Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Снижение титров анти-идиотипических антител, специфичных к аутоантителам к GAD65 (GAD65Ab), предшествует развитию диабета GAD65Ab и типа 1

Decline in Titers of Anti-Idiotypic Antibodies Specific to Autoantibodies to GAD65 (GAD65Ab) Precedes Development of GAD65Ab and Type 1 Diabetes
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3681789/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: HEL AL SI CSH. Проводили эксперименты: JRR CSH. Проанализированы данные: CSH. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: HEL IJ AL SI. Написал газету: CSH.

¶ Члены исследовательской группы DiPiS и Судебная сеть по диабету 1-го типа показаны в вспомогательной информации (дополнение S1).

Гуморальная идиотипическая сеть, состоящая из антител и их антиидиотипических антител (анти-Id), может быть временно нарушена воздействием антигена. В здоровом иммунном ответе исходное равновесие в конечном итоге восстанавливается через противорегуляторные механизмы. Однако при некоторых аутоиммунных заболеваниях уровни аутоантител превосходят уровни их соответствующего анти-ИД, что указывает на постоянное нарушение в соответствующей гуморальной сети идиотипических. Мы исследовали анти-Id, направленный на основной аутоантител к диабету типа 1 (T1D) (GAD65Ab) в двух независимых когортах при прогрессировании болезни. Образцы, взятые у участников исследования естественной истории, показали значительно более низкие уровни анти-Id у индивидуумов, которые позже прогрессировали до T1D по сравнению с не-прогрессистами (индекс анти-Id антител 0,06 против 0,08, соответственно, p = 0,02). Мы также наблюдали значительную обратную корреляцию между уровнями анти-Id и возрастом при отборе проб, но только у прогрессистов (p = 0,014). Наконец, уровни анти-Id у прогрессистов показали значительное снижение во время прогрессирования по сравнению с продольными уровнями анти-Id у нестероидов (средняя скорость изменения: -0.0004 против +0.0004, p = 0.003), что указывает на потерю anti-Id во время прогрессирования. Наш анализ прогноза диабета в когорте Skåne показал, что в раннем возрасте (в возрасте 2 лет) у людей с повышенным риском имеются уровни анти-Id, неотличимые от здоровых людей, что указывает на то, что низкие уровни анти-Id не являются врожденными характеристиками иммунного ответа в лиц, подвергающихся риску. Примечательно, что уровни анти-Id значительно снизились у лиц, которые позже разработали GAD65Ab, предполагая, что снижение уровней анти-Id предшествует появлению GAD65Ab (средняя скорость изменения: -0,005) по сравнению с сопоставимыми контрольными средствами (средняя скорость изменения: +0,001) (р = 0,0016). Мы заключаем, что, хотя анти-Id присутствует на ранней стадии жизни, их уровни уменьшаются до появления GAD65Ab и развития T1D.

Сетевая гипотеза, заявленная Нильсом Йерном, гласит, что сеть взаимодействующих идиотипов является частью системы иммунного регулирования [1]. Антитело, которое распознает другое антитело в качестве его антигена, называется «анти-идиотипическим антителом (анти-Id)». Конкретный подкласс этих анти-Id распознает сайт связывания исходного антитела и тем самым предотвращает связывание исходного антитела с его антигеном. Эти «антитела внутреннего изображения» были описаны в контрольных популяциях нескольких аутоиммунных заболеваний [2], [3] и могут иметь регуляторные функции. Важно отметить, что уровни анти-Id часто коррелируют обратно с активностью аутоиммунных заболеваний. Таким образом, высокие уровни анти-Id обнаруживаются во время ремиссии у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, а низкие уровни анти-Id обнаруживаются во время острых активных фаз заболевания [4] — [6]. Развитие анти-ИД было исследовано как у животных, так и у людей: увеличение уровней антител обычно вызывает более поздний рост уровня анти-ИД (обзор в [7]). Например, Geha et al. показали, что вакцинация столбнячным анатоксином не только индуцировала ожидаемое увеличение антител против столбнячного токсоида, но также вызвала более поздний рост анти-Ид, который имел тенденцию нормализовать уровень свободного столбнячного анатоксина. Это снижение титра антител к титану бессодержащего столбняка было вызвано конкуренцией анти-Id для сайта связывания столбнячного токсоида на идиотипическом столбнячном анатоксинном антителе [8], [9]. Кроме того, разработка анти-Id по отношению к человеческим антителам, которые используются для терапии, является хорошо документированным явлением и серьезной проблемой для биологической доступности терапевтического антитела [10]. Хотя эти исследования показывают, что анти-Id может индуцироваться введением экзогенного антитела или развиваться в ответ на индуцированное увеличение антител, очень мало известно о естественном развитии анти-Id.

Диабет типа 1 (T1D) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся отсутствием инсулина из-за аутоиммунного опосредованного разрушения бета-клеток островка. Прогрессия к T1D характеризуется появлением циркулирующих аутоантител, направленных против нескольких бета-клеток аутоантигенов: инсулина, меньшей изоформы глутаматдекарбоксилазы (GAD65), белка, связанного с инсулиномой 2, и белка Zinc Transporter 8 (обзор см. В [11]) ,

Ранее мы сообщали о одновременном присутствии анти-Id, специфичного для GAD65Ab и GAD65Ab, в сыворотках здоровых людей [12]. Важно отметить, что уровни анти-Id, специфичные для GAD65Ab, были значительно ниже у пациентов с T1D [12]. Наконец, уровни анти-Id повысились у пациентов с Т1D, которые испытали временную ремиссию, известную как фаза медового месяца. Напротив, пациенты, у которых не было ремиссии, не показали увеличения уровней анти-ИД [13]. Таким образом, несмотря на то, что после развития Т1D наблюдается обратная корреляция между бета-клеточной специфической аутоиммунностью и уровнями анти-ИД, не было известно, что уровни анти-ИД фактически уменьшались до развития Т1Д и было ли это потенциальное снижение предшествует появлению GAD65Ab.

Для решения этих вопросов мы исследовали анти-Id в двух продольных когортах людей, которые перешли на T1D.

Исследование естественной истории (NHS): протокол был одобрен институциональными советами по обзору в участвующих центрах (Исследовательский институт Бенарои (Сиэтл), Детская больница Лос-Анджелес, Колумбийский университет, Университет Джорджа Вашингтона, Университет Индианы, Институт болезни Фуера (Мюнхен) Центр диабета Джослина, Университет Сан-Раффаэле (Милан), Стэнфордский университет, Калифорнийский университет в Сан-Франциско, Университет штата Колорадо, Университет Флориды, Университет Майами, Университет Миннесоты, Университет Питтсбурга, Юго-западная медицинская школа Университета Техаса, Университет Торонто , и Вашингтонский университет), и все участники предоставили письменное информированное согласие до участия в этапе отбора.

Прогноз диабета в Сконе (DiPiS): Региональный совет по этике в Лунде, Швеция, одобрил исследование DiPiS. Письменное информированное согласие было получено от участвующих лиц или их опекунов.

a) Исследование естественной истории (NHS) является частью инициативы TrialNet [14]. В этом текущем проспективном исследовании образцы собираются у родственников проб T1D. Возраст участников при зачислении составляет 1-45 лет. Мониторинг проводится ежегодно или раз в полгода, в зависимости от их статуса аутоантител к островку.

Мы проанализировали продольные образцы 78 участников, которые разработали T1D в течение последующего периода (прогрессисты) и 161 участник, который оставался без болезней в течение анализируемого периода времени (без прогрессистов) (таблица 1).

б) Прогноз диабета в Сконе (DiPiS) — это популяционное проспективное исследование T1D у детей, родившихся в шведском графстве Сконе [15]. Было отобрано 46 000 детей, родившихся между 2000 и 2004 годами. Из них 35 658 человек были напечатаны HLA, что привело к выявлению более 2500 детей с повышенным генетическим риском для T1D, которые затем сопровождались ежегодно, начиная с 2-летнего возраста.

Мы проанализировали продольные образцы 28 участников, которые перешли на T1D в течение периода наблюдения (прогрессисты). Каждый прогрессив был сопоставлен по полу, типу HLA и дате рождения с двумя людьми, которые остались без диабета в течение периода наблюдения (без прогрессистов). Мы также проанализировали 24 человека, которые разработали GAD65Ab во время наблюдения, но остались без диабета (преобразователи GAD65Ab). Каждому из этих людей соответствовали два человека, которые остались без диабета и GAD65Ab-негативными в течение периода наблюдения (таблица 2). Промежуточные периоды для прогрессистов и преобразователей GAD65Ab были тщательно подобраны по сравнению с их соответствующими элементами управления.

Данные, относящиеся к этому исследованию, доступны по запросу.

GAD65Ab измеряли в анализе связывания радиолиганда (RBA) [16], [17], как это стандартизовано в Международной комбинированной семинарии по аутоантител [18]. Рекомбинантный 35S-GAD65 был продуцирован in vitro связанными транскрипцией / трансляцией с РНК-полимеразой SP6 и обработанным нуклеазой лизатом ретикулоцитов кроликов (Promega, Madison, WI, USA), как описано ранее [16], [17]. Введенный in vitro 35S-меченый антиген выдерживали при -70 ° C и использовали в течение 2 недель. Образцы сыворотки инкубировали в течение ночи при 4 ° С в двух повторностях с количеством осажденных TCA, которое соответствовало 20 000 м.д. 35S-GAD65 при окончательном разведении сыворотки 1:25. Маркированный антитело-связанный антиген отделяли от свободного антигена протеином A-Sepharose (Zymed, San Francisco, CA, USA). Связанная радиоактивность учитывалась в сцинтилляционном счетчике 1450 Microbeta (Wallac Oy, Turku, Finland). Анализ, который мы использовали, показал чувствительность 70% и специфичность 98% для GAD65Ab, в Международном семинаре по комбинированному аутоантител [18].

Образцы антител положительные и отрицательные были включены в каждый анализ для коррекции вариации между анализами путем вычисления индекса аутоантител (Ab-index = (cpm от испытуемого образца — cpm отрицательных стандартов) / (cpm положительного стандарта — cpm отрицательных стандартов) ), как описано ранее [16].

Верхний предел (индекс 0,05) нормального диапазона был установлен, как описано ранее [19]. Вкратце, мы определили самый низкий индекс GAD65Ab, при котором связывание GAD65 сывороткой было специально смещено рекомбинантным человеческим GAD65 (Diamyd Medical AB, Швеция). В когорте из 302 здоровых людей мы наблюдали семь образцов с индексами выше 0,05, что соответствует процентилю 97,7.

В качестве положительного контроля использовался стандарт Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [20]. Образцы с индексом GAD65Ab выше 20 были исключены из анализа. Эти образцы должны были быть разбавлены> 10 раз, что привело к потенциальной большой изменчивости ошибки.

Комплексы GAD65Ab и анти-Id в образцах сыворотки были диссоциированы, как описано ранее [12], [21]. Вкратце, образцы сыворотки (50 мкл) инкубировали с GAD65-специфическим человеческим моноклональным антителом b96.11, связанным с белком A-сефарозой (PAS) (50 мкл 10% суспензии) в течение 10 мин при 55 ° C. После этой инкубации реакционную смесь затем инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин и затем, наконец, в течение 10 мин при комнатной температуре. Объем бусинок титровали для оптимальных условий анализа. Связанную фракцию отделяли от несвязанной сыворотки центрифугированием при 14000 об / мин в течение 5 мин. Супернатант осторожно удаляли и повторно центрифугировали при тех же условиях, чтобы обеспечить отсутствие b96.11-PAS. Полученный супернатант анализировали на GAD65Ab с помощью RBA. Каждый анализ включал стандарт ВОЗ [20], который не был поглощен b96.11-PAS, и пустым контролем, который состоял из PBS, который был поглощен b96.11-PAS. Интервальная вариация стандарта ВОЗ составила ~ 10%. Индекс анти-Id рассчитывали как наблюдаемое увеличение уровней GAD65Ab после поглощения анти-Id по сравнению с уровнем GAD65Ab до поглощения анти-Id, как сообщалось ранее [22]. Уровни антител были выражены как относительный показатель для коррекции интервала. На каждой пластине выполнялся положительный образец контрольной сыворотки для анти-Id. Этот образец был получен от здорового донора. Средний показатель анти-Id для этого образца составлял 0,27 (диапазон 0,24-0,31) с коэффициентом вариации 6,83%.

Пустой контроль подтвердил, что b96.11 не был выпущен из бусинок во время процедуры. Все образцы, полученные от одного человека, анализировали на одной и той же микротитровальной планшете, чтобы избежать вариаций в ходе исследования.

Все цифры и статистические анализы были выполнены с использованием Prism 4 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Корреляции были рассчитаны с использованием критерия корреляции рангов Спирмена. Уровни медианных антител между группами сравнивались с использованием непараметрического анализа дисперсии (тест Манна-Уитни-У). Уровни медианных антител в группах сравнивали с использованием непараметрического анализа дисперсии (тест на парную партию, выполненный по Уилкоксону). Значение p менее 0,05 считалось значительным. Скорость изменения титра антител во времени рассчитывали следующим образом: изменение титра антител (индекс) / время (месяцы).

На исходном уровне пациенты в когорте NHS, которые в конечном итоге прогрессировали до диабета (прогрессисты), имели значительно более низкие средние уровни анти-ИД по сравнению с не прогрессистами (индекс 0,06 против 0,08, соответственно, p = 0,02) (рисунок 1). Также в группе progressor уровни анти-Id показали обратную корреляцию с возрастом в начале исследования в группе прогрессистов (p = 0,014) (рисунок 2). Напротив, в группе, не являющейся прогрессирующей, не было достоверной корреляции между уровнем анти-ИД и возрастом (данные не показаны).

Представлены уровни Anti-Id и медианы для прогрессистов на исходном уровне (белые круги) и в начале (черные круги) и не-прогрессисты на исходном уровне (белые квадраты) и на последнем образце последующих наблюдений (черные квадраты). Значительные различия между медианами обозначаются горизонтальными полосками и звездочками.

Уровни анти-Id были отложены по возрасту при отборе проб. Показана линия линейной регрессии.

В группе прогрессистов не было существенной разницы между уровнями анти-ИД в начале исследования и показателями диагноза (средний уровень анти-ИД 0,061 против 0,060 соответственно) (рис. 1), а уровни анти-ИД в исходном состоянии достоверно коррелировали с теми при постановке диагноза (р <0,0001). Однако периоды наблюдения варьировались в широких пределах между субъектами (от 2 до 60 месяцев), а также уровни анти-ИД (индекс анти-ИД = 0-0,19) (таблица 1). Поэтому мы рассчитали скорость изменения уровня анти-ИД от базового уровня с течением времени (дельта-анти-Id / месяц) (рис. 3).

Продольные изменения выражаются как скорость изменения (уровень анти-ИД при постановке диагноза или окончательный выборки — уровень анти-ИД в начале исследования) / продолжительность наблюдения в месяцах). Представлены изменения уровней анти-ИД и медианы для каждой группы. Значительные различия обозначаются горизонтальной полосой и звездочкой. Фактические уровни анти-Id в начале и в течение времени показаны в соответствующих вставках.

Мы обнаружили, что уровни анти-Идентичности падали с течением времени у прогрессистов, но росли у не-прогрессистов (средняя скорость изменения: -0.0004 против +0.0004, соответственно, p = 0.003).

Затем мы проанализировали изменения уровней анти-Id у нестериологов, у которых повышенный риск развития T1D, выражающийся в наличии двух или более аутоантител. Мы обнаружили, что значительно большее число людей с повышенным риском проявляли снижение уровней анти-ИД во времени (15/45 = 33% против 17/90 = 19%, p = 0,02), в то время как значительно больше людей с одним или меньшим количеством аутоантител демонстрировали стабильную анти- -Id в течение периода наблюдения (43/90 = 48% против 11/45 = 24%, p <0,0001).

Большинство как прогрессистов, так и не-прогрессистов были GAD65Ab-положительными, и только 26% (36/135) непередовых и 15% (9/59) прогрессистов были отрицательными по GAD65Ab на исходном уровне. Семьдесят процентов (25/36) отрицательных прогрессистов GAD65Ab и 78% негативных прогрессистов GAD65Ab оставались отрицательными GAD65Ab и 3% (4/135) и 5% (3/59) непереговорных и прогрессистов потеряли GAD65Ab во время наблюдения (рисунок 4). Титры GAD65Ab на исходном уровне показали значительную корреляцию с титрами GAD65Ab в конце периода наблюдения, как у прогрессистов, так и у нестероидов (p <0,0001). Уровни GAD65Ab на исходном уровне были значительно выше у прогрессистов по сравнению с не прогрессистами (средний показатель 0,18 против 0,12 соответственно, p = 0,02), однако в конце периода наблюдения не наблюдалось различий в уровнях GAD65Ab между группами (медиана индекс при постановке диагноза и соответствующий контрольный образец в непрогрессорах: 0,15 и 0,12 соответственно) (рисунок 4).

Уровни GAD65Ab на исходном уровне и при постановке диагноза (или окончательная выборка у нестероидов) показаны для прогрессистов и нестериологов когорты NHS. Уровни GAD65Ab и медиана для каждой группы представлены. Значительные различия обозначаются горизонтальной полосой и звездочкой.

Для анализа когорты DiPiS мы смогли сопоставить два отдельных элемента управления с каждым прогресором или GAD65Ab-конвертером. Контроль был согласован на время до постановки диагноза, пола и даты рождения.

Как наблюдалось для когорт антисосудистой группы NHS на исходном уровне, значительно коррелировали с таковыми при диагностике (p <0,0001). У прогрессистов в когорте DiPiS мы обнаружили, что уровни анти-Id, как правило, снижались с течением времени (средняя скорость изменения: -0.0003), в отличие от сопоставленных без прогрессистов, уровни анти-Id которых со временем увеличивались (средняя частота изменение: +0.00025), аналогично нашему обнаружению в когорте NHS. Однако в когорте DiPiS это различие в скорости изменения уровней анти-Id не достигало значимости (p = 0,09) (рис. 5). Особый интерес вызвали 24 человека, которые обратились к положительной реакции GAD65Ab, но не развивали диабет в течение периода наблюдения. В этой группе не было различий в уровнях анти-Id на базовом уровне между преобразователями GAD65Ab и их согласованными элементами управления. Однако в течение первого изученного интервала (в возрасте 2-3 лет) преобразователи GAD65Ab имели значительное снижение уровней анти-ИД (средняя скорость изменения: -0,005) в отличие от их контрольных контролей, которые не уменьшались (средняя скорость изменения : +0,001) (p = 0,0016) (фиг. 6). Следует отметить, что это снижение анти-Id произошло до появления GAD65Ab.

Продольные изменения уровней анти-Id во времени представлены как скорость изменения (как описано выше). Изменения в уровне анти-Id и медиане показаны для прогрессистов (белые круги) и совпадающих без прогрессистов (черные круги).

Изменения в анти-Id во времени представлены как скорость изменения (как описано выше) и показаны как черные круги. Для сравнения с отдельными образцами уровни анти-Id в возрасте 2 и 3 показаны в виде белых кругов. Значительные различия в медианах обозначаются горизонтальной полосой и звездочкой.

Мы исследовали анти-Id, реагирующий на T1D-специфический GAD65Ab b96.11 в двух продольных когортах индивидуумов, которые прогрессировали до T1D. Образцы, взятые в начале исследования от участников когорты NHS, показали значительно более низкие уровни анти-Id у тех лиц, которые позже перешли к T1D по сравнению с непереговорами. Мы также обнаружили обратную корреляцию между возрастными и анти-ИД-уровнями у прогрессистов, в отличие от не-прогрессистов. Таким образом, существует, по-видимому, возрастное снижение анти-ИД у лиц с риском развития Т1Д. Кроме того, наш продольный анализ прогрессистов и прогрессистов в этой когорте показал значительное снижение уровней анти-ИД со временем у прогрессистов в отличие от нестериологов.

Наш анализ образцов когорт DiPiS показал, что в начале жизни (возраст 2) индивидуумы, которые позже прогрессировали до T1D, уровни анти-Ида неотличимы от тех, которые находятся в контроле, который оставался здоровым. Это указывает на то, что низкие уровни анти-ИД не являются врожденной характеристикой иммунного ответа у лиц с риском. Однако после этого уровни анти-ИД значительно снизились со временем у людей, которые позже разработали GAD65Ab. Из этих данных мы заключаем, что, хотя анти-Id присутствует на ранней стадии жизни, их уровни уменьшаются до появления GAD65Ab и развития T1D.

Хотя увеличение титра антител, вызванное временным воздействием антигена, вызывает последующее увеличение анти-Id и, таким образом, восстанавливает равновесие, длительное высвобождение GAD65, например. во время разрушения бета-клеток будет непрерывно активировать поликлональные G-клетки, специфичные к GAD65, и индуцировать секрецию GAD65Ab. Соматические мутации и созревание аффинности изменят секретированные идиотипы GAD65Ab, и в конечном итоге анти-Id-ответ не сможет адекватно реагировать на эти изменения. Эта гипотеза подтверждается недавней публикацией, где идиотипическая сеть потерпела неудачу после гипериммунизации мышей с столбнячным токсоидом [23].

Мы признаем, что наше исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, даже у не-прогрессистов в обеих когортах повышенный риск развития T1D. Например, поскольку не-прогрессирующие NHS являются родственниками пациентов T1D, у них средний риск составляет ~ 6% по сравнению с <1% у общей популяции [24], [25]. Аналогично, неперегромные DiPiS являются генетически восприимчивыми людьми с общим риском 6% [26], [27]. Действительно, мы наблюдали, что уровни анти-Id у нестериологов когорты NHS, у которых повышенный риск развития T1D, выражающийся наличием двух или более аутоантител, чаще со временем уменьшались по сравнению с непереговорами, которые представили одно или менее аутоантител. Поскольку значительная часть не-прогрессивных лиц в обоих исследованиях в конечном итоге будет развиваться до T1D, замечательно, что мы все еще можем обнаружить сообщаемые различия между прогрессистами и непереговорами.

Другим ограничением когорты NHS было то, что большинство нестериологов были GAD65Ab-положительными, что указывало на наличие постоянной аутоиммунитета GAD65. Наш анализ людей в когорте DiPiS, которые были преобразованы в положительную реакцию GAD65Ab во время наблюдения, указывает на то, что уровни анти-Id снижаются на ранней стадии жизни до разработки GAD65Ab. Поэтому наличие GAD65Ab у нестериков когорты NHS предполагает, что к тому времени, когда мы их отбирали, у этих людей уже произошло значительное снижение уровней анти-Id, и более резкое снижение уровней анти-Id может наблюдаться в продольных анализы прогрессистов, которые являются отрицательными GAD65Ab на исходном уровне. К сожалению, ни одна когорта не содержала значительную часть прогрессистов, которые были преобразованы в GAD65Ab-позитивность до развития T1D. 24 здоровых преобразователя GAD65Ab в когорте DiPiS будут контролироваться для развития T1D, поскольку эти люди подвергаются повышенному риску.

Сильные стороны этих когорт лежат прежде всего в тщательном сборе хорошо охарактеризованных продольных образцов прогрессистов и доступности контролей, которые могут быть сопоставлены не только для пола и HLA (когорты NHS), но также для даты рождения и периода наблюдения (DiPiS когорты).

Мы пришли к выводу, что анти-Id до GAD65Ab теряются во время прогрессирования до T1D и до разработки других маркеров аутоиммунного процесса, таких как GAD65Ab. Несмотря на эти интригующие наблюдения, степень, до которой анти-Id может использоваться в предсказании T1D, еще предстоит исследовать, так же как и их потенциальная функция как иммунного регулятора.

Члены исследовательской группы DiPiS и Судебная сеть по диабету 1-го типа.

(DOC)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы благодарны д-ру Таборски (Вашингтонский университет) за его тщательный обзор этой рукописи и полезные комментарии. Авторы также признают помощь Сары М Мюллер (TrialNet Coordinating Center, University of South Florida) за предоставление данных из образцов, которые были уместны для этого исследования.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *