Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Выпуск вируса инфекционного вируса гепатита C из клеток Huh7 Происходит через транс-Golgi-путь от сети к эндосоме, независимо от секреции липопротеинов с очень низкой плотностью

Release of Infectious Hepatitis C Virus from Huh7 Cells Occurs via a trans-Golgi Network-to-Endosome Pathway Independent of Very-Low-Density Lipoprotein Secretion
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4984645/

Настоящий адрес: Хейзел Стюарт, Отдел вирусологии, Кембриджский университет Больницы NHS Foundation Trust, Кембридж, Соединенное Королевство.

J.M., C.W. и H.S. внесли одинаковый вклад в эту статью.

Цитирование Mankouri J, Walter C, Stewart H, Bentham M, Park WS, Heo WD, Fukuda M, Griffin S, Harris M. 2016. Выпуск вируса инфекционного гепатита C из клеток Huh7 происходит через сеть транс-Гольджи-эндодонтию путь, не зависящий от секреции липопротеинов очень низкой плотности. J Virol 90: 7159-7170. DOI: 10,1128 / JVI.00826-16.

Выделение инфекционных частиц вируса гепатита С (HCV) из инфицированных клеток остается плохо охарактеризованным. Ранее мы продемонстрировали, что выделение вируса зависит от комплекса эндосомальной сортировки, необходимого для транспортировки (ESCRT). Здесь мы показываем критическую роль сети транс-Гольджи (TGN) -эндосомы во время сборки, но главным образом секрецию инфекционного вируса. Это было продемонстрировано как с помощью небольшого интерференционного РНК (siRNA) -медицированного молчания связанных с TGN адаптивных белков, так и с группой доминантных отрицательных (DN) Rab GTPases, участвующих в стадиях торговли TGN-эндосомами. Важно отметить, что вмешательство в факторы, имеющие решающее значение для высвобождения HCV, не оказывало сопутствующего эффекта на секрецию триглицеридов, ApoB или ApoE, что указывает на то, что частицы, скорее всего, высвобождаются из клеток Huh7 через пути, отличные от путей липопротеинов очень низкой плотности (VLDL). Наконец, мы показываем, что HCV NS2 нарушает TGN-архитектуру, перераспределяя TGN-мембраны, тесно связанные с основным белком HCV, находящимся на липидных капельках. Эти результаты подтверждают мнение о том, что HCV захватывает трафик TGN-эндосомы для облегчения сборки и выпуска частиц. Более того, хотя это важно для сборки и инфекционности, торговля зрелыми вирионами, по-видимому, не зависит от липопротеинов хозяина.

ВАЖНОСТЬ Механизмы, с помощью которых частицы вируса инфекционного гепатита С собираются и высвобождаются из клетки, плохо изучены. Мы показываем, что вирусные субверты управляют цепями заражения клеток, чтобы вызвать выброс вирусных частиц, и разрушает структуру аппарата Гольджи, ключевой клеточной органеллы, вовлеченной в секрецию. Кроме того, мы демонстрируем, что механизмы, используемые вирусом для выхода из клетки, отличаются от тех, которые используются клеткой для высвобождения липопротеинов, что указывает на то, что вирус вызывает уникальную модификацию путей клеточной торговли.

Вирус гепатита С (HCV) является основной причиной хронического гепатита, который может прогрессировать до цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Недавняя разработка противовирусных препаратов прямого действия (DAA) (1), примером которой является недавно одобренный FDA ингибитор полимеразы sofosbuvir, обещает значительно улучшенную обработку HCV. Однако высокие затраты на лекарства в сочетании с опасениями по поводу резистентности требуют более глубокого понимания биологии ВГС с целью выявления новых противовирусных мишеней.

HCV представляет собой окутанный вирус с 9,2-килограммовым одноцепочечным РНК-геномом, кодирующим предшественник полипротеина 3000 аминокислот, который расщепляется хозяевами и вирусными протеазами в ядро ​​структурных белков, белки оболочки E1 и E2 и p7 и неструктурные (NS) белки NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Основной белок, являющийся основным компонентом вирусного капсида, нацелен на липидные капли (LD) (2-4), что подразумевает роль этих органоидов для хранения липидов во время сборки HCV. Гликопротеины E1 и E2 образуют гетеродимерный комплекс в вирусной оболочке. NS5A и вирусная РНК колокализуются с основным белком вблизи LD (5), а взаимодействие между NS5A и ядром имеет решающее значение для производства инфекционных вирионов (6). Кроме того, NS2 взаимодействует с p7, E2, NS3 и NS5A, координируя эти белки, чтобы приблизить их к LD во время сборки вирионов (7-10). Ранее описанная роль postassembly NS2 во время высвобождения вириона была описана ранее (8, 11, 12).

Сотовые пути, участвующие в сборке и выпуске вириона, остаются недостаточно понятными. Сборка инфекционных внутриклеточных вирусов HCV происходит в непосредственной близости от LD и зависит от факторов, требуемых в сборке липопротеинов низкой плотности (VLDL), включая DGAT1 (13), аполипопротеин B-100 (ApoB) (14) и ApoE ( 15). Таким образом, была предложена роль путей VLDL в последующем высвобождении частиц HCV, хотя ранее не было продемонстрировано (рассмотрено в ссылке 16). Совсем недавно мы вместе с другими продемонстрировали, что высвобождение HCV зависит от компонентов эндосомального сортировочного комплекса, необходимого для транспортировки (ESCRT), предполагая, что высвобождение HCV зависит от эндосомальных компартментов (17, 18). Кроме того, было показано, что ранние эндосомные белки, такие как Rab5, необходимы для репликации генома вируса, что указывает на то, что HCV зависит от этого отделения на нескольких стадиях жизненного цикла вируса (19, 20).

Здесь мы дополнительно исследуем эндосомальные пути выхода HCV. Мы показываем, что адаптированные к сетям переходные сети (TGN) играют решающую роль в процессе сборки и выпуска HCV. Кроме того, TGN-секреторный эндосомальный путь, определяемый доминантными отрицательными (DN) Rab-GTPase мутантами, опосредует высвобождение инфекционных вирионов, а не триглицеридов (TG) или ApoE, основных компонентов VLDL. Мы также показываем, что перераспределение TGN, наблюдаемое внутри HCV-инфицированных клеток, управляется NS2, но только тогда, когда оно выражается в контексте функциональной репликации HCV. Таким образом, наши данные подтверждают идею о том, что выделение инфекционного HCV происходит через секреторный путь TGN-эндосомы, который отличается от выделения VLDL в инфицированных клетках Huh7.

Клетки Huh7 культивировали, как описано ранее (21). Подгеномные репликон-укрывающие клеточные линии генерировались и поддерживались, как описано ранее (22).

Диффузные (WT) и доминантные отрицательные (DN) Rabs были экспрессированы с использованием pEGFP-C1 или pECFP-C1 (где EGFP — это усиленный зеленый флуоресцентный белок, а ECFP — увеличенный голубой флуоресцентный белок) и были описаны ранее (23). В общей последовательности клеток 2 × 105 Huh7 в одной лунке 6-луночного планшета трансфицировали с использованием полиэтилененимина (PEI) (Polysciences, Inc.) в соответствии с инструкциями производителя. Для количественного определения абсолютных количеств трансфицированных клеток планшеты визуализировали с помощью системы IncuCyte Zoom (Essen Bioscience) через 24 ч после трансфекции и подсчитывали количество зеленых объектов на лунку. Параметры фильтра были установлены так, чтобы исключать объекты с областями <200-мкм2 и> 3000 μm2, тем самым исключая клеточный мусор. Фоновый порог был установлен как минимум в 5,0 зеленых откалиброванных единиц (GCU) и при необходимости увеличивался до тех пор, пока нетрансфицированная контрольная лунка не имела нулевой балл.

Всего в 10 мкг транскрибированного in vitro (Promega) JFH-1, Jc1 (24) или J6 / JFH-1luc (экспрессирующий люциферазу J6 / JFH-1 химерный вирус) (25) транскрипты электропорировали в клетки Huh7 , которые промывали и ресуспендировали в диэтилопирокарбонате (DEPC) — обработанном фосфатом физиологическом растворе (PBS) (8 × 106 клеток, 400 мкл). Электропорацию проводили с использованием Bio-Rad Gene Pulser II при 975 мкФ и 270 В в 4-мм кювете. Клетки помещали в колбы T175 в 12 мл среды, которые собирали / пополняли каждые 24 ч для получения пустых вирусных запасов.

Проверенный глушитель Выбор малых интерферирующих РНК (siRNAs) (Life Technologies) использовался для отключения AP1MI, AP2MI, GGA1, GGA2 и GGA3. Клетки Huh7 высевали (1 × 105 клеток) в каждую лунку 6-луночного планшета и трансфицировали 150 пмоль каждой сиРНК, включая скремблированный контроль РНК, используя Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Через 48 ч после трансфекции супернатант и клеточный лизат собирали для анализа, и / или клетки инфицировали вирусом, как описано ниже.

После трансфекции (см. Выше) клетки были инфицированы при множественности инфекции (MOI) 0,2 фокус-формирующих единиц (FFU) / клетка в течение 24 ч в полной модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM). После двух промывок в PBS высвобожденный вирус собирали в бессывороточной среде в течение 24 часов. Уточненную инфекционную способность супернатантов культуры определяли путем фокусирующего анализа. Это также было выполнено для внутриклеточной инфекционности после ресуспендирования клеток в 50 мкл PBS, пяти повторяющихся циклов замораживания-оттаивания и осветления при 2800 × g в микроцентрифуге в течение 5 мин. Данные выражаются как средства и стандартные ошибки. Статистическую значимость определяли с помощью парного теста Student t для сравнения двух наборов данных или одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) с тестом Bonferroni, когда данные для более чем двух конструкций Rab сравнивались с контрольными группами GFP. Значение P <0,05 считалось значимым.

Содержание триглицеридов инактивированных нагреванием (65 ° С, 15 мин) фенол-красного и супернатантов культуры без сыворотки оценивали с использованием колориметрического анализа на основе липазы, который гидролизует триглицериды до свободного глицерина в соответствии с инструкциями производителя (Sigma). Для Вестерн-блот-анализа уровней ApoE супернатанты осаждали метанолом при 4 ° С в течение ночи; после этого осажденные липопротеины гранулировали при 10000 g в течение 10 мин и ресуспендировали в 1 × Laemmli-буфере для Вестерн-блот-анализа. Клетки лизировали в буфере для лизиса в Глазго (GLB, 10 мМ ТРУБЫ [пиперазин-N, N’-бис (2-этансульфокислота) -KOH, pH 7,2, 120 мМ KCl, 30 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 1% [об. / vol] Triton X-100 и 10% [объем / объем] глицерина) плюс ингибиторы протеазы (Roche Complete) и ингибиторы фосфатазы (2 мМ Na3VO4, 5 мМ NaF, 5 мМ Na4P2O7) и 10 мкг общего белка Вестерн-блоттинг. Секретированные ApoB и ApoE также были обнаружены и количественно определены с помощью коммерческих наборов иммуносорбентных ферментов (ELISA) (AlerCHEK). Вкратце супернатанты разбавляли 1:10 разбавителем (ApoB ELISA) или использовали неразбавленный (ApoE ELISA) и доводят до пластины в течение 45 мин. После того, как планшеты тщательно промывают, добавили вторичное антитело ApoB / ApoE к кожно-коклюшному пероксидазу (HRP), содержащее антитело против человека ApoB / ApoE, и его инкубировали в течение 45 мин. Скважины промывали и инкубировали с 3, 3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) в течение 15 мин до прекращения реакции серной кислотой. считанные при 450 нм, а значения образцов были экстраполированы с помощью стандартной кривой положительного контроля.

Rab-GFP / CFP-экспрессирующие или обработанные siRNA клетки инфицировали J6 / JFH-1luc при MOI 0,2 FFU / клетке, как описано выше, до лизиса в 400 мкл пассивного буфера для лизиса (Promega). Активность люциферазы Рениллы измеряли с использованием двухъядерного рецептора Stop и Glo (Promega) с использованием люминометра (EG & G Berthold). Все анализы проводили в трех повторах, и каждый эксперимент повторяли минимум три раза. Все данные выражаются как средние и стандартные ошибки.

Зараженные или трансфицированные клетки лизировали в GLB, как описано выше, и 10 мкг белка разрешали SDS-PAGE. Белки переносили на мембрану поливинилиден-дифторида (PVDF) (Millipore) с использованием переносного аппарата Bio-Rad Semidry, а затем зондировали антителом против ApoE мыши (Sigma или Abcam), поликлональным кроличьим анти-ядерным белком (добрый подарок от John McLauchlan, Center для вирусов, Глазго, Шотландия), поликлональные анти-AP1M1, -AP2MI, -GGA1, -GGA2 или -GGA3 (Abcam), мышиные моноклональные анти-EGFP или мышиные антигликеральдегидные 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) GeneTex). Промытые мембраны инкубировали с HRP-конъюгированным ослевым овечьим, ослевым кроликом или козьим антимышечным вторичным антителом (Sigma) и визуализировали с использованием собственной усовершенствованной хемилюминесцентной системы.

Клетки, выращенные на стеклянных покровных стеклах, фиксировали в течение 10 мин с 3% (объем / объем) параформальдегида (PFA) в PBS при комнатной температуре или в ледяном метаноле с последующей проницаемостью в ледяном метаноле-ацетоне в течение 10 мин. Клетки промывали PBS и блокировали в PBS-1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 30 мин перед инкубацией с первичными антителами в течение 1 часа в PBS-1% BSA с поликлональным кроличьим анти-ядерным белком, овечью поликлональной анти-TGN46 ( (0,5 мкг / мл), мышиный моноклональный анти-AP1 (Sigma), кроличья поликлональная анти-NS5A-сыворотка (добрый подарок от Ralf Bartenschlager, Гейдельбергский университет), кроличьи поликлональные анти-AP2M1 ( Abcam) или мышиное моноклональное антитело AP33 против E2 (предоставлено Genentech). Затем промытые клетки помечены с использованием соответствующего вторичного антитела Alexa Fluor 488/594/647 (Invitrogen). Клетки промывали и устанавливали на слайды микроскопа с использованием Citifluor (Agar Scientific), а затем просматривали на конфокальном микроскопе Zeiss 510-META при погружении с маслом 63 × объектив (числовая апертура 1,40). Кислота Alexa Fluor 488 (возбуждение 494 нм, излучение 519 нм) возбуждалась с использованием аргонового лазера, оснащенного 488-нм фильтрами, краситель Alexa Fluor 594 (возбуждение 550 нм, излучение 570 нм) возбуждалось с использованием гелия-неона лазер, оснащенный 543-нм фильтрами, и краска Alexa Fluor 647 (возбуждение 650 нм, излучение 670 нм) возбуждалось с использованием гелий-неонового лазера с фильтрами 633 нм. Отображаемые изображения являются репрезентативными и отображаются как отдельные оптические секции.

Принимая во внимание новые свидетельства, свидетельствующие о роли механизмов эндосомальной торговли во время выхода HCV, мы использовали нацеливание siRNA на ключевые белки TGN-эндосомального трафика, включая субъединицы μ1 ретрансляционного комплекса AP1 для кластеров TGN и эндоцитарного адаптера AP2 (называемого AP1M1 и AP2M1), а также Golgi-локализованные гамма-адаптирующие ухо-содержащие, ARF-связывающие (GGA) белки GGA1, GGA2 и GGA3 для оценки их роли в сборе / выходе вируса. Затем клетки Huh7, трансфецированные siRNA, были инфицированы либо JFH-1 для оценки образования инфекционных частиц, либо экспрессирующим люциферазу J6 / JFH-1 химерным вирусом (J6 / JFH-1luc) для измерения репликации генома.

Как и ожидалось, siRNA, нацеленная на кодирующую область NS5B генома вируса, эффективно блокировала репликацию генома, тогда как молчание отдельных белков траления TGN не оказывало значительных эффектов (фиг.1A). Напротив, важность TGN-эндосомального трафика как для сборки, так и для выхода из вириона была очевидна как опосредованное siRNA нарушение внутриклеточной и секретируемой инфекционности. Истощение AP1M1 не влияло на внутриклеточную инфективность (фиг.1B), но ингибировало высвобождение (снижение внеклеточной инфективности на 44% ± 2,5%) (рис.1C). Аналогичные данные недавно были зарегистрированы с отключением гамма-субъединицы AP1-эндосомного адаптера AP1 (AP1G1) в гепатоцитах, инфицированных JFH-1 (26). Эта же тенденция к инфекционности наблюдалась при подавлении GGA2 (снижение внеклеточной инфекционности на 64% — 3,5%) (рис.1C), предполагая, что и это, и AP1M1 сильно влияют на доставку собранных вирионов в секреторный путь. Напротив, отсутствие GGA3 приводило к значительному снижению как внутриклеточного (снижение на 87% ± 4%) (рис.1B), так и внеклеточного (78% ± 3% снижение) (фиг.1C) инфекционности, предполагая, что вирусная сборка была нарушена. Интригующе, глушение GGA1 дало необычный фенотип, в результате которого воспроизводимо уменьшалась внутриклеточная инфективность (снижение на 60% ± 4,5%), тогда как в секретируемом отделении не изменялось (фиг.1В и С). Далее мы рассмотрим последствия этого результата в обсуждении. В отличие от предыдущих исследований (27) и дальнейшего поддержки опосредованного TGN путей выхода вируса, нокдаун AP2M1 (эндоцитарный адаптер) не влиял на жизненный цикл вируса. Эффективное молчание отдельных белков было подтверждено в клетках Huh7 путем Вестерн-блоттинга (фиг.1D). Это согласуется с другим более недавним исследованием, в котором показано, что нокдаун AP2M1 не влияет на внеклеточную выработку РНК HCV (26). Вместе эти данные сильно поддерживают критическую важность TGN и связанных с ним адаптеров при производстве частиц HCV.

Влияние нокдауна siRNA белков аппарата Golgi-эндосомы на репликацию генома HCV и производство вирусов. Клетки Huh7 трансфицировали siRNAs для каждой из пяти мишеней или с помощью скремблированного контроля РНК и инкубировали в течение 48 часов с последующим инфицированием JFH-1 при MOI 0,2 в течение 48 часов. (A) Для оценки репликации генома HCV клетки были инфицированы J6 / JFH-1luc при MOI 0,2 в течение 48 часов перед измерением активности люциферазы. Внеклеточную (B) и внутриклеточную (C) инфекционность затем оценивали с помощью фокус-формирующего анализа. Все данные выражаются как отношение абсолютных значений, полученных в присутствии скремблированного контроля РНК, к показателям целевого образца siRNA и представлены как средство плюс стандартные ошибки. **, P <0,05. (D). Через 72 ч после трансфекции клетки, трансфицированные либо контрольной скремблированной siRNA (Cont.), Либо целевые siRNAs, как указано, лизировали и исследовали для каждого целевого белка и GAPDH в качестве внутреннего контроля по Вестерн-блот-анализу.

Учитывая явное значение TGN-эндосомальных адаптеров при производстве частиц, мы предположили, что вирионы, вероятно, следуют определенному эндосомальному пути во время выхода. Чтобы отобразить этот путь, мы использовали большое семейство Rab GTPases (> 60 членов), отдельные члены которого управляют конкретными этапами торговли людьми. Клетки Huh7 трансфицировали панелью плазмид, кодирующих белки дикого типа или DNRab в виде слияния GFP / CFP до заражения JFH-1 или J6 / JFH-1luc. Эффекты на внутриклеточную / секретируемую инфекционность или репликацию (анализируемую люциферазной активностью) рассчитывали путем деления значения, полученного в присутствии DN, на полученное для соответствующего Rab дикого типа; значения меньше 1, таким образом, представляют собой дефект, опосредуемый DN Rab. Сначала мы проверили, что различные этапы жизненного цикла HCV можно различить с использованием мутантов DN клеточных кофакторов: Rab5, который взаимодействует с NS4B и необходим для репликации РНК HCV (20) и ATPase VPS4 семейства AAA, который опосредует почкование / выпуск собранных частиц HCV путем рециркуляции ESCRT-III (17, 18). Обоснованно, что DN Rab5 уменьшал репликацию HCV (ингибирование на 61% ± 10%) с сопутствующими эффектами на общую инфекционность (ингибирование 62% ± 9%), тогда как DN VPS4 специально уменьшал секретируемую инфекционность (ингибирование на 64% ± 8%), не влияя на репликацию или внутриклеточной инфекционностью (фиг.2А).

Выделение HCV контролируется секреторными, но не эндоцитарными, Rab-GTPases. Клетки Huh7 трансфицировали плазмидами, экспрессирующими либо версии дикого типа, либо DN версий указанных белков в течение 24 часов с последующей заражением JFH-1 при MOI 0,2 в течение 24 часов. Инфективность определяли путем фокусирующего анализа. Для оценки репликации генома HCV клетки были инфицированы J6 / JFH-1luc при MOI 0,2 в течение 48 часов перед измерением активности люциферазы. (A) Валидация анализа с использованием ранее охарактеризованных контролей: VPS4, который ингибирует сборку, и Rab5, который ингибирует репликацию генома. (От B до D). Результаты анализа репликации и анализа внутриклеточной и внеклеточной инфекционности показаны, как указано. Все анализы проводили в трех повторах, и каждый эксперимент повторяли минимум три раза. Все данные выражаются как отношение абсолютных значений, полученных в присутствии дикого типа (WT), к отношениям конструкции DN Rab (DN / WT) и представлены как средние и стандартные ошибки. **, P <0,05. (E) Для анализа экспрессии белка Rab указанные клеточные лизаты подвергали Вестерн-блоттингу для EGFP. Лейн М, маркер молекулярной массы. (F) Чтобы определить эффективность процедуры трансфекции / инфекции, количество зараженных клеток (NS5A-положительный), которые также были положительными GFP, подсчитывалось вручную, а результаты отображались как процент от общего числа инфицированных клеток. Для иллюстративных целей показан репрезентативный образ трансфецированных клеток DN Rab7.

Поэтому мы расширили наш анализ до включения белков Rab, регулирующих либо эндоцитарную / рециркуляцию (Rab7, -9, -11 и -35), либо секреторно-экзоцитарную (Rab3a, -8b, -13, -23, -27, -32, 33 и -37) (рис.2). Никаких эффектов при репликации (и путем вывода, ввода вируса) (фиг.2B) или на производство внутриклеточных частиц (фиг.2C) не было видно, но несколько секреторных / экзоцитарных Rabs DN значительно ингибировали высвобождение инфекционного HCV; Пробы DN Rab8b, -13, -23, -27, -32 и -33 вызывали снижение внеклеточного титра на 60% (рис. 2D). Эндоцитарные / рециркулирующие белки Rab не имели заметной роли во время сборки или выхода частиц. Сравнительная экспрессия была подтверждена для подмножества белков Rab (те, которые экспрессируются как слияния GFP) с помощью Вестерн-блоттинга (фиг.2Е); в то время как общие уровни, как ожидается, в какой-то степени варьировались между Rabs, изменение в парах конструкций WT / DN было аналогичным. Таким образом, когда DN Rabs влиял на выделение частиц (например, Rab23 и -27), маловероятно, что это было вызвано увеличением выраженности по сравнению с аналогией WT. Кроме того, мы подтвердили, что трансфицированные клетки не были каким-либо образом невосприимчивы к инфекции путем количественного определения доли экспрессирующих NS5A клеток, которые также были GFP-положительными, используя систему IncuCyte Zoom (28). Это выявило сходные уровни инфекции во всех случаях, за исключением случаев, когда экспрессия DN эндоцита Rab5 была выражена, что можно было ожидать, учитывая ее роль во время репликации, как обсуждалось выше. Более того, учитывая, что только подмножество инфицированных клеток выражает доминирующие отрицательные белки, вполне вероятно, что наша инфекционная активность на основе популяции на самом деле недооценивает влияние на высвобождение на уровне отдельных трансфецированных клеток. Поэтому мы заключаем, что торговля / выпуск собранных инфекционных частиц HCV включает передачу через TGN в определенный секреторный эндосомальный путь внутри клеток Huh7.

Современные модели предполагают, что HCV кооптирует секреторный механизм VLDL для осуществления высвобождения инфекционных вирионов, и это предположение основано на существенной роли факторов, связанных с биогенезом VLDL во время сборки частиц и модуляции синтеза и секреции VLDL инфицированными клетками ( 29). Однако прямых доказательств этого секреторного пути не хватает, и недавние исследования показывают, что стадии, обусловленные клатрином, выходы вириона кажутся отчетливыми по сравнению с секрецией ApoE; нокдаун либо клатрина, либо его адаптера AP1 нарушал секрецию вируса, но не влиял на внеклеточный ApoB или ApoE (26). Следовательно, чтобы свести нашу наблюдаемую TGN / эндосомальную зависимость секреции с этими наблюдениями, необходимо было формально исследовать, привело ли нокдаун / нарушение адаптеров TGN или Rabs к нарушению секреции VLDL. Чтобы проверить это, эксперименты повторяли с клетками, выращенными в условиях без сыворотки, чтобы позволить прямое измерение высвобожденных ApoE, ApoB и триглицеридов, которые содержат основные элементы частиц, подобных VLDL, генерируемых клетками Huh7 (30).

Сначала мы исследовали, повлияло ли на выпуск ApoE нокдаун факторов, которые уменьшали накопление внутриклеточной инфекции HCV (GGA1 и -3), а также специфичные для выпуска AP1M1 и GGA2. Уровни как внутриклеточного, так и секретируемого ApoE не изменялись, за исключением небольшого увеличения секретируемого ApoE в случае нокдауна GGA1 (фиг.3A). Это ожидалось, так как показано, что GGA1 специфически ассоциируется с эндоцитозом рецептора ApoE, LR11 / SorLA (31). Затем мы оценивали влияние возмущающей функции белка Rab на секрецию основной составляющей VLDL, триглицерида (TG). Опять же, никакого влияния на высвобождение TG не наблюдалось, независимо от того, повлияли ли белки DN Rab на продукцию частиц HCV или нет (фиг.3B). Наконец, мы непосредственно определили секрецию как ApoE, так и ApoB с использованием ELISA; как показано на фиг.3C, уровни как ApoB, так и ApoE-секреции были по своей природе переменными, но это изменение не коррелировало с наблюдаемыми эффектами от секретируемой инфекционности (сравните рис. 2D и 3C).

Ингибирование белков TGN-эндосомальной торговли или секреторных Rabs не влияет на секрецию VLDL. (A) Чтобы оценить трафик и секрецию ApoE в клетках, трансфицированных siRNA, ApoE был метанолом, осажденным из супернатантов и оцененным с помощью Вестерн-блот-анализа. Клеточные лизаты также исследовали для внутриклеточного ApoE с помощью Вестерн-блот-анализа. (B) Секретируемые уровни триглицеридов оценивали в супернатантах культуры из инфицированных HCV клеток из эксперимента, показанного на фиг.2, с использованием колориметрического анализа на основе липазы, который гидролизует триглицериды до свободного глицерина. NS, не имеет значения. (C) Для оценки секреции ApoE и ApoB из клеток, экспрессирующих плазмиду WT или DN, культуральные супернатанты анализировали с помощью ELISA.

Затем мы использовали обратный подход к ингибированию секреции VLDL с использованием монензина и выяснение того, что это отрицательно сказалось на секреции белков HCV во внеклеточной среде (фиг.4). Monensin эффективно уменьшал внеклеточные уровни ApoE и приводил к сопутствующему внутриклеточному накоплению ApoE, что подтверждает блокировку секреции. В этих условиях не было никакого эффекта ни на внутриклеточный, ни внеклеточный уровни основного белка. Это согласуется с недавней публикацией, демонстрирующей ингибирующие эффекты monensin на вступление HCV, но отсутствие влияния на сборку или выпуск инфекционного вируса (32). Таким образом, хотя компоненты VLDL явно играют жизненно важную роль во время морфогенеза вирионов, TGN / эндосомальные пути, специфически связанные с трафиком / выпуском HCV, выглядят отдельно от тех, которые регулируют секрецию VLDL.

Секрецию основного белка можно отделить от секреции аполипопротеина. JFH-1-инфицированные или неинфицированные клетки обрабатывали моненсином (2 мкМ) в течение 18 ч. Лизаты или осажденные супернатанты анализировали путем Вестерн-блоттинга для указанных белков.

Учитывая роль TGN во время сборки / выпуска HCV, мы затем оценили изменения в структуре мембран TGN во время инфекции HCV. В соответствии с предыдущими исследованиями (33) мы обнаружили, что маркеры TGN TGN46 и AP1 демонстрировали диспергированное распределение в клетках, инфицированных JFH-1, по сравнению с таковыми в окружающих неинфицированных клетках, которые сохраняли характерный перинуклеарный «стоп» Гольджи (рис.5А) , Перераспределение TGN было дополнительно подтверждено окрашиванием инфицированных клеток для 6-фосфатного рецептора маннозы TGN-эндосомы (MPR) (34, 35). MPR снова более широко распространен в инфицированных клетках, чем в соседних наивных клетках. Перераспределение TGN зависело от продуктивного проникновения вируса и репликации, поскольку инфекция с инактивированным теплом вирусом предотвращала изменение распределения TGN46 или AP1 (фиг.5B). Эти данные подтверждают, что HCV рассеивает TGN и изменяет нормальный профиль трафика TGN-резидентных белков.

Инфекция HCV изменяет морфологию TGN. (A) Huh7 клетки инфицировали JFH-1, фиксировали и пермеабилизировали перед окрашиванием кроличьим антиядерным антителом и антителом против антитела против мышиного антитела Alexa Fluor 594. Эндогенные TGN46, AP1 и M6PR были обнаружены с использованием либо овечьих поликлональных антител против TGN46, либо моноклональных антител против AP1 и M6PR мыши с антителами против фолликулов или антител против мышиных антител Alexa Fluor 488. (B). Запасы вирусов подвергали инактивации тепла при 65 ° C в течение 30 минут до заражения клеток Huh7, а окрашивание TGN и AP1 оценивали, как описано для панели A. Были показаны типичные изображения с широким полем. Шкала шкалы, 10 мкм.

Мы отметили, что в клетках, инфицированных JFH-1, картина окрашивания TGN напоминала ранее описанную для LD. Чтобы исследовать это далее, мы приобрели клетки, инфицированные JFH-1, антителами к TGN46 и белку ядра, вместе с липидным реактивным красителем BODIPY (дипиррометен борфторид) (фиг.6A). Все три компонента показали смежные распределения, так что перераспределенные отделы TGN были сопоставлены как с LD, так и с белком ядра в инфицированных клетках (фиг.6A), но не в неинфицированных клетках (фиг.6B), в образце, напоминающем покрытие LDs, для основного белка и NS5A (5, 36, 37).

Перераспределение TGN на участки сборки HCV. Huh7-клетки были инфицированы JFH-1 (A, C и D) или ложно инфицированным (B), фиксированным и пермеабилизированным до окрашивания анти-ядерным белком и анти-TGN46 (как описано в легенде на фиг.5) , вместе с BODIPY для обнаружения липидных капель (LD) (A и B), мышиного анти-E2-антитела (AP33) (C) или мышиного моноклонального анти-ApoE-антитела (D) и соответствующих вторичных антител. Показаны конфокальные изображения. Шкала шкалы, 10 мкм.

Мы считали, что перераспределение TGN приводит к сопоставлению этого отсека с узлами сборки HCV (2, 5). Хотя E2 и основной белок были только частично смежными друг с другом, заметная кластеризация обоих белков происходила в областях, положительных для TGN46 (фиг.6C). Такая кластеризация также имела место для ApoE (рис.6D) и, скорее всего, представляет собой сайты сборки вирусов. Поэтому мы считаем, что перераспределение мембран TGN в непосредственной близости от LD происходит во время вирусной инфекции, что потенциально связывает области сборки вирионов с секреторными путями, необходимыми для выхода HCV.

Учитывая роль NS2 в координации NS и структурных белков во время сборки вирионов, мы предположили, что NS2 может нести ответственность за перегруппировки TGN. Чтобы проверить это, мы выразили либо структурные белки (экспрессия основного белка-р7), минимальную репликацию HCV (NS3-NS5B [NS3-5B] репликон), либо полный неструктурный белковый репертуар (репликон NS2-5B) (38) внутри Huh7. Поразительно, что по сравнению с результатами в JFH-1-инфицированных клетках (фиг.7A) экспрессия только ядра-p7 не проявляла заметных эффектов на архитектуру TGN и наблюдалась взаимоисключающая картина окрашивания для основного белка и TGN46 (фиг.7В ). Аналогично, TGN не перераспределялся внутри клеток, экспрессирующих репликон NS3-5B, хотя было обнаружено некоторое перекрытие NS5A (суррогатного маркера для реплицирующих комплексов) с TGN46 (фиг.7C). Однако клетки, экспрессирующие репликон NS2-5B, рекапилировали перегруппировки TGN, наблюдаемые во время полной вирусной инфекции (рис.7D). Перегруппировки TGN требовали непрерывной экспрессии гена HCV и не являлись артефактом клонирования, поскольку нормальный внешний вид TGN восстанавливался в клетках-репликонах NS2-5B, отвержденных обработкой интерфероном (фиг.7Е). Кроме того, контекст экспрессии NS2 в вирусной репликазе оказался критически важным, поскольку NS2, слитый с GFP, выраженный отдельно, не вызывал перераспределения TGN (фиг.7F), как это было в случае контрольных клеток, трансфицированных только GFP (фиг.8G). Наконец, мы оценили, может ли функционально консервативный NS2 Ser168 играть роль в этом процессе; Ser168 является мишенью для фосфорилирования казеинкиназой II (39) и сильно влияет как на процессы образования инфекционных частиц (8, 40), так и на NS5A (38). Репликоны, содержащие мутацию S168A, все еще индуцировали перегруппировки TGN (рис.8), что указывает на то, что для этого процесса требуются дополнительные функциональные детерминанты NS2. Кроме того, эти репликоны были основаны на адаптированной к культивированию генотипа 1b последовательности FK5.1 (22), что указывает на то, что способность индуцировать перегруппировки TGN не ограничивается изолятом генотипа 2a JFH-1.

NS2 необходим, но недостаточно, чтобы опосредовать перераспределение TGN. Huh7-клетки были инфицированы JFH-1 (A) или транзиторно трансфицированы плазмидой, экспрессирующей сердцевину-p7 (B), фиксированной и пермеабилизированной до окрашивания для основного белка и анти-TGN46, как описано в легенде на фиг.5. Ячейки Huh7, стабильно укрывающие субгеномный репликон NS3-5B (SGR) (CGR), полученный JFH-1, или модифицированную версию, также содержащую NS2 (D), фиксировали и пермеабилизировали перед окрашиванием NS5A с помощью поликлональной антисыворотки кроликов против NS5A и Alexa Fluor 594-конъюгированное антитело против кроликов и TGN46, как описано в легенде к субгеномным репликон-клеткам NS2-5B NS2-5B, отверждали путем лечения интерфероном (100 единиц / мл в течение 3 недель) и окрашивали, как описано для клеток C. Huh7 трансфицировали плазмидой, экспрессирующей слияние NS2-GFP (F) или pEGFP-N1 (G), фиксированную и пермеабилизированную до окрашивания для TGN46 с овечьим поликлональным анти-TGN46 и Alexa Fluor 594-конъюгированным анти- — вторичное вторичное антитело. Показаны конфокальные изображения. Шкала шкалы, 10 мкм.

NS2 серин 168 не требуется для перераспределения TGN. Клетки Huh7, устойчиво поддерживающие G418-резистентный генотип 1b FK5.1 (адаптированные к культуре) субгеномные репликоны (SGR), фиксировали и пермеабилизировали до покрытия с помощью антител против NS5A кролика и антител против TGN46 овец с последующей маркировкой Alexa Fluor 488 -конъюгированные антитела против кролика и Alexa Fluor 594-конъюгированные антитела против овец. Подгеномные репликон-положительные клетки выделяются белой звездочкой в ​​ядре. Показаны конфокальные изображения. Шкала шкалы, 10 мкм.

Отправной точкой для этого исследования было критическое значение TGN-эндосомальных адаптеров при производстве частиц HCV. Молчание субъединицы μ1 AP1, адаптера, участвующего в торговле ТГН-эндосомами, препятствовало выходу вируса, но не влияло на репликацию / сборку вируса. Поощряюще, этот же результат был достигнут с молчанием субъединицы γ1 AP1 (26). Наше исследование также согласуется с выводами Бенедикто и его коллег (26), в которых не было отмечено снижения инфекционности, когда субъединица μ1 AP2 (эндоцитарного адаптера) была отключена, что привело к трафику TGN-эндосомы ключевым путем выхода HCV JFH-1 (Рисунок 1). Однако предыдущее исследование (27) показало, что после заражения AP2M1 снижается производство инфекционного химерного вируса J6 / JFH-1. Расхождение между этими исследованиями может происходить в дифференцированных локальных белковых локализациях в J6 / JFH-1 и JFH-1, которые, в свою очередь, продиктованы p7 и NS2 и предполагают, что эти вирусы могут кооптировать связанные, но четкие пути во время выхода (41).

GGA-молчание дало дополнительную информацию о TGN-эндосомном переносе частиц HCV. Молчание GGA1 уменьшало уровень внутриклеточного вируса, но не влияло на репликацию вируса или внеклеточный титр. Эти данные подразумевают, что GGA1 может играть роль в стабилизации внутриклеточного вируса. В этом отношении интригует, что GGA1 (но не GGA2 или -3) играет роль в эндоцитозе рецептора ApoE LR11 / SorLA, члена семейства рецепторов LDL (31). Уменьшая эндоцитоз ApoE, глушение GGA1 может либо ингибировать процесс сборки HCV косвенно, либо дестабилизировать нарождающиеся внутриклеточные частицы за счет снижения доступности ApoE. Интересно, что подобное явление было зарегистрировано в клетках, блокированных GGA1, инфицированных ВИЧ (42). Молчание GGA2 значительно уменьшало внеклеточную инфективность (рис.1B), предполагая, что этот адаптер может связывать HCV с последующими секреторными отделениями. Заглушение GGA3 приводило к почти полной потере как внутриклеточной, так и внеклеточной инфекционности, что подразумевало его как важный медиатор инфекционной сборки вируса HCV. Таким образом, наши наблюдения коррелируют с ранее сообщенными ролями как TGN, так и эндосом в высвобождении HCV (43).

DN Rabs с ролью в борьбе с ТГН-эндосомной торговлей (Rab8b, -13, -23, -27, -32 и -33) (рис.2) блокировали выделение инфекционных частиц HCV, тогда как те, которые вовлечены в интернализацию / эндоцит (например, Rab3A, -7, -9, -11, -35 и -37) проявляли небольшой эффект (рис.2). Rab8b, -32 и -33 регулируют медиальную и пост-TGN-торговлю, тогда как Rab13 контролирует биогенез плотного соединения через TGN-опосредованный транспорт (44). Удивительно, но Rab11, который, как известно, опосредовал рециркуляцию эндосомного транспорта (45), не влиял на секрецию HCV в наших анализах, несмотря на более ранний экран siRNA, идентифицирующий роль при секреции инфекционного HCV (46). Опять же, эти предыдущие исследования отличались от наших, оценивая выделение химерного Jc1 (J6 / JFH-1), который обычно дает титры в 1000 раз выше, чем у JFH-1 (24, 47). Мы предлагаем, чтобы различные подтипы / генотипы HCV могли следовать тонко измененным путям во время выхода вируса.

Мы также демонстрируем, что секреция VLDL не зависит от глушения адаптеров DN Rabs и TGN-эндосом, которые блокируют выход HCV (фиг.3), в то время как ингибирование секреции ApoE с использованием монензина не влияет на выделение белков ядра (фиг.4). Это поддержало бы пострецепционную ассоциацию между частицами HCV и VLDL, а не образование cosecreted, гибридных «липовирусных частиц», что согласуется с динамическим переносом инфицирования HCV между VLDL и отсеками хиломикронов у пациентов (48). Это говорит о том, что белки, необходимые для сборки VLDL, включая ApoB, ApoE и микросомальный белок переноса триглицеридов (MTP), вносят специфический вклад в сборку вириона, а не к последующему высвобождению вирионов из клеток, хотя они также могут быть включены в инфекционные вирионы (49, 50) ,

Наконец, мы заметили, что мембраны и компоненты TGN перераспределяются в LD-, ApoE- и ядро-белковые клетки в инфицированных HCV клетках. Перераспределение TGN зависело от белка NS2, но только в контексте функциональной репликазы, предполагая, что взаимодействие NS2 с другими неструктурными компонентами опосредует образование этих модифицированных компартментов. Показано, что NS2 играет центральную роль во время сборки частиц HCV и высвобождается через его взаимодействие как с структурными, так и с неструктурными белками в непосредственной близости от LD (7-10). Наши данные показывают, что перераспределение компонентов TGN на сайты сборки вирусов может быть критическим результатом таких взаимодействий.

В заключение наши результаты полностью подтверждают идею о том, что TGN и связанные с ним эндосомальные компартменты представляют собой основной путь для торговли и высвобождения инфекционных частиц HCV из клеток Huh7, которые происходят независимо от секреции VLDL. Более того, вирус, по-видимому, активно модулирует эти отсеки, доставляя компоненты TGN на сайты сборки вирусов через действие NS2. Эти данные свидетельствуют о том, что механизм высвобождения HCV требует не только эндоплазматического ретикулума (ER), связанного с ЛД, но также мембранных отделений, участвующих в более позднем секреторном пути. Будущие исследования должны быть направлены на выяснение взаимодействия между вирусными и хозяиными белками, которые позволяют HCV узурпировать этот путь.

Мы благодарим Тобиаса Мейера (Стэнфорд), Найджела Буннетта (Калифорнийский университет, Сан-Франциско), Марио Зериала (Институт биологии и генетики молекулярных клеток им. Макса Планка, Дрезден, Германия), Бо ван Деурса (Университет Копенгагена, Дания), Германа М Schätzl (Университет Вайоминга) и Ричард Пагано (Медицинский колледж Мейо) для pEGFP-C1 Rab WT и доминантных отрицательных плазмид, Такаджи Вакита (Токио) для конструкций JFH-1 и SGR-JFH-1, и Чарльз Райс (Университет Рокфеллера) для конструкции J6 / JFH-1luc. Мы благодарим Джона Маклауклана, Центра исследований вирусов, Глазго, Шотландии, Ральфа Бартеншлагера, Гейдельбергского университета и Сринивасана Поннамбалама, Университет Лидса, за антитела к основному белку, NS5A и TGN46, соответственно. Мы благодарны Barnabas King за конструкцию NS2-GFP и за Carsten Zothner за техническую помощь.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *