Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Освоение раннего инфекционного механизма вируса гепатита B с использованием бионанокапсулы

Elucidation of the early infection machinery of hepatitis B virus by using bio-nanocapsule
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5064030/

Вклад автора: Лю Q выполнил большую часть письма и подготовил цифры; Сомия М предоставил материалы для написания статьи; Курода С разработал план и скоординировал написание статьи.

Корреспонденция: Шуньичи Курода, доктор философии, профессор, кафедра биомолекулярной науки и реакции, Институт научно-промышленных исследований, Университет Осаки, Ибараки 567-0047, Япония. skuroda@sanken.osaka-u.ac.jp

Телефон: + 81-6-68798460 Факс: + 81-6-68798464

В настоящее время вирус гепатита B (HBV) при прикреплении к гепатоцитам человека считается взаимодействующим сначала с гепарансульфат-протеогликаном (HSPG) через антигенную петлю белка S-оболочки HBV. Затем он незамедлительно переносится на натрий-таурохолат-котранспортный полипептид (NTCP) через миристоилированную N-концевую последовательность пред-S1-области (от Gly-2 до Gly-48, HBV-генотип D) и, наконец, попадает в клетку эндоцитозом , Однако неясно, как HSPG передает HBV на NTCP и как NTCP способствует клеточному входу HBV. Из-за плохой доступности и сложности манипуляций, включая инкапсуляцию флуорофора, было практически невозможно выполнить биохимические и цитохимические анализы с использованием значительного количества HBV. В Saccharomyces cerevisiae была эффективно синтезирована бионанокапсула (BNC), которая представляет собой полую наночастицу, состоящую из белка L оболочки HBV. Поскольку BNC может инкапсулировать полезную нагрузку (лекарства, гены, белки) и, в частности, вводить человеческие печеночные клетки с использованием инфекционного оборудования, полученного из HBV, его можно использовать в качестве модели инфекции HBV для выяснения раннего инфекционного оборудования. В последнее время было продемонстрировано, что N-концевая последовательность пред-S1-области (от Asn-9 до Gly-24) обладает низкой рН-зависимой фузогенной активностью, которая может сыграть решающую роль в эндосомном бегстве полезной нагрузки BNC и в без покрытия HBV. В этом обзоре мы описываем модель, в которой каждая область белка HBV L способствует прикреплению к человеческим печеночным клеткам через HSPG, инициированию эндоцитоза, взаимодействию с NTCP в эндосомах и последующей провокации мембранного слияния с последующим эндосомальным побегом.

Основной совет: из-за плохой доступности и сложности манипуляций с вирусом гепатита B (HBV) было сложно проанализировать его ранние инфекции в гепатоцитах человека. Используя бионанокапсулу, уникальную модель HBV, мы могли бы изучить эти события с помощью биохимических и цитохимических методов и, наконец, идентифицировать низкочувствительный pH-зависимый домен в HBV pre-S1, который может играть ключевую роль в эндосомальной побеге HBV. Настоящим мы постулируем модель, в которой каждая область в белке HBV-оболочки L участвует в прикреплении клеток, эндоцитозе, мембранном слиянии и последующем эндосомальном побеге (т. Е. Процессе без покрытия HBV).

Вирус гепатита В (HBV) представляет собой примерно овальный овальный вирус размером 42 нм, содержащий нуклеокапсид с геномом ДНК двухцепочечной ДНК размером примерно 3.2 килобазы (рис. 1). На поверхности вириона HBV существует три типа белков оболочки: маленький (S) белок, средний (M, pre-S2 + S-область) белок и большой (L, pre-S1 + pre-S2 + S-область) белка [1] (фиг. 2). Несмотря на то, что с момента открытия HBV прошло почти полвека, было сложно получить HBV в значительных количествах для биохимических анализов и установить эффективную систему in vitro, охватывающую инфекцию, репликацию и высвобождение вирионов. В качестве системы первого поколения HBV очищали от хронически инфицированной плазмы пациента, а первичные человеческие гепатоциты (PHH) использовали в качестве клеток-мишеней. Поскольку эта система полностью зависит от клинических образцов, многие исследователи неохотно используют линии клеток, полученные из гепатомы человека, в течение длительного времени, но они часто не принимают инфекцию HBV и не воспроизводят ее. Далее, как система второго поколения, было обнаружено, что первичные Tupaia hepatocytes (PTH) эффективно принимают HBV-инфекцию в присутствии диметилсульфоксида (DMSO) и позволяют воспроизводить HBV [2]. Кроме того, в качестве системы третьего поколения недавно была обнаружена одна клеточная линия гепатомы человека, HepaRG, которая принимает HBV-инфекцию в присутствии ДМСО, а также PHH и PTH [3], что дает новую возможность для изучения ранней инфекции HBV. Хотя вышеупомянутый прогресс в клетках-мишенях HBV был сделан в течение длительного времени, все же необходимо получить значительное количество HBV исключительно из плазмы пациента. Эти ситуации затрудняют всестороннее выяснение ранних инфекционных механизмов HBV.

Схематическое изображение вируса гепатита B, био-нанокапсулы и миристоилированной бионакапсулы.

Функциональные домены в вирусе гепатита В и био-нанокапсуле L-белка. BNC: био-нанокапсула; NTCP: натрий-таурохолат-котранспортирующий полипептид.

Чтобы выяснить механизм того, как HBV распознает гепатоциты человека, многие части белка L-белка HBV были предложены для незаменимости ранней инфекции, особенно для первоначального прикрепления. Было показано, что в 1986 году N-концевая часть области pre-S1 (от Pro-10 до Pro-36, см. Рисунок 2) взаимодействует с PHH [4]. Моноклональное антитело против пред-S1-области, MA18 / 7, могло нейтрализовать инфекционную активность in vitro от HBV до PTH, тогда как антитела против пред-S2 и S-областей не могли [5,6]. N-концевое миристолирование пред-S1-области также необходимо для инфицирования ВГВ с помощью PHH [7]. Кроме того, поскольку добавление гепарина может эффективно ингибировать in vitro-инфекцию HBV, присоединение к гепарансульфат-протеогликану (HSPG), богатому белками во внеклеточном матриксе, является предпосылкой для инфицирования клеток HepaRG [8] и ПТГ [9]. Высококонсервативные остатки (Gly-282, Pro-283, Cys-284, Arg-285, Cys-287 и Lys-312, см. Рисунок 2) в антигенной петле (AGL) S-области могут напрямую контактировать с HSPG [10 -12]. Интересно, что другие вирусы, включая вирус простого герпеса-1 и вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), также требуют взаимодействия с HSPG для их введения [13]. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что HSPG является низкоаффинным рецептором для входа HBV. В случае ВИЧ-1, после присоединения к HSPG, вирус взаимодействует с рецептором CD4, что приводит к конформационным изменениям в белке вирусной оболочки, а затем поступает в клетку с использованием корецептора CCR5 [14]. Однако остается неясным, какие события происходят во время инфекции и как HBV проявляет такую ​​строгую специфичность к гепатоцитам человека.

В 2012 году трансмембранный белок, таурохолат натрия-транстранспортный полипептид (NTCP), также известный как SLC10A1 [15], был обозначен как функциональный рецептор, ответственный за инфекцию HBV [16]. NTCP преимущественно экспрессируется на синусоидальной мембране гепатоцитов и отвечает за большинство натриево-зависимой транслокации желчных кислот, играя существенную роль в энтерогепатическом цикле желчных кислот [17]. Нокдаун или сверхэкспрессированный NTCP в гепатоцитах человека предотвращали или облегчали инфицирование HBV, соответственно [18]. Самое главное, что N-концевой миристоилированный пред-S1 (2-47) -пептид может эффективно ингибировать как функцию транспортера, так и HBV-взаимодействие NTCP [19] (рисунок 2). Эти результаты показывают, что NTCP представляет собой высокоаффинный человеческий специфичный для печени рецептор HBV и откроет новые возможности для понимания ранних инфекционных механизмов HBV.

Большая часть населения мира страдает от инфекции HBV. Поскольку HBV может передаваться через кровь и биологические жидкости, и не было никакого эффективного анти-HBV-препарата, вакцинация против гепатита B (HB) необходима для защиты от заражения кровью. Первоначально субвиральные частицы, состоящие из белка S оболочки HBV (то есть поверхностного антигена HBV (HBsAg)], очищали от плазмы пациента с отрицательным антигеном HBV e антигена и были сформулированы как вакцины первого поколения HB. Для устранения риска, вызванного загрязнением HBV, белок HBV-оболочки S был экспрессирован в дрожжевых клетках в виде частиц и использовался в качестве вакцины второго поколения HB [20]. Однако даже после повторной инъекции с этими вакцинами, прибл. Пять процентов вакцин не могут быть сероконвертированными (то есть низкими и не реагирующими) [21]. Вывод о том, что область pre-S2 может вызывать антитела, нейтрализующие HBV у шимпанзе [22], заставил нас синтезировать белок оболочки HBV M в виде частиц в дрожжевых клетках. Этот кандидат на вакцину против HB третьего поколения мог эффективно индуцировать защитный уровень антител против S2 даже у пациентов с низким и не реагирующим [23]. После этого из-за признания того, что область pre-S1 может вызывать дополнительные нейтрализующие HBV антитела [4], многие исследователи попытались синтезировать полноразмерный белок оболочки HBV (L-белок) в виде частиц в эукариотических клетках, но N- концевая часть области pre-S1 проявляла сильное ингибирующее действие на ее синтез. В 1992 году слияние N-конца с сигнальным пептидом, полученным из цыплят-лизоцима, может преодолеть тормозящий эффект и облегчить сверхэкспрессию L-частиц в дрожжевых клетках (до примерно 42% от общего растворимого белка) [24]. Частицы могут быть очищены путем термообработки, аффинной колоночной хроматографии и хроматографии с исключением по размерам [25]. В отличие от ок. 42-нм HBV-вирион, частица проявляла ок. 100-нм сферическая полая структура, состоящая из примерно 110 л белков, встроенных в липосомальную структуру, полученную из мембранной мембраны дрожжевого эндоплазматического ретикулума, тогда как стехиометрическое соотношение белков оболочки L / M / S вириона HBV составляет ок. 1: 1: 4 (рисунок 1) [26,27]. Кроме того, плотность частицы составляет ок. 1,22 г / см3 [28], что аналогично вивиону HBV (около 1,17 г / см3) [29]. Частица не имеет N-концевой миристоильной группы и обладает дополнительными группами сахара в пред-S1 + пред-S2-области. Они могли бы эффективно вызывать анти-S, анти-S1 и анти-пред-S2-антитела у мышей [26]. Согласно анализу защиты протеина, область предварительного S1, область предварительного S2 и часть S-области (AGL) развернуты наружу на поверхности L-частицы, подобно HBV [24]. Это сходство в структуре поверхности побудило нас использовать его в качестве биомимики HBV в дальнейших исследованиях. Поэтому мы обозначили L-оболочку HBV-оболочки как «био-нанокапсулу (BNC)» [30,31].

Поскольку HBV специфически заражает человеческие гепатоциты и доставляет свой генетический материал и связанные с ним белки в цитоплазму, мы исследовали, была ли BNC аналогичной функцией. После введения флуорофорной или усиленной зеленой флуоресцентной белковой экспрессирующей плазмиды в полое пространство BNC путем электропорации, было обнаружено, что человеческие печеночные клетки, получающие BNC, проявляют флуоресценцию in vitro [32]. Кроме того, после внутривенной инъекции этих BNC флуоресценция испускалась исключительно из опухолей, полученных из печени печеночных клеток мыши ксенотрансплантата [32], и в нормальных тканях печени человека под кожей почек серьезных мышей с комбинированным иммунодефицитом (SCID) [33]. Эти результаты убедительно показали, что BNC нацеливают и вводят человеческие печеночные клетки in vitro и in vivo с использованием HBV-инфекционного оборудования, присутствующего в L-белке.

BNC способен сливаться с липосомами (ЛП), что приводит к образованию комплекса BNC-LP [28]. Было обнаружено, что при высокой температуре (до 70 ° C) и кислотных условиях превращается в гладкую и сферическую структуру (а именно виросомы), в которой L белки транслоцируются через мембрану в правильной топологии [34]. После введения шариков и генов эти виросомы могли эффективно доставлять в цитоплазму человеческих печеночных клеток in vitro [28] и, в частности, к человеческим печеночным клеткам in vivo [28,34]. Кроме того, после введения доксорубицина методом удаленной загрузки виросомы вводили внутривенно ксенотрансферным мышам, содержащим опухоли, полученные из человеческих печеночных клеток. Виросомы могут замедлять рост опухоли более эффективно, чем ЛП, содержащие доксорубицин, что настоятельно указывает на то, что виросома может доставлять свою полезную нагрузку в опухоль человека, производную от печеночной клетки, эффективно использующую инфекционное оборудование на основе HBV [34]. Эти результаты показывают, что виросома является многообещающим наноуглером для цитоплазматической доставки лекарств и генов.

Внезапно вводимые наночастицы неожиданно оказались в ловушке ретикулоэндотелиальной системы (ВИЭ) в печени, легких, селезенке и т. Д. Однако некоторые вирусы могут эффективно удалять ВИЭ и, наконец, инфицировать клетки-мишени и ткани in vivo, а именно вирусной стелс-активностью. Между тем было продемонстрировано, что HBV может связываться с мономерным альбумином сыворотки человека (HSA) и полимеризованным HSA [35,36] через домен рецептора полимеризованного альбумина (PAR) в пред-S2-области (120-129 aa) [37 ]. Когда ЛП, отображающие пептид, содержащий домен PAR, внутривенно вводили мышам, они могли набирать альбумины на их поверхности и эффективно уклоняться от ВИЭ (Такаги и др. Личное сообщение). Действительно, у голых мышей, укрывающих человеческие опухоли, вызванные печеночной клеткой, внутривенно вводимый BNC может мигрировать и вводить опухоли-мишени, уклоняясь от ВИЭ [32]. Таким образом, BNC (предположительно, а также HBV) может набирать альбумин в кровотоке своим доменом PAR, а затем проявлять скрытую активность.

Как описано в предыдущем параграфе, было продемонстрировано, что BNC обладает инфекционным оборудованием, полученным из HBV. По сравнению с вирионами HBV BNC обладает следующими преимуществами для выяснения ранних инфекционных механизмов HBV. Во-первых, значительное количество очищенных BNC можно легко получить из рекомбинантных дрожжевых клеток. Во-вторых, BNC можно легко маркировать флуорофорами и ферментами для цитохимического и биохимического анализа.

Как описано выше, HBV считается взаимодействующим в основном с HSPG (низкоаффинным рецептором HBV), изменяет его собственную структуру и затем взаимодействует с NTCP (высокоаффинным рецептором HBV) [18,19]. HSPG обильно экспрессируется во внеклеточной матрице различных тканей, которые могут взаимодействовать с AGL S-области [8,11]. Связывание BNC с человеческими печеночными клетками [32] эффективно подавлялось гепарином [38]. Поскольку мембранная топология BNC аналогична HBV, HSPG может действовать как низкоаффинный рецептор для BNC. После прикрепления BNC к человеческим печеночным клеткам он был интернализован главным образом клатрин-зависимым эндоцитозом со скоростью, очень похожей на HBV [39] (рисунок 3). Эти результаты позволили предположить, что как BNC, так и HBV используют один и тот же механизм для прикрепления клеток и эндоцитоза. N-концевая миристоилированная пред-S1-область (от Gly-2 до Val-47, см. Рисунок 2) необходима для взаимодействия HBV с NTCP [40], но исходный BNC не имеет миристоилированного N-конца из-за добавления сигнальный пептид для экспрессии в клетках дрожжей [24]. После химического модифицирования миристоильной группой миристоилированный BNC (Myr-BNC) был подтвержден для взаимодействия с NTCP с помощью иммунопреципитационного анализа с использованием лизата НТГК-сверхэкспрессирующих клеток HepG2 (клеток HepG2 / NTCP) и ингибирования инфекции клеток HepG2 / NTCP с помощью HBV in vitro, тогда как сам BNC тоже [41]. Для оценки вклада NTCP в прикрепление клеток и введение HBV меченые флуорофором формы BNC, Myr-BNC и HB-частицы HBsAg, полученные из плазмы HBsAg (содержащие нативный L-белок с N-концевым миристоилированием), инкубировали либо с HepG2 или HepG2 / NTCP, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что каждая из трех частиц одинаково ассоциирована с обоими типами клеток и, наконец, локализована в поздних эндосомах на сопоставимом уровне (около 20% каждой частицы) [41]. Кроме того, сверхэкспрессированный NTCP в клетках HepG2 (клетки HepG2 / NTCP) не мог ни усилить взаимодействие клеточной поверхности, ни интернализацию меченой флуорофором формы Myr-BNCs или HBsAg-частиц, что сильно указывает на то, что поверхностная поверхность NTCP не участвует во взаимодействии с HBV (рис. 3) [41]. Вполне вероятно, что другие рецепторы участвуют в специфическом взаимодействии с клетками человека и интернализации BNC и HBV.

Модель раннего инфекционного оборудования для вируса гепатита B и бионанокапсулы L в гепатоцитах человека. HSPG: протеогликан сульфата гепарана; NTCP: натрий-таурохолат-котранспортирующий полипептид.

Для большинства вирусов вход в клетку осуществляется через эндоцитарный путь. При достижении поздних эндосом последующий процесс без покрытия помогает в эндосомальном побеге; иначе вирусы будут деградированы в лизосомах [42]. Как и в случае с другими окутанными вирусами, было постулировано, что HBV также ускользает от эндосомы с использованием аппаратов для мембранного слияния [43]. В L-белке были идентифицированы следующие фузогенные домены: C-концевая область pre-S2 (не зависящие от рН, аминокислотные остатки от 149 до 160) [44], N-концевая часть S-области (низкая рН-зависимая; аминокислотные остатки от 164 до 186) [45], и вся область предварительного S1 (с низким уровнем рН) [46]. Тем не менее, до сих пор остается спорным, какие области отвечают за процесс без покрытия HBV в эндосомах. В последнее время по анализу смешения липидов с использованием BNC или LP, демонстрирующих мутантный пептид, полученный до S1, мы идентифицировали новый низкомолекулярный фузогенный домен в N-конце области pre-S1 (от Asn-9 до Gly-24, см. Рисунок 2) [47]. Когда BNC, лишенный пред-S1-области, использовался для анализа липидного смешивания, фузогенная активность полностью терялась. Предварительная инкубация BNC с анти-пре-S1-антителами также ингибировала слияние. Эти результаты показали, что фузогенная активность пред-S1 (9-24) пептида является доминирующей по сравнению с другими фузогенными доменами (см. Выше). Кроме того, после смешивания ЛП, содержащих флуорофор и гасителя (модель эндосом) с BNC или LP, показывающими пептид pre-S1 (9-24), флуорофор сразу же высвобождался при низком рН. Это показало, что пептид pre-S1 (9-24) обладает низкой рН-зависимой активностью нарушения мембраны. Когда BNC, содержащие флуорофор, смешивали с ЛП, флуорофор высвобождался при низком рН, что указывало на то, что BNC, а также разрывы HBV при взаимодействии с эндосомной мембраной при низком рН. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что пептид pre-S1 (9-24) необходим для эндосомального выхода полезной нагрузки BNC, а также процесс без покрытия HBV (рис. 3), который хорошо согласуется с Watashi et al [48]. Показано, что фузогенная активность пре-S1 (9-24) пептида коррелирует с его гидрофобностью, что значительно усиливается протонированием Asp-16 и Asp-20 в кислых условиях [49].

Хотя многие исследователи пытались изолировать функциональные рецепторы HBV с последних двух десятилетий, HSPG и NTCP были окончательно идентифицированы как низкоаффинные и высокоаффинные HBV-рецепторы соответственно. Однако до сих пор неясно, поддерживают ли обе молекулы строгой специфичностью HBV для печеночных клеток человека. Поскольку NTCP не экспрессируется во всех чувствительных к ВГВ клетках, другие молекулы могут участвовать во взаимодействии HBV с печеночными клетками специфичным для клетки образом. Механизм переноса HSPG-связанного HBV на NTCP, предположительно в эндосомы, и изменение структуры HBV (область pre-S1) при низком рН для адаптации к NTCP еще предстоит выяснить (см. Рис. 3). Интересно, что пептид pre-S1 (9-24) хорошо сохраняется среди всех генотипов HBV и расположен в узле связывания NTCP (от Gly-2 до Val-47) (см. Рисунок 2) [16]. Это позиционное соотношение двух доменов подразумевает, что процесс без покрытия HBV и эндосомальный побег BNC инициируются взаимодействием с NTCP в поздних эндосомах. Выяснение молекулярного механизма ранней инфекции HBV может открыть возможности для новых целей для анти-HBV-препаратов.

Источник рукописи: приглашенная рукопись

Тип специальности: Гастроэнтерология и гепатология

Страна происхождения: Япония

Классификация отчета о сверстном обзоре

Класс A (Отлично): A

Класс B (Очень хорошо): 0

Сорт C (Хорошо): C, C

Класс D (Ярмарка): 0

Класс E (бедный): 0

Конфликт интересов: не существует конфликта интересов, связанного с любым из старшего автора или других соавторов, которые внесли свои усилия в эту рукопись.

Начался экспертный обзор: 2 мая 2016 года

Первое решение: 20 июня 2016 года

Статья в печати: 5 августа 2016 года

P-Рецензент: Ло FL, Маккуин ГМ, Чжан YY S- Редактор: Ю. J L- Редактор: E- Редактор: Чжан FF

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *