Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Инактивация HCV и ВИЧ с помощью микроволн: новый подход для профилактики передачи вируса среди людей, употребляющих инъекционные наркотики

Inactivation of HCV and HIV by microwave: a novel approach for prevention of virus transmission among people who inject drugs
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5114683/

Передачи вируса гепатита C (HCV) и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) среди людей, употребляющих инъекционные наркотики (PWID), по-прежнему представляют собой сложную проблему глобального здравоохранения. Здесь мы стремились проанализировать универсально применимую процедуру инактивации, а именно микроволновое облучение, в качестве безопасного и эффективного метода снижения риска передачи вируса. Воздействие HCV из разных генотипов на микроволновое облучение привело к значительному снижению вирусной инфекционности. Кроме того, микроволновое облучение уменьшало вирусную инфекционность ВИЧ-1 и суспензий HCV / HIV-1, что указывает на то, что эта инактивация может быть эффективной при предотвращении коинфекций. Чтобы перевести микроволновое облучение в качестве профилактического метода на используемое оборудование для приготовления лекарств, мы могли бы также показать, что HCV, а также инфекция ВИЧ-1 могут быть отменены в шприцах и фильтрах. Это исследование демонстрирует мощь микроволнового облучения для сокращения передачи вируса, и установление этой стратегии безопасности может помочь уменьшить передачу вирусов, передающихся через кровь.

Инфекции вируса гепатита С (HCV) представляют собой серьезную проблему со здоровьем, когда около 80 миллионов человек хронически инфицированы1. В промышленно развитых странах употребление инъекционных наркотиков является основным фактором риска заражения инфекцией с 50-80% заражения HCV у людей, употребляющих инъекционные наркотики (PWID) 2. Различные изоляты пациентов могут быть сгруппированы в 7 генотипов, которые различаются в отношении глобальной распространенности, а также восприимчивости к лечению34. Особенно генотипы HCV 1a, 1b и 3a являются общими для PWID, причем генотип 4d наиболее распространен среди PWID в Европе567. Текущая стандартная терапия, состоящая из комбинированной терапии одного или нескольких противовирусных средств прямого действия (DAA) с пегилированным интерфероном и рибавирином или без него, является высокоэффективной с показателями излечения более 90%, сниженной токсичностью и сокращением продолжительности лечения8. Тем не менее, высокие издержки и общие барьеры в противовирусном лечении PWID, в том числе отсутствие знаний и инфраструктуры, а также недостаточная осведомленность пациентов препятствуют успешному лечению вирусной инфекции910. Кроме того, поскольку профилактическая вакцина по-прежнему отсутствует, возможна повторная инфекция даже после успешной терапии, что представляет проблему, особенно у пациентов с постоянным воздействием HCV11. По оценкам, около 10 миллионов инфицированных HCV PWID сталкиваются с высоким риском развития фиброза печени, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы912. Факторы, способствующие прогрессированию заболевания, включают возраст, злоупотребление алкоголем, ожирение, резистентность к инсулину и коинфекцию вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) 13. Действительно, совместные инфекции ВГС / ВИЧ-1 представляют собой серьезную проблему из-за общих способов передачи, когда 20-30% ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов являются коинфицированными с ВГС, что приводит к большему риску прогрессирования заболевания печени, а также ускорение клинического течения ВИЧ-1-инфекции14. Передача обоих патогенов происходит путем совместного использования зараженных игл и оборудования (включая шприцы, воду и фильтры) 1516. Стратегии профилактики, включая программы обмена игл и шприцев и опиоидную заместительную терапию, которые были успешно внедрены для сокращения случаев ВИЧ-1 среди ПИОП, но были менее эффективны для профилактики ВГС, вероятно, из-за высокой распространенности среди ПИРД, а также в 10 раз более высокая инфекционность HCV по сравнению с ВИЧ-19. В настоящее время смертность, связанная с ВГС, даже превышает число смертей, связанных со СПИДом1718, и в глобальном масштабе ожидается, что бремя инфекции HCV еще больше возрастет в течение следующих нескольких десятилетий19. Чтобы уменьшить дальнейшую передачу вируса гепатита C и ВИЧ-1 среди PWID, необходима общая осведомленность о потенциальных факторах риска, и для снижения глобального бремени вирусной инфекции необходимо установить приемлемые стандартные процедуры, ориентированные на решение. В этом исследовании мы изучили влияние микроволнового облучения на стабильность и инактивацию HCV, а также HIV-1 как простой метод предотвращения вирусных инфекций среди PWID.

Микроволновые печи являются популярными инструментами, в основном используемыми в качестве устройств для быстрого нагрева продуктов. Они используют электромагнитную энергию для быстрого нагрева диэлектрических материалов, таких как вода20. Мы ранее анализировали стабильность HCV в жидкостях 21, а также на высушенных поверхностях 22 и сообщали о чувствительности к HCV-температуре в анализе передачи лекарственного средства22. Чтобы перевести эти выводы в превентивную стратегию блокирования передачи вируса среди PWID, было исследовано микроволновое облучение в качестве потенциальной процедуры инактивации нагревания против вирусов, передающихся через кровь. HCV, содержащие жидкости для культивирования клеток (100 мкл), подвергали микроволновому облучению в течение 1, 2 или 3 мин при 90, 180, 360, 600 или 800 Вт (ватт) и контролировали вирусные титры всех семи различных генотипов HCV (рис. 1). Облучение низкой энергией при 90 или 180 Вт не влияло на вирусную инфективность, не зависящую от вирусного генотипа (рис. 1A-G). Однако вирусная инфективность всех тестируемых генотипов HCV может быть значительно снижена при облучении в течение по меньшей мере 2 мин при 360 Вт или более высокой мощности. Следует отметить, что более короткие периоды облучения, даже с более высокими степенями, например. облучение в течение 1 мин при 600 или даже 800 Вт, не всегда приводило к значительной потере вирусной инфекционности, поскольку время достижения критической температуры было слишком коротким. Как и ожидалось, увеличение времени облучения и мощности приводило к повышению температуры, которое контролировалось для каждой обработанной культуральной жидкости (таблица 1). Например, в условиях 180 Вт в течение 2 мин были достигнуты температуры около 42-53 ° С в различных культуральных жидкостях, тогда как в условиях 360 Вт 58-69 ° С регистрировали через 2 мин облучения (табл. 1) , Для непосредственного сравнения чувствительности микроволнового облучения между различными генотипами HCV, температура, необходимая для снижения инфекционности для каждого генотипа HCV на 90% (ингибирующая температура 90: IT90), рассчитывалась из точек данных. Как показано в Приложении. Фиг.1, вирусы генотипа 3 были наиболее чувствительны к микроволновому облучению IT90 52 ° C, в результате чего другие генотипы HCV значения IT90 находились в диапазоне от 56 до 60 ° C, что указывает на то, что эта практика дезактивации одинаково эффективна против всех генотипов HCV (Suppl. Рисунок 1).

Важно отметить, что эффект процедуры инактивации микроволн может быть подтвержден с помощью высоковирусного титра безрепортерного вируса Jc1 (см. Рис.2) и при инфицировании первичных человеческих гепатоцитов ex vivo (PHH), которые были инфицированы клеткой HCV культуральные жидкости. Де-ново производство инфекционного вируса может быть значительно снижено в PHH путем обработки HCV 800 Вт в течение 2 минут, тогда как в качестве контроля использовали ингибитор полимеразы HCV (2′-C-метиладенозин, 2′-CMA) (фиг.2) , Таким образом, инфективность HCV от всех генотипов в клетках печени человека может быть эффективно отменена после микроволнового облучения 600 Вт в течение по меньшей мере 2-3 минут.

Из-за сходных способов передачи, совместная инфекция HCV / ВИЧ-1 очень распространена, особенно среди PWID, причем одна треть ВИЧ-1-инфицированных американцев и 7 миллионов человек во всем мире являются со-инфицированными2324. Для анализа влияния микроволнового облучения на совместное заражение ВГС / ВИЧ-1 вирусом гепатита C (генотип 2a Jc1) или ВИЧ-1 либо индивидуально облучали, как описано выше, либо совместно инкубировали для имитации коинфекции до того, как микроволновое облучение было выполнено. Как отмечалось ранее, низкая мощность облучения (90 или 180 Вт) не приводила к существенному уменьшению одиночной инфекционной активности отдельных ВГС (фиг.3А) или ВИЧ-1 (фиг.3С). Тем не менее, оба вируса могут быть значительно инактивированы при облучении в течение по меньшей мере 2 мин и 360 Вт. Это снижение титров вируса может последовательно наблюдаться в установке совместного инкубации как с HCV (фиг.3B), так и с ВИЧ-1 ( Рис. 3D), независимо от наличия другого вируса. Это указывает на то, что микроволновое облучение является эффективным против HCV, а также инфекционностью ВИЧ-1 и может способствовать предотвращению передачи вируса даже в контексте совместного воздействия.

Предполагается, что распространение зараженного лекарственного препарата и инъекционного оборудования, включая шприцы и фильтры, среди PWID является основным путем для вирусной передачи15. Чтобы имитировать такой сценарий передачи, шприцы были заражены инфекционными вирусными частицами HCV и / или ВИЧ-1 и облучены в течение 3 мин различными микроволновыми степенями. Инфективность HCV в шприцах была значительно снижена при облучении при 360 Вт или выше, без различий между одной HCV-инфекцией или HCV / ВИЧ-1-коинфекцией (фиг.4A). Соответственно, титры ВИЧ-1 можно снизить до фоновых уровней при облучении на 360 Вт независимо от коинфекции HCV (фиг.4B), демонстрируя, что микроволновое облучение также эффективно снижает вирусную инфекционность зараженных шприцев.

В дополнение к зараженным шприцам повторное использование вирусоподобных препаратов для сигаретных фильтров представляет собой возможный источник инфекции22. Фильтры обычно используются PWID для удаления примесей из лекарственного раствора и для предотвращения блокировки иглы при инъекции, но также повторно используются из-за остаточного количества лекарств, которые находятся внутри фильтра. Было показано, что инфекционные вирусные частицы остаются заразными в таких фильтрах для приготовления лекарств от нескольких часов до 2 дней, когда они обернуты в фольгу22, и поэтому представляют собой высокий риск перекрестной передачи вируса среди PWID при совместном использовании. Для оценки противовирусного эффекта микроволнового облучения на этой лекарственной принадлежности фильтры для лекарственного средства были заражены HCV и / или ВИЧ-1, как описано выше22, и остаточный титр вируса определяли после микроволнового облучения в течение 3 мин. В то время как облучение низкой энергией (90 или 180 Вт) не уменьшало вирусную инфекционность, как HCV (фиг.5A), так и инфекционная активность ВИЧ-1 (фиг.5B), как при одиночной инфекции, так и в инкубационной установке, значительно снижается после облучения на 360 Вт или более (рис.5). Эти результаты были воспроизведены в контексте HCV-инфекции PHH после заражения фильтрацией лекарственного средства против HCV и инактивации микроволн (рис.5C).

Чтобы подражать также потенциальному хранению фильтров в течение часов или дней с помощью PWID, мы затем высушили на воздухе фильтры для приготовления лекарств после вирусного загрязнения в течение 6 часов (фиг.6А) или 24 ч (фиг.6В), а затем применяли инактивацию микроволн процедура. Важно отметить, что также связанный с воздушным сухим фильтром вирус может быть значительно уменьшен при облучении на 180 или 800 Вт в течение 2 или 3 мин (фиг.6А, В). Наконец, мы моделировали еще более физиологическую установку зараженного вирусом лекарственного средства, добавляя 1 мг / мкл уличного героина к суспензии HCV. Мы использовали этот вирус / лекарственный раствор для загрязнения фильтров для приготовления лекарств, как описано, и проводили микроволновое облучение фильтров дозозависимым образом в течение 3 мин. Даже при наличии препарата вирусная инфективность может быть значительно снижена при облучении при 360 Вт или выше (рис.7). В заключение, эти результаты показывают, что микроволновое облучение зараженных вирусом фильтров препаратами лекарственного средства может эффективно инактивировать вирусную инфекционность и тем самым уменьшать риски передачи среди PWID.

Передача вируса среди PWID — это глобальная проблема общественного здравоохранения, в которой около 10 миллионов инфицированных ВИЧ инфицированы вирусом гепатита С и 3 миллионами ВИЧ-1, включая высокий процент инфицированных HCV / HIV-1 лиц122526. В то время как программы снижения вреда и методы замещения опиатов значительно снизили распространенность ВИЧ-инфекции и заболеваемость в последние годы, передача вируса гепатита В продолжает оставаться высокой при ВГС-инфекциях в пределах от 5 до 45% в год102728. Необходимы новые стратегии профилактики, чтобы помочь снизить глобальную передачу ВГС и ВИЧ-1, особенно среди PWID. В этом исследовании мы стремились проанализировать универсально применимую процедуру, а именно микроволновое облучение, как способ инактивации вирусных загрязнений в шприцах и фильтрах и, следовательно, для снижения потенциальной вирусной передачи из-за обмена зараженным оборудованием. Микроволновые печи обычно используются как устройства для быстрого нагрева продуктов. Предыдущие исследования показали, что пастеризация (термообработка при 60 ° C в течение нескольких часов) может инактивировать вирусную инфективность HCV, HBV, а также ВИЧ-129. Для HCV было продемонстрировано, что тепловое введение в диапазоне 60 ° C или выше является достаточным для разрушения вирусной инфекционности30 главным образом с вирусной оболочкой, но также и с вирусной РНК, на которую влияет эта процедура31. В экспериментальных условиях, применяемых здесь, микроволновое облучение в течение по меньшей мере 2 мин или более при не менее 600 Вт является достаточным для достижения критической температуры, что облегчает инактивацию HCV, а также ВИЧ-1 или HCV / ВИЧ-1. Передача вируса между PWID часто облегчается путем совместного использования оборудования для заражения лекарственными средствами16323334. Действительно, в нескольких исследованиях сообщалось, что HCV очень устойчив и способен выжить на оборудовании для приготовления лекарств, включая иглы, шприцы, фильтр и воду в течение длительного периода223035. Подражая повторному использованию потенциально загрязненных шприцев и фильтров, которые оба широко распространены среди PWID, мы могли бы показать, что микроволновое облучение этого оборудования для приготовления лекарств может эффективно снизить вирусную инфективность; поэтому предотвращает возможную перекрестную передачу вирусов между индивидуумами. Это можно было наблюдать и при наличии уличного героина. Ограничение инактивации HCV на микроволновой основе в загрязненных шприцах является иглой, полученной из металла, которую нельзя помещать в микроволновую печь. Поэтому мы рекомендуем удалять и удалять иглу или обеззараживать иглу с помощью дезинфицирующих реагентов, которые будут неактивными HCV2122. В случае шприцев, где игла не может быть удалена, процедура инактивации микроволнового вируса не рекомендуется. Как сообщалось, ультрафиолетовый свет также инактивировал HCV по крайней мере в продуктах крови36, было бы интересно оценить УФ-свет как потенциальный источник инактивации вируса в будущих исследованиях.

Важно отметить, что температура, требуемая для инактивации вирусных частиц, не должна влиять на эффект героина, поскольку основная составляющая уличного героина, диацетилморфина, начинает плавиться при 173 ° С37. Эта высокая температура плавления героина и обычная практика PWID для приготовления героина и других лекарств в раствор далее говорят о том, что наш подход к микроволновому нагреву не разрушит стабильность героина. При нагревании до 800 Вт в течение 3 минут достигалась максимальная температура 90 ° C, как указано в таблице 1, что намного ниже температуры плавления героина. Кокаин имеет температуру плавления 98 ° C и температуру кипения 187 ° C и, как сообщается, стабилен при 65 ° C в течение одного месяца3839. Температуру, необходимую для снижения инфекционности всех генотипов HCV на 90%, определяли между 56-60 ° C, что уже могло быть достигнуто с мощностью 360 Вт в течение 2 мин. Будущие исследования могут касаться тонкой настройки частоты микроволн на частоту вирусного резонанса, как описано выше для вирусов гриппа40, чтобы уменьшить эффект нагревания и тем самым улучшить метод инактивации вируса, передающегося через кровь.

PWID представляют собой основную часть эпидемии ВГС, особенно в странах с высоким и средним уровнем дохода, и при отсутствии защитной вакцины доступной передачи HCV, а также ВИЧ-1 продолжается19. Несмотря на то, что варианты лечения значительно увеличились, а парадигмы лечения меняются, по-прежнему существует несколько барьеров, которые препятствуют успешному лечению PWID941. В ситуациях, когда стерильное оборудование для инъекций наркотиков недоступно, можно было бы упростить простую и почти универсально применимую процедуру, такую ​​как микроволновое отопление в течение ограниченного времени, для снижения передачи вируса среди PWID. Мы могли бы показать, что путем простого нагрева оборудования для приготовления лекарств посредством микроволнового облучения можно эффективно снизить вирусную инфективность HCV и ВИЧ-1. Продвижение этой процедуры должно помочь уменьшить и / или предотвратить передачу вирусов, переносимых кровью, таких как ВГС и ВИЧ-1, и способствовать сокращению глобального бремени.

Плазмида HCV pFK-Jc1 кодирует интрагенотипический 2a / 2a химерный вирус Jc142. Репортерные генотипы HCV 1-7 (изолят GT1a H77, изолят GT2a Jc1, GT3a изолят S52, изолят GT4a ED43, изолят SA13, GT5a GT6a, изолят HK6a GT6a GT6a и изолят GT7a GT7a) охватывают межгенотипические химеры, кодирующие ядро ​​- NS2 генотипа 1-7, и нетранслируемые регионы (UTR) и NS3-NS5B JFH1 и были описаны ранее434445. Плазмиду, кодирующую полноразмерный клон ВИЧ-1 NL4.3, использовали для получения частиц ВИЧ-1, как описано ранее46.

Huh7.5, HEK293T и TZM клетки культивировали в модифицированной Дульбекко среде Eagle (DMEM, Invitrogen), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% несущественных аминокислот (Invitrogen), 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen) и 100 МЕ / мл пенициллин (Invitrogen). Первичные гепатоциты человека (PHH) выделяли из образцов печени, полученных после частичной гепатэктомии, высевали с плотностью 1,3 × 106 на коллаген в чашках P6 и хранили в культуральной среде гепатоцитов (Lonza), как описано47.

Инфекционные частицы HCV были получены, как описано ранее48. Вкратце, плазмидную ДНК HCV линеаризуют и транскрибируют в РНК с последующей электропорацией в клетки Huh7.5. Вирус-содержащие культуральные жидкости собирали через 48 и 72 ч, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм (VWR International) и использовали непосредственно или далее концентрировали, используя центриконы (Centricon Plus-70, Millipore, США). Для определения вирусной инфекционности клеточные супернатанты использовали для инфицирования наивных клеток-мишеней Huh7.5.

Для производства инфекционных ВИЧ-1 клетки HEK293T трансфицировали плазмидой, кодирующей полноразмерный HIV-1NL4.3, с помощью осаждения кальций-фосфатным ДНК (Takara Bio Europe). Вирус-содержащие культуральные супернатанты собирали через 48-72 ч после трансфекции, фильтровали с использованием фильтров 0,45 мкм (VWR International) и концентрировали путем ультрацентрифугирования через 20% сахарозную подушку (Sigma-Aldrich). Инфекционный титр вирусного запаса определяли анализом синей клетки на основе β-галактозидазы с использованием клеток TZM-bl46.

Титры инфекционного вируса HCV вируса дикого типа (Jc1) определяли с помощью предельного анализа разбавления на клетках Huh7.5, как описано в другом месте, с небольшими изменениями49. Инфекционная доза 50% тканевой культуры (TCID50) была установлена ​​при 72-часовой инфекции, как описано ранее42. Активность репортерного вируса люциферазы генотипов HCV определяли при инфицировании клеток Huh7.5, как описано выше50. Вкратце, клетки лизировали в буфере для лизиса люциферазы (Promega) через 72 часа после инфицирования. Активность люциферазы Рениллы измеряли после добавления субстрата люциферазы (1 мкмоль / л коэлентеразина, P.J.K) с использованием люминометра (Lumat LB9507).

Инфективность ВИЧ-1 определяли с помощью анализа синей клетки на основе люциферазы светлячков, используя клетки TZM-bl46. Инфицированные клетки лизировали в буфере для лизиса люциферазы (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Репортерную активность люциферазы определяли люминометрически после добавления субстрата люциферазы (Promega).

Микроволновое облучение проводилось в бытовой микроволновой печи Bosch, серийный номер: MM817ASM (220-230 В, 2450 МГц) с максимальной мощностью 800 Вт. Чтобы исследовать эффективность микроволнового облучения против всех генотипов HCV, 100 мкл клетки -бесконечный инфекционный вирусный супернатант, содержащийся в пробирке Эппендорфа, помещался в фиксированное положение в середине микроволны, где происходит самое высокое тепловыделение и облучается в течение 1, 2 или 3 мин 90, 180, 360, 600 или 800 Вт В инкубационной установке 50 мкл культуральной жидкости, содержащей HCV, смешивали с ВИЧ-1 (об. / Об.) И соответствующие моноинкубации проводили в 50 мкл репортерного HCV или содержащего HIV-1 супернатанта, который разбавляли в 50 мкл DMEM. Экс-vivo-эксперименты проводились путем инфицирования первичных человеческих гепатоцитов (PHH) с HCV (Jc1). Аликвоты супернатантов HCV, полученных из культуры клеток (100 мкл), облучали в микроволновой печи в течение 2 мин 800 Вт. В качестве положительного контроля ингибитор полимеразы HCV (2′-CMA) (конечная концентрация 1 мкМ 2′-CMA) был использован. Микроволновые или 2′-CMA обработанные вирусные супернатанты использовали для инфицирования PHH. После 6 ч инкубации при 37 ° С изменение среды осуществляли добавлением культуральной среды гепатоцитов (Lonza), как описано47. Производство de novo инфекционного вируса через 24 часа контролировалось TCID50.

Суспензии HCV и / или ВИЧ-1 вводили в шприц для инсулина (U-40 Insulin-1 mL / 40 I.U. Omnifix 40 Solo, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany) без прикрепления иглы. В установке для моноинкубации 50 мкл репортера HCV (Jc1) или супернатанта HIV-1 разводили в 50 мкл DMEM. В установке совместного инкубации 50 мкл культуральной жидкости, содержащей HCV, смешивали с ВИЧ-1 (об. / Об.). Шприц вместе с суспензией вируса облучали с разной мощностью в течение 3 мин в микроволновой печи. Суспензию вируса извлекали из шприца и определяли вирусные титры, как описано выше.

Тонкие сигаретные фильтры, 6 мм × 15 мм (Gizeh, Gummersbach, Germany), были пропитаны репортерными жидкостями, содержащими HCV (Jc1) или HIV-1, на ложке объемом 200 мкл, разбавленным в 200 мкл DMEM. В случае инкубации HCV / HIV-1 200 мкл культуральной жидкости, содержащей HCV, смешивали с ВИЧ-1 (об. / Об.). Для некоторых экспериментов 1 г / мкл уличного героина (40% 3,6-диацетилморфина, 8% 6-ацетилморфина, 8% 6-ацетилкодеина, 12% кофеина, 4% кодеина, 4% морфина, 8% -ного наркотика, 4% папаверина , и 12% парацетамола, LipoMed AG) с разрешения Федерального института лекарственных средств и медицинских устройств (BtM номер 4606432) добавляли к 400 мкл супернатанта HCV с вирусным титром около 106 TCID50 / мл, а тонкие сигаретные фильтры были пропитаны внутри смесь. Избыток вирусной жидкости удаляли с использованием шприца для инсулина, а зараженные фильтры подвергали микроволновому облучению при различных степенях в течение 3 мин. Для исследования вирусной инфекционности HCV в высушенных на воздухе сигаретных фильтрах тонкие сигаретные фильтры были смочены в содержащей HCV (Jc1) культуральной жидкости объемом 400 мкл и вирусным титром около 106 TCID50 / мл. Излишнюю вирусную жидкость удаляли с использованием шприца для инсулина до того, как загрязненные фильтры были помещены под вытяжной шкаф в течение 6 или 24 часов при комнатной температуре, покрытые стандартной бытовой фольгой (Edeka, Hamburg, Germany). После указанных периодов сушки загрязненные фильтры подвергались микроволновому облучению при разной мощности в течение 3 мин. Вирусные частицы извлекали при встряхивании фильтра в 400 мкл DMEM в течение 5 мин при 37 ° С. Вирусные титры определяли, как описано выше. Кроме того, эксперименты ex vivo также проводились путем инфицирования PHH с помощью HCV (Jc1) после заражения тонких сигаретных фильтров и титрования вируса, как описано выше.

У всех экспериментов был необработанный контроль вируса (100% инфекции) и группа лечения, отличающаяся мощностью облучения 90, 180, 360, 600 или 800 Вт за 1, 2 или 3 минуты. Каждая экспериментальная обработка проводилась в трех биологических повторах. Значительные различия между контролем и каждым образцом определялись с использованием t-теста ученика51. Все данные по каждой фигуре представлены в логарифмической шкале. Значение результатов было установлено как p <0,05. Для этой оценки использовался пакет статистики SPSS 23.0 (IBM Corp., Armonk, New York). (* при р <0,05, ** при р <0,01, *** при р <0,001).

Как процитировать эту статью: Сиддхарта, А. и др. Инактивация HCV и ВИЧ с помощью микроволн: новый подход к профилактике передачи вируса среди людей, употребляющих инъекционные наркотики. Sci. По донесению
6, 36619; doi: 10.1038 / srep36619 (2016).

Примечание издателя: Природа Спрингера остается нейтральной в отношении юрисдикционных требований в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Мы благодарны Такаджи Ваките и Йенсу Буху за изоляты JFH1 и HCV, соответственно, Оливеру Кепплеру за клон HIV-1NL4.3, а также Чарльзу Райсу за клетки Huh7.5 и моноклональное антитело E9E10. Кроме того, мы благодарим всех членов Института экспериментальной вирусологии, Twincore, за полезные предложения и дискуссии. E.S. был поддержан Центром исследований инфекционных заболеваний Гельмгольца. C.G. был поддержан программой DFG SFB900 / C8 и Центром исследований инфекционных заболеваний Гельмгольца.

Авторские вклады Концепция и дизайн исследования: E.S., P.M.-G. и C.G .; сбор, сбор, анализ и интерпретация данных: A.S., S.P., A.K., A.M., M.E., D.T., B.N., J.S., F.W.R.V. и J.D .; составление рукописи: S.P., C.G. и E.S .; утверждение окончательной версии рукописи: все авторы.

Различные генотипы вирусного вируса HCV ((A) GT1a, (B) GT2a, (C) GT3a, (D) GT4a, (E) GT5A, (F) GT6a, (G) GT7a) подвергались микроволновому облучению для разных временных периодов и уровни мощности. Вирусную инфективность определяли репортерной активностью люциферазы. Данные были нормализованы для необработанного контроля вируса. Пунктирная линия представляет собой фон анализа. На фиг.1A-G представлены данные трех отдельных экспериментов (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

Супернатант, содержащий HCV (Jc1), облучали в микроволновой печи в течение 2 мин 800 Вт, а затем использовали для инфицирования PHH. Де-ново производство инфекционного вируса через 24 часа контролировалось путем определения дозы инфекции тканевой культуры (TCID50 / мл). В качестве положительного контроля использовали ингибитор полимеразы HCV (2′-CMA) (конечная концентрация 1 мкМ 2′-CMA). Данные были нормализованы для необработанного контроля вируса. Пунктирная линия представляет собой фон анализа. Представлены данные трех отдельных экспериментов (*** p <0,001).

Приостановка репортерного вируса HCV (Jc1) в моноинкубационной установке (A) и совместная инкубация с ВИЧ-1 (B), а также ВИЧ-1 в моноинкубационной установке (C) и в совместной инкубации с HCV (D) подвергали микроволновому облучению, а титры вируса определяли для HCV и HIV-1, измеряя активность люциферазы репортера. Данные были нормализованы для необработанного контроля вируса. Пунктирная линия указывает фон анализа. Показаны результаты трех отдельных экспериментов (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

Суспензии дикого типа HCV (Jc1) и / или ВИЧ-1 выливали в шприц для инсулина и облучали в течение 3 мин при разных степенях. Вирусную суспензию собирали из шприца и определяли вирусные титры для HCV (A) путем ограничения анализа разбавления для определения дозы инфекции тканевой культуры (TCID50 / мл) и для ВИЧ-1 (B) путем определения активности люциферазы репортера. Данные были нормализованы для необработанного вирусного контроля. Пунктирная линия указывает фон анализа. Представлены результаты трех отдельных экспериментов (*** p <0,001).

Тонкие сигаретные фильтры были пропитаны суспензиями HCV (Jc1) и / или ВИЧ-1 дикого типа. Вирусную суспензию удаляли из фильтра с использованием шприца для инсулина, и фильтр облучали в течение 3 мин при разных степенях. Остаточные вирусные частицы извлекали из фильтра путем добавления 400 мкл клеточной культуральной среды и инкубации в течение 5 мин при 37 ° С при встряхивании. Инсулиновый шприц использовали для вытягивания супернатанта из фильтра. Вирусные титры определяли для HCV (A) по дозе инфекции тканевой культуры (TCID50 / mL) и для ВИЧ-1 (B), определяя активность люциферазы репортера. Данные были нормализованы для необработанного вируса. Пунктирная линия указывает фон анализа. Для эксперимента в PHH (C) зараженный HCV фильтр облучался в течение 2 мин с мощностью облучения 800 Вт. Дезово производство инфекционного вируса через 24 часа контролировалось путем определения дозы инфекции тканевой культуры (TCID50). Показаны результаты трех отдельных экспериментов (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

Тонкие сигаретные фильтры пропитывали суспензиями HCV (Jc1) дикого типа. Вирусную суспензию удаляли из фильтра с использованием шприца для инсулина. Затем фильтр обертывали в пластиковую фольгу и оставляли под капотом либо через 6 ч (А), либо через 24 ч (В) после облучения в течение 3 мин при разных степенях. Остаточные вирусные частицы извлекали из фильтра путем добавления 400 мкл клеточной культуральной среды и инкубации в течение 5 мин при 37 ° С при встряхивании. Инсулиновый шприц использовали для вытягивания супернатанта из фильтра. Тирезы вируса определяли для HCV путем ограничения анализа разбавления для определения дозы инфекции тканевой культуры (TCID50 / mL). Данные были нормализованы для издевательства — не обработанного вируса. Пунктирная линия указывает фон анализа. Представлены результаты трех отдельных экспериментов (*** p <0,001).

1 мг / мкл уличного героина высушивали в дикий тип HCV (Jc1), содержащий вирусную суспензию. В этом растворе был пропитан тонкий сигаретный фильтр. Вирусную суспензию удаляли из фильтра с использованием шприца для инсулина, и фильтр облучали в течение 3 мин при разных степенях. Остаточные вирусные частицы извлекали из фильтра путем добавления 400 мкл клеточной культуральной среды и инкубации в течение 5 мин при 37 ° С при встряхивании. Инсулиновые шприцы использовались для извлечения супернатанта из фильтра. Тирезы вируса определяли для HCV путем ограничения анализа разбавления для определения дозы инфекции тканевой культуры (TCID50 / mL). Данные были нормализованы для необработанного контроля вируса. Пунктирная линия указывает фон анализа. Представлены результаты трех отдельных экспериментов (*** p <0,001).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *