы и FFAs формирования липидной капли в β-клетках через 4 дня. Базальная (5,6 мМ) или умеренно повышенная (10 мМ) глюкоза сама по себе не приводила к образованию липидных капель, тогда как высокая (25 мМ) глюкоза приводила к небольшому увеличению образования липидных капель. Увеличение концентрации FFA (240, 500 мкМ) в сочетании с базальной глюкозой (5,6 мМ) показало увеличение образования капель липидов, но на низком уровне. Комбинация повышенной глюкозы и FFA заметно увеличивала образование липидных капель дозозависимым образом с максимальным эффектом при 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA.

Рисунок 1. Исследования временного интервала мониторинга липидного образования капель в рассеянных островковых клетках. Фазовые контрастные цифровые изображения рассеянных островковых клеток, обработанных 25 мМ глюкозой и 500 мкМ FFA (олеат: пальмитат = 1: 1v / v), были получены с 30-минутными интервалами в течение 40 часов с использованием объектива 20 ×. Отображаются типичные изображения в указанное время (h). Увеличенное изображение, обозначенное белой стрелкой (крайняя правая панель), демонстрирует, что липидные капли были одинаковыми по размеру. Изображения были перемасштабированы с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.

Рисунок 2. (A) Временной ход образования липидных капель в диспергированных β-клетках крысы. Дисперсные клетки островков крысы (105) обрабатывали в течение указанных периодов времени 25 мМ глюкозы и 500 мкМ FFA. После обработки клетки обрабатывали для иммуноокрашивания. Показаны инсулин (красный), ядра (синий) и краска Nile red (зеленый). (B) Гистограмма показывает среднюю интенсивность красного нила для всего ~ 80 кластеров инсулиноположительных клеток за точку времени из трех независимых экспериментов. (C) Дозозависимые эффекты глюкозы и FFAs на формирование липидных капель. Дисперсные клетки островков крысы (105) обрабатывали в течение 4 дней, как указано. После обработки клетки обрабатывали для иммуноокрашивания. Показаны инсулин (красный), ядра (синий) и краска Nile red (зеленый). 5.6G и 240FFA обозначают 5,6 мМ глюкозы и 240 мкМ FFAs соответственно. (D) Гистограмма показывает среднюю интенсивность красного нила в общей сложности ~ 80 кластеров инсулиноположительных клеток на состояние из трех независимых экспериментов.

Роль mTORC1 в формировании липидных капель изучалась путем определения влияния питательных веществ и рапамицина (специфического и мощного ингибитора mTORC1) на фосфорилирование S6 (индикатор активации mTORC1). Мы определили отношение уровней p-S6 к β-актину для нормализации изменений уровня белка, вызванных различными условиями обработки питательных веществ. Для этих экспериментов мы использовали умеренно повышенную концентрацию питательных веществ для изучения синергических действий глюкозы и FFA. Рисунок 3 показывает, что островки крыс, обработанные 10 мМ глюкозой (дорожка 1), показали низкие уровни активации mTORC1, тогда как островки, обработанные 240 мкМ FFAs в присутствии 5,6 мМ глюкозы (дорожка 5), не обнаруживали никакой обнаруживаемой активации mTORC1. Островки, обработанные комбинацией 10 мМ глюкозы и 240 мкМ FFAs (дорожка 3), показали ~ 3-кратное увеличение фосфорилирования S6, что указывает на синергический эффект глюкозы и FFA на активацию mTORC1. Рапамицин полностью блокировал фосфорилирование S6 при любых условиях. На фиг. 4А показано, что обработка интактных островков с 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA в течение 4 дней вызывала значительное увеличение содержания ТС островков по сравнению с обработкой только 5,6 мМ глюкозы, а рапамицин значительно блокировал накопление ТГ на 30%. Также были определены эффекты рапамицина на образование капель липидов в β- и α-клетках, подвергнутых воздействию избыточных питательных веществ в течение 4 дней. Рисунок 4B показывает, что инсулин-положительные β-клетки, обработанные 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA (панель b), содержали многочисленные липидные капли (зеленые), тогда как контроль (только 5,6 мМ глюкозы, панель a) или состояние, обработанное рапамицином (панель c) лишен липидных капель. Панели d, e и f показывают, что глюкагоноположительные α-клетки не содержат липидных капель независимо от условий эксперимента. На рисунке 4C показано количественное определение средней интенсивности красных нилей ~ 80 β- или α-клеток / условий, показанных на приведенных выше панелях. Затем мы изучили опосредованное питательными веществами образование липидов в интактных остриях крыс путем иммуногистохимии замороженных участков островков. Островка, обработанная 25 мМ глюкозой + 500 мкМ FFAs в течение 4 дней (фиг.5А, панель g), приводила к образованию липидных капель по сравнению с контрольным островком (панель c). Рапамицин значительно блокировал опосредованное питательными веществами образование липидных капель (панель k). Сравнение ядерного окрашивания (DAPI) двух островков (панели b и f) указывает на то, что перегрузка питательных веществ вызывала расширение островковых клеток, как показано большим расстоянием между ядрами в панели f по сравнению с панелью b. Рапамицин, как и предполагалось, полностью блокировал расширение клеток островковых клеток, обусловленное питательными веществами, показанное более компактными кластерами ядер (панель j). Содержание инсулина значительно уменьшалось при условии избытка питательных веществ, и рапамицин не мешал этому сокращению (сравните панели a, e и i). На фиг.5В показано количественное определение содержания инсулина и накопления липидов, определяемое средней интенсивностью инсулина и красным нилом трех условий.

Рисунок 3. Активация mTORC1 опосредованной питательными веществами. Крысы островков (100) обрабатывали в течение 4 дней, как указано. Образцы обрабатывали для Вестерн-блоттинга для фосфорилированного S6, лишали и реблоктировали для β-актина. Интенсивность полос была определена Biorad ChemiDoc XRS Image Lab Software. Отношение p-S6 / β-актина было получено, как описано в разделе «Методы». Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов.

Рисунок 4. (A) mTORC1-зависимое накопление TG. Крысы островков (150) культивировали в течение 4 дней, как указано. После обработки проводили липидную экстракцию хлороформом: метанолом и количественно определяли ТГ. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов с дублирующимися образцами в каждом эксперименте. (B) mTORC1 опосредует образование липидных капель исключительно в β-клетках, щадящих α-клетках. Дисперсные клетки островков крысы (105) культивировали в течение 4 дней в cCMRL-1066, содержащем 5,6 мМ глюкозы, 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA или 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA + 25 нМ рамаццина. После обработки клетки обрабатывали для иммуноокрашивания. Представительные изображения β-клеток (панели a, b и c) и α-клеток (панели d, e и f) в трех условиях [инсулин и глюкагон (красный), ядра (синий) и окрашивание краской Нила (зеленый) ]. (C) Гистограмма показывает среднюю интенсивность красного нила в общей сложности ~ 50 β- или α-клеток на каждое состояние из трех независимых экспериментов.

Рисунок 5. (A) Крышки островков (50) культивировали в течение 4 дней в cCMRL, содержащем 5,6 мМ глюкозы, 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA или 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA + 25 нМ рапамицина. Замороженные участки (5 мкм) островков обрабатывали для иммуноокрашивания [инсулин (зеленый), ядра (синий) и красный ниль (красный)], как описано в разделе «Методы». Изображения были перемасштабированы с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop. (B) Гистограмма показывает средние интенсивности красного нила для накопления липидов и DyLight 647 для инсулина, соответственно, 15-20 участков островка на каждое состояние из трех разных экспериментов.

Затем мы определили экспрессию ADRP, опосредованную питательными веществами, в островках (100 островков на состояние), определяя отношение ADRP к внутреннему контрольному β-актину, чтобы объяснить изменение уровней белка в разных экспериментальных условиях. На рисунке 6А показано, что экспрессия ADRP возрастает дозозависимым образом с перегрузкой питательных веществ. На фиг.6В показано, что активация активированного mTORC1 экспрессии ADRP в крысах. Обработка островков только 25 мМ глюкозы (дорожка 2) привела к увеличению двукратного увеличения экспрессии ADRP по сравнению с 5,6 мМ глюкозой (дорожка 1). Комбинация 25 мМ глюкозы и 500 мкМ FFA (дорожка 4) приводила к увеличению в 3 раза экспрессии ADRP по сравнению с 5,6 мМ глюкозы. Лечение рапамицином (дорожки 3 и 5) не позволяло опосредованному питательными веществами увеличению экспрессии ADRP. Иммуногистохимические исследования показали, что ADRP (красный) был локализован с липидными каплями, что показано появлением ADRP вокруг небольших различных сфер в цитозоле (фиг.6C, панель b). На рисунке 6C также показано, что рапамицин ингибировал образование липидных капель, опосредованных питательными веществами, а также расширение β-клеток (сравните панель c с панелью b). Кроме того, содержание инсулина (интенсивность зеленого) было значительно снижено путем обработки 25 мМ глюкозы и 500 мкМ FFA (сравните панель a с панелью b), и рапамицин не изменил этот эффект. На рисунке 6D показано количественное определение средней ADRP и интенсивности инсулина в ~ 90 β-клетках / состоянии из 3 независимых экспериментов.

Рисунок 6. (A) Дозозависимые эффекты питательных веществ на экспрессию ADRP. Крышки островков (100) культивировали в течение 4 дней в cCMRL-1066, содержащем 5,6 мМ глюкозы, 10 мМ глюкозы + 240 мкМ FFA или 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA. Образцы обрабатывали для Вестерн-блоттинга и определяли путем денситометрии. β-актин использовали в качестве контроля загрузки белка. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. (B) Глюкоза и FFAs синергируют в увеличении mRORC1-опосредованной экспрессии ADRP. Крышки островков (100) культивировали в течение 4 дней в cCMRL-1066 в различных условиях, как указано. Образцы обрабатывали для вестерн-блоттинга и определяли путем денситометрии. β-актин использовали в качестве контроля загрузки белка. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. (C) экспрессию ADRP и содержание инсулина в отдельных β-клетках, определенных иммуногистохимией. Дисперсные клетки островков крысы (105) культивировали в течение 4 дней в cCMRL-1066, содержащем 5,6 мМ глюкозы, 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA или 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA + 25 нМ рамаццина. После обработки клетки обрабатывали для иммуноокрашивания. Показаны типичные изображения β-клеток в трех условиях [инсулин (зеленый), ядра (синий) и ADRP (красный)]. (D) Гистограмма показывает средние интенсивности DyLight 647 для инсулина и Dylight 488 для ADRP, соответственно, всего ~ 80 β-клеток на состояние из трех независимых экспериментов.

На рисунке 7А показано, что островки, выставленные в течение 4 дней до 25 мМ глюкозы и 500 мкМ FFA (2-й черный стержень), показали значительное увеличение размера островков по сравнению с теми, у которых уровень сахара в пределах 5,6 мМ (1-й черный бар) или 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFAs + 25 нМ ратамцин (3-я черная полоса). Следует отметить, что островки, инкубированные с 5,6 мМ глюкозой, показали значительное уменьшение размера после 4 дней инкубации. Распространение островковых клеток, опосредованное питательными веществами, также изучалось с помощью иммуногистохимии секций замороженных островков. Мы наблюдали, что актиновые филаменты были высоко обогащены вдоль плазматической мембраны первичных островковых клеток, что позволило визуально оценить размер клеток внутри островков путем окрашивания фаллоидином Alexa 488, связывающего токсин с высоким аффинностью актина, помеченного флуоресцентным зондом Alexa 488. Островка обработанный 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFAs в течение 4 дней (фиг.7C, панель g), приводило к общему увеличению размера внутри островковых клеток по сравнению с контрольным островом (панель c), показанным увеличенными черными областями, окруженными зеленым актином окрашивание. Сравнение ядерного окрашивания (DAPI) двух островковых сечений (панели b и f) показало, что увеличение размера островков, вызванное избыточными питательными веществами, было в основном связано с гипертрофией, а не с гиперплазией, поскольку число ядер значительно не увеличивалось, и поскольку ядра были гораздо дальше друг от друга на панели f по сравнению с панелью b. Рапамицин блокировал увеличение размера внутриэлементных клеток, вызванное избытком питательных веществ, как показано на панелях j и k. Количественное определение размеров внутриэлементных ячеек в разных условиях показано на рисунке 7D. Содержание инсулина было значительно снижено при условии избытка питательных веществ, и рапамицин не предотвращал это снижение (сравните панели a, e и i), что соответствует рисункам 5A и 6D. Затем мы изучали, что избыточные питательные вещества также стимулируют пролиферацию островковых клеток путем измерения нового синтеза ДНК, как указано в [3H] тимидиновом включении. Для этих экспериментов мы использовали умеренно повышенную концентрацию питательных веществ для изучения синергических действий глюкозы и FFA и коррелировали с активностью mTORC1 (рис.3) и исследованиями высвобождения инсулина (рис.8А). Обработка островков с FFA (240 мкМ) в присутствии 5,6 мМ глюкозы (фиг.7В, 7-й бар) привела к 2-кратному увеличению включения [3H] тимидина по сравнению с 5,6 мМ глюкозы в одиночку (фиг.7В, 1-й бар), тогда как только 10 мМ глюкозы не показали значительного увеличения. Комбинация 10 мМ глюкозы и 240 мкМ FFAs приводила к синергетическому увеличению включения [3H] тимидина (фиг.7В, 5 бар) чувствительным к рапамицину образом.

Рисунок 7. (A) mTORC1-зависимое увеличение размера островков крыс при перегрузке питательных веществ. Фазовые контрастные изображения островков крыс (40) до и после 4-дневного периода инкубации при различных условиях, как указано, были получены с использованием объектива 20 ×. Диаметр каждого островка вычисляли путем преобразования пикселей в мкм с использованием программного обеспечения для анализа изображений Metamorph. Белая и черная полосы указывают размеры островков до и после лечения, соответственно. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. (B) mTORC1-зависимый новый синтез ДНК в крысах крыс при перегрузке питательных веществ. Крышки островков (100) культивировали в течение 4 дней в различных условиях, как указано. [3H] тимидин добавляли к каждому блюду за 24 часа до конца или 4-дневного периода. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. dpm, дезинтеграции в минуту. (C) Расширение островковых клеток при перегрузке питательных веществ, определяемой иммуногистохимией. Островки крыс (50) культивировали в течение 4 дней в cCMRL, содержащем 5,6 мМ глюкозы, 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA или 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA + 25 нМ рапамицина. Замороженные участки (10 мкм) островков обрабатывали для иммуноокрашивания (инсулин [красный], ядра [синий] и фаллоидин [зеленый]). Изображения были перемасштабированы с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop. (D) Гистограмма показывает среднюю площадь клеток внутри островки, определенную с использованием программного обеспечения для анализа изображений Metamorph. Данные представляют собой средства ± SEM из ~ 250 клеток, полученные из 10-15 участков прохода на состояние.

Рисунок 8. (A) Выделение инсулина в культуральную среду при перегрузке питательных веществ. Островки (35) культивировали в 2 мл cCMRL, содержащем 10 мМ глюкозы или 240 мкМ FFA, отдельно или в комбинации в отсутствие и присутствии 25 нМ рапамицина. Культуральную среду (50 мкл) удаляли в указанные моменты времени и количество инсулина, высвобождаемого в культуральную среду, определяли радиоиммуноанализом. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. (B) Содержание инсулина в островках после 4-дневного лечения при перегрузке питательных веществ. После обработки островки промывали и ресуспендировали в 500 мкл 0,1% BSA в PBS, после чего обрабатывали ультразвуком с помощью микротипового зонда. Содержание инсулина определяли с помощью радиоиммунологического анализа. Данные представляют собой средства ± SEM из n = 3 экспериментов с тройными образцами в каждом эксперименте. (C) Уровни про-инсулина в островках после 4-дневного лечения при перегрузке питательных веществ. После обработки островки промывали и ресуспендировали в 200 мкл 0,1% BSA в PBS, после чего обрабатывали ультразвуком с помощью микротипного зонда. Уровни про-инсулина определяли, как описано в разделе «Методы». Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов.

Затем мы определили высвобождение инсулина в среду при умеренно повышенных питательных веществах в течение 4-дневного периода. На рисунке 8А показано, что высвобождение инсулина в среду устойчиво возрастает при любых условиях. Островки, подвергшиеся воздействию комбинации 10 мМ глюкозы и 240 мкМ FFAs, показали значительно более высокие уровни высвобождения инсулина, чем те, которые были установлены до 10 мМ глюкозы в течение 5 и 24 часов, но эта разница была незначительной после 4-дневной инкубации. Наблюдалось значительно более низкое высвобождение инсулина под 5,6 мМ глюкозы и 240 мкМ FFA. Рапамицин не оказывал существенного влияния на высвобождение инсулина в среду в любых условиях. На фиг.8В показано содержание инсулина после 4-го инкубационного периода. Несмотря на то, что не было существенной разницы в высвобождении инсулина в среду под 10 мМ глюкозы и 10 мМ глюкозы + 240 мкМ FFA, содержание инсулина было значительно снижено при условии комбинации глюкозы и FFA (фиг.8В, 3 бар) по сравнению с 10 мМ глюкозы (фиг.8В, 1-й бар). Высокий уровень содержания инсулина под 5,6 мМ глюкозы и 240 мкМ ФФА соответствовал низкому уровню высвобождения инсулина в течение 4-дневного периода инкубации. Чтобы проверить, уменьшает ли биосинтез инсулина снижение содержания инсулина в островках, обработанных 10 мМ глюкозы + 240 мкМ FFA, мы определили уровни про-инсулина в островки как индикатор биосинтеза инсулина после 4-й инкубации. На рисунке 8C показано, что уровни про-инсулина в островках, обработанных 10 мМ глюкозы + 240 мкМ FFAs, были значительно ниже, чем у островков, обработанных только 10 мМ глюкозы. Обработка рапамицином снижала уровень про-инсулина ниже уровней островки, обработанных комбинацией двух питательных веществ.

Мы исследовали метаболические и морфологические изменения островков человека при перегрузке питательных веществ с использованием аналогичных подходов к исследованиям островков крысы. На фигуре 9А показано зависящее от времени накопление липидов в течение 4-дневного периода инкубации в диспергированных β-клетках человека при перегрузке питательных веществ. На фиг.9В показано, что 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFAs (дорожка 2) стимулировали активацию mTORC1, указанную фосфорилированием S6, по сравнению с 5,6 мМ глюкозы в одиночку (дорожка 1). Рапамицин полностью блокировал этот эффект. Затем мы изучили опосредованное питательными веществами образование липидов в остриях человека путем иммуногистохимии замороженных островковых участков. Островки, обработанные 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFAs в течение 4 дней (фиг.9C, панель g), приводили к образованию липидных капель по сравнению с контрольными островками (панель c). Рапамицин значительно блокировал опосредованное питательными веществами образование липидных капель (панель k). Сравнение ядерного окрашивания (DAPI) островков в двух условиях (панели b и f) указывает на то, что перегрузка питательных веществ не вызывает расширение островковых клеток. Содержание инсулина значительно уменьшалось в условиях избытка питательных веществ, и рапамицин не мешал этому сокращению (сравните панели a, e и i). На рисунке 9D показано количественное определение содержания инсулина и накопления липидов, определяемое средней интенсивностью инсулина и красным нилом трех условий. На фиг.10А показано, что обработка островков человека 25 мМ глюкозы и 500 мкМ FFA в течение 4 дней не увеличивала размер островков, что соответствовало результатам, показанным на фиг. 9С. Хотя на рис. 9C может быть не очевидно, рапамицин слегка уменьшил размер островков человека после 4-дневного лечения. На фиг.10В показано, что высвобождение инсулина в среду под 10 мМ глюкозы или 10 мМ глюкозы + 240 мкМ FFAs увеличивалось в течение первых 24 часов воздействия, затем плато. С другой стороны, высвобождение инсулина под 5,6 мМ глюкозы + 240 мкМ FFAs неуклонно возрастало в течение 4-дневного периода инкубации, но на значительно более низких уровнях. На рисунке 10C показано содержание инсулина в островках человека после 4-дневной инкубации. Содержание инсулина в островках, обработанных 10 мМ глюкозой или 10 мМ глюкозы + 240 мкМ FFAs, было примерно в 5 раз ниже, чем в островках, обработанных 5,6 мМ глюкозы + 240 мкМ FFA. В отличие от крыс островки, не было существенной разницы в содержании инсулина в человеческих островках, обработанных 10 мМ глюкозой и 10 мМ глюкозы + 240 мкМ ФФА. На рисунке 10D показаны уровни про-инсулина в указанных условиях. Не было различий в уровнях про-инсулина в островках, обработанных 10 мМ глюкозой и 10 мМ глюкозы + 240 мкМ ФФА. Эти результаты не согласуются с различием содержания инсулина в двух условиях. Как и в островках крыс, рапамицин уменьшал уровни про-инсулина ниже уровней островки, обработанных повышенным содержанием питательных веществ.

Рисунок 9. (A) Временной ход образования липидных капель в диспергированных β-клетках человека. Дисперсированные клетки островков человека (105) обрабатывали в течение указанных периодов времени 25 мМ глюкозы и 500 мкМ FFA. После обработки клетки обрабатывали для иммуноокрашивания. Показана средняя интенсивность красного нила в общей сложности ~ 80 кластеров инсулиноположительных клеток в момент времени из трех независимых экспериментов. (B) Активация mTORC1 опосредованной питательными веществами. Осколки человека (100) обрабатывали в течение 4 дней, как указано. Образцы обрабатывали для Вестерн-блоттинга и определяли путем денситометрии. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. (C) Человеческие островки (50) культивировали в течение 4 дней в cCMRL, содержащем 5,6 мМ глюкозы, 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA или 25 мМ глюкозы + 500 мкМ FFA + 25 нМ рапамицина. Замороженные участки (10 мкм) островков были обработаны для иммуноокрашивания [инсулин (зеленый), ядра (синий) и красный ниль (красный)]. Изображения были перемасштабированы с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop. (D) Гистограмма показывает средние интенсивности красного нила для накопления липидов и DyLight 647 для инсулина соответственно 15-20 участков островка на состояние из трех разных экспериментов.

Рисунок 10. (A) Отсутствие роста островковых клеток человека при перегрузке питательных веществ. Фазовые контрастные изображения островки человека (40) до и после 4-дневного периода инкубации при различных условиях, как указано, были получены с использованием объектива 20 ×. Диаметр каждого островка вычисляли путем преобразования пикселей в мкм с использованием программного обеспечения для анализа изображений Metamorph. Белая и черная полосы указывают размеры островков до и после лечения, соответственно. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. (B) Выделение инсулина в культуральную среду при перегрузке питательных веществ. Островки человека (30) культивировали в 2 мл cCMRL, содержащем 10 мМ глюкозы или 240 мкМ FFAs отдельно или в комбинации двух питательных веществ. Культуральную среду (50 мкл) удаляли в указанные моменты времени и количество инсулина, высвобождаемого в культуральную среду, определяли радиоиммуноанализом. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов. (C) Содержание инсулина в островках человека после 4-дневного лечения при перегрузке питательных веществ. После обработки островки промывали и ресуспендировали в 500 мкл 0,1% BSA в PBS, после чего обрабатывали ультразвуком с помощью микротипового зонда. Содержание инсулина определяли с помощью радиоиммунологического анализа. Данные представляют собой средства ± SEM из n = 3 экспериментов с тройными образцами в каждом эксперименте. (D) Уровни про-инсулина в островки после 4-дневного лечения при перегрузке питательных веществ. После обработки островки промывали и ресуспендировали в 200 мкл 0,1% BSA в PBS, после чего обрабатывали ультразвуком с помощью микротипного зонда. Уровни про-инсулина определяли, как описано в разделе «Методы». Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов.

Используя комбинацию микроскопии и биохимических методов, мы изучили метаболические и морфологические изменения β-клеток при перегрузке питательных веществ в крысах и крысах человека. Значительный вывод этого исследования заключается в том, что питательный датчик mTORC1 играет центральную роль в формировании липидных капель и расширении островковых клеток в островках крыс. Питательная активация mTORC1 сыграла ключевую роль в формировании липидных капель в β-клетках крысы путем повышения активности экспрессии ADRP, которая, как известно, стабилизирует капли липидов. Важно отметить, что образование капелек липидов наблюдалось только в β-клетках, но не в α-клетках. Островки, обработанные комбинацией глюкозы и FFAs, показали значительное снижение биосинтеза и содержания инсулина по сравнению с островками, обработанными только глюкозой, несмотря на аналогичные уровни высвобождения инсулина в культуральную среду. В отличие от островков крыс, островки людей не демонстрировали экспансии островковых клеток при перегрузке питательных веществ, несмотря на их сходные метаболические реакции на перегрузку питательных веществ в процессе образования липидных капель и высвобождение инсулина. В целом, это исследование показывает, что адаптивные реакции β-клеток на метаболическое возмущение, накопление липидов и расширение островковых клеток (в случае островков грызунов) связаны с β-клеточной дисфункцией, а не с компенсационным усилением β-клеточной функции.

В этом исследовании мы предоставляем количественные данные о формировании капелек липидов в зависимости от времени и дозы в первичных крысиных β-клетках в ответ на хроническую перегрузку питательных веществ. Насколько нам известно, это первое углубленное исследование зависимого от времени образования липидных капель в первичных β-клетках с использованием фотомикроскопии и иммуногистохимического подхода. Интригующе, что образование липидных капель происходило исключительно в β-клетках в зависимости от mTORC1. Селективные потери β-клеток, но расширение α-клеток были связаны с T2DM, 31,32, предполагая, что α- и β-клетки по-разному реагируют на локальные среды, такие как избыточные питательные вещества. Механизмы, ответственные за щадящие α-клетки от воздействия избыточных питательных веществ, неизвестны. По сравнению с β-клетками α-клетки могут экспрессировать восстановленные транспортеры FFA, подвергаться β-окислению с более высокой скоростью или отсутствовать ферменты, которые необходимы для биогенеза липидных капелек. На фиг.5А (панель g) показаны липидные капли на периферии островка. Однако они не локализованы в α-клетках, потому что в этих условиях возмущенная архитектура островков возмущена, что приводит к перемещению α-клеток в центр островка (данные не показаны).

Специфические молекулярные механизмы, связанные с опосредованным питательными веществами эктопическим накоплением липидов в β-клетках, не были четко поняты. Наше исследование демонстрирует, что mTORC1 играет ключевую роль в формировании липидных капель в β-клетках крысы и человека поджелудочной железы. В поддержку важной роли mTORC1 в этом процессе специфическое накопление липидных капель в β-клетках было значительно блокировано рапамицином. Кроме того, повышенная глюкоза в сочетании с активированной FFA активацией mTORC1 на основе фосфорилирования S6 способом, который отражает степень увеличения экспрессии ADRP и накопления липидных капель в β-клетках. Таким образом, оказывается, что mTORC1, питательный датчик, играет роль в хранении избыточных питательных веществ в виде нейтрального липидного TG внутри липидных капель в β-клетке путем усиления экспрессии ADRP, который стабилизирует капли липидов. De novo синтез TG также должен быть повышен при перегрузке питательных веществ через стимуляцию пути этерификации. Интересно отметить, что подавление экспрессии ADRP рапамицином было достаточно для снижения уровня TG в β-клетке. Рассматривается ли дестабилизация липидных капель недостаточным количеством ADRP, что облегчает липолиз TG на промежуточные виды липидов, такие как диацилглицерины, лизофосфатидная кислота и т. Д. Если эта гипотеза верна, предполагается, что рапамицин вызывает токсические эффекты, а не сохраняет β-клеточную функцию, хотя он блокирует образование капель липидов. Наши данные, свидетельствующие о том, что рапамицин не сохраняют содержание инсулина при перегрузке питательных веществ, подтверждают эту гипотезу.

Каузальная связь между накоплением липидов и функцией β-клеток является сложной. Многочисленные исследования in vitro33-36 показали, что насыщенный FFA пальмитат является высокотоксичным, тогда как мононенасыщенный олеат FFA — нет. Считается, что ненасыщенные жирные кислоты способствуют апоптозу, индуцированному пальмитатом, путем направления пальмитата в пул триглицеридов и вдали от путей, ведущих к апоптозу.34,35 Недавние данные свидетельствуют о том, что олеат ослабляет индуцированный пальмитатом эндоплазматический ретикулярный стресс и апоптоз β-клеток. , однако, показывает, что увеличение пула триглицеридов связано с β-клеточной дисфункцией. Возможно, что олеат спасает β-клетки от индуцированного пальмитатом апоптоза, но не может предотвратить дисфункцию β-клеток, вызванную метаболическим возмущением, связанным с хронической перегрузкой питательных веществ.

Расширение островковых клеток крысы при перегрузке питательных веществ, по-видимому, обусловлено прежде всего гипертрофией (фиг.7А и С), а не гиперплазией. Хотя комбинация питательных веществ вызывала значительное увеличение включения [3H] тимидина, степень, в которой происходит пролиферация β-клеток в этих условиях, неизвестна. Размер островков существенно не увеличивался при 5,6 мМ глюкозе и 240 мкМ (данные не показаны), однако включение [3H] тимидина было существенно повышенным. Это говорит о том, что повышенная активность синтеза ДНК представляет собой небольшой процент популяции островковых клеток или островковых клеток в S-фазе, которая не завершила клеточный цикл для получения двух новых дочерних клеток. Наши предыдущие исследования также показали, что усиленное включение [3H] тимидина, наблюдаемое в условиях продолжительной повышенной глюкозы, не было переведено на увеличение пролиферации клеток.37 Недавние данные показывают, что активация mTORC1 усиливает синтез митохондриальной ДНК 38, что говорит о том, что увеличение новый синтез ДНК, наблюдаемый на фиг. 7В, может отражать синтез митохондриальной ДНК. Регулирование роста клеток островковых клеток, по-видимому, отличается от грызунов, поскольку активация mTORC1 в питательных веществах не способствовала гипертрофии в островках человека (фиг.9C и 10A). Хотя экспериментальные данные ограничены, в морфометрическом анализе тканей поджелудочной железы человека, полученных при аутопсии, наблюдалась повышенная β-клеточная масса при ожирении.39,40. Степень этого адаптивного увеличения (~ 0,5 раза), однако, была скромной по сравнению с тем, что у тучных грызунов (~ 10 раз). Более того, считается, что повышенная β-клеточная масса у людей происходит за счет нового образования островков, а не гипертрофии или репликации существующих β-клеток.39 Результаты наших исследований in vitro согласуются с этой гипотезой. Воздействие перегрузки питательных веществ, связанное с ожирением в β-клеточных дефектах у людей, еще не выяснено.

Следует отметить, что расширение островковых клеток коррелировало со значительным снижением содержания инсулина, как показано на рисунках 7C и 8B, как при высоких, так и в умеренных концентрациях питательных веществ. Другие данные свидетельствуют о том, что увеличение массы β-клеток не всегда коррелировало с улучшенной функцией β-клеток.12,15-17,41 Эти результаты важны тем, что они бросают вызов хорошо принятому представлению о том, что расширение массы β-клеток и усиленная β-клеточная функция при резистентности к инсулину и перегрузка питательных веществ обеспечивают компенсаторные ответы, которые приводят к гиперинсулинемии. Возможно, гиперсекреция инсулина под перегрузкой питательных веществ не является следствием повышенной массы β-клеток и / или усиленной функции β-клеток, а является неустойчивым ответом, приводящим к истощению запасов инсулина. Результаты настоящего исследования поддерживают расширение островковых клеток крысы при перегрузке питательных веществ, что свидетельствует о метаболическом дистрессе, а не о компенсационном усилении β-клеточной функции.

Как и ожидалось, непрерывное длительное воздействие крыс и островков человека на повышенные питательные вещества вызывало чрезмерное секретирование инсулина в культуральную среду. Интересно отметить, что не было существенной разницы в количестве инсулина, высвобождаемого в среду между комбинацией питательных веществ (10 мМ глюкозы и 240 мкМ ФФА) и глюкозы (10 мМ) отдельно в течение 4-дневного периода инкубации. Более того, рапамицин не влиял на опосредованное питательными веществами выделение инсулина крысиными островками (фиг.8А). Однако содержание инсулина в остриях крыс после 4-дневного лечения резко отличалось в зависимости от условий эксперимента. Снижение содержания инсулина в островках, обработанных комбинацией питательных веществ по сравнению с одной только глюкозой, по-видимому, было связано с уменьшением биосинтеза инсулина (рис.8D). В отличие от островков крыс, человеческие островки не проявляли экспансии клеток островков при перегрузке питательных веществ. Кроме того, содержание инсулина в человеческих островках, обработанных комбинацией питательных веществ, существенно не отличалось от островков, обработанных только глюкозой (фиг.10С). Следовательно, 50% -ное снижение содержания инсулина в остриях крыс может быть связано с выраженным расширением островковых клеток. Идея о том, что дедифференцировка или незрелость вновь расширенных β-клеток16,17 при перегрузке питательных веществ приводит к снижению содержания инсулина, подтверждает эти результаты.

Таким образом, мы изучили многофакторные реакции β-клеток на хроническую перегрузку питательных веществ в крысах и остриях человека с использованием биохимических и микроскопических методик. Мы даем четкие доказательства того, что избыточные питательные вещества вызывают образование липидных капель в крысах и крысах человека в зависимости от mTORC1. Мы наблюдаем поразительную разницу в метаболических реакциях крыс и островков человека на перегрузку питательных веществ. В отличие от островков крыс, человеческие островки не проявляли экспансии островковых клеток. Мы считаем, что расширение островковых клеток при перегрузке питательных веществ представляет собой грань метаболического возмущения, что приводит к нарушенной функции β-клеток, а не к компенсаторному ответу, который усиливает β-клеточную функцию. Образование капель липидов как в крысиных, так и в человеческих β-клетках в ответ на высокие питательные вещества также, по-видимому, коррелирует с β-клеточной дисфункцией или возмущенным метаболическим состоянием. В качестве будущих направлений мы планируем изучить влияние других фармакологических агентов (то есть ингибитора ацил-СоА: диацилглицерол-ацилтрансферазы 1) для дальнейшего изучения причинно-следственной связи между адаптивными ответами β-клеток и дефектами β-клеток при хронической перегрузке питательных веществ.

Самцы крыс Sprague-Dawley были приобретены у Харлана Спраг-Доули. Из Sigma были получены коллагеназа типа XI (C9263), сбалансированный солевой раствор Хенкса (H1387), пальмитиновая кислота (# P0500), олеиновая кислота (O3880), красный ниль (N3013) и фибронектин (F1141). Инфинитный триглицеридный реагент (TR-22421), триглицеридный стандарт (TR22923), эмбриональная бычья сыворотка (SH3007003), пенициллин-стрептомицин (ICN1670049) и Хемилюминесцентный субстрат West Pico (34080) были получены от Fisher Scientific. Hybond ECl (RPN3032D) был получен от GE Healthcare Life Sciences. Тканевая культуральная среда, CMRL-1066 (11530037) и трипсин-ЭДТА (25200072) были из Invitrogen. BSA (фракция V, без жирной кислоты, 08823234) была получена от ICN Biomedical. Рапамицин (BML-A275) получали из Biomol. Моноклональное антитело к кроличьему инсулину (3014S) и моноклональное антитело p-S6 кролика (4856S) были приобретены из Cell Signaling. В лаборатории доктора Эндрю Гринберга было создано антитело к поликлональному кролику ADRP. Моноклональные мышиные актиновые антитела (A3853) и моноклональные мышиные антитела против глюкагона (G2654) были получены от Sigma. Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой ослиные анти-кроличьи IgG (711-035-152), конъюгированные с пероксидазой ослиные антимышиные IgG (715-035-150), DyLight 649-конъюгированные ослиные антикроличные IgG (711-495- 152), антитело против мышиных антител Alexa 488 (715-545-150) было получено из Jackson ImmunoResearch Laboratories. Alexa 488 осел-анти-кроличьи IgG (A21206), Alexa 647 осел-антимышиный IgG (A31571), Alexa 488-фаллоидин (A12379) и 4′-6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (D3571) получали из Invitrogen , [3H] тимидин (ART 0178H) был получен из American Radiolabeled Chemicals, Inc. Набор инсулина RIA RI (RI-13K) и набор RIA для человеческого инсулина (HI-11K) были из Millipore. Растворы (80-PINRT-E01) и человеческие (80-PINHU-E01.1) про-инсулиновые комплекты ELISA были получены от ALPCO. Все остальные химические вещества были получены из имеющихся в продаже источников.

Островки были выделены у самцов крыс Sprague-Dawley (250-270 г) путем расщепления коллагеназой. Поджелудочные железы накачивали 15 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), содержащего 0,5 мг / мл коллагеназы, выделяли, измельчали ​​и инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С при встряхивании. Ткань дважды промывали HBSS и ресуспендировали в 20 мл HBSS. Клеточную суспензию фильтровали через сетчатый фильтр размером 70 мкм и промывали 20 мл HBSS для удаления ацинарных клеток. Островки и оставшуюся ткань переносили в чашку Петри, инвертируя сетчатый фильтр и промывая его 20 мл CMRL-1066. Островки отбирали под стереомикроскоп и культивировали в атмосфере 95% воздуха, 5% CO2 в «полной» среде для культивирования CMRL-1066 (cCMRL), содержащей 5,6 мМ глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 10% (об / v) инактивированная инактивированной фетальной бычьей сывороткой, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Эти исследования были одобрены Южно-Иллинойским университетом Эдвардсвилл Институциональным комитетом по уходу и использованию животных.

Человеческие островки (13 отгрузок) были получены из 6 разных островковых центров по программе интегрированного распространения островков (IIDP) с января 2011 года по январь 2012 года. Мы ограничили критерии отбора доноров как BMI <32 и без диабета типа 2 для получения нетронутых и здоровых островков. Диапазон донорского возраста, пола и ИМТ: возраст (19-58), пол (6 мужчин, 4 женщины, 3 неизвестных), ИМТ (19-31,3).

Добавленную среду, содержащую жирную кислоту, получали, как описано ранее.42 Вкратце, 20 мМ раствор жирной кислоты, растворенный в 0,01 М NaOH, инкубировали при 70 ° С в течение 30 мин с перемежающимся перемешиванием. Мыло жирных кислот было комплексовано с 5% -ной безкислой BSA в PBS. Комплексную жирную кислоту BSA добавляли в 10% -ную сыворотку, содержащую клеточную культуральную среду, для достижения желаемых общих концентраций жирных кислот при жирной кислоте 3: 1 до молярного отношения BSA. PH среды, содержащей комплексные жирные кислоты, доводили до 7,4. Для всех экспериментов олеат и пальмитат готовили отдельно и объединяли для достижения желаемой концентрации с соотношением 1: 1.

Островки крысы (50) диспергировали в отдельные клетки путем инкубации в 0,05% трипсина / 0,53 мМ ЭДТА в HBSS в течение 4 мин при 37 ° С при встряхивании. Дисперсные островковые клетки промывали один раз cCMRL и ресуспендировали в 2 мл cCMRL, дополненной 25 мМ глюкозой и 500 мкМ FFA (олеат: пальмитат = 1: 1v / v). Клеточная суспензия помещалась в чашку Петри (35 × 10 мм) со стеклянным дном, покрытым фибронектином. Тарелка помещали на стадию перевернутого микроскопа Leica DMI. Используя систему Delta T (Bioptechs, Inc.), температуру камеры выдерживали при 37 ° C и вводили увлажненным 5% CO2 для поддержания подходящей среды для долговременной визуализации живых клеток. Цифровые изображения с фазовой контрастностью приобретались с интервалом 30 минут в течение 40 часов с использованием цели 20X. Изображения были перемасштабированы с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop.

Дисперсные клетки островков крысы (105 клеток / чашка) культивировали на покрытых фибронектином покровных в чашках Петри (35 × 10 мм) в различных экспериментальных условиях, как указано в легендах фигуры. После инкубации клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 20 мин с последующей инкубацией в пермеабилизационном растворе (0,1% Triton X-100) в течение 20 мин. Затем клетки инкубировали в блокирующем растворе (0,2% BSA в PBS) в течение 20 минут с последующей обработкой антителом против инсулина с первичным кроликом (разведение 1: 300 в блокирующем растворе) в течение 20 минут при 37 ° C. Клетки промывали и инкубировали в течение 20 мин при 37 ° С со вторичным DyLight 647-конъюгированным ослиным антикроличьим IgG (1: 300), DAPI (1: 5000) для ядерного окрашивания и краской нила (5 мкМ) для нейтрального липидного окрашивания , Клетки дважды промывали в PBS и устанавливали на слайдах. Используя объектив 63 × в перевернутом флуоресцентном микроскопе Leica DMI, были отобраны клетки, окрашивающие инсулин, и были захвачены изображения окрашивания краской Нила. Средняя интенсивность красного нила определялась для ~ 80 кластеров инсулиноположительных клеток на состояние. Исход, взятый как средняя интенсивность клеток, не окрашенных красным нилом, был вычтен из общей интенсивности. Для количественного определения липидных капель в α-клетках в качестве первичного и вторичного антител использовали моноклональное антитело против мышиного мыши (1: 300) и Alexa 488-конъюгированное ослиное антимышиное IgG (1: 300).

Белки разделяли полиакриламидными гелями и переносили в ECL Hybond. Для обнаружения p-S6 и ADRP моноклональные антитела p-S6 кролика (1: 1000) и антитела против ADRP (1: 1000), соответственно, использовались в качестве первичных антител. В качестве вторичного антитела использовали HRP-конъюгированный осел-антикроличный IgG. Обнаружение проводили с использованием Западно-пико-хемилюминесцентного субстрата, а p-S6 и ADRP были количественно определены Biorad ChemiDoc XRS Image Lab Software. Мембраны Hybond удаляли и повторно отбирали для β-актина с использованием моноклонального мышиного анти-β-актинового антитела и HRP-конъюгированного ослиного антимышиного IgG в качестве первичного и вторичного антител соответственно. Отношение p-S6 / β-актина или ADRP / β-актина было получено, сначала определив относительное увеличение по сравнению с контрольным условием (дорожка 1) для p-S6, ADRP или β-актина, затем вычисляя отношение соответствующая пара.

Островки крыс (150 / состояние) инкубировали в cCMRL, дополненной 25 мМ глюкозой и 500 мкМ FFA в отсутствие и присутствием 25 нМ рапамицина, как указано на рисунке. Через 48 ч островки промывали один раз PBS, ресуспендировали в 200 мкл 2: 1 (об. / Об.) Хлороформ: метанол и обрабатывали ультразвуком до тех пор, пока световая микроскопия не была обнаружена без интактной структуры островка. Растворители выпаривали досуха в Eppendorf Vacufuge при 45 ° C. Количество TG определяли количественно ферментативным колориметрическим анализом на основе продуцирования липазой глицерина.

После обработки диспергированные островковые клетки фиксировали, пермеабилизировали и обрабатывали моноклональным антителом против инсулина кролика (разведение 1: 300 в блокирующем растворе) и моноклональным антителом против ADRP мыши (Progen) в качестве первичных антител. Клетки промывали и обрабатывали вторичными антителами Cy5-конъюгированного ослиного анти-кроличьего IgG (1: 300) и Alexa 488-конъюгированного антимышиного IgG (1: 300) и DAPI (1: 5000) для ядерного окрашивания. Используя объектив 63 × в инвертированном флуоресцентном микроскопе Leica DMI, были отобраны клетки, окрашивающие инсулин, и были захвачены изображения окрашивания ADRP. Средняя интенсивность Dylight 649 для инсулина и Alexa 488 для ADRP определялась для общей сложности ~ 90 клеток на состояние из 3 независимых экспериментов.

Островки обрабатывали в течение 4 дней при различных условиях, как показано на рисунках. Триплексы 5 островков для каждой группы лечения были предварительно инкубированы в CMRL-1066 / 0,1% BSA, содержащей 3 мМ глюкозы в течение 30 мин. Культуральную среду заменяли CMRL-1066, содержащим либо 3 мМ, либо 20 мМ глюкозы, и дополнительно инкубировали в течение 1 часа. Супернатанты анализировали на секрецию инсулина радиоиммуноанализом (RI-13K для островков крыс и HI-14K ​​для островка человека, Millipore). Островки промывали и ресуспендировали в 500 мкл 0,1% BSA в PBS, после чего обрабатывали ультразвуком с использованием микротипового зонда. Содержание инсулина в крысах или островках человека определяли с помощью радиоиммунологического анализа с использованием наборов из Millipore.

Островки обрабатывали в течение 4 дней при различных условиях, как показано на рисунках. После обработки три раза в 5 островках промывали и ресуспендировали в 200 мкл 0,1% BSA в PBS, после чего обрабатывали ультразвуком с использованием микротипного зонда. Уровни про-инсулина на крысах и крысах человека определяли с использованием наборов ELISA с про-инсулином в соответствии с инструкциями производителя. Данные представляют собой средства ± SEM для n = 3 экспериментов.

Крысы или человеческие островки (30-50 островков / состояние) с аналогичными размерами помещали в чашки Falcon Petri (35 × 10 мм). Фазовые контрастные изображения островков с использованием объектива 20 × были получены до и после лечения, как показано на рисунке. Используя программное обеспечение для анализа изображений MetaMorph (Molecular Devices), был определен диаметр каждого островка.

После обработки островки промывали и ресуспендировали в 100 мкл среды для заливки криогеля, замораживали в жидком азоте и хранили при -70 ° C до использования. Замороженные участки толщиной 10 мкм получали с использованием Vibratome и переносили в покровные стекла. Ткани фиксировали и пермеабилизировали в 4% параформальдегиде и 1% Triton-X 100 в PBS. Ткани промывали в PBS для удаления остаточного глутарового альдегида, блокировали в 2% BSA в PBS и обрабатывали соответствующими первичными и вторичными антителами, DAPI для ядерного окрашивания и фаллоидином Alexa 488 для окрашивания актина, как указано в легенде фигуры. Флуоресцентные изображения были получены с использованием объектива 63 × в инвертированном флуоресцентном микроскопе Leica DMI. Изображения были перемасштабированы с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop.

Островки крыс (100 / состояние) подсчитывали в чашки Falcon Petri (35 × 10 мм) и культивировали в течение 4 дней, как указано в легендах. В течение последних 24 ч инкубации 96 ч к каждой чашке добавляли 10 мкКи [3H] тимидина. [3H] тимидина определяли экстракцией трихлоруксусной кислотой и подсчетом сцинтилляций.37

Результаты выражаются как среднее ± SEM. Различия между средствами оценивались с использованием ANOVA или t-критерия Стьюдента, если это необходимо. Значительные различия обозначаются * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Эта работа была поддержана NIH Grant 1R15DK094142 (GK), SIUE Internal Grants (GK), Американской ассоциацией колледжей фармации (GK), грантом NIH DK06181 (MLM), DK00618146S1 (MLM), Исследовательским и учебным центром по исследованию диабета в Вашингтоне Морфология и BioImaging Core DK20579 (MLM), ADA 7-08-RA-57 (ASG), USDA, Служба сельскохозяйственных исследований 58-1950-7-707 (ASG), NIH RO1-DK0822574 (ASG), 1RC2ES018781 (ASG) и R24DK087669 ( ASG). Все процедуры, выполняемые на животных, были одобрены Комитетом по удержанию и использованию животных SIUE.

Ранее опубликовано в Интернете: www.landesbioscience.com/journals/islets/article/22720

жировой дифференцировочный белок

пальмитат = 1: 1)

млекопитающих рапамицинового комплекса 1

триглицерид

Возможные конфликты интересов выявлены не были.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *