Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Интерферон-регуляторный фактор-1 вместе с реакционноспособными видами кислорода способствует ускорению прогрессирования клеточного цикла путем регуляции генов cyclin E и CDK2 во время высокой глюкозы-индуцированной пролиферации сосудистых гладкомышечных клеток

Interferon regulatory factor-1 together with reactive oxygen species promotes the acceleration of cell cycle progression by up-regulating the cyclin E and CDK2 genes during high glucose-induced proliferation of vascular smooth muscle cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3852693/

Высокая глюкоза-индуцированная пролиферация сосудистых гладкомышечных клеток (VSMCs) играет важную роль в развитии диабетических сосудистых заболеваний. В предыдущем исследовании мы подтвердили, что регуляторный фактор-интерферон-1 (Irf-1) является положительным регулятором пролиферации VSMC с высокой глюкозой. Однако механизмы еще предстоит определить.

Уровни экспрессии циклина / CDK в двух клеточных моделях с использованием нокдауна и избыточной экспрессии Irf-1 были количественно определены для изучения взаимосвязи между Irf-1 и его нисходящими эффекторами в нормальных или высоких условиях глюкозы. Затем клетки обрабатывали высоким уровнем глюкозы / NAC, нормальной глюкозой / H2O2, высокой глюкозой / U0126 или нормальной глюкозой / H2O2 / U0126 в течение инкубационного периода. Затем проводили пролиферацию, экспрессию циклина / CDK и анализ распределения клеточного цикла для определения того, участвовал ли сигнальный путь ROS / Erk1 / 2 в индуцированной Irf-1 регуляции роста VSMC в условиях высокой глюкозы.

Мы обнаружили, что избыточная экспрессия Irf-1 приводила к снижению регуляции цикла D1 / CDK4 и ингибированию прогрессирования клеточного цикла в VSMC при нормальных условиях глюкозы. В условиях повышенной глюкозы избыточная экспрессия Irf-1 приводила к повышающей регуляции циклина E / CDK2 и ускорению прогрессирования клеточного цикла, тогда как молчание Irf-1 подавляло экспрессию обоих белков и ингибировало клеточный цикл во время высокого уровня глюкозо- индуцированной пролиферации VSMC. Обработка VSMC антиоксидантами предотвращала пролиферацию VSMC с избыточной экспрессией Irf-1, повышающую регуляцию циклина E / CDK2 и ускорение прогрессирования клеточного цикла в условиях высокой глюкозы. Напротив, при нормальных условиях глюкозы стимуляция H2O2 и избыточная экспрессия Irf-1 индуцировали клеточную пролиферацию, повышенную экспрессию cyclin E / CDK2 и ускоряли ускорение клеточного цикла. Кроме того, сверхэкспрессия Irf-1 способствовала активации Erk1 / 2 и когда VSMC, сверхэкспрессирующие Irf-1, обрабатывали U0126, специфический ингибитор Erk1 / 2 отменил пролиферацию VSMC, повышающую регуляцию циклина E / CDK2 и ускорение прогрессирования клеточного цикла в условиях высокого уровня глюкозы или нормальной глюкозы / H2O2.

Эти результаты демонстрируют, что нисходящие эффекторы Irf-1 являются циклином E / CDK2 во время высокой пролиферации, вызванной глюкозой, VSMC, тогда как они являются cyclin D1 / CDK4 в нормальных условиях глюкозы. Повышенная экспрессия VSMC с избыточной экспрессией Irf-1, повышающая регуляция циклина E / CDK2 и ускорение прогрессирования клеточного цикла связаны с сигнальным путем ROS / Erk1 / 2 в условиях высокой глюкозы.

Высокая глюкоза-индуцированная пролиферация сосудистых гладкомышечных клеток (VSMCs) играет важную роль в развитии диабетических сосудистых заболеваний. Однако молекулярные медиаторы, ответственные за пролиферацию VSMC, еще предстоит определить. Ранее мы показали, что избыточная экспрессия регуляторного фактора-интерферона-1 (Irf-1) ускоряет пролиферацию VSMC и что понижающая регуляция экспрессии Irf-1 значительно подавляет пролиферацию VSMC в условиях высокой глюкозы. Показано также, что Irf-1 является положительным регулятором высокой индуцированной глюкозой пролиферации VSMC. Интересно, что наши предыдущие данные показали, что избыточная экспрессия Irf-1 обладает антипролиферативным эффектом в нормальных условиях глюкозы, и было высказано предположение, что противоречивые результаты были вызваны высокими уровнями глюкозы [1]. Irf-1, регулятор транскрипции, скорее всего, вызывает это расхождение, регулируя нисходящие эффекторные гены в условиях высокой глюкозы, которые отличаются от генов, которые он регулирует в нормальных физиологических условиях.

Первоначально Irf-1 был известен как фактор транскрипции, который распознает регуляторные элементы в промоторах интерферона-бета и некоторых индуцируемых интерферонами генах. Теперь, увеличивая данные, коэффициент транскрипции был определен как имеющий эффект регуляции пролиферации различных типов клеток, включая опухолевые клетки и соматические клетки [2-4]. Было идентифицировано несколько потенциальных медиаторов регуляторной активности Irf-1, которые включают в себя р53, р21, циклин и циклинзависимую киназу (CDK) [5-8]. Циклины и CDK являются нисходящими эффекторными генами, которые контролируют контрольные точки клеточного цикла, что указывает на то, что Irf-1 участвует в регуляции клеточного цикла. Участие Irf-1 в регуляции клеточного цикла может частично объяснить влияние этого гена на регуляцию роста VSMC.

Процесс клеточного цикла регулируется циклинами и CDK. В раннем G1 определенные события могут способствовать транскрипции белка cyclin D, который образует комплекс cyclin D / CDK4, который фосфорилирует ретинобластому (Rb), что приводит к экспрессии гена и образованию комплекса cyclin E / CDK2. Циклин E-CDK2 фосфорилирует широкий спектр белков и способствует прогрессированию клеточного цикла до позднего G1, что приводит к образованию комплекса циклина A / CDK2, который способствует прогрессированию клеточного цикла через фазу G1 / S в S-фазу. В вышеупомянутом сигнальном каскаде cyclin D / CDK4 и cyclin E / CDK2 известны как две ключевые точки, которые способствуют переходу G1 / S-фазы в регуляцию клеточного цикла [9]. Однако необходимо подтвердить взаимосвязь между Irf-1 и cyclins / CDK во время высокой пролиферации VSMC, вызванной глюкозой. Кроме того, должен быть выяснен механизм, зависящий от глюкозы, с помощью которого Irf-1 действует как положительный или отрицательный регулятор роста VSMC.

В этом исследовании две клеточные модели, включающие нокдаун и избыточную экспрессию Irf-1, были установлены, как описано ранее [1]. Уровни экспрессии циклина / CDK в двух моделях клеток были определены количественно для изучения взаимосвязи между Irf-1 и его нисходящими эффекторами, связанными с регуляцией клеточного цикла в нормальных или высоких условиях глюкозы. Затем клетки обрабатывали с высоким содержанием глюкозы / N-ацетилцистеина (NAC) и нормальной глюкозы / H2O2 или высокой глюкозы / U0126 и нормальной глюкозы / H2O2 / U0126 в течение инкубационного периода. Затем проводили пролиферацию, экспрессию циклина / CDK и анализ распределения клеточного цикла для определения того, участвовал ли сигнальный путь реактивного кислорода (ROS) / Erk1 / 2 в индуцированной Irf-1 регуляции роста VSMC в условиях высокой глюкозы. Кроме того, были оценены уровни экспрессии фосфо-Erk1 / 2 в двух клеточных моделях с использованием нокдауна и избыточной экспрессии Irf-1 для изучения взаимосвязи между Irf-1 и активацией Erk1 / 2 при высокой стимуляции глюкозы или ROS.

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных Второго военно-медицинского университета (Шанхай, Китай) и соответствовали руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Методы, используемые для культуры VSMC и переноса генов, были описаны ранее [1]. Вкратце, VSMC выращивали из эксплантов грудной аорты у крыс SD. В экспериментах использовались ячейки между проходами 3 и 6. Дополнительные олигонуклеотидные последовательности были сконструированы как небольшие интерферирующие РНК последовательности в соответствии с последовательностями кДНК IRF-1. Последовательности анализировали с помощью BLAST-поисков, чтобы гарантировать, что они не показывают значительную гомологию последовательности с другими генами. Мелкие интерферирующие последовательности РНК (siIRF-1) были: смысл, 5 ‘-GCC CAA CUC UCU ACU GUC Utt-3’; антисмысловой, 5 ‘-AGA CAG UAG AGA GUU GGG Ctt-3’. Лентивирусный вектор pGCsi-FU-Irf-1 был получен путем вставки siIRF-1 в pGC-FU-GFP (GeneChem, Shanghai, China), и лентивирусный вектор pGC-FU-Irf-1 был получен путем субклонирования полномасштабного длиной кДНК Irf-1 (номер доступа NMB01 NM_012591.1) к pGC-FU-GFP (дополнительный файл 1). Последовательность Irf-1 была куплена коммерчески от GeneChem.

Плазмиду pGCsi-FU-Irf-1 или pGC-FU-Irf-1 вместе с плазмидами pHelper 1.0 и pHelper 2.0 (GeneChem) подвергали трансплантации в 293 Т-клетки с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) для получения лентивирусных запасов. Пустой вектор pGC-FU-GFP использовался как отрицательный контроль. После определения вирусных титров для заражения VSMC использовали лентививные частицы.

Уровни ROS определяли путем измерения окислительной конверсии DCFH-DA в флуоресцентное соединение дихлорфлуоресцина. VSMC в 96-луночных планшетах инкубировали с обычным раствором глюкозы (5,5 мМ) или с высоким содержанием глюкозы (25 мМ) в течение 2, 4 и 6 дней. После этого среду удаляли и заменяли средой, не содержащей сыворотки. DCFH-DA (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China) исходный раствор (10 мМ) разводили в 1000 раз в бессывороточной среде и добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов (10 мкМ). Клетки инкубировали в течение 25 мин, а затем флуоресценцию DCF определяли при 520 нм после возбуждения с 488 нм светом аргонового лазера с FACscan. Результаты были выражены как относительная интенсивность флуоресценции на 104 клетки.

Трансфицированные VSMC высевали на 6-луночные планшеты с плотностью 1 × 105 клеток / лунку в 2 мл DMEM, содержащей 10% FBS с нормальной глюкозой (5,5 мМ). Через 24 ч синхронизация G0 / раннего G1 была достигнута путем лишения сыворотки (0% FBS). Затем среду переключили на DMEM, содержащую 10% FBS, с нормальной глюкозой / H2O2 (0,06 ммоль / л), нормальной глюкозой / H2O2 / U0126 (10 мкМ), высокой глюкозой (25 мМ) / NAC (20 ммоль / л) и высокий уровень глюкозы / U0126, соответственно. Для измерения пролиферации клеток при нормальных условиях глюкозы и высокой глюкозы после 5-дневного инкубационного периода рост и жизнеспособность клеток анализировали с помощью подсчета клеток и с использованием анализа ЭДУ. Кроме того, для определения распределения клеточного цикла трансфицированных VSMC в нормальных условиях глюкозы / Н2О2, нормальной глюкозы / Н2О2 / U0126, высокой глюкозы / NAC и высокой степени глюкозы / U0126, была использована проточная цитометрия. Полученные данные выражаются как среднее ± SD. Различия оценивали с использованием теста Даннета, а значение Р <0,05 считалось статистически значимым.

Трансфицированные VSMC, включая клетки, трансфицированные pGCsi-FU-Irf-1, pGCFU-Irf-1 или pGC-FU-вектором, инкубировали при нормальной глюкозе (5,5 мМ), нормальной глюкозе / H2O2 (0,06 ммоль / л), нормальной глюкозе / H2O2 / U0126 (10 мкМ), с высоким уровнем глюкозы (25 мМ), высоким уровнем глюкозы / НАК (20 ммоль / л) и высоким уровнем глюкозы / U0126. Через 5 дней клетки собирали и лизировали в буфере для лизиса RIPA (Beyotime). Затем экстрагированные белки разрешали с помощью SDS-PAGE и электроблокалировали на PVDF-мембранах (Beyotime). Интересующие белки были обнаружены антициклином D1, антициклином E, анти-CDK2 или анти-CDK4 с использованием системы Хемилюминесценции ECL (Beyotime). Интенсивность полосы была проанализирована с использованием программного обеспечения Multi-Analyst. Уровни β-актина были использованы для нормализации интенсивности сигнала. Затем данные об интенсивности подвергались статистическому анализу, и различия были оценены с помощью теста Даннета. Значение Р <0,05 считалось статистически значимым.

Трансфицированные VSMC, включая клетки, трансфецированные pGCsi-FU-Irf-1, pGCFU-Irf-1 или pGC-FU-вектором, инкубировали при нормальной глюкозе (5,5 мМ), нормальной глюкозе / H2O2 (0,06 ммоль / л), высокой глюкозе (25 мМ), с высоким уровнем глюкозы / NAC (20 ммоль / л), соответственно. Через 5 дней клетки высевали при 50% слиянии в 12-луночных планшетах, дважды промывали PBS и фиксировали в 95% этаноле в течение 30 мин при комнатной температуре. Кролик anti phospho-Erk1 / 2 (Cell Signaling Technology, Inc.) применяли для инкубации клеток при 4 ° С в течение ночи. После инкубации клеток со вторичными антителами анти-кроличьего IgG-TRITC (Sigma-Aldrich, Inc.), используемого при разведении 1: 100 в течение 60 мин при комнатной температуре, визуализацию флуоресценции визуализировали с помощью микроскопа Olympus IX70. Процент положительных клеток определяли путем подсчета положительных окрашивающих клеток и общих клеток в одном поле зрения под микроскопом. По меньшей мере три поля (около 300 клеток) подсчитывались в каждом образце. Средние данные представлены как средства ± SD и сравниваются с тестом Dunnett.

Ранее сообщалось, что избыточная экспрессия Irf-1 значительно снижает пролиферацию VSMC в нормальных условиях глюкозы [1]. Обнаружение согласуется с результатами, полученными в этом исследовании, которые показали, что в нормальных условиях глюкозы более 88% VSMC, трансфецированных pGC-FU-Irf-1, находились в фазе G0 / G1 клеточного цикла, а процент клеток в фазах S и G2 / M была значительно ниже по сравнению с нетрансфицированными клетками (табл. 1). Эти результаты показывают, что избыточная экспрессия Irf-1 снижает активность пролиферации и ингибирует прогрессирование клеточного цикла в VSMC.

Анализ распределения циклов VSMC методом проточной цитометрии

Значения представляют собой среднее ± SD из трех повторений, повторяющихся в 4 отдельных экспериментах.

* P <0,05 по сравнению с соответствующими значениями в нетрансфицированных VSMC; ^ P <0,05 по сравнению с соответствующими значениями в VSMC при нормальной глюкозе; #P <0,05 по сравнению с соответствующими значениями в VSMC при высокой глюкозе.

Чтобы определить влияние избыточной экспрессии Irf-1 на циклины и CDK в нормальных условиях глюкозы, VSMC трансфицировали pGCFU-Irf-1, и экспрессию циклина D1, циклина E, CDK2 и CDK4 исследовали с помощью Вестерн-блот-анализа. Результаты показали, что экспрессия циклина D1 и CDK4 в VSMC, трансфецированных pGC-FU-Irf-1, была значительно ниже уровней в нетрансфицированных VSMC или VSMC, трансфицированных пустым pGC-вектором (pGC-FU) (P <0,01, n = 5; фиг. 1), что указывает на то, что избыточная экспрессия Irf-1 с пониженной регуляцией экспрессии циклина D1 и CDK4 в нормальных условиях глюкозы. Напротив, не наблюдалось существенной разницы в экспрессии циклина E или CDK2 между VSMC, трансфицированными pGC-FU-Irf-1 и контрольными клетками в нормальных условиях глюкозы (P> 0,05, n = 5, Рисунок 1).

Изучение экспрессии циклин / CDK в трансфицированных VSMC при нормальной глюкозе. a: Вестерн-блот-анализ циклина D1, CDK4, cyclin E и CDK2 через 5 дней инкубации трансфицированных VSMC с нормальной глюкозой; b: количественная оценка уровней белка циклина / CDK посредством комплексного анализа оптической плотности. * P <0,05; ** P <0,01 по сравнению с соответствующими значениями в нетрансфицированных VSMC.

В предыдущем исследовании было показано, что избыточная экспрессия Irf-1 ускоряет пролиферацию VSMC и что понижающая регуляция экспрессии Irf-1 значительно подавляет пролиферацию VSMC в условиях высокой глюкозы [1]. В этом исследовании результаты показали, что при высоких условиях глюкозы VSMC, трансфецированные pGC-FU-Irf-1, показали значительно больший процент клеток в фазах S и G2 / M, тогда как клетки, трансфицированные pGCsi-FU-Irf-1, более низкий процент клеток в этих фазах по сравнению с нетрансфицированными клетками (таблица 1). Это означает, что чрезмерная экспрессия прогрессирования клеточного цикла Irf-1 и глушение Irf-1 вызывали противоположный эффект при высоких условиях глюкозы.

Чтобы определить влияние уровней Irf-1 на циклины и CDK в условиях высокой глюкозы, VSMC трансфицировали pGCsi-FU-Irf-1 и pGCFU-Irf-1, а экспрессия циклина D1, циклина E, CDK2 и CDK4 была определяли с помощью вестерн-блот-анализов. Результаты показали, что экспрессия циклина E и CDK2 в VSMC, трансфицированных pGCsi-FU-Irf-1, была значительно ниже, чем экспрессия, зарегистрированная в нетрансфицированных VSMC и VSMC, трансфицированных пустым pGC-вектором (P <0,01, n = 5; 2), что указывает на то, что молчание Irf-1 подавляло экспрессию двух белков в условиях высокой глюкозы. Напротив, экспрессия cyclin E и CDK2 в VSMC, трансфецированных pGCFU-Irf-1, была значительно выше, чем уровни в нетрансфицированных VSMC и VSMC, трансфицированных пустым pGC-вектором (P <0,01, n = 5; рисунок 2), что указывает что избыточная экспрессия Irf-1 повышает цикличность E и CDK2 в условиях повышенной глюкозы. Кроме того, не наблюдалось существенной разницы в экспрессии циклина D1 и CDK4 между VSMC, трансфицированными pGCsi-FU-Irf-1 или pGC-FU-Irf-1 и контрольных клеток в условиях высокой глюкозы (P> 0,05, n = 5 ; Фигура 2).

Изучение экспрессии циклин / CDK в трансфицированных VSMC при высокой глюкозе. a: Вестерн-блот-анализ циклина D1, CDK4, cyclin E и CDK2 через 5 дней инкубации трансфицированных VSMC с высокой глюкозой; b: количественная оценка уровней белка циклина / CDK посредством комплексного анализа оптической плотности. * P <0,05; ** P <0,01 по сравнению с соответствующими значениями в нетрансфицированных VSMC.

Производство ROS в VSMC измеряли с помощью проточного цитометрического анализа. Результаты показали, что уровень внутриклеточного ROS в условиях высокой глюкозы был выше, чем в нормальных условиях глюкозы (P <0,01, n = 12, Рисунок 3 и Таблица 2), что указывает на то, что лечение высокой глюкозой значительно увеличивало уровень внутриклеточного ROS в VSMC.

Производство внутриклеточного ROS измеряли с помощью анализа проточной цитометрии в условиях высокого уровня глюкозы или нормальной глюкозы. Значения показаны как относительная шкала измерения интенсивности флуоресценции (высокий уровень глюкозы / 2 дня = 100). * P <0,05; ** P <0,01 по сравнению с соответствующими значениями в VSMC при нормальных условиях глюкозы. 2 дня, 4 дня и 6 дней = VSMC, инкубированные с высокой глюкозой или нормальной глюкозой в течение 2 дней, 4 дней и 6 дней.

Анализ внутриклеточных уровней РОС методом проточной цитометрии

Значения представляют собой среднее ± SD из трех повторений, повторяющихся в 4 отдельных экспериментах. Они показаны как относительная шкала измерения интенсивности флуоресценции (высокий уровень глюкозы / 2 дня = 100).

2 дня, 4 дня и 6 дней = VSMC, инкубированные с высокой глюкозой или нормальной глюкозой в течение 2 дней, 4 дней и 6 дней.

* P <0,05; ** P <0,01 по сравнению с соответствующими значениями в VSMC при нормальных условиях глюкозы.

Когда VSMC обрабатывали NAC, между VSMC, трансфицированными pGC-FU-Irf-1 и контрольными клетками в условиях высокой глюкозы (P> 0,05, n = 12), не наблюдалось существенной разницы в количестве клеток или активности пролиферации (рис. 4). Напротив, после добавления H2O2 к клеткам количество pSM-FU-Irf-1-трансфецированных VSMC было значительно больше по сравнению с нетрансфицированными VSMC и VSMC, трансфицированными пустым pGC-вектором в нормальных условиях глюкозы (P <0,01, n = 12; фиг. 4). Эти результаты согласуются с результатами, полученными с использованием анализа ЭДУ, что указывает на то, что активность пролиферации VSMC, трансфицированных pGC-FU-Irf-1, была значительно увеличена по сравнению с нетрансфицированными VSMC и VSMC, трансфицированными пустым pGC-вектором в присутствии H2O2 или ROS (P <0,01, n = 12; фиг. 4).

Сравнение пролиферации клеток в трансфецированных VSMC после лечения NAC, H2O2 или U0126. a: номера клеток подсчитывали с помощью гемоцитометра; b: пролиферацию клеток также измеряли с использованием анализа ЭДУ; представленные данные представляют собой среднее ± SD тройных определений, повторяющихся в четырех отдельных экспериментах. Высокие уровни глюкозы / NAC =, инкубированные с высокой глюкозой и NAC в течение 5 дней; нормальная глюкоза / H2O2 = клетки, инкубированные с нормальной глюкозой и H2O2 в течение 5 дней; Высокая глюкоза / U0126 = клетки, инкубированные с высокой глюкозой и U0126 в течение 5 дней; нормальная глюкоза / H2O2 / U0126 = клетки, инкубированные с нормальной глюкозой, H2O2 и U0126 в течение 5 дней. * P <0,05; ** P <0,01 по сравнению с соответствующими значениями в нетрансфицированных VSMC.

Когда VSMC обрабатывали NAC, мощный антиоксидант, существенных различий в экспрессии cyclin E или CDK2 не наблюдалось между VSMC, трансфицированными pGC-FU-Irf-1 и контрольными клетками в условиях высокой глюкозы, что указывает на то, что NAC блокировал Irf- 1-индуцированная повышенная регуляция циклина E и CDK2 в условиях высокой глюкозы (P> 0,05, n = 5, фиг. 5). После добавления H2O2 в клетки экспрессия двух белков в VSMC, трансфецированных pGC-FU-Irf-1, была значительно выше, чем уровни экспрессии, наблюдаемые в нетрансфицированных VSMC и VSMC, трансфицированных пустым pGC-вектором в нормальных условиях глюкозы ( P <0,01, n = 5, фиг. 5), что указывает на то, что Irf-1-опосредованная восходящая регуляция циклина E и CDK2 в условиях высокой глюкозы регулируется ROS.

Вестерн-блот-анализ циклина E и CDK2 в трансфицированных VSMC после лечения NAC или H2O2. a: Вестерн-блот-анализ экспрессии уровней белка cyclin E и CDK2 в трансфицированных VSMC; b: количественная оценка уровней белка cyclin E и CDK2 с помощью интегрированного анализа оптической плотности. Высокие уровни глюкозы / NAC =, инкубированные с высокой глюкозой и NAC в течение 5 дней; нормальная глюкоза / H2O2 = клетки, инкубированные с нормальной глюкозой и H2O2 в течение 5 дней. * P <0,05; ** P <0,01 по сравнению с соответствующими значениями в нетрансфицированных VSMC.

Для определения влияния уровней Irf-1 и ROS на регуляцию клеточного цикла распределение клеточного цикла VSMC оценивали с помощью проточной цитометрии. В условиях высокого уровня глюкозы VSMC, трансфецированные pGC-FU-Irf-1, показали значительно больший процент клеток в фазах S и G2 / M, тогда как клетки, трансфецированные pGCsi-FU-Irf-1, проявляли более низкий процент клеток в этих фазах по сравнению с нетрансфицированными клетками. Напротив, трансфицированные VSMC, обработанные NAC / высоким уровнем глюкозы, не показали существенной разницы в процентах от S и G2 / M фаз по сравнению с контрольными клетками (таблица 1). В нормальных условиях глюкозы более 88% VSMC, трансфицированных pGC-FU-Irf-1, находились в фазе G0 / G1 клеточного цикла, а процент клеток в фазах S и G2 / M был значительно ниже по сравнению с нетрансфицированным клетки. Напротив, VSMC, трансфицированные pGC-FU-Irf-1 и обработанные H2O2 / нормальной глюкозой, показали значительно больший процент клеток в фазах S и G2 / M, тогда как более низкий процент клеток, трансфицированных pGCsi-FU-Irf-1 были в этих фазах по сравнению с нетрансфицированными клетками (табл. 1). Эти результаты показывают, что ускорение или остановка клеточного цикла, поддерживаемого Irf-1 в условиях высокой глюкозы, регулировалось ROS.

Когда VSMC обрабатывали U0126, специфический ингибитор MEK ингибитора Ек1 / 2 выше по потоку, никаких существенных различий в активности клеточной пролиферации, экспрессии циклина E / CDK2 и распределения клеточного цикла не наблюдалось между VSMC, трансфицированными pGC-FU-Irf-1 и контролем клеток в условиях высокого уровня глюкозы. Аналогичным образом не было существенной разницы в активности пролиферации, экспрессии cyclin E / CDK2 и распределении цикла между pSM-FU-Irf-1-трансфицированными VSMC и контрольными клетками с обработкой U0126 в нормальных условиях глюкозы / H2O2 (P> 0,05, n = 12; фиг. 4) (P> 0,05, n = 5, фиг. 6) (таблица 1). Эти данные показывают, что блокирующий путь Erk1 / 2 ингибировал Irf-1-опосредованную ROS или гипергликемию-зависимую пролиферацию VSMC.

Вестерн-блот-анализ циклина E и CDK2 в трансфецированных VSMC после лечения U0126. a: Вестерн-блот-анализ экспрессии уровней белка cyclin E и CDK2 в трансфицированных VSMC; b: количественная оценка уровней белка cyclin E и CDK2 с помощью интегрированного анализа оптической плотности. Высокая глюкоза / U0126 = клетки, инкубированные с высокой глюкозой и U0126 в течение 5 дней; нормальная глюкоза / H2O2 / U0126 = клетки, инкубированные с нормальной глюкозой, H2O2 и U0126 в течение 5 дней. * P <0,05; ** P <0,01 по сравнению с соответствующими значениями в нетрансфицированных VSMC.

Фосфорилирование ERK1 / 2 (фосфо-Erk1 / 2) определяли окрашиванием иммунофлюоресценцией. Процентное содержание фосфо-Erk1 / 2-положительных клеток было низким примерно на 2-3% при нормальных условиях глюкозы или высокой глюкозы / NAC, тогда как процент был большим около 26-27% в условиях высокого уровня глюкозы или нормальной глюкозы / H2O2. Кроме того, VSMC, трансфецированные pGC-FU-Irf-1, показали значительно больший процент позитивных клеток фосфо-Erk1 / 2, тогда как клетки, трансфицированные pGCsi-FU-Irf-1, имели более низкий процент фосфори-Erk1 / 2 положительных клеток по сравнению к нетрансфицированным клеткам в условиях высокого уровня глюкозы или нормальной глюкозы / H2O2. Напротив, трансфецированные VSMC, обработанные высоким уровнем глюкозы / NAC или нормальной глюкозой, не показали существенной разницы в процентах от положительных клеток фосфо-Erk1 / 2 по сравнению с контрольными клетками (рисунок 7) (таблица 3). Эти результаты показывают, что избыточная экспрессия Irf-1 способствовала активации Erk1 / 2 и замораживанию Irf-1, что приводило к противоположному эффекту в условиях высокого уровня глюкозы или нормальной глюкозы / H2O2.

Представительное отрицательное или положительное окрашивание фосфо-Erk1 / 2 в VSMC. Высокая глюкоза = клетки, инкубированные с высоким содержанием глюкозы в течение 5 дней; нормальная глюкоза = клетки, инкубированные с нормальной глюкозой в течение 5 дней; Высокие уровни глюкозы / NAC =, инкубированные с высокой глюкозой и NAC в течение 5 дней; нормальная глюкоза / H2O2 = клетки, инкубированные с нормальной глюкозой и H2O2 в течение 5 дней. Положительное окрашивание фосфо-Erk1 / 2 показывает красный и трансфицированный VSMCs зеленым (GFP).

Процент положительных клеток фосфо-Erk1 / 2

Значения представляют собой среднее ± SD из определений, повторяющихся в 4 отдельных экспериментах (12 образцов). Для одного образца процент положительных клеток определяли путем подсчета положительных окрашивающих клеток и общих клеток в трех визуальных полях (около 3 × 300 клеток).

* p <0,05 против соответствующих значений в нетрансфицированных VSMC; ^ P <0,05 по сравнению с соответствующими значениями в VSMC при нормальной глюкозе; #P <0,05 по сравнению с соответствующими значениями в VSMC при высокой глюкозе.

+ представляет положительный; ++ представляет собой сильный позитив.

Гипергликемия является фактором риска сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности у пациентов [10]. Для клиники имеет важное значение для выяснения механизмов, зависящих от гипергликемии, ответственных за сердечно-сосудистые заболевания. В частности, молекулярные медиаторы, реагирующие на болезни с высоким уровнем глюкозы, могут оказаться потенциальным геном-мишенью для лечения заболеваний [11,12]. В настоящее время большинство из них еще предстоит определить. Irf-1, молекулярный медиатор сосудистых заболеваний, ранее был известен как отрицательный. Однако некоторые недавние исследования показали, что Irf-1 не был отрицательным медиатором, но даже положительным [1,13,14].

Irf-1 проявляет активность супрессора опухоли и считается отрицательным регулятором роста клеток путем регулирования нисходящих эффекторных генов [3,15,16]. Хорошо известно, что циклин D и CDK4 образуют комплекс, который способствует переходу G1 / S-фазы в регуляцию клеточного цикла. Kröger et al. [6] сообщили, что Irf-1 ингибирует рост клеток путем подавления транскрипции гена cyclin D / CDK4. Таким образом, циклин D / CDK4 может быть нисходящими эффекторными генами, участвующими в ингибировании роста VSMC, индуцированным Irf-1. В предыдущем исследовании [1] мы определили, что избыточная экспрессия Irf-1 в VSMCs обладает антипролиферативным эффектом в нормальных условиях глюкозы, что согласуется с опухолевым супрессорным действием Irf-1. В этом исследовании мы подтвердили, что избыточная экспрессия Irf-1 приводит к понижающей регуляции циклина D1 / CDK4 и ингибирует прогрессирование клеточного цикла VSMC в нормальных условиях глюкозы, что указывает на то, что cyclin D1 / CDK4 являются нисходящими эффекторными генами Irf-1 с антипролиферативным влияние на VSMC.

В отличие от антипролиферативного эффекта Irf-1 / нормальной глюкозы на клетках, мы ранее показали, что Irf-1 / высокая глюкоза оказывает пропролиферативное действие на VSMC [1]. Вероятным механизмом, лежащим в основе этого расхождения, является то, что Irf-1, регулятор транскрипции, регулирует нисходящие эффекторные гены в условиях высокой глюкозы, которые отличаются от генов, которые он регулирует в нормальных условиях глюкозы. Известно, что Cyclin E и его каталитический партнер CDK2 играют важную роль в контрольной точке G1 / S клеточного цикла [17]. В этом исследовании мы обнаружили, что избыточная экспрессия Irf-1 повышает скорость экспрессии циклина E / CDK2 и ускоряет клеточный цикл. Напротив, глушение Irf-1 подавляло экспрессию этих двух белков и ингибировало клеточный цикл во время высокой пролиферации VSMC, вызванной глюкозой. Этот вывод показывает, что нисходящие эффекторные гены Irf-1 являются циклинами E / CDK2 и что они положительно регулируются в условиях высокой глюкозы, тогда как циклин D1 / CDK4 отрицательно регулируется в нормальных условиях глюкозы. В каскаде сигнализации циклин / CDK циклин D / CDK4 и циклин E / CDK2 известны как последовательная активация, которая способствует переходу G1 / S-фазы. Следовательно, через нисходящие эффекторы cyclin D / CDK4 Irf-1 может оказывать антипролиферативное действие в нормальных условиях глюкозы, но через cyclin E / CDK2 он может ускорить пролиферацию в условиях высокой глюкозы.

Irf-1 считается отрицательным регулятором роста клеток в условиях типичного состояния / нормальной глюкозы. Почему Irf-1 активирует циклин E / CDK2 и способствует распространению VSMC в условиях высокого уровня глюкозы? В нескольких исследованиях объясняется это различие с ROS, основанное на понятии, что ROS влияет на пролиферацию клеток и способствует прогрессированию клеточного цикла путем активации циклин / CDK, поскольку уровни ROS неуклонно растут во время высокой пролиферации, индуцированной глюкозой, VSMC [18-21]. Соответственно, было высказано мнение о том, что ROS участвуют в пролиферации VSMC, индуцированной Irf-1 / высокой глюкозой. В настоящем исследовании мы обнаружили, что лечение высокой глюкозой значительно повысило уровень внутриклеточного ROS в VSMC и когда VSMC, сверхэкспрессирующие Irf-1 в условиях высокой глюкозы, обрабатывали антиоксидантами, пролиферированием VSMC, повышающей регуляцию циклина E / CDK2 и ускорение процесса клеточного цикла не наблюдалось. Напротив, стимуляция H2O2 в нормальных условиях глюкозы в клетках с избыточным экспрессией Irf-1 вызывала пролиферацию клеток, повышающую регуляцию циклического E / CDK2 и ускорение клеточного цикла, что указывает на то, что при стимуляции ROS или H2O2 положительная регуляторная активность Irf-1 могут играть роль в росте клеток.

Активация пути Erk1 / 2 MAPK имеет важное значение для роста VSMC. ROS было показано по пути Erk1 / 2, чтобы опосредовать клеточные пролиферативные эффекты [9,18]. В этом исследовании мы наблюдали, что когда VSMC, сверхэкспрессирующие Irf-1, обрабатывали U0126, специфический ингибитор Erk1 / 2 отменил пролиферацию VSMC, повышающую регуляцию циклина E / CDK2 и ускорение прогрессирования клеточного цикла при высокой глюкозе или нормальные условия глюкозы / H2O2. Эти результаты показывают, что активация Erk1 / 2 требуется для Irf-1-опосредованной гипергликемией-зависимой пролиферации VSMC. В совокупности выше данные указывают на путь Irp-1-опосредованной гипергликемией-зависимой пролиферации VSMC. Во-первых, высокая стимуляция глюкозы повышает уровень внутриклеточного ROS в VSMC. Впоследствии, по пути Erk1 / 2, повышенная ROS индуцирует повышение регуляции циклина E / CDK2, что приводит к пролиферации VSMC и ускорению клеточного цикла. Поскольку избыточная экспрессия Irf-1 способствует активации Erk1 / 2 в условиях высокой глюкозы, положительная регуляторная активность Irf-1 может играть роль в гипергликемий-зависимой пролиферации VSMC.

В заключение мы продемонстрировали, что нижестоящие эффекторные гены Irf-1 представляют собой циклин E / CDK2 во время высокой пролиферации, индуцированной глюкозой, VSMC, тогда как они являются циклинами D1 / CDK4 в нормальных условиях глюкозы. Повышенная экспрессия VSMC, индуцированная избыточной экспрессией Irf-1, повышение регуляции циклина E / CDK2 и ускорение прогрессирования клеточного цикла связаны с сигнальным путем ROS / ERK1 / 2 в условиях высокой глюкозы. Результаты настоящего исследования могут оказаться важными для содействия нашему пониманию механизмов развития и регуляции диабетических сосудистых заболеваний.

Irf-1: регуляторный фактор-интерферон-1; VSMC: сосудистые клетки гладкой мускулатуры; siRNA: интерферирующие последовательности РНК; FBS: фетальная бычья сыворотка; CDK: Циклон-зависимая киназа; NAC: N-ацетилцистеин; ЭДУ: этинилдезоксиуридин; ROS: реактивные виды кислорода; ERK1 / 2: Внеклеточно-регулируемые протеинкиназы1 / 2.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

XZ проводил культуру клеток, проводил молекулярные эксперименты, участвовал в разработке исследования и составлял рукопись. LL проводили окрашивание иммунофлюоресценции, пролиферацию клеток и цикл. CC проводил анализ вестерн-блоттинга и внутриклеточное измерение ROS. Y-LC помог подготовить рукопись. X-QY участвовал в разработке исследования. YX выполнил подготовку реагента. X-TL участвовал в подготовке реагентов и статистическом анализе. S-LG провела статистический анализ. S-HX участвовал в разработке исследования. M-RS помог разработать рукопись. YS участвовал в клеточной культуре. K-MH участвовал в молекулярных экспериментах. C-SZ задумал исследование, участвовал в его разработке и координации и помог разработать рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Си Чжан, Лонг Лю и Чао Чен являются одними из первых авторов.

pGC-FU-Irf-1 положительные клоны идентифицировали с помощью ПЦР (идентифицированные группы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 были положительными клонами).

Нажмите здесь для файла

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *