Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Тест ImmunoSignature отличает трипаносома cruzi, гепатит B, гепатит C и вирусный гепатит Западного Нила среди бессимптомных доноров крови

An ImmunoSignature test distinguishes Trypanosoma cruzi, hepatitis B, hepatitis C and West Nile virus seropositivity among asymptomatic blood donors
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5600393/

Я прочитал политику журнала, и авторы этой рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: авторы заняты HealthTell, Inc. Это не изменяет приверженность авторов PLOS Забытые тропические болезни Редакционные политики и критерии, которые все авторы имеют читать.

Текущий адрес: Abreos Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, Соединенные Штаты Америки

Сложность эукариотического паразита Trypanosoma (T.) cruzi проявляется в его высокодинамичном геноме, многолетнем жизненном цикле, прогрессивных морфологиях и механизмах иммунитета. Точное определение инфекции или активности и прогноза болезни Шагаса продолжает бросать вызов исследователям. Мы предположили, что диагностическая платформа с более высокой лигандной сложностью, чем использовалась ранее, может иметь ценность.

Мы применили технологию ImmunoSignature (IST) для обнаружения специфичных для T. cruzi антител среди здоровых доноров крови. IST основан на захвате информации в репертуаре антител человека, подвергая их периферическую кровь библиотеке с более чем 100 000 позиционно-адресуемых, химически разнообразных пептидов.

Первоначально изучались образцы из двух когорт Чагаса, которые были положительными или отрицательными при тестировании банка. В первой когорте библиотечные пептиды, отображающие сигналы дифференциального связывания между серосостояниями T. cruzi, были использованы для обучения алгоритму. Классификатор был исправлен и протестирован против независимой от обучения второй когорты для определения эффективности анализа. Затем образцы из смешанной когорты доноров, объявленные положительными для Chagas, вируса гепатита B, вируса гепатита C или West Nile, были проанализированы в одной и той же библиотеке. Сигналы использовались для обучения одного алгоритма, который отличал все четыре состояния болезни. В качестве бинарного теста точность прогнозирования серопозитивности T. cruzi по IST была аналогичной, возможно, умеренно уменьшенной по сравнению с обычными ELISA. Однако результаты показывают, что информация, не зависящая от серопозитивности, может быть захвачена. К ним относятся идентификация когортных подклассов, одновременное обнаружение и распознавание других заболеваний и открытие предполагаемых новых антигенов.

Центральный результат этого исследования установил IST как надежный подход для специфического определения серопозитивности T. cruzi по сравнению с больными безболезненными индивидуумами или с другими заболеваниями. Его потенциальный вклад в мониторинг и контроль Chagas заключается в том, что IST обеспечивает считывание состояния с высоким разрешением, чем полученное с использованием в настоящее время технологий. Несмотря на сложность представления лиганда и большие количественные показания, выполнение теста IST является простым, масштабируемым и воспроизводимым.

Наиболее распространенная паразитарная инфекция в Латинской Америке вызывает болезнь Шагаса. Диагноз основан на серологических тестах, потому что прямое обнаружение T. cruzi очень сложно за пределами его короткой острой фазы. Сложность патофизиологии этого паразита и сложное взаимодействие человеческой иммунной системы с ней делают существующие методы косвенной диагностики субоптимальными. Мы применили технологию ImmunoSignature для диагностики Chagas. В дополнение к аппроксимированию точности текущих испытаний, один тест IST одновременно отличал четыре болезни группы крови, включая Chagas. Другие уникальные аспекты включают продемонстрированную способность идентифицировать подклассы внутри серопозитивных индивидуумов. В отличие от других тестов, IST использует химически разнообразные пептиды, а не протеомические последовательности, в качестве лигандов, захватывающих антитела, для идентификации образцов связывания антител, которые различаются между состояниями здоровья. Некоторые из характерных для Chagas лигандов были обогащены последовательностными мотивами, которые соответствовали известным эпитопам T. cruzi; неотображаемые последовательности предполагают наличие дополнительных целей. Хотя IST также является косвенным методом, он обладает большей емкостью для доставки серологической обратной связи высокого разрешения. Относительно предоставления этого теста миллионам людей, которые, по оценкам, заражены T. cruzi, IST обладает высокой масштабируемостью и воспроизводимостью.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации, за исключением необработанных интенсивностей сигнала всех массивных библиотечных пептидов всех образцов доноров, используемых при разработке алгоритмов Chagas и multi-disease; они доступны в виде таблиц данных из репозитория данных Dryad в разделе DOI 10.5061 / dryad.p6882 (http://dx.doi.org/10.5061/dryad.p6882).

Болезнь Шагаса считается самой важной паразитической инфекцией в западном полушарии, которая измеряется потерями жизни, скорректированными по инвалидности, и превосходит малярию более чем в 7 раз [1-5]. Он встречается преимущественно в Латинской Америке, но миграция инфицированных людей увеличила географическое распределение в Европу, Северную Америку, Японию и Австралию [5-8]. Это глобально основная причина инфекционного миокардита [8-10]. Невзирая на это значительное бремя здоровья, ресурсы для его контроля считаются крайне ограниченными [11, 12]. Этиологический агент, Trypanosoma (T.) cruzi, является жгутиковым простейшим, передаваемым преимущественно через кровососущих триатоминовых насекомых в хозяевах млекопитающих, где он может проникать и размножаться в широком диапазоне типов нуклеированных клеток. Другие способы распространения включают переливание крови или врожденные и оральные пути [13]. Здесь мы исследуем потенциальное применение технологии ImmunoSignature (IST) к диагностическим проблемам болезни Шагаса.

Через неделю или около того после заражения протозойной стадией трипомастиготы хозяева испытывают острую фазу, характеризующуюся микроскопически видимыми паразитами крови и тканевым паразитизмом. Симптомы обычно мягкие и неспецифические, так что эта фаза часто не диагностируется; однако, редкие случаи проявляются с болезнетворными периорбитальными опухолями или язвенными поражениями на месте входа. В менее чем 1% случаев острая фаза является тяжелой и опасной для жизни [5]. Выжившие переходят в хронически инфицированную фазу, в которой хозяин и паразит иммунологически сбалансированы и симптомы разрешаются. Большинство пациентов останутся на этой клинически неопределенной стадии жизни, обычно сопровождающейся потерей обнаруживаемой паразитемии, хотя низкие уровни внутриклеточных паразитов могут оставаться измеримыми в определенных тканях [13, 14]. С 10 до 30 лет спустя третий или более из этих людей перерастет в симптоматическую стадию хронического заболевания. Они страдают тяжелыми проявлениями сердечного, желудочного и других заболеваний, связанных с органами, которые приводят к необратимым мышечным повреждениям и часто смерти [15-17]. Основываясь на текущих оценках истинной распространенности инфекции T. cruzi, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) недавно подсчитала, что около 200 000 человек умрут от кардиомиопатии шагаса в течение следующих пяти лет. По прогнозам, аналогичное число женщин умирает в США от рака молочной железы в тот же промежуток времени [18].

Единственные два препарата, доступные для лечения Chagas [7, 19], показали ограниченную эффективность [20, 21] и заметные побочные эффекты [19, 22]. Открытие новых препаратов против инфекций T. cruzi, которые являются более безопасными и эффективными [23], было затруднено из-за отсутствия надежных практических методов для оценки эффективности на субклинических или клинических стадиях хронической фазы. Существует множество проблем для измерения статуса инфекции и терапевтического воздействия на этом этапе [24]. Например: i) паразитемия является субпатентной, а низкие уровни скрытых от органа паразитов анатомически разбросаны, ii) другие эндемичные паразиты, такие как Leishmania и Plasmodium spp. имеют сходные антигены с T. cruzi и iii) нет надежных биомаркеров начального или активного заболевания [25]. Таким образом, необходимо провести тест, который стратифицирует сероположительные индивидуумы T. cruzi в клинически различных группах. Эти страты включают в себя различение индивидуумов, которые остаются инфицированными от тех, кто справляется с хронической фазовой инфекцией. Было бы также желательно предсказать, какие индивидуум-стадии индивидуумы останутся бессимптомными от тех, которые будут развиваться, чтобы страдать от опасных для жизни осложнений. Недавнее исследование выявило четыре биомаркера, которые добавили прогностическую ценность краткосрочной смертности у пациентов, страдающих тяжелой кардиомиопатией [26]. В другом исследовании был определен набор воспалительных цитокинов и кардиомиопарков, которые были увеличены у пациентов с тяжелым заболеванием [25]. Анализ транскриптомы выявил ряд генов, дифференциально выраженных между пациентами с умеренной и тяжелой кардиомиопатией Шагаса [27]. Вместе эти результаты показывают, что возможна молекулярная стратификация клинически различных групп пациентов.

ВОЗ рекомендует диагностировать заболевание на основе эпидемиологического риска и лабораторных испытаний [28]. В острой фазе возможно прямое обнаружение паразита; однако это не является достоверно чувствительным в хронической фазе. Для этих людей диагноз основан на косвенном положительном выявлении двумя серологическими тестами [29]. В 2007 году американские центры крови начали серологически скрининг крови и доноров органов. FDA одобрило тесты ELISA [30] и Ortho T. cruzi [31]. Они сообщают сигнал об отключении значения (S / CO), который количественно оценивает уровни связывания лизата-антигена в плазме крови и отражает титры антител. Подтверждающий анализ радиоиммунопреципитации (Quest Diagnostic T. cruzi RIPA) [32] регулярно используется многими банками крови [30].

Анализы нового поколения разрабатываются на основе различных смесей рекомбинантных белков. В исследовании, посвященном скринингу новых кандидатов на антиген, была проанализирована черепичная пептидная матрица, охватывающая 457 протеинов T. cruzi, против объединенных препаратов иммуноглобулина G (IgG), очищенных от положительных сывороток T. cruzi-антитела. Анализ связывания выявил 97 новых кандидатов-антигенов [33]. Поскольку этот эукариотический патоген имеет сложный протеом и жизненный цикл [34], многие цели могут потребоваться для полного захвата иммунных реакций человека на него [8]. Предпосылкой для разработки теста с новыми диагностическими возможностями, связанными с болезнью Чагаса, является доступ к надежной и масштабируемой платформе для измерения разнообразия ответов хозяев на инфекции T. cruzi.

Технология ImmunoSignature продемонстрировала применимость к классификации многих иммунологически обусловленных заболеваний [35-40]. Он основан на разнообразных, но воспроизводимых паттернах связывания периферических антител с матрицей из более 100 000 пептидов, которые были выбраны для обеспечения несмещенной выборки всех возможных аминокислотных (а.а.) комбинаций, а не для соответствия любым биологическим последовательностям. Анализ проводят с небольшим образцом крови, плазмы или сыворотки [41]. Пептид, связанный антителом, по-видимому, не является исходной последовательностью распознавания антител, а скорее имитирует последовательность или структуру эпитопа. Поскольку разнообразие химических последовательностей на несколько порядков превышает протеомические последовательности, предоставляется широкий спектр мимикрии. Например, пептид с химической библиотекой может имитировать линейную последовательность, структуру, мутированную последовательность, такую ​​как обнаруженный в опухолях, или непептидную биомолекулу, такую ​​как углевод. Даже если родственный эпитоп является пептидным и линейным, вероятность любого миметического пептида (мимотопа), точно соответствующего эпитопу, низка, потому что массивная библиотека пептидов только пробывает пространство химической последовательности. Каждая пептидная последовательность IST, которая избирательно связана антителом, является функциональным суррогатом эпитопа, который антитело распознает in vivo. Когда сигнал мимотопа уникален для состояния здоровья, связанное антитело становится биомаркером. В совокупности все специфически связанные антитела, коррелированные с данным состоянием здоровья, являются информативными как для обнаружения, так и для мониторинга. Ключевым преимуществом этой платформы является то, что она не предназначена для размещения какого-либо одного заболевания, так что одна и та же библиотека является универсальной. В принципе, он должен быть информативным для любого состояния, которое вызывает специфический иммунный ответ, когда генерируется уникальный многомерный алгоритм. При желании размещение в конкретных приложениях можно зарезервировать как шаги оптимизации. В демонстрации этой универсальности мы провели два исследования с той же комбинаторной пептидной библиотекой. Вначале оценивали положительный и отрицательный контраст с бинарным заболеванием. Во-вторых, была изучена способность одновременно различать множественные инфекционные заболевания с одним алгоритмом. Для этой работы мы решили оценить способность IST классифицировать людей, которые были серопозитивными, но бессимптомными для T. cruzi, вируса гепатита B (HBV), вируса гепатита C (HCV) и вируса Западного Нила (WNV) или серонегативного для всех четырех , Имелись образцы крови от этих доноров, которые были ретроспективно собраны с использованием тех же протоколов и были объявлены положительными или отрицательными с помощью тех же схем тестирования.

Основная цель этой работы заключалась в том, чтобы установить возможность использования IST для выявления серологической позитивности T. cruzi у бессимптомных доноров крови, которые либо были T. cruzi серонегативными, либо были серопозитивными для другого заболевания. Представленные здесь исследования демонстрируют IST как жизнеспособный диагностический подход для T. cruzi и закладывают основу для его использования в новых областях клинически значимого открытия.

Образцы плазмы были собраны компанией United Blood Services (http://www.unitedbloodservices.org) и получены в Creative Ting Solutions (CTS, Tempe, AZ) в 2015 году в качестве образцов, которые были проверены группой крови как серологически позитивные для T. cruzi-специфические антитела и соответствующие возрастные и гендерно сходные образцы, которые были определены как отрицательные антитела T. cruzi. Вторая когорта сероположительных и серонегативных образцов T. cruzi была получена из CTS в 2016 году. Эти образцы испытывали отрицательные значения для всех других заболеваний группы крови. Дополнительные образцы плазмы, которые серологически тестировали положительный результат для HBV, HCV и WNV, были получены от CTS в 2016 году. Все они были собраны United Blood Services в США из популяции доноров крови; этническая принадлежность предоставляется тем, для которых она была сообщена CTS. После получения образцы оттаивали, часть каждого из них удаляли и смешивали 1: 1 с этиленгликолем в качестве криопротекторов, затем аликвотировали в одноразовые объемы. Аликвоты хранили при -20 ° С до тех пор, пока это не понадобится. Оставшийся неразбавленный объем образца хранился аккуратно при -80 ° C. Идентичность всех образцов отслеживалась с использованием двумерных штриховых трубок (Micronic, Leystad, Нидерланды). При подготовке к анализу аликвоты образцов нагревали на льду до 4 ° С и разбавляли 1: 100 в первичном инкубационном буфере (фосфатный буферный солевой раствор с 0,05% Твин 20 (PBST) и 1% маннита). Микротитровальные планшеты, содержащие разведения 1: 100, затем разбавляли до 1: 625 для использования в анализе. Для подмножества выборок, выбранных для оценки производительности платформы по многофакторным лотам, разведения 1: 100 были аликвоты в одноразовых планшетах для микротитрования и хранились при -80 ° C. Все стадии аликвотации и разбавления проводили с использованием роботизированной пипетирующей станции BRAVO (Agilent, Santa Clara, CA). Все процедуры, в которых использовались деидентифицированные, сэмплированные образцы плазмы, были рассмотрены Западным институционным советом по обзору (протокол № 20152816).

Комбинаторная библиотека из 125 509 пептидов со средней длиной 9 остатков и от 5 до 13 а.а была рассчитана на 99,9% от всех возможных 4-мерных и 48,3% всех возможных 5-мерных 16 а.а. Метионин и цистеин были исключены из-за их потенциала окисления и циклизации, что могло бы вызвать изменчивость зонда. Изолейцин и треонин были исключены из-за того, что валин и серин соответственно считаются химически и структурно подобными. Валин и серин были выбраны для включения, поскольку они структурно меньше, чем их исключенный аналог. Ограничение количества аминокислот уменьшало сложность изготовления и стоимость при сохранении обзора подобного разнообразия химического и структурного пространства. Несколько категорий контрольных пептидов добавили 6203 признаков. Например, 500 признаков соответствовали установленным эпитопам пяти различных хорошо охарактеризованных мышиных моноклональных антител (mAb), каждый из которых повторялся 100 раз. Еще 935 функций соответствовали четырем различным вариантам последовательности трех из пяти установленных эпитопов, каждый из которых воспроизводился от 100 до 280 раз. Еще 500 контрольных пептидов были разработаны с помощью a.a. композиции, подобные библиотечным пептидам, но были равномерно 8-мерными в длину и присутствовали в трех экземплярах. Медианные сигналы этих 1500 8-мер были количественно оценены и рассмотрены как часть библиотеки при разработке моделей IST; других контрольных пептидов не было. Связывание очищенных мышиных антител, человеческой плазмы человека и когорт нормальных образцов донорной плазмы ко всем этим элементам управления было проанализировано в исследованиях валидации платформы. Они также контролировались во всех библиотечно-ориентированных анализах, проводимых с использованием образцов исследования IST для обеспечения качества данных. Остальные 3 268 элементов управления включают фидуциальные маркеры, чтобы помочь выравниванию сетки, аналитическим управляющим последовательностям и функциям только для линкера. За исключением фидуциалов, все функции распределяются равномерно по всему массиву. Распределение репликационных признаков позволило проанализировать пространственную изменчивость путем измерения коэффициента вариации пептидов со многими или несколькими репликациями; он также позволил обнаружить любые градиенты сигнала или другие аберранты. Наконец, сами библиотеки пептидов служили в качестве категории элементов управления. А именно, оценка целевых специфических и побочных целей была проведена путем анализа связывания mAb с известным распознаванием эпитопов с разнообразной панелью библиотечных пептидов.

Пептиды синтезировали на пластине из оксида кремния толщиной 200 мм, используя стандартные инструменты для фотолитографии полупроводников, адаптированные для химического синтеза пептидов трет-бутилоксикарбонила (ВОС), с использованием способов, описанных ранее [40]. Короче говоря, функционализованная пластина аминосилана была покрыта BOC-глицином. Затем фоторезист, содержащий генератор фотокислот, который активируется ультрафиолетовым светом, наносят на пластину путем спинового покрытия. Экспозиция пластины к ультрафиолетовому излучению (365 нм) через фотомаску позволяет фиксировать выбор признаков на пластине с любой данной маской. После воздействия УФ-излучения пластина нагревалась, что позволяло BOC-снятие защиты с открытых объектов. Последующая промывка с последующим нанесением активированного а.a. завершит цикл. Каждый цикл добавлял конкретный a.a к N-концу пептидов, расположенных в масках определенных местах в массиве. Эти циклы повторялись, изменяя маску и а.а., которые были связаны по каждому признаку, чтобы получить комбинаторную библиотеку пептидов химической последовательности. Матрицы, используемые в исследовании Чагаса, были синтезированы на поверхности гидрофильной поверхности пластины (3-глицидоксипропил) триметоксисилана-2,2 ‘- (этилендиокси) бис (этиламин) с помощью полиэтиленгликолевого линкера. Массивы в исследовании с множественными заболеваниями были синтезированы на менее гидрофильной поверхности пластины (3-глицидоксипропил) триметоксисилана -поли (аллиламин) с помощью линкера SGSG.

Каждая завершенная пластина была нарезана кубиками в 13 прямоугольных областей, каждая из которых имела размеры стандартных слайдов микроскопа (25 мм х 75 мм). Каждый из слайдов содержал 24 массива, расположенных в восьми рядах на три столбца. Наконец, защитные группы на несколько а.а. боковые цепи удаляли с использованием стандартного коктейля [42]. Полностью подготовленные слайды хранили в сухом азоте до тех пор, пока они не использовались в анализах.

Было проведено несколько тестов качества, чтобы гарантировать, что массивы были изготовлены по техническим характеристикам процесса, включая использование статистических пределов 3σ для каждого шага. Вафельные партии периодически отбирались MALDI-MS для проверки того, что каждый a.a. соединяли с предполагаемой стадией с эффективностью> 97% (95% -100%), что обеспечивало правильность конечных продуктов комбинаторного синтеза. Производство вафель отслежено от начала до конца с помощью электронной пользовательской реляционной базы данных. Обычно отслеживаемые данные включают химикаты, рецепты, время и техник, выполняющий задачи. После того, как была изготовлена ​​пластина, данные были просмотрены, и записи были заблокированы и сохранены. Наконец, каждая партия была оценена в анализе связывания для подтверждения эффективности, как описано ниже.

Наша современная автоматизированная система, использующая коммерчески доступные инструменты для синтеза пластин, способна производить 1 248 массивов за три дня. Производство может быть увеличено путем добавления дополнительных смен или приобретения дополнительных автоматизированных систем.

Перед проведением анализов IST с донорской плазмой связывающую активность коммерческих моноклональных антител мыши (mAb) оценивали по сравнению с контрольными пептидами, соответствующими установленной последовательности распознавания каждого mAb. Массивы IST исследовали отдельно в трех повторностях: 2,0 нМ клонов антител 4C1 (GeneTex, Inc., Irvine, CA), p53Ab1 (EMD Millipore, Billerica, MA), p53Ab8 (EMD Millipore) и LnkB2 (Absolute Antibody, Ltd ., Кливленд, Соединенное Королевство) в буфере первичной инкубации (1% маннит, PBST), как подробно описано ниже. Связывание было обнаружено с 4,0 нМ козьим антимышиным IgG, конъюгированным с DyLight 549 (KPL, Inc., Gaithersburg, MD), и сигнал был определен количественно, как описано ниже.

Производящие микрочипы, изготовленные по качеству производства, повторно гидратировали перед использованием путем вымачивания при осторожном перемешивании в дистиллированной воде в течение 1 часа, PBS в течение 30 мин и буфере первичной инкубации (1% маннит, PBST) в течение 1 часа. Затем мелкие микрочипы промывали в дистиллированной воде для предотвращения остатков поверхностных солей и центрифугировали для удаления избыточной жидкости. Слайды загружались в кассету Microrayray ArrayIt (ArrayIt Corporation, Саннивейл, Калифорния), чтобы адаптировать отдельные слайды к площади микротитровальной пластины. Используя обработчик жидкости, 90 мкл каждого образца готовили в виде разведения 1: 625 в первичном инкубационном буфере (1% маннит, PBST), а затем переносили в кассету. Эту смесь инкубировали на массивах в течение 1 ч при 37 ° С с перемешиванием на TeleShake95 (INHECO, Martinsried, Germany) для связывания антитело-пептид. После инкубации кассету трижды промывали в PBST с использованием микропланшетной шайбы BioTek 405TS Select (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT). Связанное антитело было обнаружено с использованием либо 4,0 млн. Козьего анти-человеческого IgG (H + L), конъюгированного с AlexaFluor 555 (Invitrogen-Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA), или 4,0 нМ козьего анти-человеческого IgA, конъюгированного с DyLight 550 ( Novus Biologicals, Littleton, CO) во вторичном инкубационном буфере (0,5% казеина в PBST) в течение 1 часа при перемешивании на платформе MixShake95 при 37 ° C. После инкубации со вторичным антителом слайды снова промывали PBST с последующей дистиллированной водой; после снятия с кассеты, слайды распыляли изопропанолом и центрифугировали в сухом состоянии. Количественные измерения сигнала были получены путем определения относительного флуоресцентного значения для каждого адресуемого пептидного признака. Эти условия анализа были идентифицированы в нескольких конструкциях экспериментальных (DOE) матриц, в которых были перегруппированы плазменное разбавление, вторичная концентрация, блокирующий реагент, время инкубации и встряхивающая жидкость.

Отдельно проводили ELISA для оценки перекрестной реактивности между продуктами антител против IgG и анти-IgA, используемыми в этой работе. Был отмечен низкий уровень перекрестной реактивности для продукта против IgG против вторичной IgA; не было обнаружено никакой реактивности анти-IgA-продукта против вторичного реагента IgG.

Анализируемые микрочипы были отображены с использованием микроматричного сканера Innopsys 910AL, оснащенного 532-нм лазером и 572-нм BP 34-фильтром (Innopsys, Carbonne, France). Программное приложение Mapix (версия 7.2.1; Innopsys) идентифицировало области изображений, связанных с каждой функцией пептида, с использованием алгоритма автоматической сортировки. Флуоресцентные интенсивности были получены из 14 лазерных сканирований с разрешением 1 мкм для каждой характеристики массива. Средняя интенсивность пикселей для каждого пептидного признака рассчитывалась и сохранялась в виде текстового файла с разделителями табуляции и хранилась в базе данных для анализа.

Интенсивные средние интенсивности были преобразованы log10 после добавления постоянного значения 100 для улучшения гомосекустичности. Был применен лог-преобразование, поскольку данные были нормально распределены; точность измерений была приблизительно пропорциональна интенсивностям. Интенсивности на каждом массиве были нормированы путем вычитания средней интенсивности комбинаторных функций библиотеки для этого массива.

Для анализа моноклональных анализов селективное связывание каждого mAb с его родственным эпитопом оценивали с использованием Z-балла, рассчитанного как:
Z = средний (ImAb) -средний (I2 °) сд (I2 °)
где ImAb и I2o — трансформированные интенсивности пептидов в присутствии mAb и вторичного или вторичного реагента, соответственно. Измеряли интенсивности связывания всех четырех mAb ко всем признакам, соответствующим четырем эпитопным последовательностям. Расчетные баллы основаны на измерениях сканера в диапазоне от 0 до 65535 единиц RFI.

Для анализа анализов IST для всех образцов доноров измеряли связывание плазменных антител с каждой библиотекой, как было обнаружено флуоресцентно мечеными вторичными антителами. Полный список всех библиотечных пептидов и необработанных флуоресцентных интенсивностей, измеренных в каждой библиотечной пептидной характеристике для каждого из образцов доноров, используемых в разработке классификатора, сообщается в цифровом репозитории Дриады (http://dx.doi.org/10.5061/dryad .p6882). Из этих данных пептиды были идентифицированы как отображающие уровни дифференциального сигнала между различными группами здоровья с использованием t-теста средних пептидных интенсивностей пептида в пределах группы с группой контрастной группы. Была применена корректировка Уэлча для неравных дисперсий. Для когорты Шагаса 2015 года серопозитивные доноры Т. cruzi (n = 146) сравнивали с серонегативными донорами (n = 189) и идентифицировали пептиды со значительно дифференциальным сигналом. В отдельном эксперименте был определен набор пептидов, который был совместно дискриминирован Чагасом и тремя вирусно-положительными образцами-донорами. Средние интенсивности были сопоставлены с положительным (0 = 88), положительным (n = 88), положительным HBV (n = 88), положительным (n = 71) и положительным (n = 88) положительным (положительным) положительным (HCV) положительным (n = 88) донором. Как для Chagas, так и для экспериментов с несколькими заболеваниями, пептиды, которые показали значительную дискриминацию, были идентифицированы на основании 5% -ного порога для ложных срабатываний после применения поправки Bonferroni для множественности (то есть p <4e-7). Несмотря на то, что выбор пептидов осуществляется на уровне пептидов, наш классификационный анализ не зависит от эффективности отдельных пептидов, а скорее от мощности многомерного классификатора пептидов.

В другом анализе результатов когорты 2015 года была рассчитана корреляция Пирсона для трансформированных пептидных интенсивностей доброкачественных доноров в соответствии с их средним сигналом по величине отсечки (S / CO) из трех серийных анализов ELISA T. cruzi. Библиотечные пептиды, коррелированные с S / CO, были идентифицированы с использованием критерия 10% ложного обнаружения (FDR) по методу Бенджамини-Хохберга [43] или по поправке Бонферрони для множественности.

Для построения классификаторов экспериментов Chagas и multi-disease функции были ранжированы за их способность различать образцы на основе значения p, связанного с t-критерием Уэлша, который сравнивал положительные значения Chagas с отрицательными донорами или сравнивал все четыре разных класса заболеваний соответственно. Количество выбранных пептидов варьировало от 5 до 4000 признаков постепенно. Трансформированные интенсивности каждого пептида были средними по центру и масштабировались до единичной дисперсии. Для обучения классификатора эти данные были введены в векторную машину поддержки (SVM) [44] с линейным ядром и параметром стоимости 0,01. Четырехкратная или пятикратная процедура перекрестной проверки повторялась 100 раз и использовалась для оценки характеристик модели. Это было оценено как площадь под кривой характеристик приемника (ROC), которая включала в себя как выбор функций, так и классификатор, чтобы избежать смещения.

Был установлен классификатор, который включал оптимальное количество ранжированных входных пептидов на основе перекрестно проверенных оценок эффективности когорты 2015 года Шагаса. Эта фиксированная модель классификатора SVM была оценена без дальнейшей оптимизации (фиксированные коэффициенты), используя ее для прогнозирования классификации выборок в независимой когорте Шагаса 2016 года, которая служила тестовым набором для проверки алгоритма. Назначения положительных результатов банка крови этих образцов были ослеплены исследователями, проводящими анализ IST, до тех пор, пока результаты не были получены. Этот классификатор также использовался для оценки точности сигнала и воспроизводимости производительности платформы.

Все анализы выполнялись с использованием R версии 3.2.5 [45]. Классификаторы SVM были разработаны с использованием пакета e1071 [46].

Библиотечные пептиды были выровнены с T. cruzi CL Brener [47] и протеинами Sylvio, загруженными в октябре 2016 года из UniProt. Стратегия BLAST [48], требующая семян 3 а.а., штраф за разрыв 4 а.а. и матрица подсчета BLOSUM62 [49], модифицированная для отражения a.a. состав массива [50]. Эти модификации увеличили количество сохраненных замен, удалили штрафы за отсутствующие в массиве a.a. и одинаково набрали все точные совпадения.

Счету выравнивания присваивается каждому a.a. положение белковой последовательности, к которой выставляется данный набор пептидов; оценка совпадения — это сумма этих a.a. выравнивание. Чтобы исправить этот балл для композиции библиотеки, другой счет перекрытия был рассчитан с использованием идентичного метода, но для списка всех массивных пептидов. Это позволило вычислять показатель разности переходов пептида, с, на каждом а.а. положение через уравнение:
с = а (б / д) * с

В этом уравнении a — это показатель перекрытия от классифицирующих пептидов, b — количество классифицирующих пептидов, c — показатель перекрытия для полной библиотеки пептидов, а d — количество пептидов в библиотеке.

Чтобы преобразовать эти оценки (которые были на уровне а.а.а) в статистику с полным белком, была рассчитана сумма этих баллов для каждого возможного 20-мерного эпитопа, выложенного по белку. Конечная оценка белкового эпитопа, S, была максимальной оценкой вдоль прокатного окна 20-мерного белка для каждого белка. Аналогичный набор оценок был рассчитан для 100 итерационных раундов случайно выбранных пептидов из библиотеки, равный числу, равному количеству классифицирующих пептидов. Значение p для каждого балла S рассчитывали по критерию перестановки из числа случаев, когда эта оценка была встречена или превышена среди случайно выбранных пептидов, контролируя количество итераций.

Точность связывания антитела с характеристиками решетки была охарактеризована с использованием набора из восьми образцов плазмы для измерения флуоресцентных сигналов библиотечных пептидов, которые включали фиксированную модель для классификации сероположительных (Chagas positive) и серонегативных (Chagas negative) доноров образцов T. cruzi , Фиксированный классификатор был приспособлен с использованием данных из когорты 2015 года и затем применялся к этим слайдам без какой-либо дальнейшей оптимизации. Четыре положительных образца Chagas, связанных с рядом средних значений ИФА / S и СО, и тремя отрицательными образцами Чагаса были отобраны из когорты доноров 2015 года и проанализированы в трех экземплярах. Хорошо зарекомендовавший себя образец плазмы из здорового донора также был включен в дизайн слайдов, проанализированный в двух экземплярах. В качестве отрицательного контроля один массив анализировали в отсутствие плазмы во время стадии первичной инкубации, но в присутствии вторичного детектирующего антитела. Эти 24 образца были назначены на позиции массива на одном слайде, так что репликации были равномерно распределены. Этот макет слайда повторялся по слайдам в соответствии с проектами, указанными ниже. Для каждого исследования была определена точность сигналов пептидов, содержащих фиксированный классификатор. Нормализованные отсчеты соответствовали модели смешанных эффектов, из которой были рассчитаны межмассовые, межскалевые, межвалютные, междневные и межпластинчатые CV. Каждый образец донора рассматривался как фиксированный эффект. «Пластина вложенных факторов» или «вафельная партия», «слайд» и «массив» пересекались с «днем», и они рассматривались как случайные эффекты. Модели были вписаны в R, используя пакет lme4 [51], чтобы получить коэффициенты дисперсии (CV).

Для оценки точности в производственной партии были выбраны три пластины из одной партии. Двенадцать из тринадцати слайдов из каждой из этих пластин были оценены с использованием описанной выше точности с одним слайдом. 36 слайдов были оценены по трем кассетам ArrayIt, каждый из которых носил четыре слайда в три разных дня. Слайды с каждой пластины были равномерно распределены в течение трех дней, так что каждая кассета содержала два слайда из одной из трех пластин и по одному слайду каждого из оставшихся двух пластин.

Для измерения точности по партиям пластин одна пластина была выбрана из каждой из четырех различных партий производства. Двенадцать из тринадцати слайдов с каждой пластины были оценены с использованием набора образцов для исследования точности, описанного выше. Эти слайды были распределены для тестирования по четырем кассетам в день, охватывая три дня. Слайды с каждой пластины были равномерно распределены в течение трех дней, так что каждая кассета содержала два слайда из двух из четырех пластин.

Как внутренняя оценка QC надежности стационарного классификатора Chagas во многих партиях производства и времени тестирования, панель образцов контроля качества (QC) была разработана для тестирования на одном слайде. Макет состоял из представительной группы из 11 положительных образцов Шагаса, 11 отрицательных образцов Чагаса, хорошо охарактеризованной собственной здоровой донорской выборкой и вторичного массива. Эта панель анализировалась на слайде из 22 разных пластин, изготовленных по 10 различным партиям синтеза. Для каждого из 22 тестируемых вафельных слайдов классифицированный фиксированный модельный классификатор, разработанный в ходе испытания Chagas 2015, был применен к набору QC из 22 случайных или отрицательных образцов Шагаса для оценки площади под кривой ROC (AUC). Одна из этих пластин, включенных в этот анализ, использовалась для исследования Chagas (Chagas положительная и отрицательная), а другая использовалась для исследования с множественными заболеваниями (T. cruzi, HBV, HCV и WNV).

Был разработан протокол синтеза пептидов, в котором многие а. реакции взаимодействия осуществляются параллельно непосредственно на кремниевых пластинах с использованием масок и фотолитографических методов. В представленной здесь работе массивы, содержащие в общей сложности 131 712 пептидов (средняя длина 9 а.а.) in situ, синтезированных при характеристиках 14 мкм x 14 мкм, были использованы для запроса событий, связывающих антитела. Макет содержит 125 509 библиотечно-пептидных признаков и 6203 контрольных пептидных признаков, прикрепленных к поверхности через общий линкер (см. Методы). Библиотечные пептиды были разработаны для обеспечения выборки всех возможных а.a. и не были разработаны для соответствия протеомным последовательностям. В массив были включены несколько наборов элементов управления. Эти элементы управления обеспечивали проверку синтеза предполагаемых пептидных последовательностей, точность и воспроизводимость измерений, а также источники информации для изготовления и обработки данных.

Эксперименты проводились с использованием mAb, которые функционально оценивали качество конечных продуктов, синтезированных решеткой, в отношении представления лиганда и распознавания антител. Панель из четырех клонов мышиных антител (4C1, p53Ab1, p53Ab8 и LnkB2) была выбрана с помощью последовательностей распознавания, которые соответствуют четырем из пяти эпитопных контрольных пептидов, разработанных в макете. Эти четыре эпитопа вместе включают все 16 а.а. которые были использованы для синтеза библиотеки. На фиг.1 представлены результаты анализа связывания, проведенного, как описано (см. Методы), в котором каждое антитело индивидуально применяли к матрице с конкурентным агентом в трех повторностях. Для каждого mAb интенсивность контрольных признаков использовалась для вычисления оценки Z как для пептидной последовательности, соответствующей ее эпитопу, так и для трех несогласных последовательностей. Каждая из родственных последовательностей была связана с высокой интенсивностью сигнала, тогда как несознанные отображали мало или вообще не имели сигнала выше фоновых значений (только для вторичного антитела). Динамические диапазоны (95-й процентиль / 5-й процентиль) сырой интенсивности библиотечных функций составляли ~ 1,04, что отражает связывание менее 1% библиотечных пептидов. Это указывает на то, что микрочипы несут пептиды, подходящие для распознавания специфических антител и связывания.

Четыре хорошо охарактеризованных mAb (4C1, p53Ab1, p53Ab8 и LnkB2) отдельно наносят на массивы со скоростью 2,0 нМ с конкурентом в трех повторностях и затем детектируют с помощью антимышиного вторичного реагента. Для каждого анализа связывания для вычисления Z-оценки использовали среднюю интенсивность флуоресценции логарифма (RFI) элементов управления эпитопом. Результаты, соответствующие каждому эпитопу, были построены как отдельные гистограммы, причем последовательности распознавания mAb показаны выше графиков. Клоны mAb обозначены как полосы вдоль осей x внутри каждого графика. Шкалы ошибок представляют собой стандартное отклонение отдельных параметров Z-параметров управления. Собственные средства управления были насыщенными, оставляя стандартное отклонение нуля на Z-показаниях для этих реплик.

Две копии образцов плазмы, собранных у бессимптомных доноров, были получены из репозитория банка крови (Creative Testing Solutions (CTS), Tempe, AZ) и описаны в таблице S1. CTS проверяет всю кровь, собранную United Blood Services (UBS) против группы инфекционных заболеваний. Целевая группа 2015 года состоит из 335 доноров, каждая из которых была серологически протестирована на специфичные для T. cruzi антитела с использованием алгоритма банка крови. Три анализа ELISA последовательно проводили для анализа плазмы с лизатом цельной клетки T. cruzi (тест-система Ortho ELISA Test System). Если какой-либо из них наложил положительный сигнал на значение отсечки (S / CO> 1,0), то был выполнен подтверждающий тест. Подтверждающим тестом был тест иммунопреципитации (тест диагностики RIPA Quest Diagnostic), который использует плазму для осаждения радиоактивно меченных лизатов T. cruzi. По этим критериям 146 доноров были определены как сероположительные T. cruzi и были объявлены банком крови «Chagas positive»; 189 были определены как T. cruzi seronegative, и были объявлены «Chagas negative». Это обозначение широко используется, хотя и является субклиническим, и понятно, что эти положительные люди из Чагаса могут или не могут оставаться инфицированными паразитами во время ничьей. Более точное обозначение будет T. cruzi-антитело положительным или отрицательным. Источники литературы считают, что оценка S / CO выше 4,0 является сильной позитивностью [52]; это назначает 49 из 146 (33,5%) серопозитивных доноров в сильно положительную подгруппу S / CO и 66,5% как слабо положительную. Распределение по полу, возрасту и этнической принадлежности было таким, как правило, наблюдалось в популяции доноров крови UBS (http://www.unitedbloodservices.org/aboutUs.aspx), хотя не все демографические данные были представлены. Когорта 2016 года включала 116 доноров, которые были протестированы на антитела T. cruzi с тем же протоколом теста ELISA и RIPA, описанным выше. Эта вторая когорта была разработана, чтобы содержать 58 положительных Шагасов и 58 отрицательных участников Чагаса. Несколько более высокая доля серопозитивных индивидуумов забивается в более высокую подгруппу S / CO, 31 из 58 (53%). Распределение по полу, возрасту и этнической принадлежности было сходным с возрастом когорты 2015 года, причем отчетность по этническому признаку была более полной (89% против 62%). Описанные здесь доноры крови были расположены преимущественно на западе США, что отражает предвзятость латиноамериканских меньшинств.

Исследовательское исследование, представленное здесь, было проведено с использованием когорты 2015 года в качестве набора для обучения алгоритмов, который будет использоваться для разработки классификатора, который отличает сероположительный препарат T. cruzi от серонегативных индивидуумов. Этот классификатор был исправлен и затем применен к предсказанию положительности для образцов когортного донора 2016 года. Таким образом, анализ когорты 2016 года проходил как независимое от обучения испытание.

Все анализы IST выполнялись, как описано (Методы), и отсканированы для получения измерений интенсивности сигнала для каждой функции. Применение t-теста Welch выявило 356 пептидных последовательностей, которые имели значительные различия в среднем сигнале между теми донорами, которые были забиты кровеносной системой, как серопозитивные по сравнению с серонегативными для T. cruzi- специфических антител. График вулкана на фиг. 2 показывает отношение средних интенсивностей сигнала между серопозитивными и отрицательными образцами по сравнению с значением дифференциала для каждого пептида на матрице. Белая пунктирная линия демаркирует скорректированный Bonferroni предел значения p. Большинство, хотя и не всех, значительно отличающихся пептидных сигналов проявляют более высокую интенсивность связывания в серопозитивном по сравнению с серонегативными образцами доноров. Примерно половина из этих распознающих класс пептидов имели уровни сигнала, которые также были положительно коррелированы со средним значением S / CO T. cruzi образцов доноров, которые были объявлены Chagas положительными (показаны как синие и зеленые круги). Это согласуется с тем, что некоторые библиотечные пептиды связывают те же или родственные плазменные антитела, что и те, которые связаны антигеном на экране ELISA. Напротив, было 14 пептидов, которые были достоверно коррелированы с величиной S / CO, но не соответствовали порогу Бонферрони для IST-дискриминации положительности Чагаса (круги ниже белой пунктирной линии). Оставшаяся половина из 356 пептидов, которая показала самую сильную дискриминацию по IST, отличается тем, что она не была достоверно коррелирована с значениями ELISA S / CO (красные точки над белой пунктирной линией). Это открытие показывает, что в дополнение к антителам, измеренным в обоих анализах, уникальные взаимодействия антител были обнаружены с помощью IST. Библиотечные пептидные последовательности 370 (356 + 14) и связанные с ними необработанные сигнальные данные представлены в таблице S2.

График вулкана используется для оценки этой дискриминации как совместного распределения t-критериальных p-значений по сравнению с отношением средних средних геометрических значений для положительных доноров Шагаса относительно негативного Шагаса. Плотность пептидов в каждом построенном положении обозначена цветовой гаммой. 356 пептидов над пунктирной белой линией различают положительный и отрицательный серо-статус Chagas IST с доверием 95% после применения корректировки Бонферрони для множественности. Цветные круги обозначают отдельные пептиды с интенсивностью, которые были достоверно коррелированы с величиной S / CO, полученной с помощью ELISA T. cruzi, либо порогом Бонферрони p <4e-7 (зеленый), либо менее строгой скоростью ложного обнаружения (FDR) < 10% (синий).

В когорте 2015 года был разработан классификатор векторной машины поддержки (SVM) позитивности Chagas. Наилучшая средняя производительность путем кросс-валидации была достигнута, когда верхние 500 пептидов, которые были ранжированы по критерию Уэлша, были введены в модель. Это число больше, чем 356, которое соответствовало отсечению значимости Бонферрони, что указывает на то, что в некоторых пептидах, которые не соответствовали этому строжайшему порогу, содержалась дополнительная информация. Менее 200 и более 4000 библиотечных пептидов могут использоваться в модели с небольшим снижением производительности (S1 Рис.). На фиг.3А показана зависимость между средней чувствительностью и специфичностью 100 итераций пятикратных перекрестных валидаций с использованием этих 500 верхних скользящих пептидов в зависимости от диагностического порога. Оценка AUC 0,98 означает, что любой донор, выбранный случайным образом из когорты 2015 года, имел бы 98% вероятность быть классифицированным как сероположительный, если бы он был положительным в крови, а 2% — положительным, если это было кровяное давление, отрицательный банк, с 95% доверительным интервалом (ДИ) 97% -99%. На пороге, где чувствительность составляла специфичность, точность составляла 93% (CI = 91% -95%). Оценки кросс-валидации были подтверждены применением 500-пептидного SVM-классификатора, разработанного для когорты 2015 года, независимо от когорты 2016 года. Наблюдаемая производительность в этом контрольном тестовом наборе (AUC = 97%, точность = 91%) находилась в пределах 95% ДИ для оценок перекрестной проверки (рис. 3В).

(A) Критерий эксплуатационной характеристики приемника (ROC) для учебной когорты 2015 года. Синяя кривая была сформирована путем вычисления медианы предсказаний вне пакета в 100 четырехкратных тестах перекрестной проверки. (B) ROC для контрольной когорты 2016 года. Синяя кривая была сформирована путем применения алгоритма, основанного на обучающем наборе, для прогнозирования образцов 2016. Доверительные интервалы (CI), отображаемые серым цветом и численно представленные в круглых скобках, оценивались по вариации между испытаниями поперечной проверки в учебной когорте и оценивались по методу ДеЛонга [53] в когорте проверки. sens = чувствительность, spec = специфичность, acc = точность.

Кривые ROC используют непрерывные значения интенсивности сигнала. Альтернативно, может быть применено одиночное, предварительно заданное положительное значение для позитивности Chagas. Используя вероятность 50% как произвольный порог диагностики для прогнозов фиксированной модели обучающего набора, показатели производительности были рассчитаны для тестового набора 2016 года. Было установлено, что точность была равна 87% (95% ДИ = 81% -93%), чувствительность составила 76% (95% ДИ = 63% -86%), специфичность составила 100% (95% ДИ = 94% -100%), и каппа Кауна составляла 76% (95% ДИ = 64% -87%). Результаты испытаний не были исключены. В таблице 1 представлена ​​матрица 2×2 для этих результатов. Не было ложных срабатываний и 14 ложных отрицаний. Из этих ложных негативов 8 имели значения S / CO менее 2,0. Диаграмма тестового потока образца IST и назначение банка крови (CTS) одних и тех же образцов представлены в S2 Рис.

Перекрестная таблица классификаций IST и результатов ELISA позитивности Chagas для тестовой когорты 2016 года.

Этот же фиксированный классификатор был использован для оценки точности связывания анализа с использованием протокола, в котором набор образцов: четыре Chagas positive, три отрицательных Chagas и один элемент управления, неоднократно анализировали, как описано в разделе «Методы». Эти прецизионные измерения представлены в Таблице 2. Значения межскалевых, межвалютных и междневных сопоставимы с внутри- и меж-аналитическими CV, полученными с другими тестами T. cruzi ELISA. В дополнение к этим исследованиям точности воспроизводимость точности классификации была определена на 22 разных пластинах, использующих макет образца КК, описанный в Методах; эти анализы показывают AUCs> 0,98 (медиана AUC = 1,0).

Результаты на рис. 4 исследуют гетерогенность связывания антитела в когорте 2015 г. Шагаса. Относительная интенсивность сигнала отображается для 370 (356 + 14) пептидов, описанных на фиг. 2, что обеспечивает значительную дискриминацию положительности Chagas по t-тесту путем корреляции с уровнями ELISA S / CO или обоих критериев. На фиг.4 каждый пептид (ось х) для каждого донора (ось y) представлен и затенен относительно разницы его интенсивности по сравнению со средней интенсивностью того же пептида у всех серонегативных доноров, которые служат в качестве контролей. Цветовая схема цветовой карты масштабируется стандартным отклонением (sd) сигнала функции от значения серонегативного контроля. Легенда была усечена на 7 sd, чтобы разрешить визуализацию меньших, но значительных вариаций. Доноры были заказаны по их средним измерениям ELISA S / CO, и эти данные нанесены по левой стороне тепловой карты. Пептиды были сгруппированы, как показано дендрограммой наверху. Различие между сероположительными и отрицательными донорами ELISA очевидно, как визуализируется в тепловой карте IST, равно как и корреляции в серопозитивных образцах ELISA с некоторыми уровнями сигналов IST-пептидов. Положительные образцы Chagas отображали по меньшей мере три различных профиля связывания для подмножества информационных пептидов IST: те, у которых i) равномерно более низкий сигнал, чем серонегативные образцы, ii) незначительно, но равномерно более высокий сигнал, чем серонегативные образцы, и iii) сигнал, который увеличивается как S / Значения СО увеличиваются. Неравномерность пептидного сигнала в отрицательных образцах Чагаса относительно незначительна.

Тепловая карта заказывает диапазоны интенсивностей сигналов, отображаемых библиотечными пептидами 370, которые информируют о статусе положительности Chagas выборки; боковая диаграмма связывает их с каждым значением донора ELISA S / CO.

В дополнение к измерению IgG-антител, св занных с пептидной матрицей IST, активность св зывани IgA измеряли путем детектировани св зывающихс св зей плазмы с флюоресцентно меченным анти-IgA-специфическим вторичным реагентом. Интенсивности сигналов IgA-связывающих событий обычно были ниже, чем у IgG-связывания, и меньше библиотечных пептидов (224 против 356) прошло обрезание Бонферрони для значительного разного уровня сигнала между серопозитивными и отрицательными донорами. Это можно визуализировать на графике вулкана (S3 Fig), в котором отношение средних интенсивностей сигнала между серопозитивными и отрицательными образцами было построено по сравнению с значением дифференциала для каждого пептида на матрице. В пределах 224 IgA-связанных отличительных пептидов 53 перекрывались с теми, которые были обнаружены с помощью зондирования с помощью вторичного реагента против IgG (S4A Fig). Неперекрывающаяся реакционная способность IgA-пептида в целом показала более низкие изменения складки, чем изменения IgG-реактивности. При измерении IgA плазмы все 23 пептида, которые соответствовали порогу Бонферрони (p <4e-7) для корреляции с значениями S / CO T. cruzi, были среди 26 пептидов, коррелированных с S / CO при измерении событий связывания IgG. Эффективные размеры положительных и отрицательных серогрупп T. cruzi, измеренные вторичным антителом против IgA, как правило, были ниже по сравнению с теми, которые были измерены с помощью анти-IgG-вторичного. Пептиды с лучшими размерами эффекта были преимущественно такими, которые перекрывались между обоими методами обнаружения, анти-IgG и анти-IgA вторичными реагентами (S4B Fig). Производительность классификатора IgA была сильной, с AUC 0,94 и максимальным размером модели 4000 пептидов (S5 Fig), хотя и скромно меньше, чем у классификатора IgG (AUC = 0,98). Объединение списков пептидов для выбора признаков не улучшало работу классификатора (AUC = 0,98), что указывает на некоторую избыточность информации о событиях привязки. Хотя максимальный размер модели составлял 2000 при комбинированном выборе признаков, тогда как пики отбора IgG и IgA составляли 500 и 4000, соответственно.

356 библиотечных пептидов, которые отображали значительно (p <4e-7), различались интенсивности сигналов между положительными и отрицательными донорами Chagas, были объединены с 14 библиотечными пептидами, которые были достоверно коррелированы со значениями S / CO, но не соответствовали обрезанию Bonferroni для IST. Вместе эти 370 пептидов считались информативными относительно положительности Чагаса и были использованы для изучения возможного информационного выравнивания протеома T. cruzi. Был разработан модифицированный алгоритм BLAST и система подсчета очков, в которой использовалось скользящее окно 20-мерных (Методы). Это дало ранжированный список областей белка-кандидата (целевые 20-мерные), показанные в таблице 3, с избыточными ударами. Информативные библиотечные пептиды, дающие этим кандидатам T. cruzi proteome, отображали показатели выравнивания, которые значительно превышают максимальные баллы, полученные путем проведения такого же анализа десять раз с одинаковыми (370) наборами пептидов, которые были случайно выбраны из библиотеки (рис. 5) , Например, максимальная оценка, полученная с помощью итерационных наборов случайно выбранных пептидов, варьировалась от менее 2000 до максимум 2500; тогда как информативные пептиды генерировали максимальные оценки выравнивания от 3300 до 3500. Четыре из этих десяти лучших целей являются белковыми областями из членов трех семейств, ранее показавших себя антигенными у пациентов с Чагасом. Они отмечены звездочками в таблице 3.

Гистограмма показателей выравнивания из верхних 370 информационных пептидов против всех белков T. cruzi изображена в синих полосах. Алгоритм отображения повторялся с эквивалентными выравниваниями 370 случайно выбранных библиотечных пептидов десять раз. Они дали гистограммы, которые показаны в виде радужных линий, наложенных на синие полосы.

* Семейства, в которых эти белки являются членами, ранее были идентифицированы как антигенные

Верхние скользящие выравнивания информативных пептидов Chagas, отображаемых на C-конец подсемейства Muc II муцина поверхностных гликопротеинов. Здесь представлен только один идентификатор белка; однако этот C-терм встречается с высоким сходством последовательностей во всех членах семейства 662 Muc (см. обсуждение). Эта локализованная в библиотеке пептид область Muc II включает сайт связывания гликозилфосфатидилинозитола (GPI) и соответствует высокоимногенному эпитопу, обнаруженному у пациентов Chagas [54]. Наиболее часто идентифицированные в 63 совмещенных библиотечных пептидах a.a. представлены на рис. 6 как модифицированный WebLogo [55]. Соответствующая последовательность T. cruzi (TrTrypDB Gene ID = TcCLB.509753.300) отображается вдоль оси x. Аминокислотные замены в любом одном положении показаны вертикально, а пропорциональный охват в отображаемых библиотечных пептидах изображается высотой однобуквенного кода. Общая высота строки с буквенным кодом указывает абсолютное число пептидов, совпадающих с Muc II a.a. должность. Еще один член подсемейства белка Muc II является шестым ранжированным кандидатом-кандидатом, а также отображает его на C-конец. Член другого семейства гликопротеинов поверхности T. cruzi, белки семейства диспергированных генов (DGF-1) [56], занимает восьмое место по алгоритму выравнивания. Библиотечные пептиды сопоставляются с его С-терминальной областью, что соответствует консенсусной последовательности семейства DGF-1, которая разделяется всеми 565 членами. Другие целевые мишени, демонстрирующие высокие показатели выравнивания библиотеки-пептида, включали белки, вовлеченные в трансдукцию кальциевых сигналов (кальмодулин), трафик везикулы (белок, связанный с вакуолированием вакуолическим белком, Vps26) [57] или нехарактеризованные белки. Десять высокопоставленных кандидатов Т. Крузи вместе со своими подсемействами и членами семьи были нацелены на 222 из выработанных информативных пептидов Чагаса. Модифицированные WebLogos для каждой из 9 лучших целей выравнивания протеома представлены на S6 Рис.

Выравнивание 370 наиболее важных для Chagas пептидов на сайте Muc II GPI-прикрепления представлено в виде гистограммы, в которой бары были заменены на a.a. композиции в каждой позиции выравнивания, используя стандартные однобуквенные коды. Ось x указывает на сохраненную a.a. в выровненном положении в муцине II. Ось y указывает на охват этого a.a. позиции по классификационным пептидам. Общая высота всех буквенных кодов в позиции соответствует абсолютному количеству выравниваний пептидов в этом положении. Пропорциональный вклад каждого а. на строку буквенного кода выражается высотой каждого буквенного кода.

Было разработано исследование, чтобы определить, может ли IST различать положительные образцы Шагаса из образцов других инфекционных заболеваний. Подмножество из 88 сероположительных образцов 88 T. cruzi из полной когорты «Шагас 2015» было повторно проанализировано, наряду с 88 HBV, 71 HCV и 88 WNV пациентов с положительной плазмой. Образцам вируса была назначена положительность как косвенным серологическим, так и прямым тестированием нуклеиновых кислот на CTS. Все образцы исследования были отмечены положительными только для одного из четырех заболеваний. Демографические данные показали сочетание полов и этнических групп и диапазон возрастов (таблица S3). Несмотря на то, что демографические данные отсутствуют во многих образцах, среди латиноамериканских доноров наблюдается более высокая распространенность позитивности Шагаса, что соответствует распространенности заболеваемости в Центральной и Южной Америке. Эта более высокая распространенность была также замечена в полной когорте Шагаса (таблица S1). Все анализы IST для этого исследования проводились в тот же день и сразу проверялись, чтобы получать измерения интенсивности сигнала по каждому признаку. Исходные данные были импортированы в R для анализа.

В первом анализе был разработан набор бинарных классификаторов для дифференциации каждого из четырех заболеваний из комбинированного класса остальных трех (таблица 4). Показатели эффективности каждого контраста заболевания и соответствующие им 95% ДИ были определены путем четырехкратного анализа перекрестной валидации. Модели генерировали аналогично сильные AUC, которые варьировались от 0,94 до 0,97 и соответствовали точности 87% -92%. Номинально бинарный контраст Чагаса против комбинированного класса (Другой) был лучшим исполнением, а HBV против Другого был самым слабым; однако в скобках показано, что CI перекрывается. В то время как количество оптимальных входных пептидов SVM для каждого контраста варьировалось в широких пределах от 50 до 16 000 пептидов, количество используемых пептидов существенно не изменяло производительность. Например, размер модели SVM (k) 50 для T. cruzi по сравнению с другими генерировал AUC 0,97; размер модели 4000 дал AUC 0,96, что указывает на то, что размер модели был надежным.

спецификация, специфика

bsens, чувствительность

В следующем анализе была разработана модель для классификации всех четырех серологических состояний одновременно с одним набором выбранных пептидов (k = 75) и одним алгоритмом. Эта многоклассовая модель имела незначительно улучшенную производительность по сравнению с бинарными классификаторами, показанными в таблице 4. А именно, четырехкратный анализ перекрестной проверки позволил получить мультиклассические AUC 0,98 для Chagas, 0,96 для HBV, 0,95 для HCV и 0,97 для классификаций WNV. В таблице 5 представлены показатели производительности присвоений каждого образца классу на основе его наивысшей прогнозируемой вероятности. Эти вероятности присваивали большинство образцов одному классу инфекционных заболеваний, подтвержденному тестированием CTS. В этой матрице путаницы представлена ​​производительность каждого бинарного контраста с использованием единого классификатора множественных болезней. Оцененная общая точность классификации множественных заболеваний составила 87%. Рассчитана нецелевая каппа Коэна для соглашения между истинными классами и предсказаниями многоклассовой модели и определена как 0,84 (95% ДИ, 0,79-0,89), что указывает на значительно большее согласование, чем ожидалось случайно.

чувствительность, чувствительность

bSpec, специфичность

Карта тепла представлена ​​на рис. 7, которая иллюстрирует средние вероятности членства в классе для прогнозов кросс-валидации вне сумм с использованием многоклассовой модели (см. Таблицу 5). Это было определено для каждого из 335 исследовательских когортных образцов, охватывающих все четыре класса заболеваний. Назначения банка крови рассматриваются здесь как «истинные», а вероятность IST — присвоение класса болезни «предсказано». На карте представлены вероятности присвоения класса каждого образца в цветовой гамме от черного до белого; образцы упорядочены вдоль оси х по их истинному назначению. Это позволяет различать уровни различий между классами на основе IST и визуальной классификации по сравнению с реальной классификацией. Например, предсказание истинных серопозитивных образцов T. cruzi как T. cruzi по сравнению с каждым из трех вирусных заболеваний было сильным, как показывают высокие вероятности (яркие цвета) в правильном классе. Даже те немногие истинные образцы T. cruzi с высокими вероятностями для предсказания WNV также отображали скромные вероятности правильного назначения T. cruzi. Прогнозируемые назначения истинных образцов HCV как HCV по сравнению с другим вирусом печени, HBV, были слабее, чем у T. cruzi и WNV.

Средние вероятностные присвоения для каждого образца каждому из четырех классов болезни вычислялись по прогнозам вне пакета из четырехкратного анализа перекрестной валидации с использованием многоклассового классификатора машин SVM. Перекрестные проверки были перестановлены и повторно протестированы 100 раз. Каждый образец имел предсказанное членство для каждого класса болезни, которому был задан цвет от 0 (черный) до 100% (белый), соответствующий вероятности от 0% до 100%. Матричная компоновка была использована для визуализации всех комбинаций истинности (по оси x) по сравнению с предсказанными (y-осью) назначениями.

Мы продемонстрировали возможность использования технологии ImmunoSignature для обнаружения положительных людей T. cruzi-антитела в популяции бессимптомных доноров крови. Назначение IST позитивности Chagas близко соответствовало критериям алгоритмов тестирования банка крови. Библиотека максимально разнообразных пептидов, размещенных на микрочипе, была дифференциально связана с антителами периферической крови в серопозитивных и отрицательных донорах T. cruzi. Эти отличительные пептиды переносят последовательности-мотивы со сходством с известными иммуногенными областями нескольких семейств белка T. cruzi, а также несколько неописанных белков, которые здесь присутствуют как возможные антигены. В другом исследовании, использующем одну и ту же библиотеку, были разработаны как бинарные, так и одновременные классификаторы, которые выделили доноров Шагаса у тех людей, которые были положительными, но бессимптомными для трех других заболеваний, тестируемых группой крови: гепатита В, гепатита С и вируса Западного Нила.

Эти поисковые диагностические исследования проводились на хорошо охарактеризованной платформе для микрочипов. Использование фотолитографии и масок для процесса in situ дает возможность для масштабирования и воспроизводимости на уровне производства. Анализ связывания имеет рабочий процесс, аналогичный ELISA, и аналогичным образом поддается электронным трассирующим и роботизированным рабочим станциям.

Результатом анализа связывания IST являются количественные флуоресцентные измерения событий связывания антител, которые произошли при каждой функции в массивной библиотеке пептидов, которые служат в качестве эпитопов. Диагностическая сила основана на идентификации связывающих профилей, основанных на многочисленных событиях связывания с селективными антителами, которые согласуются в пределах класса болезни и последовательно отличаются друг от друга. Примечательно, что один и тот же дизайн библиотеки можно использовать для идентификации пептидов, которые различают любой класс болезни или контраст здоровья, и один анализ может быть использован для одновременного обнаружения нескольких серологических состояний.

Несмотря на то, что мы оптимизировали производство массивов и условия анализа, мы понимаем, что альтернативные проекты библиотек могут обеспечить улучшенную общую производительность или улучшения для конкретного диагностического приложения. Например, увеличение количества пептидов в библиотеке позволит более плотную выборку пространства последовательностей, но потребует либо уменьшения количества массивов, изготовленных на пластину, либо уменьшения размера объекта. Увеличение длины библиотеки-пептидов может привести к подражанию более длинным линейным и конформационным эпитопам; с другой стороны, он может позволить двум или более антителам с различными сайтами распознавания находить мимику на одном и том же пептиде и тем самым путать интерпретацию коллективного сигнала. Прорабатывается наше исследование этих параметров.

Первое исследование Чагаса показало, что интенсивность сигналов некоторых библиотечных пептидов, которые значительно отличались серопозитивным тиреозависимым от серонегативных состояний, также достоверно коррелировала с значениями S / CO, полученными ELISA. Этот вывод обеспечивает ортогональную проверку результатов испытаний IST по сравнению с текущими диагностическими стандартами. Этот вывод также указывает на то, что подобные антитела обнаруживаются двумя различными тестовыми платформами. Однако было много событий привязки к массиву, которые не коррелировали со значением S / CO донора, но было определено, что они значительно различаются между классами и усиливают классификатор IST. Это говорит о том, что в дополнение к обычно измеренным антителам существуют также уникальные события связывания антител, измеренные только платформой IST. В то время как за пределами представленной здесь работы эти уникальные события имеют потенциал для содействия дальнейшим оценкам проявленной Т. cruzi-активированной иммунной активности. Следующими шагами будет изучение этой возможности относительно клинически значимых стратификаций состояний, связанных с Т. cruzi.

Пептиды, содержащие отличительные и согласованные профили связывания положительных и отрицательных доноров Chagas в когорте 2015 года, были введены в алгоритм машинного обучения, чтобы дать оценку производительности. Классификатор был исправлен, а затем проверен, используя его для прогнозирования статуса положительности Шагаса независимой когорты 2016 плазмы. Точность анализа IST, оцененная здесь, приближалась, но была незначительно уменьшена по сравнению со стандартом ELISA, рассчитанная в исследовании популяции доноров высокого риска [58] (чувствительность = специфичность при 91% против 97%). Однако, поскольку ELISA использовался для обозначения «истинного» серологического назначения класса, мы не можем определить из этой работы, был ли метод IST более или менее точным, чем ELISA. В альтернативном анализе результатов классификации SVM для каждого из образцов в тестовой когорте 2016 применялось заранее определенное ограничение положительности. Образцы с предсказанной вероятностью Чагаса более 0,5 были классифицированы как положительные; с вероятностью менее 0,5 были классифицированы как отрицательные. Перекрестная табуляция этих присвоений банками крови выявила ноль ложных срабатываний. 14 дифференциальных присвоений были ложными негативами IST. Мы полагаем, что этот результат указывает либо на более низкую чувствительность IST, либо на ее более высокую специфичность. Это будет изучено в будущей работе с использованием образцов, собранных в продольном направлении у пациентов с серопозитивными свойствами T. cruzi, имеющих в конечном итоге разные клинические результаты.

Метод IST может содержать информацию об иммунном ответе, не извлекаемую из текущих тестов. Чтобы устранить эту гипотезу, была предпринята попытка просмотра с высоким разрешением более глубокой структуры в профилях привязки к классу. В пределах набора пептидов, которые, как было установлено, связывались со значительно различной интенсивностью с образцами Chagas positive по сравнению с чагас-отрицательными донорами, наблюдалась внутригрупповая гетерогенность. Например, были пептиды, которые проявляли низкую интенсивность и еще один набор, который показал высокую интенсивность сигнала по сравнению с отрицательными донорами Чагаса. В дополнение к этим двум серопозитивным кластерам классов T. cruzi либо равномерно низкого, либо высокого сигнала около половины пептидов, которые отличают положительный класс от отрицательного, показывают диапазон интенсивности сигнала, который увеличивается с увеличением значений S / CO. Это S / CO коррелированные пептиды. В этих коррелированных пептидах имеется субкластер, который постепенно увеличивается, а другой, по-видимому, более неожиданно переходит к более высокому сигналу на S / CO ~ 4.0. Дальнейшая работа будет необходима для определения того, имеется ли какое-либо клиническое значение для этих разных кластеров, например, возможно указание статуса инфекции или вероятности прогрессирования симптоматического заболевания [52].

В качестве другого средства для потенциального захвата дополнительной информации о ответе на антитела, вызванном T. cruzi, сигналы связывания были обнаружены с использованием анти-IgA вместо анти-IgG, вторичного антитела для обнаружения. Учитывая мукозальный путь проникновения паразита и доказательства защитных иммунных ответов слизистой к Чагасу [59, 60], была определена и действительно найдена дифференциальная связывающая активность. Однако в этих взаимодействиях не было выявлено никаких дополнительных классификационных пептидов болезни, что указывает на то, что одни и те же эпитопы T. cruzi доминируют в обоих изотипических ответах антител.

Стратегия выравнивания была предпринята для того, чтобы исследовать, могут ли классифицирующие класс пептиды сопоставляться с любыми мишенями протеома T. cruzi. Разнообразная структура последовательности пептидов в нашей массивной библиотеке направлена ​​на использование митотопов настоящих эпитопов для широкопроцессорной реактивности антител, не требуя знания ответственного антигена. Однако мы предположили, что некоторые из этих мимотопов могут в достаточной мере напоминать ранее описанный линейный эпитоп, который должен быть идентифицирован алгоритмом выравнивания. Это была еще одна проблема, поскольку геном T. cruzi содержит 12 000 генов, половина из которых несет повторяющиеся последовательности и в основном состоят из больших многоженских семейств и ретротранспозонов [61]. Хотя общий синтез между T. cruzi и его наиболее родственным кинетопластидом, майором Лейшмании, составляет 75%, в кодированных поверхностных гликопротеинах идентифицированы видоспецифические острова [34]. Предполагается, что эти гликопротеины являются диагностически важными, поскольку кросс-реактивность, особенно с лейшманией, является значительным источником ложноположительного диагноза в коэндемических регионах [62]. В нашем анализе в десятку лучших целей были включены семейства гликопротеинов поверхности T. cruzi mucin (Muc II) и DGF-1. Эти линейные пептидные удары подтверждают интерпретацию того, что анализ IST действительно измеряет события связывания антител T. cruzi и оставляют открытым возможность того, что другие отличительные, но не выявленные пептиды могут имитировать нелинейные или непептидные лиганды, такие как структурные или гликозильные фрагменты. Альтернативно, неотображаемые пептиды, которые дифференцированно связываются с положительной плазмой Шагаса, могут имитировать непаразитарные самоантигены. Хотя спорный, аутоиммунитет был выдвинут гипотезой как вклад в болезнь Шагаса [63].

Муцины (Muc I и Muc II) составляют третье по величине белковое семейство протеома T. cruzi, содержащее 662 члена, которые вместе составляют защитное гликоконъюгатное покрытие, которое покрывает поверхность паразита. Все белки Muc содержат N терминальную сигнальную последовательность для таргетирования секреторного пути, сайт присоединения якоря C терминала GPI и центральную область, которая является гипервариабельной (HV) [64]. Центральный домен переменных последовательностей стимулирует множество иммунных ответов, которые приводят к атрофии Т-клеток. Напротив, область привязки GPI является одновременно консервативной и последовательно иммуногенной [34, 54]. Самые высокие скоринговые координаты пептида-мотив IST отображаются на C-конец подсемейства белка Muc II. Хотя этот регион почти идентичен во всех членах, другой член семейства Muc II с вариантом C-терминалом занимает шестое место. Сообщалось, что муциноподобный гликопротеин, называемый мелким поверхностным антигеном триптомастиготы (TSSA), вызывает сильные реакции с антителами [65], но не был нацелен нашими лучшими выравнивающими пептидами. Возможно, это было пропущено, потому что комбинаторная библиотека, используемая здесь, не была предназначена для картирования протеома, хотя мы ее исследовали. Альтернативно, это потому, что TSSA выражается только инфекционными, триптомастиготами кровотока [66]. Образцы, проанализированные здесь, были от бессимптомных доноров; эти люди, вероятно, будут содержать внутриклеточные амастиготы, связанные с хронической инфекцией.

DGF-1 — пятое по величине семейство белков с 565 N-гликозилированными членами [56]. Их консервативные мотивы сцепления предполагают, что они функционируют аналогично интегринам и могут играть роль во внеклеточных матричных взаимодействиях и двунаправленной трансдукции сигнала [67]. Консенсусный C-конец семейства белка DGF-1 занимает восьмое место по мотивам пептидов IST. Участниками двух гораздо меньших семейств белков, также участвующих в передаче сигналов и трахеи белка, были ориентировочные цели: кальмодулин и белковый белок, связанный с вакуолированием белка 26 (Vps26). T. cruzi и человеческие калмодулины демонстрируют высокую степень сходства; классифицирующие IST пептиды, которые согласуются с T. cruzi, калмодулин также выровнены с человеческим белком. Известно, что человеческая кальция / кальмодулин-зависимая протеинкиназа играет решающую роль в выживании кардиомиоцитов и кардиомиопатии [68-70]. Наконец, идентификация Vps26 заслуживает внимания, поскольку простейший трансформирует от триптомастиготы к амастиготе внутри вакуоли инфицированного хозяина [10]. Вместе эти белковые семейства, в совокупности более 1200 белков, могли бы составлять 222 из 370 миметических пептидов, отображающих очень значительные, связывающие с Чагасом сигналы связывания. В то время как это представляет большую часть профиля антител, остается 148 миметических ответов, которые необходимо изучить.

Ни одна из этих семейств белков в настоящее время не находится на любом анализе Chagas на основе антигена. Однако большой проект, проведенный несколько лет назад, начался с 400 рекомбинантных белков Chagas и идентифицировал 16 кандидатов в скрининговом анализе на основе бусинок для серологической реактивности [71]. Было обнаружено, что как кальмодулин, так и белок DGF-1 последовательно реагируют у пациентов с серопозитивными Chagas T. cruzi. Однако использовали полноразмерные или крупные фрагменты белка, так что эпитопы в этих мишенях не были определены для нашего сравнения здесь. Ранее упомянутое исследование обнаружения антигена использовало черепичную пептидную решетку, охватывающую известные или предсказанные антигены T. cruzi для зондирования очищенных IgG из девяти серопозитивных индивидуумов T. cruzi [33]. Их результаты показали положительное связывание с пептидами, соответствующими той же области консенсусной последовательности Muc II, которую мы здесь идентифицировали. Мы предполагаем, что массив Chagas-протеома-мишеней имеет большие перспективы для нового обнаружения антигена T. cruzi и что массив митотопов IST может быть бесплатным в обеспечении дополнительной способности скрининга T. cruzi-эпитопа. Тем не менее, IST также предоставляет единую технологию для разработки масштабируемой диагностической платформы, применимой к Чагасу, в дополнение к другим заболеваниям или стратификационным заболеваниям.

Вывод о том, что один тестовый алгоритм может отличить позитивность Шагаса от положительности других заболеваний группы крови, подтверждает интерпретацию того, что специфические для антитела антитела могут быть идентифицированы на миметических пептидных матрицах. Возможно, что общее состояние иммунной активации, такое как воспаление, также может быть обнаружено на массивах, возможно, косвенно путем некоторого общего изменения активности связывания IgG. Однако любые такие связанные с антителом пептиды не предполагали бы конкретно отличать одно состояние болезни от другого и, следовательно, не были бы идентифицированы в анализе. Специфичность заболевания IST была предложена в ранних исследованиях с небольшими когортами (n = 10), в которых были идентифицированы различные группы пептидов, которые связывали образцы сыворотки от пациентов с инфекционным заболеванием или раком [39, 40]. Показанный здесь классификатор с множественными заболеваниями из четырех заболеваний группы крови указывает на то, что для выявления группы заболеваний может быть разработан один тест IST с одним набором пептидов. Способность успешно классифицировать болезни также предполагает, что IST может предоставить возможность для создания диагностики с уменьшенной перекрестной реактивностью. Большее количество биомаркеров-лигандов может обеспечить улучшенную специфичность. Клинически значимые противопоказания к заболеваниям для оценки следующей на этой платформе будут T. cruzi по сравнению с паразитарными инфекциями, эндемически обнаруженными в тех же регионах, что и Leishmania spp. [72] и Plasmodium spp [73], и непатогенного T. rangeli [74].

В то время как банки крови проверяют образцы от бессимптомных индивидуумов, клинические настройки требуют диагноза как бессимптомных, так и симптоматических пациентов, при острых или хронических стадиях заболевания. Оценивая потенциал для IST вносить свой вклад в этих контекстах, потребуются постоянные собрания образцов и эксперименты. Подклассы обязательных профилей в положительной группе Chagas могут содержать информацию, которую мы еще не научились извлекать или интерпретировать. С соответствующими группами образцов и клинической аннотацией для обучения и тестирования это может быть достигнуто.

Хотя явная цель в представленной работе заключалась не в том, чтобы обнаружить новые антигены T. cruzi или целевые мишени для лекарств или разработать диагностику для использования в эндемичных районах Чагаса, результаты прямо обращают внимание на эти потенциальные применения. Для оценки возможностей IST для удовлетворения этих клинических потребностей потребуется дополнительная работа. Что касается основной цели этой работы, представленные здесь исследования доноров крови показывают, что IST является жизнеспособным инструментом для изучения сложности иммунных реакций человека к T. cruzi и выявил специфические для платформы атрибуты, которые могут иметь преимущества для диагностики Chagas, прогнозирования и мониторинга прогрессирования заболевания или его разрешения.

Выполняется оценка производительности по AUC по сравнению с размером модели ввода SVM (k).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Это была контрольная проверка теста ImmmunoSignature для серопозитивности T. cruzi.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

График вулкана используется для оценки этой дискриминации как совместного распределения t-критериальных p-значений по сравнению с отношением средних средних геометрических значений для положительных доноров Шагаса относительно негативного Шагаса. Плотность пептидов в каждом построенном положении обозначена цветовой гаммой. 224 пептидов над пунктирной белой линией различают положительную и отрицательную серопозитивность IST с доверительностью 95% после применения корректировки Бонферрони для множественности. Цветные круги обозначают отдельные пептиды с интенсивностями, которые были достоверно коррелированы с сигналом, полученным из ELISA с T. cruzi по обрезанию (S / CO), либо порогом Бонферрони p <4e-7 (зеленый), либо менее строгим показателем ложного обнаружения (FDR) <10% (синий).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(A) Количество уникальных и перекрывающихся пептидов, связанных антителами против IgA и антителами против IgG, отображается как диаграмма Венна. (B) Эффективные размеры событий связывания IgG нанесены на IgA. Кодирование окраски совпадает с (A) и (B): графические пептиды, связанные дифференциально только IgG, являются синими, IgA — только красными, а те, которые дифференциально связаны как IgG, так и IgA, являются фиолетовыми.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Выполняется оценка производительности по AUC по сравнению с размером модели ввода SVM (k).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Выравнивание 370 наиболее важных для Chagas пептидов до дополнительных целевых T. cruzi, названных и ранжированных 2-10 в таблице 3, представлено в виде гистограмм, в которых бары были заменены на a.a. композиции в каждой позиции выравнивания, используя стандартные однобуквенные коды. Оси x обозначают сохраненную a.a. в выровненном положении в целевых белках. Оси осей указывают на охват этого a.a. позиции по классификационным пептидам. Общая высота всех буквенных кодов в позиции соответствует абсолютному количеству выравниваний пептидов в этом положении. Пропорциональный вклад каждого а. на строку буквенного кода выражается высотой каждого буквенного кода.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Это 370 пептидов, которые отображают интенсивность сигналов, которые значительно различают положительные (+) Chagas от отрицательных (-) доноров и / или коррелируют с медианными измерениями T. cruzi S / CO.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы хотели бы поблагодарить Дэвида Ломели и Кэтрин Нильсен за их работу по проведению анализов Скотта Мелвилла и Гленна Хаина для разработки типовых макетов, описанных в этом исследовании, Патрика Уолша и Гаурава Саини за их вклад в оптимизацию изготовления массивов и все членов производственной группы для предоставления массивов. Мы также благодарим Валери Винкельман и Филиппа Уильямсона в Creative Testing Solutions за предоставление точных аннотаций и высококачественных образцов доноров, которые сделали эти исследования возможными.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *