Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Помощь CD4 + T-Cell необходима для эффективного разрешения CD8 + T-клеток, вызванного острым вирусным гепатитом у мышей

CD4+ T-Cell Help Is Required for Effective CD8+ T Cell-Mediated Resolution of Acute Viral Hepatitis in Mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3897723/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: TT CW JH. Выполнены эксперименты: TT J-HK AC TL DS. Проанализированы данные: TT J-HK AC KR TL DS H-WM AWL AO CW JH. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: KR TL H-WM AO. Написал газету: TT TL H-WM AWL AO JH.

Цитотоксические CD8 + Т-клетки необходимы для борьбы с вирусными инфекциями печени, такими как HBV или HCV. Не совсем ясно, нужна ли помощь CD4 + Т-клеток для установления антивирусных ответов CD8 + Т-клеток, которые успешно контролируют инфекцию печени. Чтобы рассмотреть роль CD4 + Т-клеток при остром вирусном гепатите, мы заразили мышей вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) штамма WE; LCMV-WE вызывает острый гепатит у мышей и очищается от печени CD8 + Т-клетками в течение примерно двух недель. Роль CD4 + Т-клеточной помощи изучалась у лимфопенных мышей CD4 + T-клеток, которые либо были вызваны генетическим дефицитом трансактиватора основной степени гистосовместимости (MHC) II класса (CIITA) у мышей CIITA — / — или опосредованными антителами CD4 + истощение клеток. Мы обнаружили, что у CD4 + T-клеток-лимфопенных мышей развилась затяжная вирусная инфекция печени, что, по-видимому, было следствием снижения специфических к вирусу CD8 + Т-клеток в печени. Кроме того, у мышей CIITA — / — были нарушены антивирусные эффекторные функции инфильтрирующих печень CD8 + Т-клеток в ответ на стимуляцию пептидом LCMV, особенно с образованием IFN-γ и дегрануляционной способностью. Нарушенная функция CD8 + Т-клеток у мышей CIITA — / — не была связана с повышенной экспрессией маркера выноса PD-1. Наши данные показывают, что помощь CD4 + Т-клеток необходима для установления эффективного противовирусного ответа CD8 + Т-клеток в печени при острой вирусной инфекции. Недостаточный контроль вируса и длительный вирусный гепатит могут быть следствием нарушения первоначальной помощи CD4 + Т-клеток.

Вирусные инфекции печени являются основной причиной болезней и смертей во всем мире. В частности, вирусный гепатит, ведущий к хроническому заболеванию у сотен миллионов людей, является одной из наиболее распространенных причин цирроза печени и рака печени [1]. После заражения вирусами гепатита некоторые люди могут очистить инфекцию, тогда как другие остаются инфицированными и проявляют хроническое воспаление печени [2] — [5]. Способность очищать вирусную инфекцию печени определяется как вирусными, так и факторами хозяина, но адаптивный антивирусный иммунный ответ считается наиболее важным детерминантом [2] — [6]. Действительно, пациенты, которые спонтанно очищают инфекцию во время острого гепатита, проявляют энергичный и поликлональный ответ Т-клеток, тогда как хронически инфицированные пациенты, по-видимому, имеют задержанные, временные или пациклинные ответы Т-клеток [6].

Широко признано, что CD8 + Т-клетки являются основными эффекторными клетками, которые опосредуют вирусный клиренс из печени путем удаления инфицированных клеток; роль CD4 + Т-клеток в вирусном гепатите менее ясна [6] — [8]. С одной стороны, рецидив инфекции HCV после первоначального контроля был связан с потерей антивирусного ответа CD4 + Т-клеток [9]. Более того, повторное заражение шимпанзе, которое очистило предыдущую вирусную инфекцию, плохо контролировалось в отсутствие функционального ответа CD4 + Т-клеток [10], [11]. Кроме того, в нескольких исследованиях (см. [6]) показана связь между широким первоначальным антивирусным ответом CD4 + Т-клеток и вирусным разминированием. Однако, с другой стороны, истощение CD4 + T-клеток на ранней стадии инфекции HBV не влияло на продолжительность и исход острой инфекции HBV в исследовании шимпанзе [12]. Более того, недавние данные показывают, что раннее присутствие широкого анти-HCV CD4 + Т-клеточного ответа не определяет, очищается ли HCV или сохраняется [13]. Кроме того, по крайней мере, при некоторых вирусных инфекциях IFN I типа может стимулировать антивирусные CD8 + Т-клеточные ответы вне зависимости от помощи CD4 + Т-клеток [14]. Таким образом, роль CD4 + Т-клеток в ранней фазе вирусной инфекции печени еще предстоит выяснить.

Для решения этой проблемы в контролируемом исследовании мы использовали модель мышиного вирусного гепатита, вызванную заражением вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) штамма WE. Инфекция высоким содержанием инокулюма (106 ФФУ) LCMV-WE вызывает острый гепатит [15], [16]; вирус обычно очищается мышами дикого типа в течение примерно двух недель. LCMV-гепатит является полезной моделью для инфицирования вирусом гепатита человека, поскольку LCMV-WE, аналогичный вирусам гепатита человека, вызывает нецитопатию, при которой повреждение печени опосредуется почти полностью антивирусным иммунным ответом [16] , Также при заражении LCMV CD8 + Т-клетки необходимы для элиминации вируса [17], [18]. Считается, что CD4 + Т-клетки необходимы для поддержания CD8 + Т-клеточных ответов, тем самым предотвращая истощение Т-клеток CD8 + и хроническую инфекцию LCMV [19], [20]. Действительно, введение CD4 + T-клеток может восстановить уже исчерпанный ответ CD8 + Т-клеток [21]. Однако CD4 + Т-клетки, по-видимому, не требуются для инициирования ответа CD8 + Т-клеток на LCMV и контроля острой инфекции LCMV [22] — [24].

Чтобы изучить роль CD4 + Т-клеток в LCMV-индуцированном гепатите, мы сравнили результат заражения LCMV у мышей дикого типа C57BL / 6, которые имеют нормальные числа лимфоцитов CD4 +, что и у мышей C57BL / 6 CD4 + T-клеток лимфопены. CD4 + Т-клеточно-лимфопения либо индуцировалась опосредованным анти-CD4-клеточным истощением клеток, либо генетическим дефицитом трансактиватора класса II (CIITA) основной гистосовместимости (MIC) у мышей CIITA — / — [25]. CIITA является основным регулятором экспрессии MHC класса II в периферических тканях [25]. У мышей CIITA — / — CD4 + Т-клетки развиваются, но не расширяются, так как они не стимулируются надлежащим образом на периферии [25]. Мы демонстрируем, что CD4 + T-клеточно-лимфопенные мыши проявляют пролонгированную LCMV-инфекцию печени по сравнению с мышами с CD4 + Т-клетками. Кроме того, CD4 + T-клеточно-лимфопенные мыши проявили значительно уменьшенное количество инфильтрационных пептидов цитотоксических CD8 + Т-клеток. В частности, количество функциональных LCMV-специфичных CD8 + эффекторных Т-клеток было значительно снижено в печени лимфоцитов CD4 + T-клеток. Снижение антивирусных функций CD8 + T-клеток не связано с повышенными маркерами истощения в печени. Эти данные показывают, что помощь CD4 + Т-клеток необходима для установления эффективного контроля над вирусом с помощью CD8 + Т-клеток в печени при острой инфекции LCMV.

Мышей C57BL / 6 и мышей CIITA — / — на фоне C57BL / 6 разводили и выдерживали в особых условиях без патогенов на объектах животноводства Медицинского центра Университета Гамбург-Эппендорф. Мышей-самцов использовали в возрасте от 8 до 15 недель; LCMV-инфекция проводилась на животноводческих объектах Института имени Генриха-Петте, Лейбницского института экспериментальной вирусологии, Гамбург. Все работы на животных проводились в соответствии с соответствующими национальными и международными руководящими принципами; эксперименты на животных были одобрены комиссией по обзору штата Гамбург, Германия (номер разрешения 96/06 и 102/10). LCMV-WE был первоначально предоставлен профессором Р. М. Зинкернагелем (Университетская больница, Цюрих, Швейцария) и распространен на мышиных фибробластах L929 (DSMZ-№ ACC-2). Мыши инфицировали внутривенно 106 FFU вируса, как определено модифицированным протоколом ранее описанного Фокусирующего анализа [26]. Здесь окрашивание фокусов проводилось с помощью набора DAKO Envision Kit.

Мышиные печень были заморожены и полная РНК была выделена с использованием набора NucleoSpin TriPrep Kit (Macherey-Nagel). 1 мкг РНК использовали для обратной транскрипции с использованием набора синтеза AMV First-Strand (Roche). Количественную ПЦР в реальном времени для Z-белка LCMV проводили с кДНК 0,05 мкг транскрибируемой РНК и LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche). Для нормализации по методу ΔCt применяли анализ прайтидилпролила изомеразы А (PPIA) Primer Assay (Qiagen) [27]. Все ПЦР выполняли в двух экземплярах с последовательностями праймеров LCMV_Z_fwd (5′-CAGACACCACCTATCTTGG-3 ‘) и LCMV_Z_rev (3′-ACCTTCAGTTTGGTTGGC-5’). Альтернативно, TaqMan-зонды для хемокинов CXCL9 (Mm 00434946_m1), CXCL10 (Mm 00445235_m1) или CXCL11 (Mm 00444662_m1) использовали в TaqMan PCR (Life Technologies).

CD4 + Т-клеточное антитело (GK1.5) и антитело контрольного антитела IgG2b крысы IgT-2 (LTF-2) были получены от BioXCell. В дни -3, -2 и -1 до заражения LCMV 0,3 мг антитела вводили внутрибрюшинно в мышей дикого типа C57BL / 6; а затем инъекции антител два раза в неделю после заражения вирусом.

Противовирусные иммунные ответы анализировали в селезенке и печени инфицированных мышей. После механической диссекции селезенки спленоциты подвергали ACK-лизису. После перфузии с PBS печень была механически расчленена и мононуклеарные клетки печени были получены путем выделения на градиенте плотности. С этой целью клетки печени помещали в слой 5 мл 30% Percoll (GE Healthcare), покрывали на слой 3 мл 70% перколла и подвергали центрифугированию при 524 г в течение 20 мин при 20 ° С.

Окрашивание мертвых клеток проводили с использованием Тихоокеанского оранжевого сукцинимидилового эфира, соли триэтиламмония (Life Technologies) в PBS. Иммунофлуоресцентное окрашивание поверхности Т-клеток проводили в 2% BSA с антителами, конъюгированными с флуорохромом, с CD4, CD8, CD44, CD107a, PD-1 или IFN-γ (все из BioLegend) или с декстрамами, специфичными для иммунодоминанта H-2Db, ограниченным gp33-41 (KAVYNFATC) LCMV пептид (Immudex). Окрашенные клетки фиксировали в течение ночи в 1% PFA в PBS. Для окрашивания CD107a или внутриклеточного IFN-γ клетки стимулировали в течение 4 часов иммермоминантным gp33-41 (KAVYNFATC) LCMV-пептидом (3 мкг / мл) в присутствии 1 мкл / мл Golgi-Plug (IFN-γ) или 0,65 мкл / мл Golgi-Stop (CD107a) (как из BD Bioscience) в среде Panserin 401 (PAN Biotec), дополненной 1% пенициллином / стрептомицином и 0,5 × 104 М β-меркаптоэтанолом. Для внутриклеточного окрашивания IFN-γ клетки затем перфорировали в буфере, содержащем 2% BSA / 0,5% сапонина и окрашивали антителом против IFN-γ. Цитометрию протока проводили цитометром LSR II, и данные анализировали с помощью программного обеспечения FACSDiva 6.0 (как BD Bioscience).

Замороженные секции печени блокировали 1% BSA, 5% нормальной сывороткой крысы, 1:50 Fc-Block (eBioscience) и 1:50 мышиным IgG в PBS. Окрашивание проводили в 1% BSA и 5% нормальной сыворотке крыс с CD8-PE (Abcam) и VL-4 антителом из линии клеток гибридомы, помеченной комплектом этикеток Alexa-488 (Life Technologies). Ядра клеток были окрашены Hoechst 33258 (Life Technologies). Микроскопию проводили с помощью микроскопа Keyence BZ-9000.

Статистическая значимость различий между двумя наборами данных была проверена тестом Манна-Уитни; для сравнения нескольких групп были проведены тест Крускала-Уоллиса и пост-тест Данна. Значения P <0,05 (*), <0,01 (**), <0,001 (***) считались значительными. Бары представляют медианы.

Мы сначала проанализировали мышей CIITA — / — для CD4 + и CD8 + T-клеток в селезенке и печени по сравнению с мышами C57BL / 6 дикого типа (рис. S1). Как и ожидалось, количество CD4 + Т-клеток значительно снижалось как в селезенке, так и печени мышей CIITA — / -; тем не менее, оба штамма мыши показали относительно высокое количество CD8 + Т-клеток.

Затем мы заразили мышей C57BL / 6 дикого типа и мышей CIITA — / — с LCMV-WE в дозе 106 FFU. В различные моменты времени после инфицирования (дни 4, 7, 9, 12, 15, 18, 21 и 30) мы определяли титры вируса в селезенке (рис. 1А) и печени (рис. 1В) с помощью анализа фокуса, как а также путем количественной RT-ПЦР РНК печени для белка LCMV Z (рис. 1C). Ранняя кинетика инфекции была одинаковой у обоих штаммов мыши; однако во все моменты времени, начиная с 12-го дня, мыши CIITA — / — проявляли значительно более высокую степень инфекции печени, чем мыши дикого типа. В то время как мыши дикого типа очищали инфекцию до 15-го дня, инфекция сохранялась у мышей CIITA — / — в течение как минимум 30 дней. Мы также подтвердили эти данные гистологическим окрашиванием секций печени для нуклеопротеина LCMV антителом VL4 (рисунок 1D). Во всех проанализированных точках времени у мышей CIITA — / — было больше VL4-положительных гепатоцитов, чем у мышей C57BL / 6. В соответствии с более высокой и затяжной вирусной нагрузкой мыши CIITA — / — проявляли повышенное и продолжительное повышение уровня ALT в сыворотке по сравнению с мышами C57BL / 6 (рисунок 1E). Таким образом, численное нарушение CD4 + Т-клеток при острой LCMV-инфекции, по-видимому, предотвращало клиренс инфекции LCMV-WE и вызывало затяжные вирусные гепатиты.

Мыши C57BL / 6 и CIITA — / — были инфицированы 106 фокус-формирующими единицами (FFU) LCMV-WE. (A) В указанные моменты времени после заражения селезенки гомогенизировали и титр вируса определяли с помощью анализа фокуса. Черные точки представляют собой средний титр мышей C57BL / 6, белые квадраты — средний титр мышей CIITA — / -. Ломаная линия представляет собой предел обнаружения. (В) В указанные моменты времени после инфицирования уровень инфекции печени определяли как в (А). (C) В указанные моменты времени после инфицирования уровень инфицирования печени определяли с помощью количественного RT-ПЦР-анализа для LCMV Z РНК. (D) Замороженные участки печени, взятые в указанные моменты времени после заражения, окрашивались для нуклеопротеина LCMV с антителом VL4 (зеленый); ядра были окрашены Hoechst 33258 (синий). (E) В указанные моменты времени после инфицирования определяли уровни ALT в сыворотке. Графированные линии представляют собой среднее значение и s.e.m.

Чтобы подтвердить, что наблюдаемое нарушение контроля над вирусом у мышей CIITA — / — действительно было вызвано CD4 + Т-клеточно-лимфопенией, а не каким-либо другим эффектом, опосредуемым дефицитом CIITA, мы заразили мышей C57BL / 6 дикого типа, которые были истощены с CD4 + Т-клеток с анти-CD4-антителом (GK1.5). В качестве контроля мышей C57BL / 6 обрабатывали контрольным антителом с изотипом. Эффективность разрушения CD4 + Т-клеток была подтверждена проточной цитометрией (рис. S2A и B). На 18-й день после заражения LCMV мы определили титры вируса в селезенке (рис. 2A) и печени (рис. 2B) с помощью анализа фокуса, а также количественной RT-PCR для белка LCMV Z (рисунок 2C). В соответствии с результатами, полученными у мышей CIITA — / -, мы обнаружили, что мыши с обедненной CD4 + Т-клеткой на 18-й день после заражения по-прежнему проявляли значительно более высокие вирусные титры в печени, тогда как контрольные животные, обработанные IgG, очищали вирус. Кроме того, у мышей с CD4 + клетками были обнаружены явные гепатиты, о чем свидетельствуют значительно повышенные уровни ALT в сыворотке (рисунок 2D). Затянувшаяся инфекция мышей с обедненными CD4 + Т-клетками была подтверждена гистологическим окрашиванием секций печени для LCMV-нуклеопротеина с антителом VL4 (фиг. 2Е), что явно демонстрирует больше окрашенных VL4 гепатоцитов у мышей с обедненными CD4 + Т-клетками. Эти данные подтвердили, что присутствие CD4 + Т-клеток во время острого гепатита LCMV требуется для эффективного контроля вируса.

Мышей C57BL / 6 обрабатывали два раза в неделю с разрушающим антителом CD4 (GK1.5) или контрольным антителом, сопоставимым с изотипом, для получения мышей с CD4-обедненной или CD4-изоляцией, которые впоследствии были инфицированы 106 FFU LCMV-WE. Все образцы были взяты на 18-й день после заражения. (A) Селезенки гомогенизировали и титр вируса определяли FFA. Каждая точка (черная: мыши C57BL / 6, белые: мыши CIITA — / -) представляет собой среднее FFU одного образца, проверенного в двух экземплярах; ломаная линия представляет собой предел обнаружения. (B) Печень гомогенизировали и скорость инфицирования определяли как в (А). (C) Частоту инфицирования печени определяли с помощью количественного RT-PCR-анализа для LCMV Z РНК. (D) Определены уровни ALT в сыворотке. (E) Замороженные участки печени окрашивали для нуклеопротеина LCMV с антителом VL4 (зеленый); ядра были окрашены Hoechst 33258 (синий).

Поскольку вирусный клиренс преимущественно опосредуется CD8 + Т-клетками, мы затем проанализировали, связана ли неспособность CD4 + T-клеток-лимфопенных мышей контролировать LCMV-инфекцию с измененными частотами CD8 + T-клеток в печени. Мы определили общее количество CD8 + Т-клеток в инфицированной селезенке и печени мышей дикого типа и CIITA — / — в ходе инфекции LCMV. На 7-й и 9-й дни после заражения LCMV числа CD8 + Т-клеток в печени были одинаково низкими как у мышей C57BL / 6, так и у мышей CIITA — / — (рис. S3). Однако на 12-й день число CD8 + Т-клеток в печени C57BL / 6 значительно увеличилось, тогда как количество CD8 + -T-клеток в печени мышей CIITA-/ — было значительно ниже (рис. 3A). На 15-й день номера CD8 + Т-клеток были одинаково низки в обоих штаммах мыши; однако в этот момент мышей C57BL / 6 дикого типа уже очистили инфекцию (рисунок 3A). Следует отметить, что дефицит CD8 + Т-клеток, по-видимому, специфичен для печени, поскольку в селезенке количество CD8 + Т-клеток увеличилось с 12-го дня до 15-го дня у обоих штаммов мыши. Мы подтвердили это обнаружение гистологическим окрашиванием CD8 + T-клеток в участках печени инфицированных мышей, демонстрируя значительно уменьшенное количество CD8 + T-клеток в CIITA — / — печени на 12-й день и одинаково низкие числа CD8 + T-клеток в дикого типа и CIITA- / — печени на 15-й день после заражения (рис. 3B). Эти данные свидетельствуют о том, что CD8 + Т-клетки либо неэффективно завербовались в инфицированную печень мышей CIITA — / -, либо не проникали в клетки CD8 + Т-клеток, пролиферирующие печень, в отсутствие CD4 + Т-клеток.

Мыши C57BL / 6 и CIITA — / — были инфицированы 106 FFU LCMV-WE. (A) На 12 или 15 день после заражения определяли количество CD8 + Т-клеток в селезенке и печени мышей C57BL / 6 и CIITA — / -. Каждая точка представляет собой абсолютное количество CD8 + Т-клеток на селезенку или печень одной отдельной мыши. (B) Замороженные участки печени, полученные на 12 или 15 день после заражения, окрашивали для CD8 T-клеток (красный); ядра были окрашены Hoechst 33258 (синий).

Поскольку набор CD8 + Т-клеток в воспаленную печень в основном зависит от хемокиновых лигандов CXCR3 CXCL9, CXCL10 и CXCL11 [28], [29], возможно, что малочисленность CD8 + T-клеток в LCMV-инфицированных печени CIITA — / — мышей из-за сокращения производства хемокинов. Поэтому мы проанализировали экспрессию этих хемокинов в печени инфицированных мышей в разные моменты времени (рис. 4A), но не обнаружили существенных различий между уровнями экспрессии CXCL9, CXCL10 или CXCL11 у мышей C57BL / 6 и мышей CIITA — / -. Таким образом, недостаточность CD8 + Т-клеток у инфицированных печени мышей CIITA — / — вряд ли объяснялась дефектами набора. Действительно, в различные моменты времени после LCMV-инфекции общее количество лейкоцитов, которые были завербованы в печени мышей CIITA — / -, было, по меньшей мере, столь же высоко, как и те, которые были набраны для печени C57BL / 6 (рисунок 4B) ,

Мыши C57BL / 6 и CIITA — / — были инфицированы 106 FFU LCMV-WE. (A) В указанные моменты времени после инфицирования экспрессию хемокиновых лигандов CXCR9 CXCR9, CXCL10 и CXCL11 в инфицированных печеньх определяли с помощью qPCR. Черные точки представляют мышей C57BL / 6, белые квадраты представляют CIITA — / — мышей. (B) В указанные моменты времени после заражения определяли количество лейкоцитов в инфицированной печени. Каждая точка представляет собой абсолютное число мононуклеарных клеток, проникающих в печень одной отдельной мыши.

Чтобы проанализировать LCMV-специфический ответ CD8 + Т-клеток, мы использовали LCMV-gp33, нагруженные H-2Db-декстрамеры для обнаружения вирус-специфических CD8 + -T-клеток с помощью проточной цитометрии; репрезентативное окрашивание декстрамера показано на рисунке S4. На 7 и 9 дни число лимфоцитов + LCMV-специфических CD8 + T-клеток было сходным в печени инфицированных мышей C57BL / 6 и мышей CIITA — / — (фиг. S5). Однако на 15-й день мы обнаружили значительно уменьшенное количество лимфоцитов + LCMV-специфичных CD8 + T-клеток в селезенке и печени мышей CIITA — / — (рисунок 5), что указывает на то, что CD4 + Т-клетки, по-видимому, необходимы для эффективного расширения или поддержания вируса -специфические CD8 + Т-клетки во время острой инфекции. Затем мы проанализировали противовирусные эффекторные функции проникающих в кровь CD8 + Т-клеток в ответ на стимуляцию иммунодоминантным LCMV-gp33-пептидом. С этой целью мы сначала окрашивали проникающие в кровь CD8 + Т-клетки для внутриклеточного IFN-γ в ответ на стимуляцию пептидом LCMV-gp33 (типичное окрашивание показано на рисунке S6). На 7 и 9 дни не было различий в ответе IFN-γ между мышами C57BL / 6 и мышами CIITA — / — (рисунок S7). Однако на 12 и 15 днях мы обнаружили, что мыши CIITA — / — проявили значительно снижение частоты печеночных IFN-γ, продуцирующих CD8 + Т-клетки в ответ на стимуляцию пептидом LCMV-gp33 (рис. 6), что соответствует выводу, что Мыши CIITA — / — имели значительно меньшее количество LCMV-специфичных CD8 + Т-клеток. Затем мы оценивали способность клеток CD8 + T дегранулировать в ответ на стимуляцию пептидом LCMV-gp33 окрашиванием для CD107a; типичное окрашивание CD107a показано на рисунке S8. На 7 и 9 дни не было различий в способности дегрануляции между мышами C57BL / 6 и мышами CIITA — / — (рис. S9). Однако с 12-го дня до дня 15 CD8 + Т-клетки у мышей C57BL / 6 показали значительно повышенную способность к дегрануляции в ответ на стимуляцию LCMV-gp33 после инфицирования (рис. 7A), что, по-видимому, соответствует увеличению с 12-го дня до 15 внутрипеченочной частоты LCMV-специфичных Т-клеток (см. Рис. 5). Напротив, у мышей CIITA — / — наблюдалось снижение количества внутрипеченочных клеток, которые могли дегранулировать как на 12 и 15 дни. Мы также оценивали способность дегрануляции LCMV-специфического декстрамера + CD8 + Т-клеток в ответ на стимуляцию LCMV- gp33 (фиг. 7B и фиг. S8) и обнаружили, что процент дегранулированных клеток среди LCMV-специфических CD8-T-клеток в печени мышей C57BL / 6 был таким же высоким на 12 и 15 дней. Напротив, процент CD107a + клеток среди внутрипеченочных LCMV-специфических декстрамеров + CD8 + Т-клеток значительно снижались у мышей CIITA — / — от 12-го дня до дня 15. Эти данные показывают, что CD4 + Т-клетки, по-видимому, поддерживают также клеточную функцию LCMV-специфических CD8 + T-клеток в печени прямо или косвенно и, таким образом, способствуют более быстрому контролю инфекции LCMV.

Мыши C57BL / 6 и CIITA — / — были инфицированы 106 FFU LCMV-WE. На 12 или 15 день после инфицирования количество специфических CD8 + Т-клеток LCMV-gp33 в селезенке и печени мышей C57BL / 6 и CIITA — / — определяли окрашиванием нагруженным LCMV-gp33-декстрамом H-2Db. Каждая точка представляет процентное содержание декстрамара + CD8 + Т-клеток среди всех CD8 + Т-клеток в селезенке или печени отдельных мышей.

Мыши C57BL / 6 и CIITA — / — были инфицированы 106 FFU LCMV-WE. На 12 или 15 день после инфицирования эффекторную функцию LCMV-специфических CD8 + Т-клеток в селезенке и печени мышей C57BL / 6 и CIITA / / определяли путем внутриклеточного окрашивания CD8 + T-клеток для IFN-γ после стимуляции LCMV- gp33. Каждая точка представляет процент IFN-γ + CD8 + Т-клеток среди всех CD8 + Т-клеток селезенки или печени отдельных мышей.

Мыши C57BL / 6 и CIITA — / — были инфицированы 106 FFU LCMV-WE. На 12 или 15 день после инфицирования дегрануляционную способность CD8 + Т-клеток (А) или LCMV-специфического декстрамера + CD8 + Т-клеток (В) в селезенке и печени в ответ на стимуляцию пептидом LCMV-gp33 определяли окрашиванием для CD107a. Каждая точка представляет процент CD107a + CD8 + Т-клеток среди всех CD8 + T-клеток (A) или CD107a + декстрамера + CD8 + Т-клеток среди всех CD8 + T-клеток (B) селезенки или печени отдельных мышей.

Для изучения того, была ли уменьшенная дегрануляционная способность LCMV-специфических CD8 + T-клеток в печени мышей CIITA — / — была следствием истощения Т-клеток, мы проанализировали экспрессию основного маркера выноса PD-1 на LCMV-специфическом CD8 + T клетки в печени на 15-й день после заражения; PD-1 считается первым маркером истощения, выраженным все более дисфункциональными CD8 + Т-клетками [30]. Однако мы не обнаружили увеличенной экспрессии PD-1 в общей внутрипеченочной популяции CD8 + T-клеток мышей CIITA — / — (фиг. 8A) или в внутрипеченочной LCMV-специфической фракции декстрамера + CD8 + Т-клеток (фиг. 8B), как при определении процент PD-1-экспрессирующих клеток среди CD8 + Т-клеток (левые панели) или как средняя интенсивность флуоресценции (MFI) на анализируемую клетку (правые панели). Таким образом, дисфункция CD8 + Т-клеток у остро инфицированных мышей CIITA — / — мышей вряд ли объяснят истощением Т-клеток.

Мыши C57BL / 6 и CIITA — / — были инфицированы 106 FFU LCMV WE. На 15-й день после заражения экспрессию маркера выдоха PD-1 на LCMV-специфических CD8 + Т-клетках в селезенке и печени определяли окрашиванием декстрамара + CD8 + Т-клеток для PD-1. (A) Каждая точка представляет процентное соотношение PD1 + декстрамара + CD8 + Т-клеток среди всех клеток декстрамера + CD8 + T селезенки или печени отдельных мышей. (B) Каждая точка представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) окрашивания PD-1 всех декстрамаров + CD8 + Т-клеток в селезенке или печени отдельных мышей.

Несмотря на то, CD4 + Т-клетки являются существенными для генерации памяти CD8 + Т-клеток [31] и устойчивого контроля вирусных инфекций, их роль в инициации адаптивного иммунного ответа на острую вирусную инфекцию является спорным [22]. Здесь мы использовали два разных метода, чтобы индуцировать CD4 + Т-клеточно-лимфопению у мышей; один по генетическому дефициту CIITA (рис. S1), другой — обработкой истощающим антителом (фиг. S2). Обе модели CD4 + T-клеток-лимфопении проявляли длительную вирусную инфекцию печени (рис. 1, 2), что указывает на то, что CD4 + Т-клетки имеют решающее значение для инициирования эффективного антивирусного иммунного ответа при остром вирусном гепатите. Недостаточность CD4 + T-клеток, по-видимому, вызывала недостаточное расширение внутрипеченочного пула Т-клеток CD8 + (фиг. 3), в первую очередь вирус-специфических CD8 + Т-клеток (фиг. 5). Наши данные не указывают на то, что отсутствие CD4 + Т-клеток вызвало неэффективное локальное расширение проникающих в кровь CD8 + Т-клеток или неэффективную рекрутировку CD8 + T-клеток к инфицированной печени; однако мы не обнаружили дефектного производства необходимых хемокинов для вербовки в инфицированную печень (рис. 4А) или общего дефекта неспецифического набора лейкоцитов (рисунок 4B). Тем не менее, было сообщено, что вербовка CD8 + Т-клеток в инфицированные ткани требует помощи CD4 + Т-клеток [32]; поэтому этот вопрос требует дальнейшего изучения. Интригующе, что уменьшенное расширение вирус-специфических CD8 + Т-клеток в печени не только вызывало глобальные нарушения антивирусных эффекторных функций, особенно производство IFN-γ [33] и дегрануляции (рис. 6, 7), но также нарушало антивирусные функциональность LCMV-специфических CD8 + Т-клеток на основе каждой клетки (рисунок 7B). Однако нарушенная функциональность вирусосодержащих CD8 + Т-клеток в печени лимфопенных мышей CD4 + T-клеток, по-видимому, не связана с повышенной экспрессией маркера выноса PD-1 (фиг. 8); PD-1 является первым маркером истощения, который выражается в прогрессирующей потере функции [31], а экспрессия связана с вирусной нагрузкой [34]. Это открытие показало, что функциональное ухудшение CD8 + Т-клеток может происходить без проявления повышающей регуляции маркеров истощения, по крайней мере, в течение временных точек, проанализированных в этом исследовании.

Наша демонстрация причинно-следственной связи между наличием CD4 + T-клеток и результатом острой вирусной инфекции печени полностью согласуется с предыдущими результатами, которые выявили связь между широким и сильным ответом Т-клеток CD4 + на вирусы гепатита и способностью очистить инфекцию [6]. Однако наши результаты, по-видимому, противоречат выводам Thimme et al. [12], которые показали, что истощение CD4 + Т-клеток не оказывает существенного влияния на клиренс инфекции HBV у шимпанзе. Мы считаем, что эти несоответствующие результаты могут быть объяснены сроками истощения CD4 + Т-клеток. Действительно, в исследовании Thimme et al. CD4 + Т-клетки были истощены на 6-й день после инокуляции HBV, когда, вероятно, уже началось первичное праймирование CD8 + T-клеток. В нашем исследовании, напротив, мыши были уже исчерпаны CD4 + Т-клетками во время инокуляции вирусом, и праймирование реакции CD8 + Т-клеток происходило в отсутствие CD4 + Т-клеток.

Как правило, считается, что CD4 + Т-клетки не требуются для контроля острых малых доз LCMV-инфекций (см. [22]), поскольку IFN типа I может заменить CD4 + T-клеточную помощь при прайминге LCMV-специфичных CD8 + T-клеток [14], [35]. Действительно, Matloubian et al. [24] ранее показали, что истощение CD4 + Т-клеток не оказывает существенного влияния на клиренс острой инфекции с LCMV штамма Armstrong, который, однако, не вызывает гепатит. Здесь, напротив, мы инфицировали мышей LCMV-WE, которые более вирулентны и, таким образом, способны индуцировать острый гепатит [15]. Таким образом, возможно, что дифференциальное требование для CD4 + T-клеток может быть связано с дифференциальной вирулентностью штаммов LCMV. Как бы то ни было, в индуцирующей гепатит инфекции LCMV-WE, которую мы здесь изучили, CD4 + Т-лимфопения, как представляется, индуцирует нарушенный внутрипеченочный CD8 + Т-клеточный ответ и нарушает внутрипеченочный контроль вируса. Действительно, это функциональное ухудшение, по-видимому, было более выраженным в печени, чем в селезенке (рис. 7), что указывает на то, что контроль над вирусом в печени в значительной степени зависит от помощи CD4 + Т-клеток.

В совокупности наши результаты указывают на актуальность CD4 + Т-клеток для борьбы с вирусом в печени, также при остром вирусном гепатите. Наши результаты показывают, что неэффективная помощь CD4 + Т-клеток может способствовать развитию острой инфекции печени в связи с хроническим вирусным гепатитом. Таким образом, терапевтические и вакцинные стратегии, направленные на усиление острого ответа на Т-клетки CD4, могут оказаться полезными для предотвращения хронизации вирусных инфекций гепатита.

Уменьшение количества CD4 + Т-клеток, но не CD8 + Т-клеток у мышей CIITA — / -. Секулярные и печеночные мононуклеарные клетки мышей дикого типа C57BL / 6 и CIITA — / — выделяли и окрашивали для CD4 + и CD8 + Т-клеток соответственно. Каждая точка представляет собой абсолютное число CD4 + или CD8 + Т-клеток на селезенку или печень отдельных мышей.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Эффективность CD4 + истощения Т-клеток обработкой анти-CD4-антителом. Мышей C57BL / 6 обрабатывали два раза в неделю истощающим анти-CD4-антителом (GK1.5) или контрольным антителом, сопоставимым с изотипом, и эффективность истощения определяли с помощью проточной цитометрии. Показаны проценты CD4 + T-клеток (окрашенных анти-CD4-антителом клона RM4-4) среди всех CD3 + T-клеток (A) и типичного окрашивания CD4 + у отдельных мышей на 18-й день инфекции (B).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Инфильтраторы печени CD8 + Т-клеток в ранней инфекции LCMV. Мыши, инфицированные LCMV C57BL / 6 или CIITA — / -, были оценены для индексов CD8 + Т-клеток с инфильтрацией печени. Каждая точка представляет собой абсолютное количество CD8 + Т-клеток на печень одной отдельной мыши на 7-й или 9-й день после LCMV-инфекции.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Анализ LCMV-специфического ответа CD8 + Т-клеток с LCMV-gp33, нагруженными H-2Db-декстрамерами. LCMV-инфицированные мыши C57BL / 6 или CIITA — / — оценивали для LCMV-специфичных печеночно-инфильтрирующих CD8 + Т-клеток, которые распознавали иммунодоминантный gp33-пептид, связанный с молекулами H-2Db, путем иммунофлуоресцентного окрашивания gp33-нагруженными декстрамерами H-2Db, проточной цитометрии. Показаны репрезентативные окраски декстрамерами инфильтрирующих печень CD8 + Т-клеток у мышей на 15-й день инфекции.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Инфильтрация печени с LCMV-специфическими номерами CD8 + Т-клеток в ранней инфекции LCMV. LCMV-инфицированные мыши C57BL / 6 или CIITA — / — оценивали для LCMV-специфических индексов CD8 + T-клеток, инфильтративных в печени, с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания gp33-нагруженными декстрамерами H-2Db. Каждая точка представляет процент содержания декстрамара + CD8 + Т-клеток среди CD8 + Т-клеток на печень одной отдельной мыши на 7-й или 9-й день после LCMV-инфекции.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Анализ продуцирования IFN-γ CD8 + Т-клетками в ответ на стимуляцию пептидом LCMV-gp33. Инфильтрационные для печени CD8 + Т-клетки LCMV-инфицированных мышей C57BL / 6 или CIITA — / — оценивали с помощью проточной цитометрии для продуцирования IFN-γ в ответ на стимуляцию иммунодоминантным LCMV-gp33-пептидом. Показаны репрезентативные внутриклеточные IFN-γ окрашивания инфильтрирующих печень CD8 + Т-клеток у мышей на 15-й день инфекции.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Анализ продуцирования IFN-γ CD8 + Т-клетками в ранней LCMV-инфекции. Инфильтрационные для печени CD8 + Т-клетки LCMV-инфицированных мышей C57BL / 6 или CIITA — / — оценивали с помощью проточной цитометрии для продуцирования IFN-γ в ответ на стимуляцию иммунодоминантным LCMV-gp33-пептидом. Каждая точка представляет собой процент зараженных IFN-γ инфильтрирующих CD8 + Т-клеток на печень одной отдельной мыши на 7-й или 9-й день инфекции.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Анализ дегрануляционной способности LCMV-gp33 специфических CD8 + Т-клеток на основе окрашивания CD107a. Инфильтрационные лимфоциты LCMV-специфичные CD8 + Т-клетки инфицированных LCMV мышей C57BL / 6 или CIITA — / — оценивали по проточной цитометрии для LCMV-gp33, нагруженных D-образными декстрамерами H-2Db (верхние панели). Декстрамер + клетки последовательно стробировали для окрашивания CD107a как маркер дегрануляции (нижние панели). Показаны репрезентативные декстраматоры и CD107a окрашивания инфильтрирующих печень CD8 + Т-клеток от мышей на 15-й день инфекции. Указанный процент LCMV-специфичных CD107a + клеток в нижних панелях относится к клеткам декстрамера + в соответствующих родительских воротах верхних панелей.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Анализ дегрануляционной способности CD8 + Т-клеток при ранней инфекции. На 7 или 9 день после заражения дегрануляционная способность инфильтрирующих печень CD8 + Т-клеток (A) или инфильтрация печени LCMV-специфического декстрамера + CD8 + T-клеток (B) в ответ на стимуляцию пептидом LCMV-gp33 определяли окрашиванием для CD107a , Каждая точка представляет собой процент дегранулированных CD8 + Т-клеток среди всех CD8 + Т-клеток (A) или среди всех клеток декстрамера + CD8 + T (B) на печень одной отдельной мыши на 7-й или 9-й день инфекции.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим наших коллег из Института им. Генриха-Петте, Института экспериментальной вирусологии им. Лейбница за поддержку и проведение экспериментов по заражению мыши. Мы благодарим Бирте Ханиша, Марко Хилькена и Агнес Малотту за техническую помощь.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *