Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Обезьяны Cynomolgus (Macaca fascicularis), экспериментально инфицированные вирусом B19V и вирусом гепатита A: никаких свидетельств коинфекции как причины острой печеночной недостаточности

Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) experimentally infected with B19V and hepatitis A virus: no evidence of the co-infection as a cause of acute liver failure
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4830115/

В память

Это исследование было проведено для анализа курса и результатов заболевания печени
в ко-инфицированных животных, чтобы оценить возможный синергетический эффект человека
parvovirus B19 (B19V) и гепатита A (HAV). Девять взрослых cynomolgus
обезьян инокулировали сывороткой, полученной из фатального случая инфекции B19V
и / или фекальной суспензии острого HAV. Наличие специфических антител к HAV
и B19V, уровни ферментов печени, виремия, гематологические изменения и
некровоспалительные поражения печени были использованы для мониторинга инфекций.
Сероконверсия была подтверждена во всех инфицированных группах. Аналогичная модель B19V
наблюдалась инфекция человека, которая характеризовалась высокими и
стойкая виремия в сочетании с ретикулоцитопенией и легкой до умеренной
анемия в период исследования (59 дней). Кроме того, внутриядерные
тела включения наблюдались в проэритробластной клетке от инфицированного cynomolgus
и B19V Ag в гепатоцитах. Гипоплазия эритроидов и снижение лимфоцитов
подсчеты были более очевидными в группе, которая была инфицирована. Настоящие результаты продемонстрировали,
в первый раз, восприимчивость cynomolgus к инфекции B19V, но она сделала
не показывают ухудшения гистопатологии печени в ко-инфицированной группе.

Парвовирус B19 (B19V), агент, который вызывает инфекцию эритемы (пятое заболевание), заражает
клетки эритроидного предшественника, вызывает остановку созревания в серии эритроидов и кость
(BM) у пациентов с ослабленным иммунитетом. Инфекции, вызванные B19V и другими
Известно, что эритровирусы приматов сильно зависят от иммунологических и
гематологический статус хозяев. В целом здоровые иммунокомпетентные взрослые проявляют острый
инфекции, отмеченной временной депрессией эритропоэза. Появление конкретных
антитела в крови могут сопровождаться полиартритом, артралгией, миокардитом и
иммунного комплексного осаждения в тканях, придавая иммунную опосредованную природу заболеванию
(Anderson et al., 1985).

Был описан более широкий спектр клинических проявлений инфекции B19V
(Bathla et al., 2014), включая гепатит, который
обычно вызвано гепатотропными вирусами (A-E) (Hatakka
и другие. 2011, Rauff et al. 2011, Huang et al. 2012). На основе обнаружения ДНК
в печени пациентов с острой печеночной недостаточностью (ALF), связанной с аплазией BM и в
сыворотка пациентов с ALF неизвестной этиологии, B19V была замечена как
этиологический агент для апластической анемии, ассоциированной с ALF (Aoyagi et al., 1987, Langnas et al., 1995,
Bernuau et al. 1999, Abe et al. 2007, Dwivedi et al.
2009, Huang et al. 2012, Bathla et al. 2014).

ALF представляет собой серьезное осложнение острого вирусного гепатита, которое происходит менее чем у 1%
случаев и, как правило, вызваны вирусами гепатита А-Е, либо одиночными, либо комбинациями
(Dwivedi et al., 2009). Однако предыдущие отчеты
продемонстрировали значимость печеночной тяжести у пациентов с гепатотропным
вирусы (A и E), совместно инфицированные B19V (Ozcay et al.
2006, Kishore & Sen 2009). В последнее время,
одно исследование, проведенное с 48 педиатрическими пациентами с ALF, показало наличие B19V
генома в 19 (39%) случаях, из которых 13 (27%) были также положительными для IgM-антител против
другие вирусы гепатита (Dwivedi et al., 2009).
Сравнение клинических характеристик и результатов пациентов с печеночной недостаточностью
связанный только с B19V и коинфицированный с гепатитом А, В, С или Е, результаты показали
что заболевание было значительно более тяжелым у пациентов с коинфекцией B19V.

Хотя фульминантная инфекция гепатита А встречается редко (Jeong
& Lee 2010), это частая причина ALF среди детей (Aydoğdu et al., 2003, Jayakumar et al., 2013). Известно, что у пациентов с фульминантным гепатитом А
спонтанного лучшего прогноза, чем те, которые вызваны другой этиологией (Ozcay et al., 2006). Однако, плохой прогноз молниеносного гепатита
Пациенты были связаны с коинфекцией B19V (Chehal et
и др. 2002, Ozcay et al. 2006). К тому же,
смертельный случай с ребенком с ALF из-за инфекций с вирусами гепатита A и E вместе
с сообщением B19V (Kishore & Sen 2009).
Однако есть много противоречивых результатов об ассоциации B19V с другими вирусными
инфекции, индуцирующие ALF (Wong et al., 2003, Kumar et al., 2006, Opaleye et al., 2011) или другие наихудшие результаты (Mogensen et al., 2010). Таким образом, многие аспекты роли коинфекции в
исход заболевания печени остается неясным.

Поэтому мы провели экспериментальное исследование инфекции для анализа курса и
исход заболевания печени у ко-инфицированных животных B19V / HAV для оценки
возможный синергический эффект коинфекции в отношении травмы печени. Мы также
исследовали восприимчивость обезьяны cynomolgus к B19V гематологическими и
вирусологический параметр, чтобы определить, может ли это животное быть полезной моделью для
новые исследования о B19V-инфекции.

Животные. Это исследование проводилось в строгом соответствии с
рекомендации национальных и международных руководящих принципов по уходу и
лабораторных животных. Этот конкретный экспериментальный протокол был рассмотрен и одобрен
Фонд Освальдо Крус (Fiocruz) (Рио-де-Жанейро, Бразилия) Этический комитет по использованию
животных (резолюция P0064-00). Все операции проводились под анестезией и все
были предприняты усилия по минимизации страданий.

Девять клинически здоровых, молодых взрослых (весом 3-5 кг) обезьян cynomolgus, в пределах
возраст от трех-четырех лет, от факультета Приматологии, Института Науки
и технология в биомодели (Fiocruz), были использованы и подтверждены как серонегативные для
специфические анти-HAV и анти-B19V иммуноглобулины с помощью коммерческих иммуноанализов. Все
животные имеют сертификаты здоровья, которые гарантируют отсутствие инфекционных заболеваний.
серологическая съемка подтвердила, что они не содержат вируса иммунодефицита обезьян и
анаболический тип D ретровируса. В период исследования и карантина обезьяны были
размещенных отдельно, для предотвращения перекрестного заражения среди инокулированных и
неинокулированных обезьян cynomolgus, в клетках сжимания из нержавеющей стали в
климатически контролируемое помещение (температура 21 ± 1ºC и относительная влажность 55 ± 5%) с 12 ч
свет / темный цикл. Их ежедневно кормили коммерчески доступной диетпитанием приматов
с добавлением свежих фруктов и овощей. Вода была предоставлена ​​реклама
неограниченном. Клетка, используемая в нашем исследовании для размещения каждой обезьяны, составляла 0,77 м (высота)
х 0,60 м (ширина) х 0,68 м (глубина) (Suburban Surgical CO, Inc, США). Чтобы свести к минимуму
стресса животных в течение всего периода исследования, они подвергались
программа экологического обогащения, состоящая из ряда мер, которые изменяют
физических и социальных аспектов, улучшения качества жизни животных, таких как: (i)
зеркало из нержавеющей стали — из полированной нержавеющей стали, прикрепленной к передней клетке
сетка, позволяющая животному перемещать ее, чтобы исследовать окружающую среду; (ii) поддон для кормления —
из нержавеющей стали, содержащей пластиковый ковер с углублениями, прикрепленными к клетке,
позволяя животному обрабатывать некоторые предметы (т. е. фрагменты зерновых батончиков, изюм, подсолнечник
семена), расположенные на подносе; (iii) ПВХ с укусом — с ПВХ-трубой с перфорацией
вдоль его длины и резьбовых колпачков на концах, что позволяет размещать предметы
(т. е. кусочки зерновых, изюм, рисовые зерна); (iv) предложение электронного оборудования
классическая музыка на CD; (v) микроволновая печь для попкорна — попкорн в течение как минимум одного дня
неделя; (vi) лекарственные травы — предлагая различные лекарственные травы в течение как минимум одной недели
день (мята, лимонный бальзам, ромашка и календула). Животные были в хорошем физическом
здоровья с нормальными исходными биохимическими и гематологическими признаками.

Инокулят — инокулят B19V был получен из сыворотки
68-летний мужчина-афро-бразильский пациент (против HAV IgG отрицательный) диагностирован как имеющий
серповидноклеточная болезнь, проявляющая невосприимчивую анемию и тромбоцитопению. Биопсия BM
подтвердили миелодисплазию и включения, подобные парвовирусу (Rio de Janeiro B19V
вспышка произошла в 2004-2006 годах). Для детектирования и генотипирования ДНК B19V
полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с использованием праймеров (P12F / P16R и P13F / P16R)
которые усиливают частичную область VP1 / VP2 гена B19V (Durigon et al., 1993). Фрагмент 476 п.о. очищали с использованием ПЦР
(комплект QIAquick® DNA Mini Kit, Qiagen, Великобритания) и подвергается прямому
секвенирования в обоих направлениях с использованием набора для циклического секвенирования большого красящего красителя на
3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Последовательности были выровнены с использованием BioEdit
Редактор выравнивания последовательностей v.7.0.5.2 (Ibis Biosciences, США) и были сопоставлены с другими
последовательностей, доступных в GenBank. Анализ последовательности характеризовал этот фрагмент как
генотип 1a (присоединение к GenBank KU342655). Вирусная нагрузка (VL) в сыворотке пациента была
105 копий / мл. Каждое животное получало 1 мл этой сыворотки
через внутривенный путь.

HAV-штамм HAF-203 (GenBank-присоединение AF268396) выделяли из стула
Бразильский ребенок со спорадическим гепатитом А, собранный в рамках ранее опубликованного
(Gaspar et al., 1992). Образцы стула
разбавляли 1% (мас. / об.) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (10 нМ фосфат натрия, 0,15 М NaCl)
с пенициллином (100 МЕ / мл) и стрептомицином (100 мг / мл), проясненным низкоскоростным
центрифугированием и фильтровали через мембрану 0,45 мм. Этот инокулят определяли количественно
ПЦР в реальном времени (RT-PCR) (3 × 105 копий / мл).

Экспериментальный проект. Исследование предназначалось для оценки клинических и
лабораторные данные трех групп циномолгуса: (i) трех животных с инокулятом B19V
только (b-U5, b-T9, b-D2); (ii) три
животных, совместно инфицированных B19V и HAV (bh-T15, bh-G7,
BH-В14); (iii) три животных, инфицированных только HAV
(h-V3, h-V13 и h-H8).
Предварительную инокулирующую сыворотку, BM и биопсию печени собирали перед инокуляцией до
установить индивидуальные базовые значения. Клинические особенности и ректальные температуры были
ежедневно проверяется, а также сбор фекалий. Все инвазивные процедуры были выполнены
под гидрохлоридом кетамина (20 мг / кг) (Ветанаркол, Кениг, Аргентина) и ксилазин (0,1
мг / кг) (Syntec Do Brasil, Brazil), анестезия, вводимая внутримышечно, и все
были предприняты усилия по минимизации страданий. Всех животных контролировали в течение 59 дней;
периодичность хирургических процедур и сбор крови были следующими: ноль, семь,
14, 19, 31, 45 и 59 дней после заражения (dpi). Образцы биопсии печени были взяты
Прокол иглы Menghini (16G) под правым боковым плавающим ребром раз в месяц, управляемый
ультразвуковая эхография. К BM подошел аспирационный прокол (14G) правой боковой подвздошной кишки
гребень для морфологического анализа красных клеточных линий. Послеоперационные процедуры были
хорошо переносимые всеми обезьянами циномолгуса, их клинически выполняли дважды в день, любые
во время этого исследования была необходима дополнительная анальгетическая процедура, и операция была исцелена
через два дня после прокола. Все обезьяны были подвергнуты эвтаназии общей оккупацией под глубокими
проведена анестезия с кетамином / ксилазином и вскрытием. Обезьяны инокулировали
с B19V были подвергнуты эвтаназии в конце наблюдения (59 dpi), в то время как обезьяны
моноиноцированные только с HAV, подвергали эвтаназии на 30-й день (h-H8), 45
(h-V13) и 59 (h-V3) dpi. После вскрытия печени
фрагменты были вырезаны для гистологического исследования.

Обнаружение антител HAV и B19V. Образцы сыворотки анализировали для
обнаружение общих антител против HAV с использованием коммерческого набора (Bioelisa HAV 96T Kit;
Biokit SA, Испания) в соответствии с инструкциями производителя. IgG антитела против B19V
были обнаружены с использованием коммерческого иммуноферментного анализа (Biotrin International Ltd,
Ирландия). Все серологические тесты проводились в соответствии с инструкцией производителя
с незначительными изменениями. Эти тесты были основаны на перекрестной реактивности между человеком и
cynomolgus IgG антител (de Swart et al., 1998,
Clark et al. 2013). Точки отсечения для HAV
и B19V-антитела оценивали с использованием рабочей характеристики приемника
(ROC) (MedCalc, Бельгия). Способность модели дифференцироваться
между положительными и отрицательными обезьянами для общего анти-HAV или IgG anti-B19V
(дискриминация) определяли количественно с использованием площади под кривой (AUROC) (Hanley & McNeil 1982, Steyerberg et al., 2001).

Ферменты печени — проанализированы образцы сыворотки, собранные у обезьян
для уровней аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы с использованием
коммерчески доступный комплект (Abbott, США). Базовые уровни были получены от каждого животного
на этапе предварительной инокуляции, и эти значения считались ссылками для нормальных
значения.

Гематологический и БМ-анализ. Следующие гематологические
были определены параметры: уровни гематокрита и гемоглобина, полная клетка крови
включая ретикулоциты, а также общее и дифференциальное количество лейкоцитов (Horiba ABX,
Япония). Для оценки дифференциального процента лейкоцитов и морфологических
анализ аспирации BM, оба образца были намазаны на слайды микроскопа и окрашены
с Май-Грюнвальдом-Гимзой. Образцы сыворотки также получали центрифугированием
периферическую кровь, собранную в пробирках и хранящую при -20ºC для дальнейшего анализа.
Гематологические аномалии были проанализированы в Центре клинических анализов
Платформа для лабораторных животных, Fiocruz.

Гистопатология печени и обнаружение антигена — были зафиксированы образцы печени
в 10% нейтральном формалине. Парафиновые участки размером 4 мкм окрашивали гематоксилином и
эозин для гистологического исследования. Иссеченные образцы печени хранили при -70ºC до
анализировали на обнаружение антигена HAV или B19V. Иммунофлуоресценция для выявления HAV
антиген проводили с использованием моноклонального антитела против HAV IgG1 в качестве первичного антитела
(0,1 мг / мл) при разведении 1:20 (United States Biological, США). Для обнаружения B19VAg
анти-B19-моноклональное антитело-ацит 522-G3 от мыши разбавляли 1:40 (CDC,
США). В качестве вторичного антитела для обнаружения обоих антигенов Alexa Fluor 488-меченый
добавляли куриный антимышиный IgG (2 мг / мл), разбавленный 1: 300 (Molecular Probe, USA). Слайды
были контрастированы с Эвансом Синим и покровным с медленным затуханием в глицерине с
DAPI (Molecular Probe) Изображения положительных полей были получены с использованием конфокальной
микроскопии с помощью LSM Zeiss 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). Неинфицированные HAV или B19V
секций печени использовали в качестве контрольных образцов.

Обнаружение и количественное определение генома HAV и B19V — загрузка HAV-РНК была
определяемый RT-PCR с использованием системы TaqMan (Applied Biosystems 7500 PCR в реальном времени
Система, прикладные биосистемы). Для количественной оценки HAV-РНК стандартная кривая рекомбинантного
был использован клоун 5′-некодирующей (NC) области генома HAV (штамм HAF-203) (27).
Специфические праймеры для HAV 5 ‘NC и одного помеченного 5’ FAM зонда были разработаны нашими
группа.

Чтобы обнаружить и количественно определить ДНК B19V из сыворотки инокулированных обезьян, B19V в реальном времени
ПЦР проводили с использованием праймеров, которые ранее были описаны для амплификации всех
три генотипа B19VV (Nguyen et al., 2002).
Количественное определение проводили с использованием SYBR Green в реакционной смеси (SYBR Green PCR
Мастер-микс; Qiagen) с помощью Roche Lightcycler и по сравнению с набором стандартов плазмиды
и к стандарту ВОЗ B19V (Национальный институт биологических стандартов контроля).
Для генотипирования B19VDNA, полупринятая ПЦР для частичной амплификации гена капсида,
и анализ последовательности фрагмента 476-bp проводили, как описано
выше.

Статистический анализ. Средство ± стандартная ошибка средств была
анализируется двухсторонним ANOVA. Статистический анализ и графики выполнялись с использованием
Программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 и программное обеспечение Medcalc v.14.8.1 (medcalc.org/). Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Клинические данные: ни одна из обезьян, зараженных B19V и / или HAV
показали типичные клинические признаки острого гепатита или печеночной недостаточности (желтуха,
коагулопатия и энцефалопатия). Средняя ректальная температура и вес тела
не изменяются на протяжении всего исследования.

Обнаружение антител. Профиль титров антител суммируется в
на фиг.1. Сероконверсия групп B19
был рассмотрен, когда значения оптической плотности (OD) / отсечки были ≥ 0,41, согласно
ROC. Все животные из группы B19 представили IgG-анти-B19, обнаруженные EIA. Рано
повышение уровня IgG B19 при 7 dpi было обнаружено inb-D2, тогда как обезьяны
b-U5 и b-T9 показали увеличение титров с 14 точек на дюйм
достигая наивысших титров на 45 точек на дюйм (рис.1). В
со-инфицированная группа, антитела IgG B19V обнаруживались в bh-Q14
andbh-G7 с 7 точек на дюйм. Среднее количество титров антител B19V в
со-инфицированная группа была значительно выше (р = 0,04), чем у моноинфицированных животных
(Фиг.2А). Аналогичная картина роста IgG
титры антител против B19 наблюдались в обеих группах с 14-45 точек на дюйм, а затем
постепенное снижение до конца исследования. С другой стороны, анти-B19 IgG
антитело не обнаруживалось в bh-T15. Всего анти-HAV иммуноглобулинов
были обнаружены с 7-59 точек на дюйм в B19 / HAV и с 14 точек на дюйм в группах HAV. Исключениями были
наблюдаемые в bh-Q14 и h-H8, которые имели задержанное обнаружение
от общего количества анти-HAV (фиг.1).

Рисунок 1: индивидуальный анализ курса парвовируса человека B19 (B19V) и
инфекции гепатита А в cynomolgus. Во время курса сыворотку анализировали
для загрузки вирусов [ДНК B19 ДНК и / или вирус гепатита A (HAV)] и конкретные
антитела (IgG против B19 и / или общие антитела против HAV). * IgG против B19 и
общие анти-HAV показаны в оптической плотности (OD) / cut-off. IgG anti-B19
DO / отсечка ≥ 0,41 были положительными. Общее количество анти-HAV DO / cut-off ≤ 1,2 было положительным;
**: животные (h-H8 и h-V13) подвергаются эвтаназии при 45
дней после инфицирования; #: общее анти-HAV-детектирование у ко-инфицированных животных (+:
положительны; -: отрицательный).

Рисунок 2: сравнительный анализ нагрузки ДНК и средств титров антител из
parvovirus B19 (B19V). A: разница IgG против B19 среди моно
и ко-инфицированных животных; B: обнаружение ДНК B19 среди моно и совместно инфицированных
групп. Результаты оптической плотности (OD) были выражены как средние ± стандартные
ошибка средств. HAV: вирус гепатита А; *: p <0,05; **: p < 0,01.

Гематологический и BM-анализ — данные по количеству клеток крови и BM
анализ соответствовал активной инфекции B19V. В общем, средний ретикулоцит
подсчеты показали статистически значимое снижение (р <0,05) как в моно, так и в коинфицированных групп (фиг.3) по сравнению с базовые значения (значения предварительной инокуляции). Сокращение количества ретикулоцитов произошло сразу после первой или второй недели после прививки. Признаки полного выздоровления были не обнаруживаются в этих группах до конца последующего наблюдения (фиг.3). Среднее количество гематокрита, эритроцитов (RBC) и концентрация гемоглобина были значительно снижены в ко-инфицированной группе при 19 dpi (p <0,01) (фиг.3). В BM-анализе группа B19V, b-U5 показала малочисленность мегакариоцитов при 31 и 45 dpi и более низкая BM-клеточность. У животных b-D2 отсутствие мегакариоцитов было обнаружено при 19 dpi и было связано с выраженным уменьшением BM Клеточность. Мазок BM, наблюдаемый для обезьяны b-D2 при 7 dpi, показал ядерные включения B19V в базофильном эритробласте (рис. 4D). Inb-T9, мегакариоциты наблюдались, несмотря на клеточность ВМ. В коинфицированной группе HAV и B19 аспирации BM выявили сильную уменьшение числа мегакариоцитов, связанных с очень низкой клеточностью BM в cynomolgusbh-T15 и bh-Q14 с 14 точек на дюйм.

Рисунок 3: средства гематологических и биохимических значений, полученных из cynomolgus
обезьяна, инокулированная парвовирусом B19 (B19V), B19 / вирус гепатита A (HAV) и
HAV. Результаты были выражены как средство ± стандартная ошибка средств. *: п
<0,05; **: p <0,01.

Рисунок 4: экспериментальный вирус гепатита A (HAV) и парвовирус B19
cynomolgus monkey (Macaca fascicularis). A: отсутствие B19
антиген в контрольном животном, инокулированный HAV; B: ядерные и цитоплазматические
флуоресцентные маркеры к антигену B19 были обнаружены через 59 дней после инфицирования
(dpi) в monkeysbh-Q14, bh-G7,
andbh-T15 соответственно (стрелки); C: конфокальное сканирование
образ. B19, окрашенным в зеленый цвет непрямой иммунофлюоресценцией (Alexa
Fluor® 488), паренхиму печени контрастировали в ярко-красном (Эванс сине),
и ядро ​​показано как синий (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол); D: костный мозг
мазки от обезьяны b-D2 при 7 dpi, май-Грюнвальд-Гимза пятно
показаны три разных этапа эритроидных клеток при световой микроскопии
анализ. Обратите внимание на гигантский проэритробласт со свободным хроматином и два возможных
вирусные включения (стрелка), полихроматический эритробласт с более структурированным
ядро (стрелка) и меньший ортохроматический эритробласт (нормобласт)
с более темным ядром (круг).

Гистопатология печени и биохимия крови — Гистопатологические
результаты были согласуются с изменениями, вызванными HAV у нечеловеческих приматов, которые
описанных в таблице. Экспериментальная коинфекция
с HAV и B19V продемонстрировали небольшое ухудшение при травме печени во время
исследуемый период, как умеренное портальное воспаление (bh-G7) (фиг.5A), некроз печени и стеатоз
(bh-G7) (фиг.5B), умеренный
и диффузное кровообращение гепатоцитов (bh-T15) (рис.5C) и многочисленные очаги лобулярного воспаления в печени
паренхиму (bh-T15) (рис.
5D).

Рисунок 5: Гистопатология печени обезьяны cynomolgus после экспериментальной коинфекции
в 59 дней после инокуляции вирусом гепатита А (HAV) и парвовирусом B19
окрашенных гематоксилином и эозином. A: умеренное портальное воспаление (стрела,
обезьяна bh-G7); B: фокус некроза печени (стрелка) и
стеатоз (обезьяна bh-G7); C: умеренное и диффузное tumefaction
гепатоцитов (monkeybh-T15); D: многочисленные очаги долото
воспаление (стрелка) в паренхиме печени (обезьяна
BH-Т15).

TABLESummary сравнительных результатов гистологических изменений печени
cynomolgus, инокулированный вирусом гепатита A (HAV) и парвовирусом B19
(B19V) HAV инокулировали
животные (dpi) HAV и B19V
(19) 1 (14-19) 3 (45-55) 1 (14) 1 (14) Гепатоцеллюлярная опухольАбсенцияАбсенцияПрезидентность (19) Наличие (14) Присутствие (19-55) Возбуждение гепатоцитовПреобразование (19) ОтсутствиеAbsenceAbsenceAbsenceAbsenceIntra-acinar воспаление1 (14) 1 (31) 1 (55) 1 (19) 2 (45) 2 (55) 1 (45-55) 1 (55) Портальное воспаление1 (19) 2 (31) 1 (19-55) 1 (19) 2 (45) 1 (19) 2 (55) 1 (45-55) 1 (31) 1 (55) Апоптоз00001 (55) 1 (55) Застой 1 (14) 00000Моноядерные клетки в синусоида
2 (19-31) 00000
a: тип клеток, присутствующих в синусоидах; отсутствие (0),
минимальная (1), умеренная (2), тяжелая (3) / дневная прививка; dpi: дни
после заражения.

В этой модели некровоспалительные поражения в дольке или окружающем районе порта были
считаются наиболее репрезентативными находками вирусного гепатита, поскольку эти данные
никогда не были диагностированы в секциях печени во время предварительного заражения, включая
в cynomolgus, инокулированном только B19V. На интерфейсе между портальными трактами и
паренхиму, были рассеянные рассеянные макрофаги, смешанные с лимфоцитами, и
несколько полиморфноядерных лейкоцитов. Наиболее типичный поиск антигена B19V был в
ядро и / или в перинуклеарной цитоплазме гепатоцитов, которая была обнаружена в
B19V инокулированных животных иммунофлюоресценцией при 59 dpi (фиг.4A-C). Хотя среднее значение ALT
уровень проявлял лишь незначительное повышение во время коинфекции,
HAV-инфицированные животные показали значительное увеличение этого фермента печени при 19 dpi
(Фиг.3). Другой параметр, описывающий печень
функция не вносила существенных изменений (p> 0,05) ни в одном из трех
групп.

Молекулярная характеристика и VL B19V и HAV B19VDNA, выделенные из сыворотки
инокулированные обезьяны (b-T9, b-U5,
andbh-G7) показал 100% идентичность последовательности с исходным вирусом
инокулята и были охарактеризованы как генотип 1a (GenBank-присоединения 34342656-KU342658).
В общем, ДНК B19V была обнаружена во всех инокулированных обезьянах с наивысшим VL при 7 dpi
(1011 копий / мл), а затем постепенно уменьшающийся рисунок до 59 dpi.
Уникальный видимый B19V клиренс периферической крови произошел в
bh-G7 с 45 точек на дюйм. Животное b-D2 показало короткие и низкие
viraemia, с сывороткой VL 105 копий / мл при 7 dpi (рис.1C).

HAV-инокулят характеризовался как генотип 1B (Amado
и другие. 2010). В группе HAV виремия была обнаружена с 7 точек на дюйм
(h-V13 и h-V3) до 59 точек на дюйм с наивысшей нагрузкой
обнаружено при 14 dpi (104 копий / мл) и с постепенным уменьшением до
102 копий / мл (рис. 1G-I), тогда как совместно инфицированные животные
(bh-T15 и bh-G7) показали кратковременную виремию HAV до
20 точек на дюйм (рис.1D, E). Прерывистая виремия HAV наблюдалась у одного ко-инфицированного животного
(bh-Q14), поскольку он стал необнаружимым на 30-й день, но вновь появился на 59
dpi (фиг.1C). Аналогичная картина убывания B19
VL наблюдали в обеих группах (B19V и HAV / B19V) до конца исследования.
Сравнительно, VL группы B19 был значительно ниже, чем у соинфицированных
животных (p = 0,001) (фиг.2B).

В этом исследовании наблюдалось экспериментальное заражение обезьяны cynomolgus
(Macaca fascicularis) после внутривенной инокуляции B19V и
HAV более 59 дней. Все животные, изученные в настоящей работе, состояли из иммунокомпетентных,
клинически здоровый, анти-B19V IgG-отрицательный и показательные признаки того, что cynomolgus
были инфицированы человеческим B19V по внутривенному пути, были основаны на
изменения гематологических и вирусологических параметров.

Наши серологические данные после инокуляции показали прогрессирующее повышение титра IgG
(OD / скорость отсечения) почти у всех инокулированных животных обеих B19V-инфицированных групп.
единственным исключением было ко-инфицированное животное bh-T15, поскольку оно не показывало
сероконверсии. Этот несоответствующий результат может отражать высокую виремию (в среднем
1010 копий / мл), обнаруженное у этого животного с 7 точек на дюйм. предыдущий
исследования показали, что в сильно вираемических образцах пациентов с B19V
инфицирование, большое количество IgG против B19V может быть комплексовано с вирусными частицами,
становясь необнаружимым серологическими анализами. В образцах с низкой нагрузкой B19V удельный
IgG-анти-B19 может быть обнаружен с помощью ELISA из-за чрезмерного количества антитела в
отношение к VL (Bredl et al., 2011). Эта картинка
было очевидно у животного b-D2, которое показало обнаруживаемые титры IgG B19V
связанный с уменьшенной виремией только при 7 dpi (105 копий / мл).

Высокая и стойкая виремия B19 была обнаружена на протяжении всего исследования до 59 точек на дюйм в
большинство животных, даже после сероконверсии антител. Аналогичные результаты были получены в
острые случаи человека, где хорошо документировано, что очистка B19V от периферической крови
после острой инфекции может длиться несколько месяцев, несмотря на наличие специфического IgG
анти-B19V (Musiani et al., 1995, Lindblom et al., 2005, Mogensen et al., 2010).

В этом исследовании течение инфекции контролировали детектируемой B19V-ДНК и HAV-РНК
в образцах сыворотки в сочетании с каплями в параметре RBC, в частности
ретикулоцитопения, легкой и умеренной анемии, а также обнаружение ядерного включения
в базофильном проэритробласте и обнаружении B19V Ag в образцах печени в течение 59
день расследования. Эти результаты были также сообщены другими авторами в естественных
Simian parvovirus (SPV) и в экспериментальной инфекции B19V с использованием людей
как добровольцы (Anderson et al., 1985). В нашем
понимание, B19V тропизм для эритроидных клеток-предшественников индуцировал красную клетку
депрессии в течение первых 10 дней экспериментальной инфекции, как описано ранее
у людей, инфицированных B19V другими (Anderson et al.
1985, Potter et al. 1987). Эти
результаты не были обнаружены у HAV-инокулированных животных.

Несмотря на наше краткосрочное исследование, наши данные показывают, что обезьяна cynomolgus разработала доброкачественную
картина инфекции B19V, сходная с болезнью человека, которая характеризовалась более высокой
и стойкая виремия, связанная с обнаружением антител и эритроидным предшественником
(Potter et al., 1987, Bredl et al., 2011). Наличие инфекции B19V
был связан с умеренными лабораторными результатами ретикулоцитопении, уменьшением
количество эритроцитов и содержание гемоглобина, гипоцеллюлярность костного мозга и уменьшенное число
мегакариоцитов, с менее выраженным воздействием на другие гемопоэтические клетки.
тяжелое гематологическое расстройство, вызванное SPV, ранее сообщалось только в
иммунокомпрометированный cynomolgus (Green et al., 2000,
Schröder et al. 2006).

Обнаружение депрессии эритроидной линии, которая была наиболее распространенной лабораторией
функция, описанная в инфекции человека B19V, была подтверждена в нашем исследовании в B19V-инфицированном
крабоед. Эта переходная гипоплазия объясняется апоптозом, вызванным B19V NS1
в эритроидной линии (Moffatt et al., 1998, Sol et al., 1999, Yaegashi et al., 1999). Интересно, что cynomolgus инокулировали только B19V
показало более выраженное снижение количества ретикулоцитов в течение первых 15 т / д, в то время как
в коинфицированной группе этот вывод наблюдался ранее на первой неделе
после инокуляции. Сообщалось также о гематологических осложнениях у людей
в HAV-инфекции (Aoyagi et al., 1987, Chatzimichael et al., 2008, Rauff et al., 2011), но никогда не были описаны в иммунокомпетентных
крабоед. В нашем исследовании гипоплазия эритроидов была более очевидной в коинфицированной
группы, что также объясняется синергическим эффектом как инфекции, так и
перепроизводство фактора интерферона-гамма и фактора некроза опухоли-альфа в ходе
коинфекция, как описано другими (Morceau et al.
2009).

Ни у одной из инфицированных ГАВ обезьян не наблюдалась желтуха, связанная с инфекцией гепатита, поскольку
сообщается нашей группой (Pinto et al.
2002, Amado et al. 2010). Однако
повышенный уровень АЛТ, вирусная пролиферация и гистопатологические находки B19 / HAV и HAV
инфекции были согласуются с изменениями, вызванными HAV в New World нечеловеческими приматами
(Pinto et al., 2002). Как отмечают другие
авторы, антиген B19V можно было обнаружить в клетках паренхимы печени B19V, инокулированных
обезьян.

Однако коинфекция B19V и HAV не вызывала ALF в коинфицированной
cynomolgus обезьяны. Механизм, с помощью которого B19V вызывает печеночную травму, остается неясным,
но было предложено повреждение печеночной клетки в результате прямого вторжения
вирусом (Poole et al., 2004). Возможная
объяснение — наличие глобозида, основного клеточного рецептора вируса, который
могут быть обнаружены на мембранах гепатоцитов (Koliou et al., 2014). Кажется, что, несмотря на неспособность вируса к
реплицируются в непермиссивной клетке, как гепатоциты, он сохраняет свою способность продуцировать
неструктурный белок NS1, который индуцирует арест на фазе G1. G1 арестовал гепатоциты
подвергаются апоптозу путем активации каспазы-3 и каспазы-9, поддерживая гипотезу
прямой цитопатический эффект B19V на клетки печени (Poole et al., 2004). Дополнительные исследования молекулярных механизмов
повреждение печени при HAV и B19V ко-инфекции должно быть темой для дальнейших экспериментальных
инфекции. Что касается HAV-индуцированной травмы печени, было предложено иммунное
опосредованный механизм, вызванный HAV-инфекцией. Поэтому отсутствие сигналов
печеночная недостаточность в нашем исследовании может усилить роль индивидуального иммунного ответа в ALF
как это наблюдается и у человека-хозяина (Jeong & Lee
2010).

Таким образом, наши наблюдения показали, что гепатит, вызванный коинфекцией HAV и B19V, делает
по-видимому, не вызывает тяжелой острой печеночной болезни в модели cynomolgus. Эти выводы
в соответствии с предыдущими исследованиями, которые продемонстрировали, что множественные гепатротропные
вирусные коинфекции у людей могут не привести к более тяжелым острым гепатитам (Kumar et al., 2006, Wang & Zhang 2009). Это предварительное исследование также способствует
что in vivo демонстрирует восприимчивость циномолгуса к человеку B19V
квалифицирует это животное как полезную модель для исследований патогенеза B19V.

Идейвальдо Инасио Феррейра, Эдни де Монте, Мария Луиза Борхес де Азеведо, Симона
Рамос и Клебер Хупер, за техническую помощь во время экспериментальной инфекции
процедуры.

Финансовая поддержка: CNPq, LADTV (IOC-FIOCRUZ)

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *