Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Колориметрический фокус-анализ с автоматическим подсчетом фокуса с помощью анализа изображения для количественного определения инфекционного гепатита C Virions

Colorimetric Focus-Forming Assay with Automated Focus Counting by Image Analysis for Quantification of Infectious Hepatitis C Virions
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3427175/

Конкурирующие интересы: соавтор Eui-Cheol Shin является членом PLOS ONE. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLoS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: WK ECS. Провели эксперименты: WK. Проанализированы данные: WK ECS. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: WK ECS. Написал документ: WK ECS.

Инфекция вируса гепатита С (HCV) является основной причиной трансплантации печени в западных странах. Исследования инфицирования ВГС с использованием продуцируемых культурой клеток HCV (HCVcc) in vitro-систем требуют количественной оценки инфекционных вирусов HCV, которые традиционно проводились с помощью анализа фокуса, основанного на иммунофлуоресценции, с ручным подсчетом фокусов; однако это трудоемкая и трудоемкая процедура с потенциально предвзятыми результатами. В настоящем исследовании мы установили и оптимизировали метод удобной и объективной количественной оценки вирионов HCV колориметрическим фокусообразующим анализом с автоматическим подсчетом фокуса путем анализа изображения. При тестировании различных ферментов и хромогенных субстратов мы получили превосходное развитие фокусов с использованием вторичного антитела, конъюгированного с щелочной фосфатазой, с хромогенным субстратом BCIP / NBT. Мы также обнаружили, что коллагеновое покрытие типа I минимизировало отделение клеток во время интенсивной промывки аналитической пластины. После колориметрического фокусировочного анализа число фокусов определяли с использованием программного обеспечения для считывания и анализа изображений ELISpot. Число очагов и рассчитанный вирусный титр, определенные этим методом, сильно коррелировали с показателями фокуса, которые были определены методом фокуса-формирования на основе флуоресцентного флуоресценции и ручным подсчетом фокусов. Эти результаты показывают, что колориметрический фокус-формирующий анализ с автоматическим подсчетом фокуса путем анализа изображений применим как более эффективный и объективный метод количественной оценки инфекционных вирусов HCV.

Вирус гепатита С (HCV) представляет собой РНК-вирус рода Hepacivirus в семействе Flaviviridae, и он заражает 170 миллионов человек во всем мире [1]. HCV имеет тенденцию к развитию хронической персистирующей инфекции и хронического гепатита, который часто прогрессирует до цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [2]. В западных странах инфекция HCV является основной причиной трансплантации печени [2]. К сожалению, профилактическая вакцина в настоящее время недоступна, а стандартная терапия с помощью пэгилированной комбинации интерферона-α / рибавирина имеет ограниченную эффективность в зависимости от генотипов HCV и сопровождается существенными побочными эффектами [3]. Поэтому необходимо провести более энергичное исследование HCV, в частности, в его полный жизненный цикл вируса и взаимодействие вируса с хозяином.

В 2005 году появилась система культивирования клеток для HCV-инфекции, использующая штамм HCV-генотип 2a [4], [5], который был первоначально выделен у пациента с фульминантным гепатитом C [6] и который обладает уникальной способностью к высокой репликации, не требуя адаптация к системе клеточной культуры [7]. JFH-1 используется для создания HCV HCV (HCVcc), продуцируемого культурой, посредством трансфекции транскрибируемой in vitro РНК JFH-1 в клетки гепатомы человека Huh-7; он заразен для наивных клеток Huh-7 in vitro и для шимпанзе in vivo
[4]. Эффективность продуцирования и инфицирования HCVcc была значительно улучшена за счет использования разрешительных клеточных линий, таких как клетки Huh-7.5, которые были получены из клеток Huh-7, трансформированных репликом HCV, путем элиминации РНК HCV с интерферонами I или II типа [5] , [8]. Система HCVcc также применялась для исследований других штаммов HCV как химерных форм на основе штамма JFH-1 [8] — [13].

Для производства и инфицирования HCVcc in vitro каждый требует количественной оценки инфекционных вирусов HCV. Для этой цели фокусообразующий анализ вирионов HCV обычно проводят иммуноокрашиванием HCV-антигенов с помощью специфичных к флуорохромам специфических антител и последующего флуоресцентного микроскопического наблюдения. Однако ручной подсчет фокусов флуоресцентным микроскопическим наблюдением неудобен и трудоемкий и может давать предвзятые результаты. Поэтому в настоящем исследовании мы установили и оптимизировали метод колориметрического фокусообразующего анализа и анализа изображений, используя считыватель ELISpot для удобной и объективной количественной оценки вирионов HCV.

(A) Клетки Huh-7.5, инокулированные серийными разведениями HCV, были иммунизированы моноклональным антителом против HCV и вторичными антителами, конъюгированными с различными ферментами, как указано, с последующим хромогенным развитием с использованием различных субстратов и сканированием изображений с помощью считывателя ELISpot. (B) Увеличенный вид сканированного изображения колориметрического фокусообразующего анализа показал, что вторичное антитело, связанное с щелочной фосфатазой с BCIP / NBT, дало наилучшие результаты, учитывая фон и отчетливость фокусов. Biotin-2 ° Ab, вторичное антитело, конъюгированное с биотином; SA-AP, стрептовидин-конъюгированная щелочная фосфатаза; AP-2 ° Ab, вторичное антитело, конъюгированное с щелочной фосфатазой; HRP-2 ° Ab, вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена; BCIP / NBT, 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат / нитро-синий тетразолий; DAB, 3,3′-диаминобензидин; ТМБ, 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидин.

Фокусировочный анализ на основе иммунофлуоресценции часто используется для количественной оценки вирионов HCV; однако это трудоемкая и трудоемкая процедура и может привести к предвзятым результатам. Поэтому мы установили колориметрический фокус-формирующий анализ для более удобного и объективного анализа. Монослой клеток Huh-7.5 в 96-луночном планшете для культивирования ткани был инфицирован различными разведениями JFH-1 HCVcc с последующим хромогенным развитием; результаты были проверены читателем ELISpot для автоматического подсчета фокуса.

(A) Вторичное антитело, конъюгированное с биотином, в сочетании со щелочной фосфатазой со стрептавидином и BCIP / NBT. (B) Вторичное антитело, связанное с щелочной фосфатазой, и BCIP / NBT. (C) Вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена и DAB. (D) Вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена и DAB. (E) Вторичное антитело, конъюгированное с флуоресценцией. Увеличение, 100 ×.

Во-первых, мы оптимизировали анализ путем тестирования различных ферментов с различными хромогенными субстратами. Использование конъюгированного с биотином вторичного антитела и конъюгированной с стрептавидином щелочной фосфатазой с хромогенным субстратом BCIP / NBT приводило к тому, что фоновая интенсивность была слишком высокой для выделения фокусов (рис. 1), и фокусы были неясны, когда вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, используется с хромогенным субстратом DAB или TMB (рисунок 1). Микроскопическое наблюдение показало, что вторичные антитела, связанные с щелочной фосфатазой, с хромогенным субстратом BCIP / NBT, дают наилучшие результаты, демонстрируя четкий фокус с минимальным фоном (рис. 2) с отчетливостью, сравнимой с таковой, наблюдаемой в анализе иммунофлуоресценции. Цветные фокусы были хорошо обнаружены с использованием различных первичных антител против HCV, включая сердечник против HCV (фиг. 1 и 2) и анти-HCV NS3 (фиг. S1).

(A) Отсканированное изображение колориметрического фокусообразующего анализа подчеркивает важность предварительного покрытия пластины коллагеном типа I для предотвращения отслоения клеток во время энергичных этапов промывки в анализе. (B) Увеличенный вид изображений в коробке в (A). (C) Культуральную пластину предварительно покрывали либо поли-D-лизином 4 мкг / см2, либо коллагеном I типа 5 мкг / см2, и проводили колориметрический фокус-формирующий анализ. Коллагеновое покрытие типа I превосходило поли-D-лизиновое покрытие с точки зрения предотвращения отделения клеток.

Мы тестировали, если колориметрический фокус-формирующий анализ работал на штаммы HCV, отличные от JFH-1. Мы подражали настройке фокусообразующего анализа путем культивирования небольшого количества серийно разведенных генотипов 1а H77-репликона Huh-7.5 клеток с большим количеством не-репликонных клеток Huh-7.5. Колориметрический анализ работал в этой настройке (рис. S2A), а фокус-подобные области были идентифицированы с помощью анализа изображений (рисунок S2B). При микроскопическом наблюдении фокус-подобные области хорошо отличались от окружающих антиген-отрицательных клеток HCV (рис. S2C).

(A) Несколько параметров, включая размер пятна, чувствительность, баланс фона и другие, были скорректированы для определения фокусов для автоматического подсчета фокуса. (B) Определенные фокусы окружены красным цветом, а число подсчитанных фокусов обозначается в левом верхнем углу. (C) Гистограмма, изображающая распределение размера фокуса в яме.

Мы также оптимизировали препарирующие реагенты для 96-луночных планшетов, чтобы свести к минимуму отрыв клеток Huh-7.5 во время энергичных стадий промывки. Мы обнаружили, что коллаген I типа полезен для этой цели (рис. 3А и В). Коллагеновое покрытие типа I дало лучший результат, чем поли-D-лизиновое покрытие [14] с точки зрения предотвращения отслоения клеток (рис. 3C). В покрытой поли-D-лизином скважине было много маленьких отверстий в результате отслоения клеток. Поэтому для дальнейших анализов мы использовали вторичное антитело, конъюгированное с щелочной фосфатазой, с хромогенным субстратом BCIP / NBT в пластинах, покрытых коллагеном I типа.

(A) Количество фокусов в каждой лунке, определяемое колориметрическим фокусообразующим анализом с анализом изображения, сильно коррелировало с числом фокусов, определяемым методом фокус-образования на основе иммунофлуоресценции и ручным подсчетом. (B) Титры вирусов, рассчитанные с использованием чисел фокусов, полученных двумя различными методами, также показали значительную корреляцию. (C) Определенные вирусные титры в шести различных партиях HCVcc не выявили существенных различий между результатами двух типов фокуса-формирующего анализа.

Затем мы подсчитали количество фокусов с помощью программного обеспечения для чтения и анализа изображений ELISpot. Чтобы определить фокус для автоматической функции подсчета фокуса программного обеспечения, мы скорректировали несколько параметров, включая размер пятна, чувствительность, баланс фона и другие. Пример скорректированных параметров подсчета фокусов представлен на рисунке 4A, а определенные фокусы отмечены на рисунке 4B. Распределение размера фокуса в скважине представлено на рисунке 4C. Колориметрический фокус-формирующий анализ и последующий анализ изображений позволили нам легко подсчитать количество фокусов без трудоемкого ручного подсчета под флуоресцентным микроскопом.

Наконец, мы сравнили число очагов, определяемое с помощью колориметрического фокусообразующего анализа и анализа изображений, с учетом подсчета фокус-образования на основе иммунофлуоресценции. Мы провели оба типа фокуса-анализа в шести разных партиях JFH-1 HCVcc. Мы нашли сильную корреляцию между числом очагов, определяемым анализом изображения, после колориметрического фокуса-анализа и числа, определяемого методом фокуса-формирования на основе иммунофлуоресценции и ручным подсчетом (рис. 5А). Число фокусов использовалось для определения титра вируса в каждой партии HCVcc. Титр вируса, определяемый колориметрическим фокусообразующим анализом и анализом изображения, значительно коррелирует с титром, определяемым методом фокуса-формирования на основе иммунофлуоресценции (фиг. 5B) без существенной разницы между двумя типами фокуса-формирующих анализов (фиг. 5C).

Система HCVcc, основанная на JFH-1, позволяет детально анализировать HCV в жизненном цикле вируса, взаимодействии с вирусом-хозяином и антивирусном врожденном иммунитете, что облегчает разработку препаратов против HCV. Эксперименты с использованием HCVcc требуют согласованных условий эксперимента; например, in vitro исследования HCVcc-инфекции требуют последовательной множественной инфекции (MOI) в серии экспериментов. Таким образом, инфекционные вирусы HCV необходимо количественно определять в каждой партии HCVcc. С этой целью иммунофлуоресцентный фокус-формирующий анализ проводят путем иммуноокрашивания антигенов HCV с помощью специфичных к флуорохромам специфических антител с последующим флуоресцентным микроскопическим наблюдением. Однако ручной подсчет фокусов флуоресцентным микроскопическим наблюдением является громоздкой процедурой и может давать предвзятые результаты. Поэтому в настоящем исследовании мы установили и оптимизировали метод колориметрического фокусообразующего анализа и автоматизированного анализа изображений с использованием считывателя ELISpot, который может заменить традиционный фокус-формирующий анализ на основе иммунофлуоресценции для более удобной и объективной количественной оценки вирионов HCV ,

Функция анализа изображения для считывателя ELISpot ранее успешно использовалась для бляшкообразующих анализов цитопатических вирусов [15], [16]. Тем не менее, бляшкообразующий анализ не может быть выполнен для нецитопатических вирусов; вместо этого зараженные вирусом фокусы обычно окрашиваются вирусными белковыми специфическими антителами для фокуса-формирующего анализа, а иммуноокрашенные фокусы часто визуализируются флуоресценцией. С помощью этого метода исследователи должны рассчитывать фокусы вручную под флуоресцентным микроскопом и не могут помочь с помощью функции анализа изображения считывателя ELISpot. Напротив, колориметрический фокус-формирующий анализ, установленный в настоящем исследовании, легко анализируется функцией подсчета пятна считывателя ELISpot. Применение этого анализа не может быть ограничено HCV, но, вероятно, также может быть распространено на другие нецитопатические или минимально цитопатические вирусы, которые в настоящее время количественно оцениваются с помощью фокусирующего анализа [17] — [19].

Система HCVcc на основе JFH-1 была успешно установлена ​​благодаря уникальной высокой репликационной способности штамма JFH-1. Линии клеток, разрешающие HCV, такие как Huh-7.5, демонстрируют ограниченную инфекцию in vitro любым штаммом HCV, который не подвергается химерической рекомбинации с основой JFH-1. Это ограничение системы HCVcc ограничивает использование представленного колориметрического фокуса-анализа и метода анализа изображений. Тем не менее, в будущем могут быть разработаны более эффективные системы HCVcc, так что широкий спектр штаммов HCV, включая клинические изоляты, сможет инфицировать HCV-разрешающие клеточные линии in vitro. В этом случае колориметрический фокус-формирующий анализ и метод анализа изображений, которые были установлены и оптимизированы в настоящем исследовании, будут применимы для дополнительных целей, включая скрининг нейтрализующих HCV антител и блокаторов входа HCV.

Клетки Huh-7.5 (предоставленные Apath, LLC, Бруклин, Нью-Йорк) культивировали при 37 ° С с 5% СО2 в модифицированной среде Иглля Дульбекко (DMEM, Welgene, Daegu, Korea), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Welgene) 4,5 г / л глюкозы, L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Антитела, используемые в этом исследовании, включали мышиный моноклональный анти-HCV-сердечник IgG1 (Clone C7-50, Thermo Scientific / Affinity BioReagents, Rockford, IL), анти-HCV NS3 IgG1 (Clone BDI371, Meridian Life Science, Memphis, TN), Alexa Конъюгированный с флуором 488 антимышиный IgG (H + L) (Invitrogen / Molecular Probes, Eugene, OR), конъюгированный с щелочной фосфатазой кроличьим антимышиным IgG (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), конъюгированный с хренами пероксидазой хрена — мышиный Ig (BD Biosciences / Pharmigen, San Diego, CA), биотин-конъюгированный козьи антимышиный Ig (BD Biosciences / Pharmigen) и стрептовидин-конъюгированная щелочная фосфатаза (Invitrogen). Субстраты для хромогенного развития включали набор субъединицы AP-конъюгата (Bio-Rad, Hercules, CA), состоящий из хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP) / нитро-синего тетразолия (NBT), 3, 3′-диаминобензидин (DAB, Vector Laboratories, Burlingame, CA) и 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидин (TMB, Sigma-Aldrich). Крысиный хвостовой коллаген типа I был получен от BD Biosciences (Бедфорд, Массачусетс). Поли-D-лизин получали из Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).

Штамм JFH-1 (генотип 2a) HCV получали путем трансфекции клеток Huh-7.5 с транскрибируемой РНК in vitro из плазмиды, кодирующей полный геном HCV JFH-1 (предоставленный Apath). Клетки Huh-7.5 трансфицировали реагентом DMRIE-C (Invitrogen). После трансфекции РНК супернатанты клеточной культуры от пика продукции HCV использовали для инфицирования наивных клеток Huh-7.5. HCV-инфицированные клетки Huh-7.5 пассировали, и супернатанты клеточной культуры с наивысшей производительностью HCV были выбраны, как описано ранее [14]. Отобранные супернатанты HCV или HCVcc запасы фильтровали (0,45 мкм) и замораживали при -70 ° C до использования.

Клетки готовили при 1 × 105 мл полного DMEM и высевали на 100 мкл / лунку в прозрачные 96-луночные планшеты для культивирования плоских дна. После ночного осаждения при 37 ° С (5% СО2) из ​​каждой лунки удаляли 50 мкл / лунку среды и добавляли 100 мкл / лунку серийных десятикратных разведений полной среды, содержащей вирус; инокуляция с каждым разбавлением проводилась, по меньшей мере, в двух экземплярах. После дальнейшей инкубации при 37 ° С в течение 72 ч культуральную среду полностью удаляли, а затем фиксировали / пермеабилизировали 50 мкл / лунку охлажденного льдом 100% метанола при -20 ° С в течение 15 мин. Фиксированные и проницаемые клетки промывали дважды 200 мкл / лунку PBS с последующим блокированием в 50 мкл / лунку блокирующего буфера (1% BSA, 0,25 мМ ЭДТА в PBS) при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем блокирующий буфер заменяли на 40 мкл / лунку мышиного моноклонального ядра IgG1 против HCV (1:300 в блокирующем буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехкратного промывания 200 мкл / лунка PBS клетки подвергали 40 мкл / лунку вторичного антитела против IgA-антитела AlexaFluor-488 (1:000 в блокирующем буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре, защищали от легкий. Клетки промывали три раза 200 мкл / лунку PBS с последующим добавлением 50 мкл / лунку PBS для флуоресцентной микроскопии. Инфицированные клеточные фокусы визуализировали с использованием инвертированного микроскопа Zeiss (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Была просмотрена вся пластина, и была идентифицирована скважина, содержащая последний развод, в котором был обнаружен фокус зараженной клетки. Фокусы подсчитывали вручную только в двух последних лунках, а титр вируса рассчитывали по среднему числу очагов из двух последних лунок в двух экземплярах. Например, если количество подсчитанных фокусов составляло 84 и 70 в разведенных дублированных лунках 1:100 и 7 и 9 в разбавленных лунках 1:000, исходную концентрацию рассчитывали следующим образом: [(84 + 70) × 100 + (7 + 9) × 1000] / 4/100 × 1000 = 7,85 × 104 вирионов / мл.

Клетки готовили, как описано выше, в 96-луночных планшетах для культивирования плоских дна, которые предварительно покрывали хвостовым коллагеном крыс крыс I со скоростью 5 мкг / см2 или поли-D-лизином при 4 мкг / см2. Инокуляция с серийно разведенным инфектором, фиксация / пермеабилизация, блокирование и окрашивание первичным антителом выполнялись, как описано для анализа фокуса-формирования на основе иммунофлуоресценции. Для вторичных антител мы использовали 40 мкл / лунку либо щелочной фосфатазы-конъюгированной кроличьей антимышиной IgG (1: 00 в блокирующем буфере), конъюгированной с пероксидазой хрена с козьим антимышиным Ig (1:000 в блокирующем буфере), либо биотина (1:400 в блокирующем буфере) с последующим использованием стрептавидин-конъюгированной щелочной фосфатазы (1:5 000 в блокирующем буфере). Для хромогенного развития мы использовали 100 мкл / лунку комплекта субъединицы AP конъюгата (Bio-Rad), состоящего из хромогенного субстрата BCIP / NBT для анализов со вторичным антителом, связанным с щелочной фосфатазой, или 100 мкл / лунку хромогенного субстрата DAB или TMB для анализа с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена. Хромогенное развитие контролировали при комнатной температуре до оптимального развития, и реакцию останавливали дважды промыванием 200 мкл / лунку PBS. Сразу после полного удаления PBS из каждой лунки планшет сканировали с помощью считывателя ELISpot (ImmunoSpot® S5 Versa Analyzer, Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH) и подвергали автоматическому подсчету фокуса.

Изображение пластинки для анализа было получено с помощью считывателя ELISpot, а автоматическое подсчет фокуса выполнялся с использованием программного обеспечения BioSpot 5.0 Professional (Cellular Technology Ltd.). Параметры подсчета фокуса были настроены на оптимизированные настройки в зависимости от силы хромогенной реакции.

Данные представлены как средняя ± стандартная ошибка среднего (SEM). Коэффициент корреляции Пирсона использовался для анализа корреляции между колориметрическим фокусообразующим анализом с анализом изображения и автоматическим подсчетом фокусов, а также методом фокус-образования на основе иммунофлуоресценции с ручным подсчетом фокусов. Для определения значительной разницы в вирусных титрах между колориметрическими и иммунофлуоресцентными фокус-формирующими анализами проводили т-тест с двумя хвостами Стьюдента. Весь статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism версии 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Значение p менее 0,05 считалось статистически значимым.

Колориметрический фокус-формирующий анализ с использованием первичного антитела против HCV NS3. (A) Клетки Huh-7.5, инокулированные серийными разведениями HCV, были иммунизированы моноклональным антителом против HCV NS3 и вторичным антителом, конъюгированным с щелочной фосфатазой, с последующим хромогенным развитием с использованием BCIP / NBT. (B) Увеличенный вид изображений в коробке в (A).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Колориметрический анализ для обнаружения фокус-подобных областей в генотипе 1a H77-репликона Huh-7.5. (A) Небольшое количество генотипов 1a H77-репликона Huh-7.5 клеток серийно разводили и культивировали с большим количеством нерепликонных клеток. Через 5 дней культивирования клетки иммуноокрашивали моноклональным антителом против HCV и вторичным антителом, конъюгированным с щелочной фосфатазой, с последующим хромогенным развитием с использованием BCIP / NBT. (B) Фокус-подобные области были легко обнаружены при анализе изображений. (C) Микроскопическое изображение цветных фокус-подобных областей, образованных генотипом 1a H77-репликона Huh-7.5 клеток. Увеличение, 100 ×.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *