Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Повышение активности аланин-аминотрансферазы происходит после активации клеточной смерти, инициированной рецепторами распознавания паттерна, но до активации цитолитических эффекторов в NK или CD8 + Т-клетках в печени во время острой инфекции HCV

Elevation of Alanine Aminotransferase Activity Occurs after Activation of the Cell-Death Signaling Initiated by Pattern-Recognition Receptors ‎but before Activation of Cytolytic Effectors in NK or CD8+ T Cells in the Liver During Acute HCV Infection
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5082795/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Концептуализация: YHC.

Сохранение данных: YHC TY.

Формальный анализ: YHC NJ FK SKS.

Исследование: YHC NJ FK SKS.

Методология: YHC NJ FK SKS.

Программное обеспечение: NJ TY.

Надзор: YHC.

Проверка: YHC TY.

Визуализация: YHC.

Письмо — оригинальная черновик: YHC.

Написание — просмотр и редактирование: YHC NJ FK SKS TY.

Рецепторы распознавания образов (PRR) способствуют защите хозяев от инфекции HCV путем связывания с их соответствующими молекулами адаптера, что приводит к инициации врожденных иммунных реакций, включая гибель клеток. Мы исследовали экспрессию PRR-генов, биомаркеров клеточной гибели клеток и генов, связанных с активацией / ингибированием Т-клеток и NK-клеток, в печени и сыворотке, полученных от трех экспериментально инфицированных шимпанзе с острой HCV-инфекцией, и проанализировали корреляцию между уровнями экспрессии генов и клинические профили. Наши результаты показали, что экспрессия пептидных RIG-I, TLR3, TLR7, 2OAS1 и CXCL10 мРНК была активирована уже через 7 дней после инокуляции и достигла максимума через 12-83 дня после инокуляции. Все три инфицированных HCV шимпанзе демонстрировали значительные повышения активности сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) в течение 70-95 дней после инокуляции. Повышенные уровни активности цитокератина 18 в сыворотке (CK-18) и каспаз 3 и 7 тесно совпадали с повышением активности ALT и предшествовали значительное увеличение уровней каспазы 3 и каспазы 7 мРНК в печени. В частности, мы обнаружили, что наблюдались значительные положительные автокорреляции между RR-I, TLR3, CXCL10, 2OAS1 и PD-L1 мРНК и активностью ALT за 3-12 дней до пика активности ALT. Тем не менее, мы наблюдали существенные отрицательные автокорреляции между T-клетками и NK-клеточными активационными / ингибирующими генами и активностью ALT через 5-33 дня после пика активности ALT. Наши результаты показали, что сигнализация смерти клеток предшествует ранней индукции мРНК RIG-I, TLR3, 2OAS1 и CXCL10, что приводит к повышению активности ALT, и этот сигнальный путь происходит до активации NK и Т-клеток во время острой HCV-инфекции. Наше исследование показывает, что ПРР и ответ ИФН типа I могут играть решающую роль в развитии повреждения клеток печени, связанных с вирусным разминированием при острой инфекции HCV.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Инфекция HCV является наиболее распространенной инфекцией, передающейся через кровь, в США, где проживает около 3 миллионов человек, инфицированных [1]. Чрескожное воздействие зараженной крови является наиболее частым способом передачи ВГС с использованием инъекционных наркотиков (ПИН), являющимся преобладающим фактором риска заражения. Данные эпиднадзора показывают, что с 2006 по 2012 год наблюдалось общенациональное увеличение зарегистрированных случаев острой HCV-инфекции, причем наибольший прирост происходил к востоку от реки Миссисипи, особенно в штатах Аппалачи [2]. По всей видимости, около 30 000 случаев острых инфекций с гепатитом С, по оценкам, произошли в 2013 году. Демографические данные и данные о поведении показывают, что большинство случаев были среди молодых людей (в возрасте ≤30 лет) из непунктовых районов с ПИН в качестве основного фактора риска [3] ,

Острый гепатит С определяется наличием каких-либо признаков или симптомов острого вирусного гепатита плюс желтуха или повышенная активность аланинаминотрансферазы в сыворотке (ALT), с серологическими доказательствами антител против HCV или РНК HCV в течение 6 месяцев после воздействия. В 2012 году определение случая для острой инфекции HCV было расширено, чтобы включать случаи с отрицательным антителом HCV в крови с последующим положительным антителом в течение 6 месяцев [3]. Тем не менее, большинство людей с острой инфекцией HCV во время диагностического тестирования уже положительны для анти-HCV-антител.

Биомаркеры ответа хозяина на HCV во время ранней фазы инфекции могут использоваться в качестве дополнения для более точного определения острого гепатита C и обеспечения более четкого определения случая острого гепатита C [4]. Ответы хозяев включают те, которые генерируются врожденными и адаптивными иммунологическими механизмами, и те, которые связаны с сигнализацией смерти клеток. Изучение модели заражения HCV шимпанзе позволяет тщательно анализировать реакции хозяина, особенно на ранней стадии инфекции.

У экспериментально инфицированных шимпанзе РНК HCV может обнаруживаться в крови через 1-2 недели после инокуляции и сохраняется в течение дополнительных 8-18 недель [5-9]. Активность ALT в сыворотке достигает 6-10 недель, когда уровни РНК HCV начинают снижаться. АЛТ-активность является показателем гиперактической смерти печени. Были описаны два основных механизма клеточной смерти; неупорядоченный некроз и запрограммированный апоптоз. Исследования показали, что эти два процесса являются частью одного и того же спектра смерти [10, 11]. Апоптоз индуцируется по существу митохондриальной смертью и по прошествии времени после запуска клеточного пути смерти с помощью рецепторов, таких как фактор некроза опухоли (TNF), Fas-лиганд (FASL) и связанный с TNF апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL) [11]. Цистеин-аспартатные протеазы, называемые каспазами, активируются в конце обоих путей и могут быть разделены на две основные группы: каспазы инициатора (такие как каспазы 2, 8, 9 и 10), которые обеспечивают регуляторную функцию; и эффекторные каспазы (такие как каспазы 3, 6 и 7), которые выполняют апоптотическую гибель клеток [12].

HCV активирует рецепторы распознавания образов (PRR), включая Toll-подобные рецепторы (TLR) и ген, индуцируемый ретиноевой кислотой 1 (RIG-I), очень рано после инфицирования [13]. PRR инициируют механизмы для ликвидации вирусной инфекции как части врожденного иммунного ответа хозяина [14]. Сильные иммунные реакции хозяина индуцируются через несколько дней после инфицирования HCV у шимпанзе, в котором многие гены иммунного ответа, как обнаружено, являются IFN-стимулированными генами (ISG) [5, 7-9]. Активацию ISG на ранней стадии острой HCV-инфекции инициируют путем выявления вирусных патогенов, связанных с молекулярными структурами (PAMPs), посредством PRR. PRR-индуцированные реакции участвуют в продуцировании провоспалительных цитокинов, интерферонов I и III типа (IFN), которые совместно действуют для ограничения репликации вируса путем инициирования гибели клеток [15-21]. Точные механизмы взаимодействия между индукцией ИФН и апоптозом неясны. Однако известно, что TLR-белки распознают РНК как лиганд и вводят IFN-ответы типа I и типа III [22, 23], например, RIG-I, цитозольная РНК-геликаза, которая может распознавать как двухцепочечные, так и одноцепочечные РНК может затем индуцировать нижестоящий сигнальный каскад, что в конечном итоге приводит к апоптозу [24]. Кроме того, было показано, что HCV-специфичные Т-клетки и NK-клетки связаны с вирусным клиренсом и травмой печени от апоптоза [25, 26].

Мы сообщаем здесь о кинетике экспрессии генов печени маркеров врожденного и адаптивного иммунитета и сигнализации о клеточной смерти и появлении биомаркеров в периферической крови, полученных из такой экспрессии у инфицированных HCV шимпанзе во время острой фазы. Мы показываем маркеры врожденного иммунитета и сигнализацию смерти клеток как в печени, так и в сыворотке предшествуют или совпадают с повышением активности ALT в сыворотке, тогда как маркеры адаптивного иммунитета в печени и крови, как правило, происходят после пика активности ALT в сыворотке.

Это исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных центров по контролю и профилактике заболеваний. Протокол был одобрен Институтом по уходу и использованию животных Центров по контролю и профилактике заболеваний (номер протокола: 1363KRACHIC). Животных анестезировали персонал отдела ресурсов животных с тилетамином (telazole) для биопсии печени в дозе 5 мг / кг через межмышечный (IM), кетамин HCL использовали для успокоения для сбора крови с дозой 10 мг / кг через IM и все усилия были направлены на минимизацию страданий. Диета состояла из смеси высокобелковой чау-чау (Diet Diet High-Protein Monkey Diet 5045, PMI Nutrition International, Сент-Луис, Миссури), высококалорийной чау (Fiber-Plus Monkey Diet 5049, PMI Nutrition International), различных фрукты и овощи, а также угощения (Bio-serv, Frenchtown, NJ). Животные были поодиночке, а пары — в соответствии с федеральными законами, правилами и «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных». До прививки с гепатитом С и по завершении исследования животные находились в паре. После инокуляции гепатитом С животные размещались индивидуально (приблизительная площадь пола составляла более 25,1 кв. Футов), чтобы предотвратить вирусную передачу, но были позволены зрительный и слуховой контакт друг с другом. Экологическое обогащение состояло из социальных (например, парного жилья и человеческого взаимодействия), структурных (например, качелей, окуней, туннелей), манипулянда (например, различные игрушки, вращающиеся на еженедельной или двухнедельной основе), сенсорные (например, визуальные, тактильные и ольфактивные, такие как телевидение , музыка, видео и т. д.), различные новые продукты питания и различные возможности для пиления. Анальгетик, используемый для облегчения боли, был инъекционным, а пероральный мелоксикам (Metacam, Boehringer Ingelheim, St Joseph, MO) вводили внутримышечно сразу после биопсии печени и устно в последующие дни лечения в дозе 0,3 мг / кг. Исследование проводилось в период с августа 2005 года по март 2006 года. Три шимпанзе (CH1541, CH256 и CH6413) инокулировали внутривенно генотипом HCV 1a. Инокулят варьировал от 103 до 103,5 инфекционных доз шимпанзе (CID) [27-29]. Образцы сыворотки тестировали на исходном уровне и еженедельно после инокуляции для РНК HCV с использованием системы Cobas Amplicor в соответствии с рекомендацией производителя (предел обнаружения: 600 МЕ / мл) (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA) и далее количественно определяли с использованием системы Amplicor Monitor (Roche Молекулярные системы). IgG против HCV измеряли с использованием тестовой системы ORTHO 3.0 ELISA (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ). Активность ALT измеряли с использованием анализа, проведенного Drew Scientific (Даллас, штат Техас), и значение отсечки для каждого шимпанзе было установлено как 3 стандартных отклонения выше среднего значения 9 или 10 значений предварительной инокуляции.

Еженедельная биопсия иглы печени была получена в начале и после инокуляции HCV. Общая РНК была извлечена из образцов биопсии печени и РВМС с использованием набора для очистки РНК TRIzol Plus в соответствии с рекомендацией производителя (Ambion, Austin, TX). кДНК получали с использованием 100 нг общей РНК комплектом обратной транскрипции большой емкости (Applied Biosystems, Foster City, CA) и использовались в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени, выполняемой с использованием SYBR green PCR JumpStart Master Mix (Sigma, St. Louis , MO) для каспазы-3, каспазы-7, каспазы-8, каспазы-9, каспазы-10 и транскриптов APAF-1. Транскрипты 2OAS-1, RIG-1, TLR3, TLR7, TNFα, CXCL10, перфорина, CXCR3, CCR1, CCR7, NKG2D, KIR2D, CD8β IFNγ, CD86, PD-1, PD-L1, CTLA-4 и Tim- 3 в печени, и РВМС анализировали с помощью ПЦР Taqman в реальном времени с использованием Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system (Life Technologies, Grand Island, NY). Информация о последовательностях праймеров и зондов описана в сопроводительных материалах (материалы и методы S1). Большие, чем двукратные изменения (2-ΔΔTT) в измененной экспрессии генов считались значимыми. Уровень мРНК каждого гена был нормализован до эндогенного эталонного гена и выражен как увеличение по сравнению с исходными уровнями ткани печени.

Апоптоз-опосредованный неоэпитоп (антиген M30), расположенный в С-концевом домене цитокератина-18 (CK-18) (аминокислота 387-396), измеряли с помощью анализа ELISA M30-Apoptosense (Peviva AB, Bromma, Sweden). Активность Caspase 3 и 7 в сыворотке измеряли Caspase-Glo (Promega, Madison, WI). Для обоих анализов значения отсечки были рассчитаны из 10 исходных образцов у каждого шимпанзе и установлены как среднее значение плюс 1,6 от стандартного отклонения. Все анализы выполнялись в двух экземплярах.

Уровни сыворотки CXCL10 измеряли с использованием набора ELISA из набора Chemokine Array (RayBiotech, Norcross, GA). Растворимый PD-1 (sPD-1) измеряли в сыворотке или плазме с использованием внутреннего иммуноферментного анализа, связанного с ферментом (ELISA), детали которого включены в Информацию о поддержке. Показатели отсечения для sPD-1 были рассчитаны для каждого шимпанзе из 10 образцов сыворотки, полученных до инокуляции HCV (CH6413: 0,17 нг / мл, CH256: 0,22 нг / мл и CH1541: 0,12 нг / мл). Установлено, что фоновые уровни sPD-1, определенные по 24 образцам плазмы, полученным из исторических контрольных образцов 3 наивных шимпанзе, не превышают 0,1 нг / мл.

Чтобы исследовать взаимосвязь между экспрессией мРНК печени, уровнями сывороточного белка, титром сывороточного РНК HCV и активностью ALT во время острой HCV-инфекции, были проведены корреляционные тесты Пирсона и лага. Средние значения наблюдаемых данных от всех трех животных были использованы из-за консистенции и сходства концентрации РНК HCV и профилей ALT у каждого животного. Корреляционный тест Pearson был выполнен с использованием SPSS-программного обеспечения версии 21 (IBM Inc. Armonk, NY), а также для комплексной сети R архива (CRAN), Bioconductor (версия программного обеспечения R.2.2.2) [30]. Зависимые временные корреляции были рассчитаны между каждым биомаркером и активностью ALT после сдвига данных экспрессии для согласования с пиком активности ALT [31]. При необходимости применялась линейная интерполяция из-за появления отсутствующих или неравномерных точек времени выборки. Выравнивание проводилось таким образом, чтобы время, соответствующее самым высоким значениям двух наблюдаемых кривых, точно перекрывалось. Все статистические тесты были двухсторонними и считались значимыми при p ≤ 0,05. Плавный анализ траектории проводился с использованием Prism 6 (GraphPad).

Три шимпанзе были инфицированы генотипом ВГС 1а и показали типичную картину инфицирования ВГС. Виремия HCV была обнаружена на 4-й день в CH1541 и 7-й день в CH256 и CH6413; животных сероконвертировали между днями 70 — 88 (фиг. 1А). Пиковый уровень РНК HCV составлял около 5,7 log IU / мл. Все три шимпанзе демонстрировали значительные повышения активности ALT, которые достигали пика между 70 и 95 днями после инокуляции и возвращались к исходным уровням между днями 88 и 153 после инокуляции во время снижения РНК HCV в сыворотке. Обнаружение РНК HCV в CH6413 и CH256 продолжалось до конца 180-дневного периода наблюдения, тогда как CH1541 очищал РНК HCV до дня 131.

(A), курс инфекции у шимпанзе при острой инфекции HCV. Уровни РНК HCV сыворотки представлены в виде линейного графика; уровни ALT в сыворотке обозначены серым оттенком; серопозитивность для IgG против HCV представлена ​​баром. (B), активность каспазы в сыворотке 3/7 (красная линия) и уровни CK-18 (синяя линия) (C), печеночная экспрессия каспазы 3 (синяя линия) и 7 (красная линия) мРНК (D), уровни каспазы 8 (красная линия), каспаза 9 (зеленая линия), каспаза 10 (синяя линия) и APAF-1 (фиолетовая линия) мРНК в печени (E), уровни TNFα (красная линия) и перфориновые (синие линии) мРНК ( F), Уровни 2OAS-1 (синяя линия), RIG-I (красная линия), TLR3 (зеленая линия) и TLR7 (фиолетовая линия) мРНК в печени. Уровень мРНК каждого гена был нормализован до эндогенного эталонного гена и выражен как увеличение по сравнению с исходными уровнями ткани печени.

Активация каспазы является общей чертой гибели клеток путем апоптоза. Уровни активности Caspase 3/7 в сыворотке всех трех шимпанзе были увеличены с 71 до 91 дней после инокуляции, а их пики совпадали с пиковыми уровнями CK-18 (рис. 1B). Активность каспазы в сыворотке 3/7 и уровни CK-18 были тесно коррелированы с активностью ALT. Корреляционный тест Пирсона подтвердил, что существует статистически значимая сильная положительная корреляция между активностью каспазы 3/7, активностью CK-18 и ALT (таблица 1). Кроме того, в CH6413 и CH256 активность каспазы 3 и 7 над уровнями отсечки базовой линии была обнаружена с 110 по 180 дней. Повышенные уровни мРНК каспазы-3 и каспазы-7 в печени были обнаружены у всех трех животных, в которых повышенные экспрессию мРНК с 32-го дня в CH1541, 40-й день в CH256 и на 47 день в CH6413. Эти уровни достигли пика примерно за 20 дней до наивысших уровней повышенной активности каспазы 3/7 в соответствующих образцах сыворотки (рис. 1В и 1С).

Все статистические тесты были двухсторонними и считались значимыми при p ≤ 0,05.

Также были проанализированы высокие уровни инициатора каспазы-8, -9, -10 и молекулы-переходника, мРНК APAF-1 в печени. В CH6413 экспрессия мРНК каспазы 8, 9, 10 и APAF-1 повышалась с дней 47, 88, 75 и 32 соответственно (фиг.1D). В CH256 были обнаружены высокие уровни экспрессии мРНК каспазы 8, 9 и APAF-1 с 40 по 75 дней и повышение экспрессии мРНК каспазы 10 на день 75. В CH1541 экспрессия каспазы 8, 9 и 10 мРНК повышали с 32-го дня, а экспрессия мРНК APAF-1 была значительно повышена с 12-го дня (изменение в 7,2 раза). Экспрессия мРНК печеночной TNFα повышалась с 82 по 180 день в CH6413, в дни 95, 124 и от 152 до 180 в CH256 (фиг.1E). Выражение мРНК перфориновой перфорины повышалось на 4-й день и с 12-го по 12-й день и ее пиковый уровень был обнаружен на 125-й день в CH6413. В CH256 экспрессию мРНК перфорина повышали на 124 и 152 сутки. Однако повышенная экспрессия TNFα и перфориновых мРНК не была обнаружена в CH1541.

Проанализирована внутрипеченочная экспрессия 2’5 ‘олигоаденилата синтетазы-1 (2OAS-1), гена интерферона типа I и RIG-I, TLR3 и TLR7 в виде PRR. Возвышение экспрессии мРНК 2OAS-1 наблюдалось к 12-му дню, что совпало с появлением РНК HCV сыворотки и достигло максимума до того, как сывороточная АЛТ начала повышаться у всех шимпанзе (рис. 1F). Повышенные уровни экспрессии мРНК 2OAS-1 поддерживались в CH6413 и CH256, но его экспрессия снижалась до исходных уровней к концу острой фазы инфекции в CH1541.

В CH6413 печеночная экспрессия мРНК RIG-I и TLR3 достигла максимума на 12-й день и оставалась поднятой до дня 32 или 53 и снова регулировалась с 103 по 180 дней; Экспрессия мРНК TLR7 повышалась только на 12-й день (фиг.1F). В CH256 печеночная экспрессия мРНК RIG-1 и мРНК TLR3 повышалась от 53 до 82 и 53-61 соответственно, а высокие уровни экспрессии мРНК TLR7 наблюдались с 152 до 180 дней. В CH1541 экспрессию мРНК RIG-1 был повышен с 12 до 53 дней и на день 103; экспрессия мРНК TLR3 повышалась на 12, 47-53 и 103. Высокие уровни экспрессии мРНК TLR7 были обнаружены на 46-й день и с 82 по 103 день.

Экспрессию хемокинов, CXCR3, CCR1, CCR7, CXCL10 и NK-клеточного активационного маркера, NKG2D и NK-клеточного ингибирующего маркера, мРНК рецептора KIR2DL2 / 3 анализировали, чтобы определить, были ли эти гены вовлечены в индукцию повреждения печени. Печеночная экспрессия мРНК CXCR3 и CCR1 повышалась с 61 года до 124 в CH6413 и в дни 61 и 124 в CH1541, но не в CH256 (фиг. 2A). Высокая экспрессия мРНК CCR7 была обнаружена в дни от 61 до 152 в CH6413, в дни 95 и 152 в CH256 и в дни от 61 до 152 в CH1541. Печеночная экспрессия мРНК CXCL10 повышалась с 7 или 12 дней до конца наблюдения в CH6413 и CH1541 соответственно, а также в дни 19-82, от 103 до 124 и от 152 до 180 в CH256. МРНК NKG2D повышалась между днями 82 — 180 в CH6413, на день 152 в CH256 и между днями 103 и 152 в CH1541, но экспрессия мРНК рецептора KIR2DL2 / 3 не повышалась ни в одном из этих шимпанзе (рис. 2B).

(A), уровни экспрессии хемокиновых мРНК в печени при острой HCV-инфекции: CCR7 (фиолетовая линия), CCR1 (зеленая линия), CXCR3 (красная линия) и CXCL10 (синяя линия). (B), уровни экспрессии мРНК маркеров NK-клеток в печени: KIR2DL2 / 3 (синяя линия) и NKG2D (красная линия). (C), маркеры активации маркеров Т-клеток: CD8β (синяя линия), IFN-γ (красная линия) и CD86 (зеленая линия). (D), экспрессия мРНК маркера экспрессии Т-клеток в печени: PD-1 (красная линия), PD-L1 (синяя линия), Tim-3 (фиолетовая линия) и CTLA4 (зеленая линия). Уровень мРНК каждого гена был нормализован до эндогенного эталонного гена и выражен как увеличение по сравнению с исходными уровнями ткани печени.

T и маркеры ингибирования были проанализированы, чтобы определить их связь с повреждением печени. Экспрессия мРНК CD8β начала возрастать в дни 82, 95 и 75 в CH6413, CH256 и CH1541 соответственно и достигла максимума между днями 118 и 124. Высокие уровни экспрессии мРНК CD8 поддерживали до конца острой фазы инфекции HCV во всех шимпанзе. (Фиг. 2С). Уровень экспрессии мРНК IFNγ постоянно возрастал по мере того, как виремия HCV снижалась, а ее уровни повышались с 82 дня для CH6413 и CH256 до конца наблюдения. Для CH256 высота IFNγ была менее выраженной, чем для двух других шимпанзе, и уровни уменьшались к концу периода наблюдения. Высокие уровни экспрессии мРНК печеночной PD-1 и PD-L1 были обнаружены в дни от 61 до 180 и от 40 до 180 соответственно (фиг. 2C). Повышенная регуляция экспрессии мРНК PD-1 продолжалась до конца периода наблюдения в CH6413 и CH256, тогда как в CH1541 она снизилась до базовых уровней к дню 124. Структура экспрессии мРНК печеночной PD-L1 варьировала у всех трех шимпанзе , Он колебался в CH1541 и CH6413 снижался в конце острой инфекции. В CH256 он все еще был высоко выражен в конце острой инфекции. У всех трех шимпанзе экспрессию мРНК печеночной PD-L1 предшествовало повышению экспрессии мРНК печеночной PD-1. Никаких существенных изменений экспрессии мРНК PD-1 и PD-L1 в РВМС не наблюдалось у любого шимпанзе, хотя незначительное увеличение отмечалось лишь иногда в CH1541 (данные не показаны). Экспрессия мРНК CTLA4 повышалась от 82 до 152 дней в CH6413 и CH256, но не в CH1541. Высокие уровни экспрессии мРНК Тим-3 были обнаружены с 47 по 180 дней у всех трех шимпанзе (рис. 2В). CD86 мРНК повышалась между 53 и 124 днями в CH256 и CH1541, но это не наблюдалось для CH6413 (фиг. 2C).

Исходные уровни sPD-1 анализировали с использованием образцов сыворотки от 10 наивных шимпанзе и 8 образцов от трех изученных шимпанзе, полученных до экспериментальной инокуляции. Уровни sPD-1 измерялись при содержании менее 0,2 нг / мл во всех образцах (данные не показаны). уровни sPD-1 в CH6413 и CH1541 повышались на 47 и 61 дней соответственно, быстро достигая максимума (рис. 3А). Для CH256 повышение уровня sPD-1 было менее выраженным. В CH6413 и CH256 уровни sPD-1 уменьшались после его пика, но уровни sPD-1 повышались до 138 дня в CH1541. Уровень sPD-1 в плазме значительно коррелировал с внутрипеченочной мРНК PD-1 (r = 0,491, p = 0,001) и активностью ALT в сыворотке (r = 0,302, p = 0,035). Из-за отсутствия доступности образцов сыворотки из CH1541 уровни CXCL10 в сыворотке определялись только в CH6413 и CH256. Исходные уровни CXCL10 анализировали с использованием 9 различных образцов предварительной инокуляции и определяли как 112 пг / мл в CH6413 и 32 пг / мл в CH256. Высокий уровень циркулирующего CXCL10 был обнаружен с 12-го дня с 4,4-кратным увеличением по сравнению с уровнем исходной экспрессии в CH6413 и 6,5-кратным увеличением CH256, и эти уровни достигли пика на 61-й день в CH6413 и 82 в CH256 (рис. 3B).

(A) Уровни сыворотки sPD-1 (красная линия) сравнивались с активностью ALT (серое затенение). (B), уровни сыворотки CXCL9 (красная линия), CXCL10 (синяя линия) и CXCL11 (зеленая линия) в CH6413 и CH256. Образцы сыворотки CH1541 были недоступны, поэтому сывороточные уровни хемокинов с помощью анализа ELISA не могли быть определены.

Корреляционный тест Пирсона проводили для определения взаимосвязи между уровнями экспрессии мРНК печени, сывороточного белка и клиническими параметрами, такими как активность АЛТ и присутствие РНК HCV при острой инфекции HCV. Слабая корреляция была обнаружена между концентрацией РНК HCV и активностью ALT. Уровни РНК ВГС сыворотки были положительно коррелированы с экспрессией мРНК 2OAS-1, PD-1, APAF-1, RIG-I, PD-L1 и CXCL10 и обратно коррелировали с экспрессией мРНК CCR1 и KIR2DL2 / 3 (таблица 1). Были обнаружены сильные положительные корреляции между активностью ALT и активностью CK-18, Caspase 3/7 и растворимым PD-1. Эти результаты показывают, что печеночная экспрессия мРНК 2OAS-1, PD-1, APAF-1, RIG-I, PD-L1 и CXCL10 активировалась во время репликации РНК HCV. Статистически значимые корреляции не были обнаружены между какой-либо печеночной мРНК и активностью АЛТ.

Простой тест на линейную корреляцию, такой как корреляция Пирсона, позволяет определять линейные отношения между двумя переменными. Гладкие траектории, как показано на рис. 4, обеспечивают картину тенденций в уровнях экспрессии различных мРНК и АЛТ во время острой фазы HCV-инфекции. Кривые траектории генерировались на основе уровней экспрессии мРНК печени, которые были повышены до пика активности ALT, на пике и после пика активности ALT у каждого шимпанзе (рис. 4). Высокие уровни экспрессии печени (≥ 2-кратное изменение) мРНК 2OAS-1, RIG-I, CXCL10, TLR3 и TLR7 были обнаружены до пика активности ALT. Уровни сыворотки активности CK-18, Caspase 3/7 и растворимого PD-1 повышались на пике активности ALT, а печеночная экспрессия мРНК PD-1, IFNγ, NKG2D, перфорина, CXCL3, TNFα и CCR7 повышалась — регулируется после пика активности ALT. На основе этих тенденций было проведено корреляционное тестирование запаздывания для определения временной зависимости между этими мРНК и активностью ALT (таблица 2). Активность ALT была положительно коррелирована с экспрессией мРНК RIG-I, TLR3, CXCL10, PD-L1, 2OAS-1, Caspase 7 и Caspase 10 от 3 до 12 дней до пика активности ALT, что указывает на увеличение уровней этих мРНК связано с последующим увеличением активности ALT. Активность ALT была положительно коррелирована с экспрессией маркеров для Т-клеток и NK-клеток, таких как IFNγ, CD8β, CD86, KIR2D и NKG2D мРНК через 7-32 дня после пика активности ALT, что указывает на то, что экспрессия этих генов была выше, регулируется после повышения активности ALT.

Печеночная экспрессия мРНК регулировалась до пика (А) на пике (В) и после пика активности АЛТ.

Экспериментально инфицированные шимпанзе позволили нам проанализировать кинетику ответа хозяина, вызванного острой HCV-инфекцией. Профили врожденных и адаптивных иммунологических реакций и те, которые касаются биомаркеров сигнализации о смерти клеток, выраженных в печени и сыворотке, предоставили информацию о ранних иммунных ответах, связанных с повреждением печени при острой инфекции HCV. Мы обнаружили, что маркеры апоптоза, активность каспазы 3/7 и CK-18 были положительно коррелированы с активностью ALT, а повышение экспрессии мРНК печеночной каспазы 3 и 7 было обнаружено ранее, чем активность каспазы 3/7 в сыворотке и антиген M30. Эти результаты продемонстрировали доказательства ассоциации между апоптозом и повреждением печени при острой инфекции HCV. Два апоптотических пути, внутренние и внешние, сходятся при активации эффекторных каспаз, но для запуска процесса требуются различные каспазы инициации. Происхождение собственного апоптоза происходит через цитохром c, освобожденный после повреждения митохондрий, активацию каспаз инициатора, каспазы 9 и APAF-1 и последующую активацию эффекторной каспазы 3 и каспазы 7 [32]. Для внешнего апоптоза TNFα, плейотропный провоспалительный цитокин, продуцируемый главным образом активированными макрофагами, может инициировать апоптоз через рецепторы смерти в гепатоцитах, что приводит к последующему повреждению печени [33]. Мы обнаружили, что каспаза 9 и молекула-переходная молекула, экспрессия мРНК APAF-1 были обнаружены у всех трех шимпанзе, а экспрессия мРНК APAF-1 была увеличена уже через 12 дней после инокуляции (рис. 1D), и повышение экспрессии мРНК TNF было обнаружено либо после пик активности ALT (дни 82 или 95 в CH6413 и CH256) или не обнаружены (CH1541). Эти результаты свидетельствуют о том, что апоптоз может происходить через опосредованный митохондрием, внутренний путь, а не внешний путь во время острой фазы инфекции HCV. В предыдущем исследовании сообщалось, что инфекция HCV, индуцированная митохондриальным апоптозом, в которой увеличилось накопление проапоптотического белка Bax, приводила к высвобождению цитохрома c после набухания митохондрий и активации каспазы 3 в HCV-инфицированных клетках Huh 7.5 [34].

Врожденные иммунные ответы обеспечивают первую линию защиты от инфекции HCV. ИФН IF I, IFNα / β и III-й тип IFN, IFN-λ, индуцировали подобные наборы генов, стимулированных интерферонами (ISG) [35]. Повышенная регуляция мРНК IFN, IL-28 и IL-29 типа III была обнаружена в печени и повышенном уровне белка IL-28 и IL-29 в сыворотке шимпанзе с острой HCV-инфекцией [20, 21]. RIG-I, TLR3 и TLR7, и индуцируют интерфероны, цитокины и хемокины во время ВГС-инфекции [36, 37]. Было показано, что опосредованный RIG-I ответ IFN играет важную роль в борьбе с вирусной инфекцией в клетках, инфицированных HCV [38]. В других отчетах сигнализация RIG-I и сигнализация TLR-3 необходимы для индукции CXCL10 в гепатоцитах во время ранней инфекции HCV, но IFN типа I или III типа не требуются в начальной фазе индукции [39]. Эти исследования in vitro-инфекции проводились в независимой системе, но воспалительные и противовирусные пути одновременно действуют для борьбы с вирусной инфекцией [40]. Мы также заметили, что повышение регуляции печеночной экспрессии мРНК 2OAS-1, RIG-I, TLR3, TLR7 и CXCL10 было обнаружено уже через 7 дней после заражения и совпадало с появлением РНК HCV сыворотки (фиг.1 и 2). Эти результаты показали, что PRR-опосредованные противовирусные пути, ответы IF типа I и типа III и провоспалительные хемокины продуцируются HCV-инфицированными гепатоцитами в то же время и устанавливают сильное противовирусное состояние у шимпанзе во время острой инфекции гепатита C.

IFN-индуцибельный ген, 2OAS-1, провоспалительные цитокины и хемокины участвуют в ликвидации вирусной инфекции от инфицированных клеток и индуцируют апоптоз инфицированных клеток. HCV-опосредованная активация RNase L, 2OAS-зависимой рибонуклеазы, приводит к апоптозу и элиминированию HCV-инфицированных клеток. Апоптоз, инициированный РНКазой L, характеризуется высвобождением цитохрома c из митохондрий и требует активности каспазы 3 [41]. TLR3 может непосредственно инициировать апоптоз в раковых клетках человека [42]. Экспрессия CXCL10 коррелировала с апоптозом клеток печени у людей и мышей, а апоптоз встречается через неконтактный рецептор TLR4 [36]. Повышенная регуляция экспрессии CXCL10 наблюдалась у пациентов, которые употребляли инъекционные наркотики и связанных с последующим увеличением уровней АЛТ во время острой инфекции гепатита С [37]. В нашем исследовании печеночная мРНК 2OAS-1 была положительно коррелирована с активностью каспазы 3/7 (r = 0,504, p = 0,02), экспрессия мРНК печеночной RIG-1 была положительно коррелирована с экспрессией мРНК каспазы 3 (r = 0,669, p = 0,034 ) и экспрессию мРНК CXCL10 положительно коррелировали с экспрессией мРНК каспазы 7 (r = 0,711, p = 0,014). Мы также наблюдали повышение активности ALT после увеличения каждого из этих уровней мРНК. Экспрессия этих генов показала, что ранняя экспрессия 2OAS-1, RIG-I, TLR3 и CXCL10 была связана с увеличением уровней РНК HCV и сопровождалась повышением активности ALT за 10-12 дней до пика активности ALT (таблица 2). Эти результаты показывают, что 2OAS-1, RIG-I, TLR3 и CXCL10 участвуют в индуцировании апоптоза при инфекции HCV и приводят к травме печени при острой инфекции HCV.

Было показано, что NK-клетки и CD8 + Т-клетки участвуют в элиминации гепатоцитов, инфицированных HCV [43, 44]. В нашем исследовании экспрессия мРНК NKG2D и KIR2D, маркеров NK-клеток NK, маркеров активации T-клеток (CD86, CD8β и IFNγ) и маркеров ингибирования Т-клеток (PD-1, CTLA4) были отрегулированы после пика ALT активности у всех трех шимпанзе (рис. 2). Анализ корреляции запаздывания показал маркеры NK-клеток, маркеры активации / ингибирования Т-клеток отрицательно коррелировали с активностью ALT. Т-клеточный и NK-индуцированный апоптоз гепатоцитов опосредованы в основном членами семейства рецепторов TNF, включая TNFα, Fas и TRAIL [45]. Мы обнаружили, что повышение экспрессии мРНК TNFα было обнаружено либо после пика активности ALT, либо не повышалось, что указывает на то, что элиминация HCV-инфицированных гепатоцитов Т-клетками и NK-клетками может не приводить к повышению активности ALT у экспериментально инфицированных шимпанзе с острой HCV-инфекцией ,

Увеличение сывороточных уровней активности каспазы 3/7, CK-18 и растворимого PD-1 имеет сильную положительную корреляцию с активностью ALT при острой инфекции HCV (рис. 4). В настоящее время активность ALT в сыворотке используется в качестве маркера для повреждения печени, но не может различать острую и хроническую инфекцию HCV. Острый гепатит С определяется наличием каких-либо признаков или симптомов острого вирусного гепатита плюс желтуха или повышенная активность АЛТ с наличием антител против HCV или РНК HCV [3]. Тем не менее, большинство людей с острой HCV-инфекцией бессимптомны во время диагностического тестирования и уже положительны для анти-HCV-антител. Шимпанзе-модель инфекции HCV позволяет анализировать реакции хозяина, особенно на ранней стадии инфекции. Ранее мы сообщали, что уровни miR-122 в сыворотке положительно коррелировали с активностью ALT во время острой HCV-инфекции [6]. Уровни сыворотки CK-18 показали высокую чувствительность и специфичность при диагностике безалкогольного стеатогепатита у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени и отраженной клинической болезнью более точно, чем уровни ALT [46, 47]. Мета-анализ повышенных уровней цитокератина-18 в сыворотке крови у гепатита показал его клиническую ценность для выявления развития гепатита [48]. Биомаркеры, такие как CK-18, активность каспазы 3/7, sPD-1 и уровни miR-122 в сыворотке, могут быть использованы в качестве дополнительных критериев для более точного определения острого гепатита C и обеспечения более четкого определения случая острого гепатита C.

Таким образом, мы обнаружили, что сигнализация смерти клеток инициируется ранней индукцией мРНК RIG-I, TLR3 и CXCL10 и ответ IN типа I, вызывающий повышение активности ALT, и что инициирование этого сигнального пути происходит до активации NK и T клеток во время острой инфекции HCV.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы очень благодарны доктору Крису Кравчински (умершему) за его вклад в это исследование. Мы также благодарим доктора Майкла А. Перди (Отдел вирусного гепатита, CDC) за критические обзоры рукописи и полезные обсуждения. Это исследование было профинансировано CDC. Эта информация распространяется исключительно для целей экспертной оценки с предварительным распространением в соответствии с применимыми руководящими принципами качества информации. Он не был официально распространен Центрами по контролю и профилактике заболеваний / Агентством по токсичным веществам и регистрам заболеваний. Он не представляет и не должен толковаться как представление какого-либо определения или политики агентства. Использование торговых наименований предназначено только для идентификации и не подразумевает одобрения Департаментом здравоохранения и социальных служб США, Службой общественного здравоохранения или Центрами по контролю и профилактике заболеваний. Выводы и выводы в этом отчете принадлежат авторам и не обязательно отражают взгляды Центров по контролю и профилактике заболеваний.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *