Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Иммуногенность парентерально поставленных мелких и средних поверхностных антигенов вируса гепатита В

Immunogenicity of parenterally delivered plant-derived small and medium surface antigens of hepatitis B virus
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4833783/

Сообщается Н. Стюартом.

Внутримышечно поставляемый растительный M-HBsAg сравнивали с S-HBsAg и в результате вызывают специфические антитела против preS2 и значительно более высокий титр антител против HBs вместе с профилем изотипа IgG, указывающим на некоторую поляризацию Th1, кроме основного Th2 ответ.

Распространенность HBV по-прежнему угрожает независимо от программ профилактики с использованием вакцин, содержащих S-HBsAg, дополненных вакцинами третьего поколения, включая M- и L-HBsAg. Системы экспрессии растений предлагают экономичный вариант производства антигенов. Полученные из растений S- и M-HBsAg, внутримышечно доставляемые мышам, вызывают антитела против HBs в несколько раз выше, чем пороговый титр высокой чувствительности. M-HBsAg индуцирует более сильную реакцию анти-HB, а также специфические антитела против preS2. Профили изотипа IgG указывали главным образом Th2-ответ, но также была отмечена поляризация Th1, в некоторой большей степени для M-HBsAg. Эти результаты соответствуют исследованиям M-HBsAg, полученных из CHO, по сравнению с коммерческими вакцинами на основе S-HBsAg и поддерживающей активностью растительных антигенов в качестве альтернативных инъекционных вакцин.

Вирус гепатита B (HBV) является возбудителем одного из наиболее распространенных и опасных вирусных заболеваний человека. Хотя эффективные субъединичные вакцины, основанные на небольшом поверхностном антигене вируса S-HBsAg, были внедрены в программы вакцинации 30 лет назад, считается, что одна треть глобальной популяции инфицирована HBV, число хронических носителей превышает 370 миллионов человек и около 800 000 человек умирают каждый год из-за осложнений после заболевания, в основном в развивающихся странах. Поэтому много исследований было посвящено созданию как более эффективных, так и экономически целесообразных вакцин. Это привело к разработке образцов, которые содержат помимо S-HBsAg другие поверхностные антигены HBV, демонстрирующие иммуногенные домены: среда M-HBsAg с preS2 и / или большой L-HBsAg с preS1 и preS2 (Shouval et al., 2015), а также попытки получить эти антигены в системах экспрессии растений. Многочисленные исследования показали, что растения могут использоваться в качестве эффективных биореакторов, продуцирующих различные нативные антигены, способные индуцировать эффективный иммунный ответ, эквивалентный обычным образцам. Среди самых современных биофармацевтических препаратов, полученных из растений, глюкоцереброзидаза для лечения болезни Гоше, вырабатываемой в клетках моркови (Protalix ™), уже одобрена FDA, а четырехвалентная вакцина против гриппа, произведенная Medicago Inc. в Nicotiana benthamiana с помощью вирусной опосредованной вектором экспрессии, был зарегистрирован на этапе II клинических испытаний (Ward et al., 2014). Также антигены HBV, в основном S-HBsAg, эффективно продуцировались на растениях, и их иммуногенность была доказана как после перорального, так и парентерального введения (Pniewski 2014). Тем не менее в этих исследованиях был проанализирован почти исключительно титр антител против HBs как наиболее общий ответ на антигены HBV. Другие компоненты иммунного ответа не были тщательно исследованы, в то время как они определяют тип ответа, жизненно важный для эффективности потенциальной вакцины. Более того, детали реакции на парентерально доставленные очищенные растительные HBV-антигены требуют обширных исследований, поскольку они могут играть незаменимую роль в схемах смешанной иммунизации, включающих инъекционное введение и пероральный стимул с инкапсулированными клетками антигенами.

Целью этого исследования было оценить эффективность иммунизации с использованием растительных S- и M-HBsAg, вводимых парентерально мышам. Для определения специфической иммуногенности антигенов были проанализированы общие анти-HB и антитела против preS2, в то время как анализ распределения подкласса IgG против HBs проводили для определения структуры иммунного ответа.

Антигены HBV были получены из ранее полученных трансгенных растений табака, продуцирующих ок. 10 мкг / г FW VLP-собранного S- или M-HBsAg, как анализировали с помощью ELISA-тестов на основе mAb, специфичных к эпитопу ‘a’, и с использованием S-HBsAg (Meridian Life Science) или CHO-экспрессированного M / L-HBsAg ( любезно предоставленный профессором Рейнхольдом Ширбекком, Университет Ульма, Германия) в качестве стандартов. Антигены, полученные растением, очищали из экстрактов листьев (PBS pH 7,4 с 1% об. / Об. Tween® 20, соотношение 1: 5) путем ультрацентрифугирования (60 000 об / мин, 20 ч, 15 ° C) в градиентах на стадии CsCl (10 мл из четырех равных частей растворов 1,1-1,4 г / мл). VLP-собранные антигены, расположенные главным образом в 8-9-й части 1 мл, соответствующие ок. 1,2 г / мл плотности CsCl. После диализа концентрация цезия упала до 0,7 мкг / мл, как анализировали ICP MS. Конечное содержание S- и M-HBsAg составляло соответственно 1,693 и 0,727 мкг / мл по сравнению с 0,1-0,7 мкг / мл, достигнутым ранее с использованием градиента сахарозы (Pniewski 2014), а затем примерно в 5 раз концентрировалось с использованием фильтрующих колонок Amicon® Ultra (Millipore).

Препараты, содержащие 0,3 (прайминг) или 0,1 мкг (усиление) VLP S- и M-HBsAg или эквивалентный объем контрольного препарата, адъювантировали с 10% об. / Об. Альгидрогелем (Sigma) в общем объеме 100 мкл PBS и вводили мышам (5 на группу) путем внутримышечной инъекции на дни 0 и 28. Всего антитела против HBs в сыворотке мышей анализировали три раза с использованием аналитического набора Monolisa ™ Anti-HBs PLUS Assay (BioRad). Изотипы IgG анализировали с помощью собственных ELISA-тестов с использованием S-HBsAg и соответствующих IgG1, IgG2a и IgG2b mAb-mAb (Meidian Life Science) в качестве стандартов, а затем HRP-конъюгированных козьего поликлональных антител, специфичных для конкретных изотипов Ig (Rockland). Анти-preS2-антитела в сыворотке анализировали с помощью теста ELISA собственного сендвича с использованием анти-preS2 mAb (Meridian Life Science), 1-25 aa preS2-фрагмент (американский пептид) и козьего антимышиного IgGAM (Sigma), а затем анти- -goat HRP-конъюгированное поликлональное кроличье антитело (Sigma).

Парентерально вводимые растительные HBs-антигены вызывали значительные иммунные ответы, в то время как у контрольных мышей не наблюдалось никакой реакции. M-HBsAg проявлялся более иммуногенным, чем S-HBsAg, поскольку титры антител против HBs были значительно выше во все моменты времени после повышения до достижения 1165 мМЕ / мл по сравнению с 765 мМЕ / мл (фиг.1а). Среди подклассов IgG против HBs IgG1 был преобладающим для обоих антигенов. Хотя конечные концентрации IgG1 существенно не различались между группами, можно заметить, что M-HBsAg вызвал более сильный ответ IgG1 (28 000 против 24 000 нг / мл, соответственно), который продолжал расти, тогда как реакция на S-HBsAg, по-видимому, замедлялась вниз (рис.1b). Изотипы IgG2a и IgG2b могут быть обнаружены уже через 15 недель после форсирования, и эти ответы были значительно ниже, чем IgG1 (не показаны). Конкретные антигены индуцировали явно отличающиеся отклики (рис. 1, г, г). S-HBsAg по сравнению с M-HBsAg индуцировал значительно более высокий IgG2a, но почти в равной степени с IgG2b (отношение концентрации 1,1). Для M-HBsAg образование IgG2a против IgG2b, хотя и статистически однородное (не показано), было заметно ниже (отношение 0,4). Аналогичная тенденция наблюдалась, когда концентрация этих подклассов IgG была сопоставлена ​​с IgG1. Соотношения IgG1 / IgG2a и IgG1 / IgG2b для S-HBsAg составили 31 и 38 соответственно, тогда как наоборот для M-HBsAg это были 70 и 31, что отражает более интенсивное продуцирование IgG2b-антител. Гуморальный ответ против домена preS2 наблюдался только у мышей, доставленных M-HBsAg, с титрами от 1: 100 до 1: 400, тогда как все мыши, иммунизированные S-HBsAg, были отрицательными (фиг.1е). ЯМР-ответа антител против HBs (a-d) и анти-preS2 (e), вызванных сыворотками мышей после внутримышечной инъекции S-HBsAg (серых кругов), полученных из растений, или M-HBsAg (черные круги) и контрольного экстракта из табак дикого типа (белые круги). Мышей иммунизировали (стрелки) эквивалентными дозами антигена в день 0 (праймирование 0,3 мкг) и через 4 недели (повышение — 0,1 мкг). Антитела против HBs: общий Ig (mIU / ml), b IgG1 (нг / мл), c IgG2a (нг / мл), d IgG2b (нг / мл); сравнение ответов, сделанных отдельно для общих подклассов Ig и IgG, с использованием ANOVA для повторных измерений с постсоветским тестом Дункана (Statistica 8.0), буквенные индексы указывают однородные группы при p = 0,05; уровни антител, рассчитанные для каждой группы в виде арифметических средств (n = 5) со стандартными отклонениями (SD) из трех анализов на основе стандартной кривой для общего Ig или каждого подкласса IgG. Антитела против preS2 (e) анализировали на 15 недель после повышения и выражали в виде титра, рассчитывали путем сравнения разведения сыворотки с средними показателями среза (абсорбция при длине волны 450 нм) плюс три стандартных отклонения контрольных мышей ; примечание: данные для разведений из диапазона 25 600-102 400 не показаны, из-за значений OD450, идентичных этим для разбавления 12 800

В этом исследовании мы охарактеризовали основные свойства иммунного ответа, индуцированные растительным S- и M-HBsAg, полученные внутримышечно. Эти выявленные антитела против HBs в несколько раз выше, чем титр, которые считаются порогом высокой чувствительности (100 мМЕ / мл) и сравнимо с коммерческими вакцинами, например. Engerix B® вводили мышам в дозе 0,5-2,0 мкг. Здесь ответы вызывались в несколько раз меньшими дозами антигена (0,1-0,3 мкг) и без специального применения (например, адъювантом Фрейнда или повышением с помощью коммерческой вакцины), но они дали результаты, сопоставимые или выше, чем сообщалось ранее (см. Pniewski 2014 для обзора ). Мы также впервые показали, что парентерально доставленный растительный M-HBsAg вызвал также специфические антитела против preS2. Домен preS2, помимо его врожденной иммуногенности, вероятно, усиливал реакцию, вызванную только S-доменом. M-HBsAg индуцирует общее количество антител против HBs более эффективно, чем S-HBsAg, подобно коммерческим вакцинам, например. Био-Нер-B ™. Более того, поскольку изотипы IgG отражают иммунные ответы Th1 и Th2, результаты показывают, что хотя ответ Th2 был основным компонентом иммунного ответа для обоих растительных антигенов, M-HBsAg был способен индуцировать Th1-поляризацию в несколько большей степени.

Заводские S- и M-HBsAg требуют дальнейших исследований по очистке и гликозилированию растительного образца из-за его возможного воздействия на иммуногенность (Ward et al., 2014). Также другие детали вызванного иммунного ответа, например, изменения в популяции лимфоцитов. Однако наши данные соответствуют наблюдениям, ранее сообщаемым для вакцин, полученных из CHO, содержащих M-HBsAg, и по сравнению с данными, основанными на S-HBsAg (Madaliński et al., 2002, Krawczyk et al., 2014, Shouval et al., 2015). Следовательно, полученные результаты подтверждают эффективность очищенных растительных S- и M-HBsAg в качестве самодостаточных инъекционных вакцин или используются в схемах смешанной парентерально-пероральной иммунизации.

OFS, JK и TP задумали и разработали исследование. OFS проводили большинство экспериментов с помощью экспериментов по иммунизации JK-мыши, анализа MC-антител и генерации ТП-растительного материала. MK и TP провели статистический анализ. OFS, MC и TP написал статью.

Это исследование было поддержано грантом № PBZ / MNiSW / 07/2006/15 и № N302 / 157837 от Министерства науки и высшего образования.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *