Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Иммуногенность 20 пептидов, представляющих эпитопы ядра гепатита В и поверхностных антигенов с помощью ответа IFN-γ в хроническом и разрешенном HBV

Immunogenicity of twenty peptides representing epitopes of the hepatitis B core and surface antigens by IFN-γ response in chronic and resolved HBV
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4630833/

Пациенты с хронической инфекцией вируса гепатита В (CHB) обычно устанавливают умеренный ответ Т-клеток против эпитопов HBV. Для определения иммуногенных эпитопов HBV, распознаваемых HBV-специфическими Т-клетками, в предыдущих исследованиях основное внимание уделялось ранее подтвержденным эпитопам HBV и оценивали ответ Т-клеток на количество Т-клеток, специфичных для HBV, по ELISPOT IFN-γ.

Мы изучили функциональность Т-клеток, объединив в силиконовые методы прогнозирования HBV-специфических эпитопов и экспериментальные исследования по распознаванию этих эпитопов. В исследование были включены 30 хронических пациентов с ХГБ и 10 пациентов с разрешенным ВГВ (RHB). Мы идентифицировали эпитопы из литературы и в силиконовом анализе. Они были оценены на предмет иммуногенности с использованием синтетических пептидов, представляющих эпитопы, путем воздействия РВМС у пациентов с CHB или RHB с помощью IFN-γ ELISPOT. Было зарегистрировано количество клеток, продуцирующих IFN-γ (SFC), средний размер пятна (MSS) и индекс стимуляции (SI).

Частота HBV-специфических Т-клеток, продуцирующих IFN-γ после стимуляции эпитопами HBV, была одинаковой у пациентов с CHB и RHB. У пациентов, получавших CHB, была более высокая MSS SI, чем у пациентов с RHB. Пациенты, не несущие генотип HLA-A2, имели более высокие SFC SI и MSS SI. Пациенты с HLA-A11 имели более высокий уровень MSS SI по сравнению с пациентами с аллелями не-HLA-A11. HBeAg-положительные пациенты имели более низкий MSS SI, и ни у одного из положительных пациентов с HBeAg не было генотипа HLA-A11. Мы обнаружили 3 иммуногенных эпитопа, не описанных ранее.

IFN-γ ELISPOT-определенный MSS является эффективным маркером для распознавания T-клеток эпитопов. Эта экспериментальная мера показала, что в силиконовом анализе прогнозирование эпитопа является ценным инструментом в будущих исследованиях генотипов HLA и эпитопов HBV. Таким образом, наше исследование теперь указывает на ранее недооцененные последствия переноса аллели HLA-A11 с точки зрения более сильного иммунитета к HBV.

Вирус гепатита B (HBV) является причиной спектра острых заболеваний, включая фатальный гепатоцеллюлярный некроз. Более 350 миллионов человек страдают хронической инфекцией HBV, что приводит к примерно 1 миллиону смертей в год от связанных с этим заболеваний, цирроза печени и рака [1]. Несколько линий доказательств указывают на то, что инфекция HBV вызывает подавление иммунного ответа на вирусные компоненты в результате как вирусного тропизма, так и высвобождения антигена.

У пациентов с хронической HBV-инфекцией HBV-специфичные Т-клетки выходят в печень, но представляют собой лишь скромный антивирусный ответ [2, 3]. Напротив, пациенты с острой, самоограниченной ВГВ-инфекцией обычно проводят энергичный поликлональный ответ CTL, нацеленный на множественные эпитопы HBV [4] и с достаточной долговечностью, которые можно обнаружить через несколько лет после заражения [5, 6]. Здесь мы показываем, что это заключение не всегда убедительно для пациентов с разрешенным ВГВ более двух лет назад.

В рамках исследований для понимания иммунного ответа на инфекцию HBV важная часть усилий была сосредоточена на выявлении высокоиммуногенных эпитопов CTL. Один подход включает в себя силиконовые предсказания по константе диссоциации (KD) для связывания пептидов, полученных из антигена, с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), которые обычно сопровождаются экспериментальным тестированием CTL-ответа на эти пептиды или экспериментально тестируемой способностью молекул HLA к связывают эти пептиды. В ряде исследований сообщалось, что связывание между молекулами HLA и антигенными пептидами, характеризующимися KD <500 нМ, по-видимому, позволяет ответы CTL [7]. Однако другие исследования показывают, что эффекты антигенных эпитопов не всегда коррелируют с аффинностью эпитопсодержащего пептида к HLA [8, 9]. Предыдущие исследования оценивали иммунный ответ на инфекцию HBV путем тестирования ранее подтвержденных эпитопов HBV и оценивали реакцию Т-клеток путем определения частоты реактивных Т-клеток, как правило, с помощью анализа IFN-γ с иммуноферментным пятном (ELISPOT). Из таких исследований было высказано предположение, что частоты антигенспецифических ЦТЛ не могут быть основным детерминантом иммуно-опосредованной защиты при хроническом гепатите В, и иммунотерапевтические подходы не направлены только на повышение частоты Т-клеток, специфичных к ВГВ. Действительно, функциональность Т-клеток, такая как способность продуцировать цитокины, также может быть важными параметрами [10]. Однако корреляция между аффинностью HLA к эпитопсодержащим пептидам и продуцированием цитокинов Т-клеток, как оценивается ELISPOT, не была всесторонне изучена в контексте хронической инфекции HBV.

Здесь мы объединяем в силиконовые методы для прогнозирования HBV-специфических CTL-эпитопов и сравниваем их с ответом Т-клеток in vitro. Сравнивая клетки пациентов с хронической инфекцией HBV (CHB) и пациентов с разрешенной инфекцией HBV (RHB), мы показываем, что расчеты были эффективными при прогнозировании иммуногенных эпитопов, распознаваемых Т-клетками у пациентов с ХГБ. Действительно, функциональность Т-клеток, рассчитанная по количеству продуцируемого IFN-γ, была увеличена у пациентов с ХГБ с генотипом HLA-A11.

Исследовательская популяция состояла из пациентов с CHB, то есть положительного статуса HBsAg более шести месяцев, затем в больнице Орхусского университета и бывших пациентов с RHB, ранее наблюдавшихся в больнице Орхусского университета. Диагноз острого ВГВ был основан на клинических и биохимических доказательствах острой травмы печени в соответствии со стандартными диагностическими критериями острой инфекции HBV, то есть повышенными ферментами печени, положительными HBsAg и IgM-антителами против HBcAg [11] и рассмотрены в [12]. Письменное согласие было получено от каждого участника, включая согласие на публикацию всей личной информации, содержащейся в Таблице 3. Исследование было одобрено Комитетами Центральной комиссии Дании по этике исследований в области здравоохранения, ref. номер M-40-12 и номер журнала Национального агентства по защите данных 2012-41-0028.

HBsAg, HBeAg, анти-HBe, анти-HBc, анти-HBs, HIV Ag / Ab и анти-HCV были определены коммерчески доступными хемилюминесцентными анализами в системе Architect (Architect, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA). Уровни ДНК HBV определяли количественно с помощью коммерческого анализа гибридизации.

РВМС были выделены из 50 мл свежей цельной крови в 6 × 8 мл пробирках для приготовления клеток, предварительно заполненных 1 мл 0,1 М цитрата натрия и 3 г полиэфирного геля, 2,0 мл раствора FICOLL ™ Hypaque ™ (BD Vacutainer® CPT ™). Гранулу ресуспендировали в RPMI-1640 с 20% (об. / Об.) FCS и 10% (об. / Об.) ДМСО и замораживали в жидком азоте.

Набор HLA класса I высокого разрешения был выполнен с использованием метода ввода на основе последовательности с использованием шаблонов последовательности ПЦР, выполненных на обеих цепочках. Последовательные ДНК-шаблоны были получены с помощью локус-и групповых амплификаций, которые включают экзоны 2 и 3, которые содержат сайты распознавания антигена. Класс I, секвенирующий праймеры, где общие амплификации для всех локусов в областях интрона / экзона и в общей сложности 40 локусов и групповых праймеров использовались для амплификации целевых последовательностей (HistoGenetics LLC, Ossining, NY, USA).

Опубликованные отчеты о остром и хроническом HBV-пациенте и ответ на различные эпитопы HBV были изучены и сопоставлены с прогнозами NetMHC версии 3.2 эпитопов 8-мерного типа с использованием аппроксимации искусственных нейронных сетей (www.cbs.dtu.dk/services/) [6, 8 , 9, 13-19]. Компьютерные прогнозы были сделаны по генотипам I класса HLA-A11, HLA-A24 и HLA-A2, поскольку эти генотипы охватывали большинство наших пациентов. Поверхностные последовательности сильно различаются между различными генотипами и подтипами HBV [20], и мы наблюдали однократные и двойные вариации вычетов между опубликованными последовательностями и последовательностями, найденными в базе данных компьютерного алгоритма. По этой причине мы не смогли напрямую сравнить результаты опубликованных отчетов с компьютерными прогнозами. Компьютерные предсказанные эпитопы были разработаны путем сопоставления различных подтипов HLA и генотипов HBV исследуемой популяции. Согласно классификациям, сделанным ранее [21], константа диссоциации KD <50 нМ предсказала сильное связывание, слабое связывание 50-500 нМ, а KD> 500 нМ предсказало, по существу, отсутствие связывания. На каждом эпитопе (http://web.expasy.org/protparam/) был выполнен анализ изоэлектрической точки белка (pI) [22], длины, индекса неустойчивости [23] и алифатического индекса [24].

Двадцать HBsAg и HBcAg-эпитопов были приобретены у GL Biochem (Шанхай, Китай) с чистотой> 95%, как оценивается по масс-спектрометрии. Мы использовали HLA-класс I-ограниченных Т-клеточных эпитопов из цитомегаловируса человека, вируса Эпштейна Барра и вируса гриппа (CEF) для позитивного контроля (CTL-Europe GmbH, Германия).

Анализы на иммуноферментный иммунофермент (ELISPOT) проводили с использованием 20 различных пептидов, высеваемых в отдельных лунках. Вкратце, 96-луночные планшеты (Multiscreen-IP; Millipore S.A.S., Molsheim, France) были покрыты в течение ночи при 4 ° С 100 мкл / лунок-захват мышиным человеческим IFN-γ-моноклональным антителом (диагностика AH, Орхус, Дания). Планшеты дважды промывали буфером для покрытий ELISPOT и блокировали бесконтактной средой CTL в течение 1-2 часов при комнатной температуре (CTL-Europe GmbH, Германия). РВМС (3 × 105 / лунку) оттаивали и суспендировали в бесконтактных средах, не содержащих сыворотку крови, затем высевали в три раза для каждого отдельного пептида. Плиты инкубировали в течение 48 ч при 37 ° С и промывали PBS и 0,05% Твин-20. В соответствии с рекомендациями производителя добавляли 100 мкл / лунку биотинилированного вторичного мышиного антитела к человеческому IFN-γ моноклональному антителу. После 2 ч инкубации при комнатной температуре планшеты четыре раза промывали PBS и 0,05% Tween-20, 100 мкл раствора Avidin-HRP добавляли в лунки и планшеты инкубировали еще 45 мин при комнатной температуре. Плиты промывали 3 раза PBS и 0,05% Tween-20 и 2 раза только PBS и добавляли 100 мкл раствора субстрата AEC (3-амино-9-этилкарбазол). Через 10-15 мин колориметрическую реакцию останавливали трижды промывкой дистиллированной водой. Плиты сушат на воздухе, и пятна подсчитывают и анализируют с использованием автоматизированного считывателя ELISPOT (CTL-Immunospot S6 Analyzer, CTL GmbH, Германия). Реакция Т-клеток оценивалась как пятнообразующие клетки (SFC) и средний размер пятна (MSS). Чтобы исключить субъективную оценку, независимо от того, был ли фон связан с фактическим ответом, мы решили использовать индекс стимуляции (СИ) для анализа, рассчитанный путем деления значения стимулированного образца на значение нестимулированного контроля. Были включены четыре неинфицированных человека (с чистой серологией HBV), чтобы исключить неспецифические данные (данные не показаны). Все пациенты энергично реагировали на положительный контроль CEF.

Статистический анализ выполнялся с использованием GraphPad Prism 6 (© 2014 GraphPad Software, Inc) и STATA / IC 13.1 (© 2014 StataCorp, LP). Непараметрические меры были проанализированы корреляцией Спирмена, тестом Манна-Уитни U, критерием Крускала-Уоллиса с коррекцией Данна для множественного сравнения, тогда как параметрические данные оценивались по T-критерию Стьюдента и одностороннему анализу дисперсии (ANOVA).

Десять экспериментально подтвержденных (EC) HBsAg и HBcAg эпитопов были выбраны из литературы, и 10 8-мерных HBsAg и HBcAg эпитопов были выбраны на основе компьютерных предсказаний (CP) связывания HLA класса I с эпитопами (таблицы 1 и 2). Среди пациентов с ХГБ 12/30 (40%) были HLA-A * 02: 01, 1/30 (3%) HLA-A * 02: 03, 1/30 (3%) HLA-A * 02: 06 и 1/30 (3%) HLA-A * 02: 17. Среди пациентов с RHB 6/10 (60%) были HLA-A * 02: 01. Мы включили один поверхностный эпитоп, протестированный среди пациентов с генотипом HLA-A * 11, и один из испытуемых среди пациентов с генотипом HLA-A * 24. Среди пациентов 5/30 (17%) пациентов с CHB и 2/10 (20%) пациентов с RHB имели HLA-A * 11 генотип, а 6/30 (20%) пациентов с CHB имели генотип HLA-A * 24. У пациентов с RHB не было генотипа HLA-A * 24. Характеристики пациентов показаны в таблице 3. Таблицы ILA класса I, ограниченные эпитопами (I)

Название и аминокислотное положение 20 эпитопов. HLA-генотип указывает, какие генотипы тестировались в предыдущих исследованиях (HBsEC1-5 и HBcEC11-15), или какие генотипы мы стратифицировали в силиконовом анализе (HBsCP6-10 и HBcCP16-20)

HBsEC HBsAg экспериментально подтвержден, компьютер HBsCP HBsAg предсказал, HBcEC HBcAg экспериментально подтвержден, компьютер HBcCP HBcAg предсказал

все подтипы

bdifferences по положению последовательностей среди генотипов HBV наблюдалось для силиконовского предсказания HBsAg

HLA-класс I ограничивал эпитопы (II)

Все K
Значения D приведены в силиконных прогнозах по прогнозам NetMHC версии 3.2 8mer. HBsEC: HBsAg экспериментально подтверждено; HBsCP: компьютер HBsAg предсказал; HBcEC: HBcAg экспериментально подтверждено; HBcCP: компьютер HBcAg предсказал. N / A: недоступно, AHB и CHB ссылаются на число респондентов в предыдущих исследованиях острого гепатита B (AHB) и пациентов с хроническим гепатитом B (CHB)

Характеристики пациента

Нормальные уровни ALT были обнаружены у всех пациентов, кроме пациентов C18 и C19, где уровни ALT повышались до 59 и 66 МЕ / мл (нормальный диапазон для женщин составлял 10-45 МЕ / мл). Ни у одного пациента не было двойного положительного или двойного отрицательного значения для HBeAg / anti-HBeAg. Медиана ДНК HBV у положительных пациентов с HBeAg составляла 81 000 МЕ / мл (2 — 400 000 МЕ / мл) и 0,019 МЕ (0-555 МЕ / мл) у отрицательных пациентов с ВГВ, статистические данные по генотипу HBV не проводились, поскольку количественная оценка невозможна у 12 из 30 пациентов. N / A: недоступно; F: женщина; M: мужчина; Поз: положительный; Neg: отрицательный

Возрастные данные пациентов с CHB и RHB были протестированы на предмет нормальности и равны SD и проанализированы t-критерием для учащихся. Между двумя группами не было обнаружено существенной разницы (разница в году: -3,16 (ДИ: -14,1-7,8), р = 0,72). Чтобы проверить, был ли ответ на эпитопы HBV пациентов с CHB зависел от возраста, этнической принадлежности и пола, дисперсионный анализ Крускала Уоллиса был проведен по каждому отдельному параметру ответа, SFC и MSS. Не было обнаружено существенной разницы в ответах среди четырех этнических групп: черный африканец (n = 2), арабский (n = 1), азиатский (n = 12) и белый европейский (n = 15), p = 0,68 для MSS, p = 0,12 для SFC. Кроме того, не было обнаружено существенных различий среди мужчин и женщин, p = 0,55 для MSS, p = 0,13 для SFC. Ранее мы сообщали, что возраст является важной детерминантой гуморальных и Т-клеточных реакций на иммунизацию поверхностным антигеном гепатита В [25], поэтому для проверки того, был ли возраст связан с ответом на эпитопы HBV, мы разделили пациентов на три группы: 23-30 лет (n = 6), 31-49 лет (n = 13) и 50-73 (n = 11). Между группами не было обнаружено существенных различий в ответе, p = 0,15 для MSS, p = 0,45 для SFC. Из-за ограниченного числа пациентов в группе RHB статистическая мощность была недостаточно сильной, чтобы сделать субанализ.

Число HBV-специфичных Т-клеток, продуцирующих IFN-γ после стимуляции эпитопами HBV, было сходным у пациентов с CHB и RHB. Кроме того, у хронических пациентов неожиданно был значительно более высокий MSS SI (рис.1). Сравнение площади под кривой (AUC) на основе профилей ответов SFC и SFC x MSS показало, что разница в профилях ответов достигла статистической значимости при сравнении SFC x MSS area (p <0,0001). При расслоении анализа пациентов с генотипом HLA-A2 и не-HLA-A2 группа не-HLA-A2 была обнаружена со значительно более высоким SI SFC и MSS, результаты были еще более отчетливыми, когда только пациенты CHB были включены в анализ, MSS: p <0,0001, SFC: p = 0,0099 (фиг.2). Анализ AUC подтвердил, что профиль ответа существенно отличается. Анализируя SI-стратификацию для различных генотипов HLA, только пациенты с HLA-A11 имели значительно более высокий SI MSS (фиг.3). Анализ AUC пациентов с CHB с генотипом HLA-A11 по сравнению с пациентами с RHB с генотипом HLA-11 и CHB с генотипом HLA-A2, соответственно, показал статистическую значимость в профиле ответа SFC x MSS (p <0,0001). Кроме того, у пациентов с положительной реакцией HBeAg, у всех с более высокой вирусной нагрузкой, была значительно ниже SI MSS, и ни у одного из положительных пациентов с HBeAg не было генотипа HLA-A11 (фиг.4). Результаты 1ELISPOT хронических и разрешенных пациентов с ВГВ. Индекс стимуляции (SI) для пациентов с CHB и RHB. Каждый datapoint представляет собой средний ответ на каждый отдельный эпитоп. Никакой разницы, где обнаружено в частоте пятнообразующих клеток. У пациентов с ХГБ было значительно более высокое количество продукции IFN-γ. Непарный двухсторонний t-тест с равными SD, N = 10 пациентов с RHB, N = 30 CHB, **** указывает p <0,0001. b AUC показало, что разница в профилях ответов достигла статистической значимости при сравнении SFC x MSS area, теста множественных сравнений Dunn, R; разрешено, C; хронический, **** Указывает p <0,0001. c Изображение из анализа данных пациента с RHB и CHB. Большой круг указывает на подсчитанную область. Маленькие круги указывают подсчитанные пятна

Результаты ELISPOT хронических пациентов с HLA-A2. индекс стимуляции (SI) для пациентов с CHB, разделенных на две группы: пациенты с генотипом HLA-A2 и пациенты без генотипа HLA-A2. Каждый datapoint представляет собой средний ответ на каждый отдельный эпитоп. У пациентов без генотипа HLA-A2 было значительно более высокое количество продукции IFN-γ. Если мы включили пациентов с RHB в анализ, результаты были все еще значительными. Непарный двухсторонний t-тест с равным SD, N = 15 в каждой группе, **** указывает p <0,0001, ** указывает p = 0,0099. b AUC показало, что разница в профилях ответов достигла статистической значимости при сравнении SFC x MSS area, критерия множественных сравнений Kruskal-Wallis (Dunn's), *** указывает p = 0,0009. c Число точек коррелировано с размером пятна. Значительной корреляции не обнаружено

Результаты ELISPOT пациентов HLA-A11 и не-HLA-A11. Индекс стимуляции (SI) для пациентов, разделенных на 5 групп. Каждый datapoint представляет собой средний ответ на каждый отдельный эпитоп. У пациентов с ХБЛ с HLA-A11 было значительно больше SI MSS по сравнению со всеми другими группами. При анализе пятнообразующих клеток не было никакого значения; R: разрешено; C: хронический. Непарный односторонний анализ ANOVA, Kruskal-Wallis (Dunn’s), сравнительный тест Non HLA-A11 (R) (N = 8), HLA-A11 (R) (N = 2), HLA-A2 (C) (N = 15), другой HLA (C) (N = 10), **** обозначает p <0,0001, верхняя линия: 95% ДИ разницы (-2,8, -1,9), средняя линия: 95% ДИ (-2,7; 1,8), нижняя линия: 95% ДИ (-2,4, -1,6), **: 95% ДИ (1,1; 1,9). b AUC показало, что разница в профилях ответов достигла статистической значимости при сравнении SFC x MSS area, критерия множественных сравнений Kruskal-Wallis (Dunn's), **** показывает p <0,0001

Результаты ELISPOT положительных и отрицательных пациентов HBeAg. индекс стимуляции (SI) для пациентов с CHB, разделенных на HBeAg положительный и отрицательный HBeAg. Каждый datapoint представляет собой средний ответ на каждый отдельный эпитоп. У пациентов с CHB с отрицательным HBeAg было достоверно более высокое значение SI MSS по сравнению с HBeAg-положительными пациентами, и наоборот, было обнаружено количество пятнообразующих клеток, непарный двухсторонний t-тест с одинаковым SD, отрицательным HBeAg (N = 24), HBeAg положительным ( N = 6), **** обозначает p <0,0001, *** означает p = 0,0009. b AUC не достигла статистически значимой разницы в критериях множественных сравнений Kruskal-Wallis (Dunn's)

Чтобы определить, было ли количество пятен коррелировано с размером пятна, например. частота НВВ-специфических Т-клеток пропорциональна функциональности, мы соотносили SFC и MSS во всех разных группах. Используя корреляцию спирмена, никакого значения не обнаружено, но тенденция к корреляции была обнаружена во всех группах (данные, показанные для хронических пациентов с генотипом HLA-A2 на фиг.2c).

Мы сравнили эпитопы из литературы (экспериментально подтвержденные, EC, эпитопы 1-5 и 11-15) с компьютерными предсказаниями эпитопов (CP, эпитопы 6-10 и 16-20), чтобы оценить способность компьютерного алгоритма определять эпитопы HBV , Мы сравнили SI в 4 группах: хронический и разрешенный генотип HBV, HLA-A2 и генотип HLA-A2, HLA-A11, HLA-A2 и другие генотипы HLA, отрицательные HBeAg и HBeAg. Мы проанализировали эпитопы HBsAg и HBcAg вместе и отдельно, соответственно, и не обнаружили существенной разницы в реакции на эпитопы, экспериментально подтвержденной по сравнению с прогнозируемым компьютером эпитопов.

Анализ параметров белка включал изоэлектрическую точку, длину, индекс неустойчивости и алифатический индекс и выполнялся для каждого эпитопа. Мы проанализировали параметры в 4 группах: эпитоп HBsAg 1-5 EC, эпитоп HBsAg 6-10 CP, эпитоп HBcAg 11-15 EC и эпитоп HBcAg 16-20 CP. Не найдено корреляции между различными параметрами и СИ (данные не показаны). Нет существенной разницы между группами (данные не показаны).

Мы оценили способность отдельных эпитопов вызывать специфический ответ Т-клеток на количество продуцируемого IFN-γ. MSS SI широко варьировалась внутри групп. Мы обнаружили, что 6 эпитопов обычно вызывали более высокий уровень СИ во всех группах (таблица 4). Три эпитопа были уже экспериментально подтверждены (EC-1, -4 и -11) и три эпитопа, в которых предсказано компьютер (CP-7, -9 и -17). Оценка таблеток 4Epitope

Оценка основана на индексе стимуляции среднего размера пятна. HBsEC: HBsAg экспериментально подтверждено; HBsCP: компьютер HBsAg предсказал; HBcEC: HBcAg экспериментально подтверждено; HBcCP: компьютер HBcAg предсказал

Основываясь на результатах нескольких прошлых исследований, мы предположили, что более сильный ответ IFN-γ будет производиться в РВМС у разрешенных пациентов с ВГВ по сравнению с РВМС у пациентов с хроническим гепатитом В при стимуляции 20 отдельными эпитопами HBV и количественном определении ответа IFN-γ на количество пятнообразующих единиц и количества произведенного IFN-γ. Неожиданно было обнаружено, что Т-клетки у пациентов с СНБ распознают аналогичное количество CTL-эпитопов по сравнению с Т-клетками у пациентов с RHB. Мы наблюдали относительно беспрепятственный ответ цитокинов с более высокими уровнями IFN-γ у пациентов с ХГБ, у пациентов без генотипа HLA-A2, пациентов с генотипом HLA-A11, и мы обнаружили более низкие уровни продукции IFN-γ у пациентов с высокой вирусной нагрузкой ( HBeAg положительный). Эти результаты свидетельствуют о том, что нарушение иммунного ответа в CHB происходит не только из-за нарушения производства IFN-γ. Действительно, IFN-γ остается важным компонентом общего иммунного ответа, требуемого для борьбы с инфекцией HBV. Отметим, что в нашем исследовании средний индекс стимуляции не превышал 6, что все еще указывает на низкую продукцию IFN-γ. Поскольку большинство эпитопов были разработаны для того, чтобы дать сильный ответ у пациентов с генотипом HLA-A2 с небольшой разницей между подтипами HLA-A * 02, и поскольку мы обнаружили более сильный ответ у пациентов с HLA-A11, это может указывать на то, что HLA- A11 является защитным. Ни один из пациентов не был как HLA-A11, так и HBeAg положительным, и это поддерживает HBeAg как фактор вирулентности и что контроль над HBV более сложный, чем способность T-клеток только для производства IFN-γ [26]. В других исследованиях сообщается, что количество цитокинов, секретируемых отдельными антигенспецифическими Т-клетками, а не различия в частотах, было фактором, ответственным за иммунные дефициты у пациентов с ВИЧ-инфекцией [27]. Никакие исследования не сообщили о корреляции между MSS и SFC при инфекции HBV. Большинство исследований по HBV сосредоточены на SFC в качестве параметра первичного ответа [28-30]. Одно исследование вакцинации против туберкулеза у приматов, отличных от человека, показало, что размер пятна в сочетании с числом пятен является ключом к определению защитного иммунного ответа [31]. Мы не обнаружили корреляции между SFC и MSS соответственно, но где можно описать аналогичные результаты в отношении SFC в сочетании с MSS.

Три экспериментально подтвержденных (EC) эпитопа с наивысшим уровнем SI (эпитоп 11, являющийся HBcAg 18-27, который ранее был описан как высокоиммуногенный [10, 32, 33]), коррелировал с наблюдениями предыдущих исследований. Три новых предсказанных компьютера (CP) эпитопа HBsCP-7, HBsCP-9 с предсказанными KD <50 и HBcCP-17 с предсказанным KD> 500, могут быть изучены в будущих исследованиях. Неожиданно мы наблюдали высокий уровень SI при стимуляции HBsCP-17, несмотря на высокое значение KD, и это говорит о том, что индуцирующий CTL эффект антигенного пептида не всегда коррелирует с компьютерным оценочным значением KD [8, 9]. Однако наши результаты показывают, что программное обеспечение предсказывает новые эпитопы, а также подтверждает ранее описанные эпитопы.

Клеточная среда печени предлагает возможности для иммунного уклонения, что может частично объяснить, почему иммунный ответ на HBV часто не проходит в печени. Означает ли это, что HBV является хорошо адаптированным патогеном — или это предвзятая среда Th2 в печени, которая допускает путь к хроническому состоянию? Печень является важным сайтом для активации Т-клеток, однако окружающая среда смещена в сторону индукции толерантности. Частично это связано с продолжающимся синтезом IL-10 клетками, которые конститутивно подвергаются воздействию следов эндотоксина и других микробных продуктов [34]. Кроме того, структура печени позволяет открытому доступу наивных Т-клеток к различным подмножествам антигенпредставляющих клеток (БТР). В результате образование Т-клеток памяти в этой ткани отсутствует, поскольку праймирование CD8 + Т-клеток происходит без сопутствующей активации CD4 + Т-клеток [35]. Кроме того, в печени большинство БТР экспрессируют PD-L1, обеспечивая способность к инактивации Т-клеток. Эти механизмы могут быть ключевым фактором иммунотолерантности при хроническом ВГВ в соответствии с нашими и результатами исследований другими, это говорит о том, что производство IFN-γ не является одним из основных компонентов в клиренсе HBV. Предыдущие исследования обнаружили длительный ответ Т-клеток только после острой инфекции [5, 6]. Однако наши выводы свидетельствуют о том, что эти наблюдения следует интерпретировать с осторожностью. Память CD8 + Т-клеток можно разделить на два подмножества, а именно центральный (TCM) и эффектор (TEM), которые преимущественно находятся в лимфатическом узле и в кровообращении соответственно. Тем не менее, их индивидуальная способность защищать иммунитет не уточняется. В одном из исследований было установлено, что TCM более эффективны в обеспечении защитного иммунитета, приводящего к антигенному разминированию, и что TEM превращается в TCM в пути дифференцировки линии. Кроме того, эти результаты показывают, что долгосрочная сохранность Т-клеток памяти в основном представлена ​​в виде TCM и что через 400 дней после инфицирования 95% всех Т-клеток были CCR7hi [36]. Это может объяснить наш низкий ответ среди разрешенных пациентов с ВГВ, поскольку кровь была взята с периферии, и все доноры были инфицированы более 2 лет назад. В последнее время Loggi et al. обнаружили, что общая ширина и величина специфических Т-клеточных ответов HBV в ELISPOT IFN-γ существенно не различались между группами пациентов с CHB и RHB [29] в соответствии с нашими результатами.

Мы обнаружили доказательства того, что статус HBeAg и HLA-типа повлияли на количество продукции IFN-γ. Передача сигналов IL-7 имеет важное значение для пролиферации и функции CD8 + Т-клеток [37], а стойкая вирусная антигенная нагрузка подавляет экспрессию CD127, то есть α-цепь на рецепторе IL-7 на загрунтованных Т-клетках. Исследования показали, что CD127 отрицательно коррелирует с сывороткой ДНК HBV и уровнем HBeAg при хроническом HBV [38]. В дополнение к нарушенной экспрессии CD127 у истощенных HBV-специфичных Т-клеток в печени наблюдалось увеличение экспрессии PD-1 [39]. В нескольких исследованиях показано, что путь PD-1 / PD-L1 способствует подавлению специфичной к HBV функции Т-клеток, и секреция IFN-γ быстро подавляется, несмотря на продолжающееся присутствие антигенов. Эта потеря функции совпадает с повышающей регуляцией PD-1 [40]. Теперь сообщаем, что более высокая вирусная нагрузка у положительных пациентов с HBeAg повлияла на количество Т-клеток, специфичных для HBV. Однако, несмотря на большее количество SFC, количество продуцируемого IFN-γ было нарушено по сравнению с пациентами, отрицательными для HBeAg. Это говорит о том, что подмножество T-клеток IFN-γ может быть инактивировано или истощено связью PD-1 и регуляцией CD127, тогда как способность T-клеток регистрироваться и связываться с антигеном частично поддерживается.

На сегодняшний день ни один аллель класса HLA I не был подтвержден как защитный или фактор риска CHB. Однако многие предложения были сделаны [41, 42], и, действительно, наши результаты подтверждают некоторые из этих предыдущих исследований. Производство IFN-γ было значительно выше у пациентов с ХГБ с генотипом HLA-A11 по сравнению с другими группами и с самыми высокими уровнями СИ, наблюдаемыми среди всех тестируемых групп (рис.3а). Ранее сообщалось, что HLA-A11 может способствовать развитию естественного иммунитета против HBV [43], а HLA-A11 являются одними из наиболее распространенных генотипов ответчиков на вакцину HBsAg [44].

В заключение, наше исследование предполагает, что средний размер пятна IFN-γ является важным дополнительным маркером для специфичности Т-клеток, обеспечивая измерение количества IFN-γ, когда Т-клетки не могут получить ответ, рассчитанный по количеству конкретных Т-клеток. Было обнаружено, что это показание повышает дискриминационную способность анализа ELISPOT и дает дополнительную информацию о профиле ответа IFN-γ у пациентов с CHB и RHB. Кроме того, мы показали, что предсказания компьютерной программы NetMHC версии 3.2 8mer с использованием искусственной нейронной сети могут быть ценным инструментом в будущих исследованиях генотипов HLA и эпитопов HBV. Следовательно, мы обнаружили 3 иммуногенных эпитопа, не описанных ранее. Наконец, в нашем исследовании подчеркивается роль аллеля HLA-A11 в инфекциях HBV с потенциальным последствием как для приобретения заболевания, так и для обеспечения защитного иммунитета путем вакцинации.

Вирусная инфекция гепатита В

Интерлейкин 10

Запрограммированный клеточный лиганд смерти 1

Цитотоксические Т-лимфоциты

Постоянная диссоциации

Крупный комплекс гистосовместимости

Интерферон гамма

Фермент-связанное иммуносорбентное пятно

Хроническая инфекция вируса гепатита В

Решенная инфекция вируса гепатита В

С-антиген вируса гепатита В

С-антиген вируса гепатита В

Вирус иммунодефицита человека

Инфекция вируса гепатита C

Э-антиген вируса гепатита В

Антитела против HBeAg

Антитела против HBcAg

Антитела против HBsAg

Энзим-связанный иммуносорбентный анализ

Вирус дезоксирибонуклеиновой кислоты вируса гепатита В

Периферические кровяные мононуклеарные клетки крови

Фосфатный буферный раствор

Фетальная сыворотка теленка

Диметилсульфоксид

Полимеразной цепной реакции

3-амино-9-этилкарбазол

Пятнообразующая ячейка (ячейка продуцирования IFN-y)

Средний размер пятна

Индекс стимуляции

Анализ разницы

Экспериментально подтверждено

Компьютерные прогнозы

Площадь под кривой

Антиген, представляющий клетки

Центральные ячейки памяти T

Тэги памяти с эффекторной памятью

C-C хемокин Тип рецептора 7

Интерлейкин 7

альфа-цепь рецептора IL-7

Конкурирующий интерес

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

Нанна-Софи Бринк-Дженсен (NSBJ), Томас Форуп-Дженсен (TVJ), Питер Кристиан Дерек Лютчер (PCDL), Кристиан Эриферап (CE), Эскильд Петерсен (EP). NSBJ, TVJ и EP были главами концепции исследования и дизайна. NSBJ и PCDL приобрели все данные пациентов и образцы крови. CE отвечал за приобретение и интерпретацию HLA. NSBJ проводил все иммунологические анализы. NSBJ TVJ и CE провели весь анализ и интерпретацию данных. NSBJ и TVJ составили рукопись. TVJ, CE и EP сделали критический пересмотр рукописи для важного интеллектуального контента. NSBJ, TVJ и CE провели статистический анализ. ПХДЛ и СЕ отвечали за административную, техническую и материальную поддержку. TVJ и EP были генеральными наблюдателями. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Информация для авторов

NSBJ является аспирантом, обучающимся в Орхусском университете. Она уже более 5 лет является частью исследовательской группы по гепатиту B и занимается исследованиями, связанными с HBV в Орхусе, Херлеве, Пекине и Ливерпуле, изучая различные методы и навыки.

TVJ является профессором кафедры биомедицины Орхусского университета с особыми обязанностями в области биофизической иммунологии. Он возглавляет аспирантуру аспиранта по биомедицине в Орхусском университете.

PCDL — врач, доктор философии, в Отделе инфекционных заболеваний Орхусского университета. Он возглавляет проект InfCare Hepatitis DK, базу данных качества в режиме реального времени для пациентов с хроническим HBV.

CE является главным врачом и доцентом кафедры клинической иммунологии больницы Орхусского университета. Он возглавляет тестирование на ВИЧ и гепатит в Центральной Дании, Дания.

EP — профессор кафедры инфекционных болезней Орхусского университета, многолетний опыт работы в области инфекционных заболеваний, тропических болезней и иммунологических исследований. Он является главным редактором международного экспертного журнала International Journal of Infectious Diseases.

Авторы выражают благодарность Беттине Винтер Грумсен за отличную техническую помощь, за консультацию Карину А. Розенберг, за консультацию и Фонд Карен Элиз Дженсен, Фонд А.П. Моллера, Фонд Элсе и Могенса Ведель-Ведельсборгса, Фонд Хеде Нильсена и Ааз и Эйнер Даниэльсенс Фонд финансовой поддержки. Источники финансирования не участвовали в проведении исследований или подготовке статей и не потеряли финансовой выгоды от публикации этой рукописи.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *