Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Кролики SPF, инфицированные вирусом гепатита E, зараженным вирусом гепатита, экспериментально показывают хроничность гепатита

SPF Rabbits Infected with Rabbit Hepatitis E Virus Isolate Experimentally Showing the Chronicity of Hepatitis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4061063/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: JH LingW. Провели эксперименты: JH. Проанализированы данные: JH YL LL PL JX YZ H. Zeng LinW. LingW. Х. Чжуан. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: LingW. Вклад в рукопись: JH.

В этом исследовании основное внимание было уделено исследованию патогенеза, наблюдаемого у кроликов, не содержащих патогенных (SPF), после заражения гомологичным изолятом HEV кроликов (CHN-BJ-rb14) и сопоставлением его с наблюдаемым после заражения гетерологичным изолятом HEOT генотипа 4 свиньи ( CHN-XJ-SW13). Три из четырех животных, инокулированных гомологичным кроличьим гепатитом, заразились, проявляя прерывистую виремию, очевидные колебания биомаркеров функции печени аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) и пролиферацию вируса фекалий в течение девятимесячного исследования. Кроме того, гистопатология печени показала как хроническое воспаление, так и некоторую степень фиброза. Как положительная, так и отрицательная цепная экспрессия HEV РНК и HEV-антигена были обнаружены в печени, головном мозге, желудке, двенадцатиперстной кишке и почках у некропольных кроликов. Наблюдалось также воспаление внепеченочной ткани (двенадцатиперстной кишки и почки). Три из четырех кроликов, инокулированных гетерологичным генотипом 4, также заразились вирусом гепатита 4, показав сходные уровни антител против HEV, которые были получены после заражения гомологичным вирусным изолятом. Продолжительность как виремии, так и фекальной пролиферации вируса была, однако, короче после заражения гетерологичным вирусом и не было значительного повышения биомаркеров функции печени. Эти результаты свидетельствуют о том, что инфекция HEV кролика может вызвать более тяжелый гепатит и продлить течение заболевания, с возможной хронической тенденцией гепатита у кроликов SPF.

Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все данные включены в документ.

Вирус гепатита E (HEV), причина гепатита E, по-видимому, передается преимущественно фекально-оральным путем. Как и вирус гепатита А, с которым он обладает рядом молекулярных характеристик, изначально предполагалось, что HEV вызвал только острое самоограниченное заболевание [1]. Тем не менее, в последние годы было показано, что инфекция HEV может приводить к хроническому гепатиту у лиц с иммунной системой, таких как пациенты с трансплантацией органов (SOT) [2], ВИЧ-положительные пациенты [3] и пациенты с лейкемией, получающие химиотерапия [4]. Смертность, связанная с инфекцией HEV, обычно низкая (<1%), но она может достигать 25-30% у инфицированных беременных женщин [5].

HEV представляет собой незараженный вирус с положительным смысловым одноцепочечным РНК-геномом размером приблизительно 7,2 кб, в котором вместо 5′-кодирующей области следуют три частично перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF) и полиаденилированные 3 ‘ -кодирующей области. Это единственный член семейства Hepeviridae [6]. Четыре генотипа HEV были признаны на сегодняшний день. Генотипы 1 и 2 ограничены людьми, чаще всего встречаются в развивающихся странах Азии, Африки и Южной Америки [7] и, по-видимому, передаются главным образом через загрязненную воду. Генотипы 3 и 4 имеют более расширенный диапазон хозяев, который включает людей, свиней и других млекопитающих, и они ответственны за спорадические случаи заболевания как в развивающихся, так и в промышленно развитых странах либо путем прямого контакта с инфицированными животными, либо путем потребления зараженного мяса животных и внутренних органов [8].

Первый нечеловеческий штамм HEV был выделен из свиньи в Соединенных Штатах в 1997 году и, следовательно, был обозначен как HV H свинья [9]. Вирус был изолирован от различных видов животных, включая цыплят, оленей, мангустов, лисиц, хорьков, крыс, летучих мышей, кабанов и форели [10] — [18]. В 2009 году новое ХЭВ было изолировано от фермерских кроликов в Китае [19]. У штаммов HEV кроликов, изолированных на сегодняшний день, 73-77%, 70-76%, 75-82%, 71-77% идентичны генотипам 1, 2, 3, 4 соответственно на уровне нуклеотидов и идентичности 53-65% к птичьим изолятам HEV [20]. Филогенетически изоляторы изолятов кроликов наиболее тесно связаны с генотипом 3 [21], [22], хотя некоторые предположили, что они представляют новый генотип [19], [23]. Было показано, что в экспериментальных условиях кроличье HEV может давать кросс-видовые инфекции у обезьян и свиней [24], [25]. Было также показано, что изоляты свиней HEV могут заражать кроликов [26], указывая на то, что кролики могут служить в качестве модели для животных с низким уровнем приматов для заражения HEV. Однако профиль патогенеза инфекции HEV у кроликов не был четко определен. Поэтому целью этого исследования было исследование патогенеза HEV кроликов в его естественном хозяине и сравнение его с данными, полученными изолятом HEV генотипа 4 свиньи.

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по охране здоровья и этике лабораторных животных, Научным центром здравоохранения Пекинского университета. Это исследование проводилось в строгом соответствии с Принципами лабораторного ухода за животными (публикация NIH № 85Y23, пересмотренная в 1996 году).

Штамм HEV кроликов CHN-BJ-rb14 (JQ768461), использованный в этом исследовании, был извлечен из образца фекалий кролика [24]. Использовали штамм HEN свиньи CHN-XJ-SW13 (GU119961) из фекальных образцов свиньи, взятых в Синьцзяне, Китай [27]. Образцы фекалий разбавляли в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, pH 7,4), чтобы получить суспензию 10% (мас. / Об.), Осветляли центрифугированием при 5000 об / мин при 4 ° С в течение 30 мин и последовательно фильтровали через 0,45 мкМ и 0,22 мкМ фильтры. Полученные суспензии хранили при -80 ° С. Титрами используемой инокуляции CHN-BJ-rb14 и CHN-XJ-SW13 были скорректированы 104 эквивалента генома (ГЭ) на миллилитр (мл), как определено полуколичественной вложенной ПЦР обратной транскрипции (RT-nPCR) [20].

3-месячные белые новорожденные SPF Новой Зеландии (2-2,50 кг) были получены в Отделе лабораторной животноводческой отрасли Пекинского университета здравоохранения. Перед инфицированием HEV все животные были протестированы на АЛТ и АСТ, чтобы установить исходный уровень и были подтверждены отрицательными для антител против HEV с помощью иммуноферментного анализа на основе фермента (ELISA) и отрицательного для РНК HEV в фекалии / сыворотке с помощью RT- nPCR.

Десять кроликов SPF были распределены случайным образом на 3 группы. Группа 1 состояла из двух кроликов (C1 и C2), которые инокулировали внутривенно (в / в) 1 мл стерильного PBS в качестве отрицательных контролей. Группа 2 состояла из четырех кроликов (R1, R2, R3 и R4), и они были инокулированы i.v. с 1 м L кроличьего HEV (штамм CHN-BJ-rb14). Группа 3 состояла из четырех кроликов (S1, S2, S3 и S4), которые были инокулированы i.v. первоначально с 1 мл генотипа 4 свиней HEV (штамм CHN-XJ-SW13). После их выздоровления от этой начальной инфекции они были инокулированы i.v. при 25 wpi с 1 мл HEV кролика (штамм CHN-BJ-rb14). Каждое животное размещалось в отдельной клетке и разрешало доступ к пище и питьевой воде ad libitum.

Образцы сыворотки и фекалий собирали через недельные интервалы после инокуляции (wpi) и хранили при -80 ° C. Образцы сыворотки тестировали на уровни антител ALT, AST и анти-HEV, используя стандартные методы [24]. Образцы сыворотки и фекалий тестировали еженедельно для РНК HEV с помощью nRT-PCR [24]. Кроме того, желчь и ряд различных типов тканей и органов, включая печень, мозг, желудок, двенадцатиперстную кишку, почки, легкие, мочевой пузырь и селезенку, были собраны либо у животных, которые погибли в результате несчастных случаев в ходе исследования, тех, кто подвергся эвтаназии. Один кролик R1 умер в результате несчастных случаев в ходе исследования, и девять кроликов (C1-C2, R2-R4, S1-S4) выжили до эвтаназии. Примерно 100 мг собранной ткани или органов гомогенизировали в 1 мл реагента TRIzol (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) и осветляли центрифугированием при 12000 об / мин в течение 15 мин при 4 ° C. Супернатанты этого центрифугирования собирали и хранили при -80 ° С на более позднем этапе с помощью nRT-PCR. Образцы тканей и органов также обрабатывали для гистопатологии и иммуногистохимии, сначала фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине сразу после отбора проб. Для предотвращения перекрестного загрязнения во время вскрытия для каждого образца использовались индивидуально упакованные, стерильные одноразовые материалы и новые стерильные лезвия скальпеля. Органы, содержащие экскременты (фекалии и желчь), которые могут содержать высокие титры HEV, отбирались в последний раз, чтобы уменьшить вероятность перекрестного заражения.

Образцы тканей и органов фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине, вставляли в парафин и разрезали на 5 мкМ серийных секций. Слайды окрашивали гематоксилином и эозином (H & E) и трихромом Массона. Образцы фотографировались и анализировались с помощью микроскопа (Olympus CX31, Япония), оснащенного цифровой камерой с помощью программного обеспечения Motic Images Plus 2.0.

Для иммуногистохимии секции тканей и органов депарафинизировали, гидратировали, водяную баню нагревали для извлечения антигена и блокировали добавлением 3% перекиси водорода. Затем срезы инкубировали в течение ночи с разбавлением 1:20 моноклонального антитела (антитело против антитела против мыши генотипа 1 человека HEF’S, Wantai, Biopharmaceutical, Beijing, China), промывали PBS и окрашивали для визуализации с использованием двухступенчатой ​​плюс Poly-HRP В соответствии с инструкциями поставщика, система обнаружения IgG Anti-Mouse / Rabbits (PV-9000, K123307E, ZSGB) в сочетании с субстратом DAB (ZLI-9018, K125905A, ZSGB).

Все кролики контролировали еженедельно в течение 36 недель после заражения вирусом. Концентрации ALT и AST в сыворотке измеряли в день сбора с использованием стандартных методов на спектрофотометре SmartSpec 3000 (BioRad, CA) [24]. Считалось, что животные страдают от гепатита, когда концентрация ALT в сыворотке превышает более чем двукратный уровень ALT перед заражением [28].

Все образцы сыворотки были протестированы на антитела против HEV, используя коммерческий специфический ELISA-анализ с использованием сандвича, основанный на белке E2 генотипа генотипа 1 HEV (аминокислоты 394-606 HEV ORF2) в соответствии с инструкциями производителя (Wantai, Biopharmaceutical, Beijing , Китай). Были рассчитаны значения выборки / отсечки (S / CO), а значения> 1 считались положительными [29].

РНК HEV экстрагировали из 100 мкл образцов сыворотки / фекалий или из 500 мкл супернатантов тканевых гомогенатов с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) в соответствии с инструкциями. RT-nPCR для обнаружения положительной / отрицательной цельной гена HEV проводили, как описано ранее [24]. Использовались два набора специфических внешних и внутренних праймерных пар для частичных фрагментов ORF1 (129-373 nt) и ORF2 (5 983-6 349 нт) [24]. Отрицательные и положительные контрольные показатели были включены во все анализы. Выделение РНК и другие стадии амплификации до ПЦР проводили в отдельной чистой комнате, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Конечные ампликоны анализировали 1% (мас. / Об.) Агарозным гель-электрофорезом и визуализировали окрашиванием этидиумбромидом [24]. Выбранные ампликоны положительной / отрицательной цельной гена HEV были секвенированы для подтверждения специфической вирусной инокуляции, используемой для инфекций животных.

Профиль инфекции HEV у кролика контролировали с помощью анализа двух специфических ферментов печени, ALT и AST; через обнаружение РНК HEV в фекалиях и за счет уровня антител против HEV в сыворотке. До прививки вирусом все кролики были отрицательными для антител против HEV и HEV РНК в образцах сыворотки / фекалий и имели нормальные уровни ALT и AST (данные не показаны).

Контрольные кролики C1 и C2 были отрицательными для антител против HEV, фекальной / сывороточной РНК HEV и имели нормальные уровни ALT и AST во время всего исследования (фиг.1A, таблица 1).

(A) Кролик C1 в группе 1, инокулированный стерильным PBS. (B) Кролик R1 в группе 2, инокулированный штаммом HEV кролика. (C) Кролик R3 в группе 2 1, инфицированный штаммом HEV кролика. (D) Кролик S2 в группе 3, инокулированный генотипом 4 свиноматки HEV при 0wpi, и HEV кролика при 25wpi. (E) Кролик S4 в группе 3, инокулированный генотипом 4-го поколения HEV при 0wpi, и HEV кролика при 25wpi. Примечание: ↑ указывает, что кролики кроликов 3 были заражены штаммом HEV кролика при 25wpi (при восстановлении после первоначальной инфекции).

Инокулируют стерильным PBS (отрицательные контрольные образцы).

Инокулировали штаммом HEV кролика CHN-BJ-rb14 (JQ768461) (экспериментальная группа).

Инокулировали штаммом HEV генотипа 4 свиней HEN CHN-XJ-SW13 (GU119961) при 0wpi и при 25wpi (при восстановлении от первоначальной инфекции), инокулированным штаммом HEV кроликов CHN-BJ-rb14 (JQ768461) (экспериментальная группа).

N Никакие образцы не собирались из-за случайной смерти или не были вскрыты.

Однако интересный и неожиданный результат наблюдался у кроликов в группе 2, инокулированных кроличьим гепатитом. Во-первых, персистирующая фекальная пролиферация ХЭВ-РНК была обнаружена у всех кроликов группы 2 от 1 до 39 сПи или до конца этого исследования (длятся в течение 9 месяцев). В этой группе пиковые уровни ALT были как минимум в 3-4 раза выше, чем исходные значения, а пиковые уровни АСТ были увеличены примерно в 2 раза выше базовых уровней. Сосредоточив внимание на одном из животных (R3) в этой группе, он сероконвертировался для антител против HEV при 5 wpi, а значения S / CO подскочили до пикового значения 22 при 6 wpi и после этого поддерживались на уровне 18-20. У этого животного пиковые уровни ALT достигали 114 U / L при 5wpi, а также наблюдалось резкое повышение AST (148 U / L при 5 wpi) до более чем в 8 раз выше базового значения 17 U / L , Хотя фекальная пролиферация вируса была обнаружена в R3 на протяжении всего периода после инфицирования, виремия проявлялась только в течение 11-13 wpi и 20-30 wpi (рис.1C, таблица 1). Другие животные в этой группе показали сходный профиль болезни с R3, за исключением того, что положительная сероконверсия была обнаружена только при 22-25 сПи для R1, а значения S / CO были только слабо положительными в пределах от 1,072 до 1,266 (фиг. 1B, таблица 1).

В отличие от группы 2, животные в группе 3 не показали никаких очевидных возвышений для АЛТ и АСТ после инокуляции инокулированным свиным HEV. Кролик S4 в этой группе сероконвертировался для антител против HEV при 5 wpi, при этом значения S / CO анти-HEV прыгали до пикового значения 22 при 6 wpi и поддерживались на 18-20 после (рис.1E, таблица 1 ). Стойкая экскреция фекальной HEV-РНК была обнаружена у животного S4 от 2 wpi до 16 wpi, но не была обнаружена после этого до 25 wpi. Все кролики в этой группе инокулировали кроличьим HEV при 25 сП. После этой второй проблемы с вирусом фекальная РНК HEV была обнаружена только один раз при 26 wpi (рис.1E, таблица 1). Другие животные в этой группе имели сходный профиль заболевания, за исключением кролика S2, который оставался серонегативным для антител против HEV до 4 недель после второй инокуляции вирусом с помощью кроликов HEV при 25 wpi. После сероконверсии этого животного значения S / CO достигали максимума в 20 и поддерживались на этом уровне в течение 6 недель до конца исследования. (Фиг.1D, таблица 1).

Никаких грубых гистопатологических поражений, гистопатологического хронического воспаления или антигенов HEV не наблюдалось в участках печени групп контрольной группы (группа 1) (фиг.2А, 2Е и 2Н). Гистопатология, проведенная на животных из группы 2, также не выявила серьезных гистопатологических поражений, но наблюдались хронические воспалительные клеточные инфильтрации (фиг.2В и 2С) и портальный фиброз (рис. 2D, 2F и 2G). Кроме того, антигены HEV наблюдались в участках печени всех животных из групп 2 и 3 (фиг.21).

(A) Секция печени от контрольного кролика без видимых патологических признаков инфекции HEV. (B) — (C) Лимфоциты распределены фокальными или рассеянными в печеночной доле, воспалительные клетки, собранные вдоль стен кровеносных сосудов. (D) Хронические воспалительные клетки проникают в область портала, утолщение стенок кровеносных сосудов, связанных с фиброзом, локальная гиалиновая дегенерация. (E) Никакие гистопатологические изменения с минимальным окрашиванием ограничены областями, непосредственно примыкающими к портальным структурам. (F) утолщение стенки артерии, связанное с фиброзом средней и тяжелой степени. (G) Более продвинутый портал и перипортальный фиброз с короткими волокнистыми перегородками. (H) Отрицательный результат иммуногистохимии для антигена HEV в секциях печени у контрольных кроликов. (I) Положительные результаты для антигена HEV в участках печени экспериментальных групп.

Положительная и отрицательная цепь HEV РНК, указывающая на активную репликацию вируса, была обнаружена в ряде внепеченочных тканей (мозг, желудок, двенадцатиперстная кишка, почка, желчь, легкие и мочевой пузырь), взятые у животных, зараженных группой 2. Положительное окрашивание антигенов HEV, наблюдаемое при проведении окрашивания IHC разделов головного мозга, желудка, двенадцатиперстной кишки и почек, сделанных из зараженных животных группы 2, служило подтверждением доказательности внепеченочной репликации вируса (фиг.3B, 3C, 3D и 3E). Экстрахепатические участки ткани, полученные из животных контрольной группы (группа 1), были, как ожидалось, отрицательными для экспрессии антигена HEV (фиг.3А, 3F и 3H). Интересно, что гистологическое окрашивание как тканей двенадцатиперстной кишки, так и тканей почек у животных, инфицированных HEV (группа 2), показало четкое свидетельство инфильтрации воспалительными клетками (рис. 3G и 3I).

(A) Отрицательный результат иммуногистохимии для антигена HEV в внепеченочных участках ткани у контрольных кроликов. (B) — (E) Положительные результаты для антигена HEV в головном мозге, желудке, двенадцатиперстной кишке и почках. (F) участок дуоденума от контрольного кролика без видимых патологических признаков воспаления. (G) Большое количество лимфоцитов проникает в слизистые интерстициальные фокусные фолликулы фолликулов, образованные в отделах двенадцатиперстной кишки. (H) Секция почки от контрольного кролика без видимых патологических признаков инфекции HEV. (I) Мультифокальные лимфоциты и мононуклеарные клетки проникают в почечный интерстициальный.

HEV — известный патоген, классически связанный с острым вирусным гепатитом [1]. Однако ряд недавних исследований показали, что заражение генотипом 3 HEV может привести к развитию хронического гепатита у пациентов с ослабленным иммунитетом [2] — [4]. Инфекция HEV также была связана с рядом внепеченочных состояний, в том числе с участием в неврологических симптомах [30]. Эта ассоциация HEV с рядом патологий болезни [31] — [33], связанная с явной необходимостью создания приемлемой модели небольшого животного для этого патогена с растущей медицинской значимостью, стимулировала исследования патогенеза HEV. Были предыдущие исследования, в которых предполагалось, что кролики могут быть возможной малой моделью животных для заражения HEV [26], [34], но ни одна из них не сосредоточилась на определении патогенного профиля вируса. Наиболее интересным результатом, полученным в текущем исследовании, посвященным этому аспекту биологии HEV, было то, что заражение кроликов SPF, используемых с гомологичным изолятом HEV кролика, приводит в некоторых случаях к развитию хронического гепатита и связанного с ним фиброза печени. Интересно, что эту хроническую патологию болезни не наблюдали, когда кролики были инфицированы гетерологичным генотипом 4 свиней HEV. Хроническая инфекция HEV была определена ранее как наличие постоянно повышенных уровней фермента печени и детектируемой РНК HEV в сыворотке и / или табурете в течение по меньшей мере 6 месяцев [35], и в этом исследовании кролики, засеянные кроличьим HEV, соответствовали этому определение с персистирующим фекальным пролитием и повышенными ферментами печени проявляется уже более шести месяцев после заражения. Обнаружение как положительного, так и отрицательного целенаправленного антигена HEV и HEV в головном мозге, желудке, двенадцатиперстной кишке и почке вместе с гистопатологическими изменениями, наблюдаемыми в двенадцатиперстной кишке и почках инфицированных HEV животных, повышает вероятность того, что репликация вируса в внепеченочных тканях могут быть ответственны за некоторые клинические симптомы, о которых сообщалось. Кроме того, обнаружение репликации HEV в ткани головного мозга с помощью ПЦР и иммуногистохимии дает некоторые основанные на доказательствах объяснения неврологических признаков и симптомов, которые были связаны с инфекцией HEV [36]. Это также указывает на то, что клиницисты должны рассмотреть возможность заражения HEV у пациентов с неврологическими нарушениями неизвестной этиологии.

Однако механизм этого хронического тренда, вызванного кроличьим гепатитом, был неясным. Сообщенные хронические инфекции HEV имели место главным образом у пациентов с ослабленным иммунитетом и были вызваны генотипом 3 HEV [2] — [4]. Недавно сообщалось о случаях хронического гепатита Е у пациентов с иммунокомпетентностью [37], [38]. Является ли острая вирусная инфекция развитой до хронического курса или не в основном зависит от обоих факторов вируса и хозяина. Для интерпретации хронической инфекции кроличьей HEV мы полагали, что филогенетически геном HEV кролика наиболее тесно связан с генотипом изолятов HEV генотипа 3, который, как полагают, связан с развитием хронического гепатита [2] — [4], [ 37], [38]. Кроме того, у кроличьего гепатита было введено 31 aa в области X ORF1 (929-959 aa) [20]. Неясны ли вставки, ведущие к хроническому тренду, и нуждаются в дальнейшем изучении. Кроме того, длительный период в девять месяцев наблюдался стойкий выпадение фекального вируса вместе с высоким титром анти-HEV-антителом для кроликов 2-й группы во время развития болезни. Этот результат противоречил предыдущему исследованию, что нейтрализующее антитело против HEV может нейтрализовать HEV, и поэтому вирус следует очистить с помощью антител против HEV с высоким титром [39]. В новом докладе говорилось, что «незараженный» вирус HEV в крови может выводить мембраны хозяина, поэтому может уйти от нейтрализующих антител к HEV [40]. Это может быть еще одним фактором, ответственным за хроническую инфекцию HEV.

Таким образом, это исследование предоставило первое экспериментальное доказательство того, что кролики SPF, экспериментально инфицированные гомологичным изолятом HEV кролика, развивают признаки хронического гепатита. Учитывая растущую медицинскую важность инфекций HEV и их связь с хронической симптоматикой в ​​некоторых группах пациентов, основные механизмы, ответственные за хроническую картину патогенеза, наблюдаемую в этом исследовании, заслуживают дальнейшего изучения.

Мы благодарны профессору Малкольму А. МакКрей из Университета Уорик, Великобритания за корректуру рукописи.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *