Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Нарушение передачи зародышевой линии после инъекции бластоцисты с эмбриональными стволовыми клетками мыши, культивируемыми вирусом гепатита мыши и мышиным вирусом мыши

Impairment of germline transmission after blastocyst injection with murine embryonic stem cells cultured with mouse hepatitis virus and mouse minute virus
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2758372/

Целью этого исследования было определить восприимчивость мышиного эмбрионального ствола (mESC) к вирусу гепатита мыши (MHV-A59) и мышиному вирусу (MMVp) и воздействию этих вирусов на передачу зародышевой линии (GLT) и серологическому статусу получателей и щенков. Когда получатели получали 10 бластоцист, каждый из которых вводили 100 TCID50 MHV-A59, три из пяти реципиентов и четыре из 14 щенков из трех пометов стали серопозитивными. Когда бластоцисты вводили 10-5 TCID50 MMVp, все четыре реципиента и 14 щенков из четырех пометов оставались серонегативными. МЭСК реплицировали MHV-A59, но не MMVp, MHV-A59 были цитолитическими для mESC. Воздействие mESC на вирусы в течение четырех-пяти проходов, но не на 6 часов, повлияло на GLT. Получатели были серопозитивными для MHV-A59, но не для MMVp, когда mESC культивировали с вирусом в течение четырех или пяти проходов. Данные показывают, что на GLT влияют зараженные вирусом mESC.

Трансфекция мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs) с желаемыми генными конструкциями и инъекция в бластоцисты в сочетании с переносом подходящим реципиентам — это стандартизованный метод для получения трансгенных мышей (Gossler et al., 1986). Однако, помимо фидерных клеток и бластоцист, mESC могут содержать мышиные патогены (Okumura et al., 1996; Kyuwa et al., 1997), и их введение в колонию мыши может привести к распространению инфекций. Из-за обмена mESC между лабораториями во всем мире риск передачи инфекционных агентов мыши может даже быть выше, поскольку mESC часто не скринируют на наличие вирусов, а заражение и заражение вирусами не могут быть обнаружены на основе морфологии клеток.

Мышиный вирус гепатита (MHV) и мышиный вирус (MMV) имеют размер 80-160 нм и 20 нм соответственно и являются инфекционными агентами, которые имеют отношение к регулярному мониторингу здоровья современных колоний мыши (Nicklas et al., 2002). MHV относится к семейству коронавирусов окутанных вирусов с рибонуклеиновой кислотой с положительной цепью (РНК), и его репликация происходит в цитоплазме клеток (Brayton et al., 1981; Gosert et al., 2002). MMV представляет собой необращенный, линейный вирус дезоксирибонуклеиновой кислоты с положительной цепью (ДНК) семейства Parvoviridae и реплицируется в ядре митотически активных клеток (Tattersall 1972; Linser et al., 1979).

Несмотря на то, что в исследовании 46 мешковых линий не было обнаружено присутствие мышиных инфекционных агентов (Nicklas and Weiss 2000), два исследования показали, что мышиные mESC заразились MHV-2 и MHV-A59 и продолжали расти in vitro, не проявляя ни цитопатических эффектов, ни явных признаки дифференцировки (Okumura et al., 1996; Kyuwa, 1997). Поскольку эти исследования проводились in vitro, нет никакой информации о том, переносят ли бластоцисты, которые были введены зараженными вирусом mESC для реципиентов, влияют на эффективность зародышевой линии мЭСК, и если и как скоро после переноса эмбрионов реципиенты и щенки показывают специфические антитела к таким вирусы. Это имеет отношение к лабораторной животной науке, поскольку передача зародышевой линии (GLT) является необходимостью для производства и использования трансгенных мышей. Кроме того, инфицированные мыши влияют на результаты экспериментов на животных (Fox et al., 1977; Kyriazis et al., 1979; Dempsey et al., 1986; Barthold, 1986; Lussier, 1988).

В настоящем исследовании целью было (1) исследовать восприимчивость mESC к инфицированию MHV-A59 и MMVp, (2) исследовать влияние MES-A59- и MMVp-мишеней mESC на GLT и репродуктивную эффективность получатели и (3) определяют серологический статус получателей и щенков в обычных условиях работы на нашем мышечном объекте.

Вирусные запасы MHV-A59 (VR-764) и MMVp (VR-1346) и их производных клеточных линий NCTC-1469 (CCL-9.1) и A9 (CCL-1.4) соответственно и клетки L929 (CCL-1) были полученной из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, USA). NCTC-1469 и A9 использовали для распространения MHV-A59 и MMVp соответственно, в то время как клетки L929 использовали для титрования обоих вирусов. Культуры клеток NCTC-1469, A9 и L929 поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Eagle (DMEM) с добавлением 4,5 г / л d-глюкозы / 1-глутамина и 10% инактивированной инактивированной телячьей сывороткой плода (L929 в 5% фетальной телячьей сыворотке ). Распространение вирусных запасов проводили в колбах для культивирования клеток 75 см2 (NCTC-1469 в колбах для культивирования клеток Corning Costar, Cambridge, Maryland, USA; A9 и L929 в колбах для культивирования клеток, полученных из Nunc, Roskilde, DK) при 37 ° C, используя 5% CO2 в увлажненной атмосфере. Культуры разрешительных клеток инфицировали соответствующим вирусом в течение 1 часа с последующим удалением вирусной суспензии и заменой ее на 10 мл клеточной культуральной среды. MHV-A59- и MMVp-инфицированные клетки замораживали в культуральных колбах через 20 и 5 дней соответственно. Они были подвергнуты трем циклам замораживания-оттаивания, чтобы разрешить высвобождение вируса. Содержимое колб центрифугировали при 3000 г в течение 5 мин для отделения вируса от клеточного мусора. Супернатант пропускали через фильтр Minisart® с размером пор 0,20 мкм (Sartorius, Göttingen, Germany). Для титрования клетки L929 высевали в 96-луночные планшеты с концентрацией 2 × 104 / лунку для MHV-A59 и 3 × 103 / лунку для MMVp и культивировали в течение ночи. После удаления культуральной среды для каждого 10-кратного разведения до 10-10 12 лунок инокулировали 100 мкл вируса. Цитопатический эффект (CPE), наблюдаемый как синцития и цитолиз для MHV-A59 и отрыв клеток для инфекции MMVp, определялся на второй и шестой день культуры соответственно. Средняя лекарственная доза культуры тканей (TCID50) для каждого вирусного запаса рассчитывалась по методу Спирмена-Каербера (Spearman 1908, Kaerber 1931). Запасы MHV-A59 и MMVp, используемые в этом исследовании, имели титры соответственно 109 и 104 TCID50 / мл и хранили при -80 ° C до использования.

Избитый Crl: CD1 (Icr) / Dcm (Dcm = отдел сравнительной медицины) мышей разводили в блоке полного барьера на наших объектах животноводства. Размножающиеся колонии хранились в клетках типа II Makrolon® с фильтром при температуре 20-24 ° C, влажности 50-60%, 20 воздушных обменов в час и 12/12-часовой свет / темный цикл. Деревянные стружки (Altromin, Lage, Германия) были предоставлены в качестве постельных принадлежностей. Мышей кормили стандартизированной диетой для мышей (1314, Altromin) и обеспечивали питьевую воду ad libitum.

Персонал носил чистые костюмы, одноразовые перчатки, шляпки и маски для лица. Мышей переносили в новые индивидуально вентилируемые клетки (IVCs, VentiRacks ™, BioZone, Margate, UK) на ламинарных станциях изменения уровня II с дезинфицированными щипцами, заполненными силиконовыми трубками. Все материалы были подвергнуты автоклавированию перед использованием.

Микробиологическое исследование колоний мыши проводилось каждые 6 недель с использованием мужских контрольных образцов Cr1: CD1 (Icr) / Dcm из колонии, как описано (Mahabir et al., 2007). Вкратце, аликвоты приблизительно 5 см3 загрязненного слоя были взяты из каждой использованной клетки на стойке. Эти аликвоты смешивали в стерильной коробке с эквивалентным количеством новых стерильных постельных принадлежностей, и полученную смесь распределяли в дозорную клетку той же стойки в течение 12 недель. Серологические исследования проводились в соответствии с годовым стандартом, рекомендованным FELASA (Федерация ассоциаций лабораторных ассоциаций животных) (Nicklas et al., 2002) с добавлением серогрупп Leptospira, балла, каниколы, hebdomadis и icterohaemorrhagiae, вируса K, вируса лактатдегидрогеназы , Вирус полиомы, вирус тимуса мышей, хантавирусы (Kraft et al., 1994), а с октября 2006 года — норовирус мыши. Мыши были найдены неизменно отрицательными для всех вышеупомянутых инфекционных агентов, в том числе рассмотренных в этом исследовании.

Экспериментальные и контрольные мыши содержали в IVC при положительном давлении и условиях, указанных выше. Все манипуляции с животными выполнялись в шкафу биологической безопасности ламинарного потока класса II (Heraeus Instruments GmbH, Мюнхен, Германия). Все исследования на животных были одобрены Комитетом по охране и использованию животных в Хельмгольц-Центре Мюнхена и правительством Верхней Баварии (Германия) (211-2531-8 / 02).

Около 6-8-недельных женщин Crl: CD1 (Icr) / Dcm были индуцированы для овуляции внутрибрюшинными инъекциями 5 IU лошадиного хорионического гонадотропина (eCG; Intervet, Boxmeer, The Netherlands), затем через 48 часов спустя 5 IU человека Chorionic Gonadotropin (hCG; Интервет). Они сразу же спаривались с мужчинами с доказанной плодовитостью. Присутствие вагинальных пробок определяли следующим утром (d0.5). Мышей убивали на d3.5, бластоцисты вымывали из рогов матки и собирали в среде M2 (Quinn et al., 1982).

Чтобы определить, приводит ли инъекция MHV-A59 и MMVp в бластоцисты к рождению щенков, и если мышей сероконвертировали, примерно 1 нл каждого вирусного запаса вводили в каждую бластоцисту с использованием микроманипулятора (Leitz, Bensheim, Germany). В общей сложности 50 и 40 эмбрионов вводили MHV-A59 и MMVp соответственно. Для контрольной группы 20 эмбрионов были введены средой ESC. Во-первых, вводили инъекционные бластоцисты, зараженные вирусом.

В общей сложности пять бластоцист были перенесены на каждый рог матки d2.5 псевдопрегнантных реципиентов, как описано (Nagy et al., 2003). Во-первых, были перенесены вирусные обнаженные бластоцисты. Получатели содержались отдельно в ИВК. Щенки содержались со своими матерями до отлучения в 21 день после родов, а затем отдельно в IVC.

Чтобы определить, были ли реципиенты сероконвертированы и время сероконверсии, сыворотки получали в 14, 21, 28, 42 и 63 дни после переноса эмбрионов. Сыворотки из потомства были приготовлены в дни 42, 63, 84 и 112 после переноса эмбрионов, чтобы определить, было ли потомство серопозитивным и если это антитело было материнским по происхождению или если сами потомство заразилось вирусом. Кровь брали от мышей, получавших контрольные бластоцисты, а затем от мышей, получавших бластоцисты с вирусными проявлениями.

Сыворотку разбавляли 1 в 10 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, Oxoid, Hants, UK), содержащем 0,05% Tween 20 (R & L Slaughter, Essex, UK). Они были протестированы на специфические антитела (цельная молекула IgG) на MHV и MMV с использованием иммуноферментного анализа с ферментным связыванием (ELISA) с использованием контрольных покрытий, не покрытых вирусом, и покрытых вирусом пластин, а также отрицательной и положительной сыворотки. Антигены MHV и MMV были получены от Черчилля Applied Biotechnology Ltd. (Кембриджшир, Великобритания). Оптическая плотность (OD) считывалась с длиной волны 492 нм с помощью пластинчатого считывателя Multiskan ELISA (Thermo Life Sciences, Hampshire, UK). Сыворотки были двусмысленными низкими положительными, когда ОП составляло 0,600-0,799 и положительно, когда значения OD превышали 0,799.

Для ПЦР-анализа три щенка из каждой из трех групп, исследованных в эксперименте 1, были убиты в течение 3 дней после рождения, и были собраны органы. Что касается ПЦР MHV, то общая РНК из печени и кишечника была экстрагирована с использованием набора QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Осажденную РНК поглощали в 60 мкл RNase-свободного AVE-буфера, который также предоставляется в комплекте. Данную ДНК удаляли без РНКазы ДНКазы (Qiagen). Сразу же после этого к смеси RT добавляли ингибитор РНКазы (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Германия) в концентрации 10 U / мкл. кДНК синтезировали с использованием 12 мкл РНК и набора Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen). Для ПЦР-анализа для амплификации использовали 1 мкг (мкл) кДНК. Использовали праймеры, разработанные Тейлором и Копли (1994): 5′-CAGCCTGCCTCTACTGTAAAACC-3 ‘(форвард), 5′-GCCTCCAAAATTCTGATTGGGGC-3’ (обратный), получая продукт 225 п.н. Образец с двойной дистиллированной водой использовали в качестве отрицательного контроля как на РТ, так и на этапах ПЦР. ПЦР проводили в общем объеме 20 мкл с использованием ДНК-полимеразы Taq (Qiagen) в течение 35 циклов в термоциклере (Biometra, Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen, Germany). Денатурацию проводили при 94 ° С в течение 4 мин. Каждый цикл состоял из 94 ° C (60 с), 57 ° C (60 с) и 72 ° C (45 с). За последним циклом следовал период удлинения в 10 минут при 72 ° C.

ДНК из селезенки и почки для ПЦР MMV экстрагировали с использованием набора QIAamp DNA mini kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Использовали праймеры, разработанные Bootz et al. (2003) следующим образом: 5′-GAGCGCCATCTAGTGAGC-3 ‘(вперед) и 5′-ATTTGCCTGTGCTGGCTG-3’ (обратный), что дает продукт 483 п.о. Образец с двойной дистиллированной водой служил отрицательным контролем ПЦР. ПЦР проводили в общем объеме 20 мкл с использованием ДНК-полимеразы Taq (Qiagen) в течение 40 циклов в термоциклере (Biometra). Денатурацию проводили при 94 ° С в течение 4 мин. Каждый цикл состоял из 94 ° C (30 с), 55 ° C (30 с) и 72 ° C (30 с). За последним циклом следовал 7-минутный период растяжения при 72 ° C.

ПЦР-продукты (10 мкл) из обеих групп вирусов и контрольные образцы смешивали с 2 мкл загрузочного буфера (MBI Fermentas), подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле, окрашивали бромидом этидия и визуализировали под ультрафиолетовым светом.

Линия mESC с генетическим фоном 129 / SvPas была предоставлена ​​в проходе 13 (P13) W. Wurst, Центр Гельмгольца в Мюнхене, Нойерберг, Германия, и показала GLT. Ранее использовавшиеся в настоящем исследовании mESC культивировали на инактивированных митомицином C (1 мг / мл) эмбриональных питательных клетках мыши и пассировали каждые 2 дня. Как mESC, так и фидерные клетки были свободны от микоплазм, патогенов, перечисленных в рекомендациях FELASA и мышином норовирусе. Культуру mESC проводили в высокоомной глюкозе DMEM, дополненной 15% фетальной телячьей сывороткой, 1% пируватом натрия, 0,1 мМ β-меркаптоэтанолом, 2 мМ глутамином и 1000 МЕ / мл LIF (Chemicon International Ltd, Хофхайм, Германия).

В 13-м проходе (P13) в количестве 13,34 × 106 мЭСК высевали с плотностью 2 × 104 клеток / см2 в 0,1% покрытых желатином чашках Петри 10 см без питающих клеток и культивировали в течение пяти проходов (P13 + 5) , В каждом из пяти проходов трипсинизированным клеткам давали осадок приблизительно 15-30 мин в пробирках, а мЭСК для дальнейшей культивирования отбирали из верхней части колонны, тем самым удаляя питающие клетки, которые располагались на дне пробирок. При P13 + 5 mESC подвергали воздействию 104 или 10-1 TCID50 MHV-A59 или 10-1 TCID50 MMVp / cell. Через 6 часов воздействия вируса инокулят удаляли и заменяли культуральной средой ESC. Контрольные mESC не подвергались воздействию вирусов. Для продолжения культивирования более четырех (P13 + 5 + 4, MHV-A59) или пяти проходов (P13 + 5 + 5, MMVp) в 0,1% покрытых желатином чашках Петри 10 см без питающих клеток, mESC, инокулированных 10-1 TCID50 вирус / клетка пассировали каждые 2 дня. mESC, подвергнутые воздействию 104 TCID50 MHV-A59 / cell в течение 6 ч, использовали для инъекции бластоцисты.

В каждом проходе клетки дважды промывали PBS (Gibco, Invitrogen ™, Окленд, Новая Зеландия), один раз трипсином / ЭДТА (Biochrom AG, Берлин, Германия), а затем трипсинизировали. Количество мЭСК, обнаруженное в суспензиях трипсинизированной клетки, определяли с помощью гемоцитометра (Hycor Biomedical Inc., Kassel, Germany). Трипсинированные клеточные суспензии для дальнейшей культуры из каждого блюда объединяли в соответствии с экспериментальной группой. Супернатанты, свободные от клеток, хранили при -80 ° С до титрования. Жизнеспособность, вирусный статус и плюрипотентный статус трипсинированных mESC от двух повторов определяли при P13 + 5 + 1 проточной цитометрией, как описано ниже. Для определения роста, инъекции бластоцисты и титрования в течение двух разных дней (культуры 1 и 2) проводили еще два повторения.

Анти-POU5F1 (ранее известный как Oct-4) моноклональные антитела (клон 9E3, Chemicon, Chandlers Ford, UK) были помечены монореактивным красителем Cy5 (Amersham, Freiburg, Germany), как рекомендовано производителем. Сыворотки с анти-MHV-A59 и анти-MMVp были собраны у сероположительных мышей на нашем объекте. Фракцию иммуноглобулина G (IgG) очищали с использованием хроматографии быстрого протекания Prot-G (Amersham) и помещали изотиоцианатом флуоресцеина (FITC).

Все клетки были ковалентно окрашены монодиазой этидия (EMA, Molecular Probes, Karlsruhe, Germany), чтобы различать мертвые клетки. Их фиксировали 1% параформальдегидом (PFA, Sigma, Deisenhofen, Germany), проницаемым с использованием 0,2% сапонина (Sigma) и мечеными вышеописанными антителами. Клетки обрабатывали с помощью LSRII проточного цитометра (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) или проточного цитометра CyAn (Daco-Cytomation, Гамбург, Германия). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения FloJo (Tree Star, Ashland, USA).

Супернатанты, свободные от клеток из соответствующих проходов культур с 10-1 TCID50 MHV-A59 или 10-1 TCID50 MMVp / cell, титровали, как описано выше для вирусных запасов. Вирусные титры были рассчитаны с использованием метода Спирмена-Каербера (Spearman 1908, Kaerber 1931).

Через 6 часов после заражения вирусами или после четырех (MHV-A59) или пяти (MMVp) проходов в каждую бластоцисту вводили 15-20 мЭСК. Контрольные бластоцисты получали не-вирусные МЭСК. Инъекции бластоцисты, перенос эмбрионов на d2.5 псевдопрегнантных реципиентов и взятие крови проводили сначала с контролем. Серологический статус реципиентов и щенков определяли, как описано для эксперимента 1.

Чтобы определить, внесли ли МЭСК в зародышевую линию, полученные химеры были сопряжены с мышами C57BL / 6. Были зарегистрированы размер, цвет и пол мусора. Потомство было либо агути с светлым животом (GLT, происходящим из штамма 129 Sv / J), либо черным цветом (дикий тип, происходящий из штамма C57BL / 6).

Экспериментальные группы сравнивались точным тестом Фишера. Для среднего количества клеток, обнаруженных за репликацию после культивирования зараженных вирусом и контрольных mESC по проходам, проводился многократный тест Duncan. Этот тест контролировал коэффициент ошибок по сравнению с типом I и позволял ранжировать номера клеток по количеству проходов и обработке. Глобальный уровень значимости был выбран равным 0,05. Все статистические анализы были выполнены с использованием SAS (SAS / STAT User’s Guide, Version 9.1. Cary, NC; SAS Institute Inc., 2003).

На первом этапе бластоцисты подвергали микроинъекции с вирусными запасами, чтобы определить, будут ли реципиенты сероконвертироваться и повлияет ли репродуктивная эффективность. После инъекции бластоцисты с MHV-A59 и переноса эмбрионов три из пяти реципиентов усеяли 14 щенков (таблица 1). В общей сложности два из пяти и трех из пяти получателей сероконвертированы соответственно d14 и d21. Что касается щенков, то четыре из одного помета были сероположительными для MHV на d42. По d63 только один щенок был серопозитивным и через d112 после эмбрионального переноса он больше не обнаруживал антитела к MHV. В группе MMVp все четыре реципиента усеяли 14 щенков. Антитела MMVp не были обнаружены ни у реципиентов, ни у щенков. Когда контрольные бластоцисты были введены средой M2, два из двух реципиентов засоряли девять щенков. В течение экспериментального периода оба реципиента и щенки в контрольной группе были серонегативными для MHV-A59 и MMVp. В d42 было значительно больше числа щенков, серопозитивных к MHV-A59 (4/11), чем для MMVp (0/11); Р <0,05. ПЦР-анализ показал, что образцы, проанализированные из всех девяти щенков, были отрицательными для MHV и / или MMV. Таблица 1 Результаты инъекции бластоцисты с суспензиями MHV-A59 и MMVp и перенос в d2.5 псевдопрегнантных реципиентов

Различные онлайн-алфавиты в столбцах указывают на значительные различия (P <0,05)

aOrgans из трех щенков из каждой группы были исследованы на наличие MHV и / или MMV с использованием ПЦР

bPups происходит от одного мусора

cMice были серонегативными между d84 и d112

Полипотентность и вирусный статус, измеренные FACS, определялись при P13 + 5 + 1 (данные не показаны). Процент контрольных mESCs, положительных только для POU5F1, или положительный как для POU5F1, так и для MHV-A59, или положительный как для POU5F1, так и для MMVp, составлял в среднем 80%, 3% и 3% соответственно. Для культур, подвергнутых воздействию MHV-A59, процент клеток, положительных только для POU5F1, или положительный как для POU5F1, так и для MHV-A59, или положительный только для MHV, составлял 55%, 32% и 3% соответственно. Для культур, подверженных воздействию MMVp, процент клеток, положительных только для POU5F1, или положительный как для POU5F1, так и для MMVp, или положительный только для MMV составил 65%, 6% и 0% соответственно.

Из четырех повторений среднее количество трипсинизированных клеток в контрольной группе составляло 3,1 × 106 при P13 + 5 + 1 и 3,2 × 106 при P13 + 5 + 4 (фиг.1). Культура mESC с MMVp приводила к 1,4 × 106 клеткам при P13 + 5 + 1 и 2,1 × 106 при P13 + 5 + 4. Что касается культур с MHV-A59, то у P13 + 5 + 1 было обнаружено 0,8 × 106 клеток , а число уменьшилось до 1,4 × 104 клеток при P13 + 5 + 4. Средняя жизнеспособность трисфинированных контрольных mESCs, MHV-A59- и MMVp-облученных mESC при P13 + 5 + 1 составляла 86%, 88% и 89 %, соответственно. Значительные различия наблюдались в среднем числе клеток из культур MMV по сравнению с культурами MHV при прохождении P13 + 5 + 3 и в средних числах клеток из контрольных и MHV культур в проходе P13 + 5 + 4 (P <0,05) .Fig , 1 Среднее количество клеток, найденных за репликацию (n = 4) после культуры зараженных вирусом и контрольных mESCs в течение четырех проходов. mESC были инфицированы 0,1 TCID50 MHV-A59 или MMVp на клетку; средства контроля были безвирусными. МЭСК пассировали каждые 2 дня

В первых двух проходах культуры 1 с MHV-A59 титр супернатанта был выше, чем 1010 TCID50 / мл, уменьшившись до 107,8 TCID50 / мл в четвертом проходе (таблица 2). При первом прохождении культуры 2 титр надосадочной жидкости был также выше 1010 TCID50 / мл, уменьшаясь до 107,5 TCID50 / мл в четвертом проходе. Что касается MMVp, то при первом прохождении культуры 1 вирусный титр супернатанта составлял 104,8 TCID50 / мл (таблица 2). Вирусы не были обнаружены на третьем в пятом проходе. При первом прохождении культуры 2 вирусный титр супернатанта составлял 103,8 TCID50 / мл, уменьшаясь до 101,3 TCID50 / мл в пятом проходе. Типичный 2-вирусный титр супернатантов после культивирования mESC с MHV-A59 или MMVp

n.d., не сделано

Когда mESC подвергали воздействию 104 TCID50 MHV-A59 / cell в течение 6 ч и вводили в бластоцисты, один из пяти реципиентов засорял двух нехимерных щенков (таблица 3). В общей сложности четыре из пяти реципиентов сероконвертировали к 14-му дню и показали наличие антител против МГВ в течение экспериментального периода. Оба щенка были сероположительными для MHV на d42 и, d63, антитела MHV больше не были найдены. Когда mESC подвергали воздействию 10-1 TCID50 MHV-A59 / cell в течение 6 часов и вводили в бластоцисты, все пять реципиентов засоряли 34 щенка, из которых 17 были химерическими. Ни получатели, ни щенки не были сероположительными для MHV-A59. В группе MMVp, когда mESC культивировали с помощью 10-1 TCID50 MMVp / cell в течение 6 часов и вводили в бластоцисты, все пять реципиентов засоряли 30 щенков, три из которых были химерными. Ни получатели, ни щенки не были серопозитивными для MMVp. Контроль mESC привел к тому, что все три реципиента засоряли 16 щенков, три из которых были химерическими. Контрольные мыши не проявляли антитела против MHV-A59 и антитела против MMVp. Таблица 3 Результаты инъекции бластоцисты с MHV-A59- и MMVp-мишенью (P13 + 5 + 6 ч) mESC и перенос в d2.5 псевдопрегнантных реципиентов

Различные онлайн-алфавиты в столбцах указывают на значительные различия (P <0,05)

Значительно большее число химерных щенков родилось в группе MHV-A59, чем в группе MMVp, где mESC инокулировали 10-1 TCID50 MHV-A59 или MMVp / клеткой и в контрольной группе (P <0,05). Значительные различия наблюдались в числе серопозитивных реципиентов в группе MHV-A59 (104 TCID50 / клетка) по сравнению с MHV-A59 (10-1 TCID50 / cell) и группами MMV (P <0,05). Что касается потомства, значительно большее число мышей было сероположительным в группе MHV-A59 (104 TCID50 / клетка) на d42 (P <0,05).

Когда mESC подвергали воздействию 10-1 TCID50 MHV-A59 / клетку для четырех проходов и вводили в бластоцисты, пять из 11 реципиентов усеивали 16 нехимерных щенков (таблица 4). В общей сложности девять из 11 и 10 из 11 реципиентов сероконвертированы соответственно d14 и d21. Все 16 щенков были сероположительными для MHV на d42. К d63 шесть щенков были сероположительными, а через d84 после эмбрионального переноса больше не проявлялись антитела к MHV. Когда mESC культивировали с 10-1 TCID50 MMVp / cell для пяти проходов и вводили в бластоцисты, шесть из девяти реципиентов засоряли 22 нехимерных щенков. Ни один из получателей или щенков не был серопозитивным для MMVp в течение всего экспериментального периода. Инъекция бластоцисты с контрольными mESC приводила к трем из четырех реципиентов, засоряющих 19 щенков, восемь из которых были химерическими. Контрольные мыши не проявляли антител к MHV-A59 и MMVp.Таблица 4Результаты инъекции бластоцисты с MHV-A59 (P13 + 5 + 4) и MMVp (P13 + 5 + 5) открывали mESC и переносили в d2.5 псевдопрегнантных реципиентов

Различные онлайн-алфавиты в столбцах указывают на значительные различия (P <0,05)

Все мыши были серонегативными по d84

bThree химеры были женщины

В контрольной группе было получено значительно большее число химерных мышей (Р <0,05). Количество серопозитивных реципиентов и щенков было значительно выше в группе MHV-A59 (P <0,05).

В таблице 5 приведено краткое описание репродуктивных и серологических данных, полученных при инъекции бластоцисты с помощью мЭСК, подверженных воздействию вируса, в течение 6 или 4 (MHV-A59) или пяти (MMVp) проходов. После 6-часовой совместной инкубации mESC с 104 и 10-1 TCID50 MHV-A59 / клеткой из 50 эмбрионов 1 и 5 литров из пяти реципиентов состояли из 4% и 68% живых щенков соответственно (P <0,05). Никаких зародышевых химер не получали из группы, получавшей mESC, которые были совместно инкубированы с 104 TCID50 MHV-A59 / cell. Кроме того, один из пяти реципиентов только из этой группы был серопозитивным. Что касается 6-часовой совместной инкубации mESC с 10-1 TCID50 MHV-A59 / cell, то 17 микроорганизмов рождались у всех пяти реципиентов, которые засорялись, и восемь химер из трех пометов показали GLT. В среднем родилось семь щенков на зародышевую химеру. Одной химерой была женщина, которая не рождала щенков. Ни у одной из мышей этой группы не было антител против MHV. В группе 10-1 TCID50 MMVp / cell 60% эмбрионов приводили к появлению живых щенков. Из всех получателей, которые засорялись, были получены три химеры из двух пометов, все из которых показали GLT. В среднем родилось 6,7 щенков на зародышевую химеру. Мыши в этой группе были серонегативными для MMV. В контрольной группе у 53% эмбрионов были живые щенки. Из трех получателей, которые засорились, были получены три химеры из двух пометов, все из которых показали GLT. В среднем родилось 6,7 щенков на зародышевую химеру. Контрольные мыши были серонегативными для MHV и MMV.Таблица 5Редуктивная эффективность и серология мышей, получавших бластоцисты, инъецированные MHV-A59 (P13 + 5 + 4) и MMVp (P13 + 5 + 5), подвергнутые воздействию mESC

Различные онлайн-алфавиты в пределах строк указывают на значительные различия (P <0,05)

Была получена одна не-зародышевая женская химера

bThree женские химеры были получены

cTwo женские химерки зародышевой линии были получены

После культивирования mESC с 10-1 TCID50 MHV-A59 или MMVp / клеткой для четырех или пяти проходов, из 110 и 120 эмбрионов соответственно, пять из 11 и шесть из 12 реципиентов родили помет с 16 и 22 щенка соответственно (P> 0,05). Из этих двух групп не было получено никаких химер. Все пять реципиентов из группы MHV-A59, которые засорялись, были серопозитивными, в то время как антитела против MMV не присутствовали у реципиентов из группы MMV. Из контрольных эмбрионов 48% приводили к появлению живых щенков, и результат был значительно отличен от результатов по обеим вирусным группам (P <0,05). Из трех получателей, которые засорились, было получено восемь химер, пять из которых показали GLT. В среднем родилось 6,2 щенков на зародышевую химеру. Мыши были серонегативными как для MHV, так и для MMV. Сравнение группы MHV-A59 (10-1 TCID50 MHV-A59 / клетка) через 6 часов или после четырех проходов показало, что были значительные различия в количестве пометов с химерами (5/5 против 0/5 соответственно) и в количестве серопозитивных помет (0/5 против 5/5 соответственно) (P <0,05).

В настоящем исследовании изучалась восприимчивость mESC к инфекции MHV-A59 и MMVp и риск передачи этих двух вирусов мышам mESC во время инъекции бластоцисты и переноса эмбрионов. Кроме того, было определено влияние этих вирусов на GLT мЭСК. MHV и MMV были выбраны, поскольку они относятся к числу наиболее распространенных вирусов, обнаруженных в современных мышах, и MHV-репликации в цитоплазме, тогда как MMV реплицируется в ядре клетки.

На первом этапе бластоцисты подвергали микроинъекции с примерно 1 нл вирусных запасов, чтобы определить, будут ли реципиенты сероконвертироваться и повлияет ли репродуктивная эффективность. Настоящие данные показывают, что микроинъекция бластоцист с титрами до 109 TCID50 MHV-A59 / мл приводит к сероконверсии реципиентов, а в некоторых случаях у щенков также есть антитела против MHV, которые имеют материнское происхождение. Титр MMVp, используемый в этом исследовании, не приводил к сероконверсии реципиентов, и у щенков не было антител против ММВ, что свидетельствовало о том, что титр вируса был слишком низким. Из-за небольшого объема жидкости, которая была введена, действительно, одна бластоциста получила бы максимум 1 TCID50 MHV-A59 или 10-5 TCID50 MMVp, и получатели получали максимальную дозу 10 TCID50 MHV-A59 или 10-4 TCID50 MMVp поскольку 10 бластоцист были переданы каждому реципиенту. Кроме того, на эффективность репродуктивной функции, по-видимому, не влияло присутствие вирусов даже при высокой дозе MHV, скорее всего, из-за кратковременного воздействия бластоцист на вирусы и отсутствия репликации вируса у эмбрионов или сами плоды. Все исследованные щенки, в том числе рожденные у серопозитивных реципиентов, были свободны от вируса, как показывает анализ ПЦР.

Насколько нам известно, есть только один отчет о микроинъекции мышиного вируса в зиготы с последующим переносом эмбрионов (Tebourbi et al., 2002). После микроинъекции мышиного цитомегаловируса (MCMV) в цитоплазму зигот с титром 108 единиц образования бляшек (PFU) / мл, 10 промывок средой M2 и переносом эмбрионов, эти работники сообщили, что количество щенков, родившихся на подстилке, было не зависит от наличия MCMV. Несмотря на то, что ПЦР-анализ обнаружил ДНК MCMV в культивируемых эмбрионах in vitro, ни у одного из них не было обнаружено у щенков и реципиентов (Tebourbi et al., 2002). Напротив, Baskar et al. (1993) вводили 5-20 молекул ДНК MCMV в мужской пронуклеус каждой зиготы с той же методикой, которая используется для трансгенеза и передавала полученные бластоцисты получателям. Эти работники сообщили о меньших размерах мусора, замедлении роста плода, резорбции эмбриона, аномалиях и ДНК MCMV у эмбриональных мышей. В настоящем исследовании щенки от MHV-сероположительной матери показали наличие антител против MHV, которые уменьшились на d112 после эмбрионального переноса. К сожалению, количество микроинъекции MCMV (Tebourbi et al., 2002) и серологический статус щенков и реципиентов не сообщалось. Что касается репродуктивной эффективности, то представленные результаты подтверждают результаты исследований с использованием MCMV (Tebourbi et al., 2002).

В настоящем исследовании инокуляция mESC с 0,1 TCID50 / клеткой, культурой, для 4-5 проходов и титрованием бесклеточных супернатантов показала, что продуктивная инфекция наблюдалась в культуре с MHV-A59, тогда как ограничительная инфекция была наблюдаемых в культуре с MMVp. Это подтверждается тем фактом, что титры супернатантов из культур с MHV-A59 были выше 107 TCID50 / мл, тогда как титры супернатантов из культур с MMVp уменьшались со временем или не было обнаруженного инфекционного вируса, присутствующего в последующих проходах. В общей сложности восемь линий мЭСК различного генетического происхождения, включая B6, B6CBAF1 и 129 / Sv, которые были инфицированы 0,1 множественностью инфекции (moi), реплицированными MHV-2 и MHV-A59 в течение 2-3 дней (Kyuwa 1997). Последний работник наблюдал титры более 106 ПФУ / мл и небольшой цитопатический эффект. В отличие от исследования Kyuwa (1997), наши результаты показывают, что mESC, культивируемые с MHV-A59, привели к хорошо выраженному цитолизу, что привело к уменьшению числа клеток. В исследовании Kyuwa (1997) нет информации о количестве клеток, культивируемых и / или инфицированных двумя штаммами MHV, и культура была только краткосрочной, в отличие от настоящего исследования. Однако более интенсивное исследование in vitro было выполнено Okumura et al. (1996), который продемонстрировал, что мески, полученные из 129 / SvJ, которые были инфицированы менее патогенным MHV-2 при moi 1, реплицировали вирус в течение более 60 дней, все клетки были инфицированы, титры вируса достигали 106-109 PFU / мл, и плюрипотентность mESC не была затронута.

В отличие от культуры с MHV, в настоящем исследовании никаких заметных изменений не наблюдалось с MMVp, а количество клеток увеличивалось во время культивирования. Во время обычной mESC-культуры вирусные штаммы, вызывающие цитолиз, такие как MHV-A59, будут обнаружены морфологически, тогда как те, которые не вызывают открытые эффекты, такие как MHV-2 (Okumura et al., 1996), могут оставаться незамеченными, если не используются соответствующие диагностические методы.

Парвовирусы грызунов связываются с поверхностными рецепторами, которые экспрессируются на большинстве клеток и, по-видимому, не интегрируются в хромосомы хозяина во время литических или персистирующих инфекций (Cornelis et al., 2004). Репликация парвовируса в разрешающих клетках в течение 20-30 ч (Ward and Tattersall 1982) приводит к высвобождению вирионов потомства и обычно ассоциируется с гибелью клеток. В рестриктивной культуре хозяина вирусный выход из культуры всегда меньше, чем множественность, необходимая для его получения. Даже при очень высокой дозе 5-10 PFU / клеток только 0,1-5% клеток продуктивно инфицированы и умирают (Ward and Tattersall, 1982). Оставшиеся в живых (95-99%) продолжают расти и не заражаются при первоначальной множественности, и поэтому инфекции быстро разлагаются. Предыдущее исследование показало ограничительную инфекцию клеток мышиной эмбриональной карциномы (mECC) с MMV (Miller et al., 1977). Менее 0,1% положительных ядер были обнаружены, когда клетки были инфицированы 10 PFU / клеткой (Miller et al., 1977). Блокирование репликации MMV в стволовых клетках тератокарциномы не является полным; небольшая часть инфицированных клеток продуцирует капсидный антиген (Miller et al., 1977). В настоящем исследовании было обнаружено, что 6% клеток были положительными как для POU5F1, так и для MMV при P13 + 5 + 1 с помощью анализа FACS, тем самым поддерживая предыдущие результаты (Miller et al., 1977; Ward and Tattersall, 1982). Что касается репликации MMV, mESC, используемые в настоящем исследовании, аналогичны mECC. Устойчивость к инфекции MMV может включать перенос вирусного антигена или капсида в ядро ​​(Tattersall 1978) или в результате пост-адсорбционных событий, а не отсутствие связывания вируса с поверхностью клетки-мишени (Spalholz and Tattersall 1983; Tattersall и Bratton, 1983).

Настоящие результаты показывают, что инъекция бластоцисты с mESC, подвергнутая воздействию 10-1 TCID50 MHV-A59 и MMVp в течение 6 часов, привела к образованию химер зародышевой линии. Кроме того, реципиенты были серопозитивными для MHV-A59, но не для MMVp, только когда использовалась высокая доза 104 TCID50 / mESC. Щенки были серопозитивными для MHV-A59, когда их матери были серопозитивными к 14-й день после переноса эмбрионов. Кроме того, это антитело было материнским по происхождению, так как оно уменьшалось со временем после рождения. Что касается полученной химерной зародышевой линии, то такое же количество потомства родилось, когда мЭСК были безвирусными или культивировали с 10-1 TCID50 MHV-A59 или MMVp / cell в течение 6 часов. Культура с более высокой дозой (104 TCID50 / mESC) MHV-A59 не привела к образованию химер. Аналогичным образом, культура с 10-1 TCID50 MHV-A59 или MMVp / cell в течение четырех или пяти проходов не приводила к образованию химер, тогда как контроль не влиял. Кроме того, как и в случае 6-кратной краткосрочной культуры с 104 TCID50 MHV-A59 / mESC, сероконверсия также имела место при длительной экспозиции MHV (P13 + 5 + 4), но не в MMV (P13 + 5 + 5) mESC. Введение бластоцисты с mESC, которые ранее инкубировали в течение 1 часа с 1 PFU MCMV / клеткой, приводило к развитию нормального потомства, которое не содержало ДНК MCMV (Tebourbi et al., 2002). Однако данные о статусе антитела реципиентов и щенков из этого исследования отсутствуют. Подобно настоящему исследованию, в котором mESC инкубировали с вирусами в течение 6 часов, отсутствие эффекта на репродуктивные характеристики путем совместной инкубации mESC с MCMV может быть связано с кратковременным воздействием.

Количество проходов mESC может повлиять на GLT. Nagy et al. (1993) сообщили, что длительная культура in vitro влияет на начальную тотипотентность клеточной линии R1 (129 / Sv × 129 / Sv-CP), тогда как сублины способны к дальнейшей культуре, сохраняя их тотальность и приводя к жизнеспособным химерам. В настоящем исследовании mESC культивировали без питающих клеток на желатине для обеспечения надежного производства данных только из mESC. Из-за низкого количества mESC из культур, инокулированных MHV-A59 в более поздних проходах, было невозможно измерить состояние плюрипотентности с использованием FACS. Вместо этого mESC использовались для инъекций бластоцисты. Однако при P13 + 5 + 1 процент МЭСК, положительный только для POU5F1, был самым высоким в контрольной группе (80%) по сравнению с группами MHV (55%) и MMV (65%). Истинным критерием плюрипотентности mESC является вклад в зародышевую линию. В этом исследовании было затронуто производство зародышевых химер, что указывает на то, что отсутствие GLT было связано с наличием вирусов, а не с количеством проходов, поскольку безрецептурные контрольные mESC приводили к зародышевым химерам. Причина отсутствия GLT в MES-факторах, подвергнутых MHV, может быть связана с эффектами, связанными с цитолизом, возможно, из-за ингибирования макромолекулярного синтеза хозяина, но механизм остается неясным в отношении того, почему GLT MMES-облученных mESC был затронут, несмотря на ограничительная инфекция и отсутствие антител против ММВ у реципиентов и щенков. Последнее наблюдение может быть связано с изменениями в ядре mESC, поскольку MMV реплицируется в ядре разрешающих клеток, но это явление требует дальнейшего изучения.

В заключение, это исследование показало, что вирусы, такие как MHV и MMV в культурах mESC, влияют на GLT мЭСК. Принимая во внимание все более широкое использование mESC в биомедицинских исследованиях, первостепенное значение имеет скрининг mESC для нежелательных микроорганизмов до их использования. Таким образом, раннее обнаружение могло бы сэкономить ценные ресурсы, в то время как можно было бы избежать неправильной интерпретации экспериментальных результатов. Кроме того, использование беспозвоночных mESC имеет важное значение для благосостояния животных, поскольку количество мышей, используемых для генной инженерии, может быть уменьшено.

Мы выражаем благодарность наблюдателям за животными и С. Вайдеман за техническую помощь.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *