Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Нейтрализация различных штаммов цитомегаловируса человека, назначаемых антителами, нацеленных на вирусный гепатит gH / gL / pUL128-131 Pentameric Complex

Neutralization of Diverse Human Cytomegalovirus Strains Conferred by Antibodies Targeting Viral gH/gL/pUL128-131 Pentameric Complex
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5355600/

Citation Ha S, Li F, Troutman MC, Freed DC, Tang A, Loughney JW, Wang D, Wang IM, Vlasak J, Nickle DC, Rustandi RR, Hamm M, DePhillips PA, Zhang N, McLellan JS, Zhu H, Adler SP, McVoy MA, An Z, Fu TM. 2017. Нейтрализация различных штаммов цитомегаловируса человека, полученных антителами, нацеленными на пентамерный комплекс вируса gH / gL / pUL128-131. J Virol 91: e02033-16. https://doi.org/10.1128/JVI.02033-16.

Цитомегаловирус человека (HCMV) является ведущей причиной врожденной вирусной инфекции, а разработка профилактической вакцины имеет первостепенное значение для общественного здравоохранения. Недавно мы сообщили о неполноценном человеческом цитомегаловире с восстановленным пентамерным комплексным гликопротеином H (gH) / gL / pUL128-131 для профилактики врожденной инфекции HCMV. В то время как количество ответных антител к вакцинам может быть измерено в анализе вирусной нейтрализации, оценка качества таких ответов, включая способность антител, индуцированных вакцинами, к перекрестной нейтрализации полевых штаммов HCMV, остается проблемой. В этом исследовании с группой нейтрализующих антител от трех здоровых доноров человека с естественной HCMV-инфекцией или вакцинированным животным мы сопоставили восемь сайтов на доминирующем антивирус-нейтрализующем антигене — пентамерный комплекс гликопротеина H (gH), gL и pUL128 , pUL130 и pUL131. Оценивая специфические для сайта антитела в иммунных сыворотках вакцин, мы продемонстрировали, что вакцинация выявила функциональные противовирусные антитела к множественным нейтрализующим сайтам в макаках резуса с атрибутами качества, сопоставимыми с характеристиками гиперинмунного глобулина CMV. Кроме того, эти иммунные сыворотки проявляли противовирусную активность против группы генетически отличных клинических изолятов HCMV. Эти результаты подчеркивали важность понимания качества ответных антител к вакцинам, которые включают не только нейтрализующую активность в ключевых типах клеток, но и способность защищать от генетически разнообразных полевых штаммов.

ВАЖНОСТЬ HCMV является основной причиной врожденной вирусной инфекции, а разработка профилактической вакцины является одним из приоритетов общественного здравоохранения. Чтобы понять охват штаммов иммунных ответов, индуцированных вакцинами, по сравнению с естественным иммунитетом, мы использовали панель широко нейтрализующих антител для идентификации иммуногенных сайтов доминантного вирусного антигена — пентамерного комплекса. Мы также продемонстрировали, что после вакцинации вируса с дефектом репликации с восстановленным пентамерным комплексом макаки резуса могут вырабатывать широко нейтрализующие антитела, нацеленные на многочисленные иммуногенные сайты пентамерного комплекса. Такой анализ специфических для сайта ответов на антитела является обязательным для нашей оценки качества вакцинного иммунитета в клинических исследованиях.

Цитомегаловирус человека (HCMV) является вездесущим в популяции человека. В то время как HCMV-инфекция, как правило, бессимптомна у здоровых людей, она может вызывать серьезные заболевания у пациентов с ослабленным иммунитетом, таких как реципиенты трансплантата при иммуносупрессии. HCMV также признан ведущей причиной вирусной инфекции внутриутробного происхождения, по оценкам, примерно в 0,64% случаев беременности в Соединенных Штатах (1). Врожденная передача HCMV может произойти после первичной инфекции у HCMV-серонегативных матерей или нетримальной инфекции у HCMV-серопозитивных женщин (2). Хотя у большинства инфицированных новорожденных нет клинического проявления инфекции при рождении, врожденная инфекция HCMV может привести к неврологическим осложнениям у 12-25% инфицированных детей с проявлениями, которые включают сенсорную потерю слуха и нарушения зрения. Никакая вакцина пока не доступна, несмотря на то, что Институт медицины назначил профилактику против врожденного HCMV до наивысшей категории приоритетов вакцины с 1999 года (3).

Предконцептивный материнский иммунитет от естественной HCMV-инфекции связан с 69% -ным снижением риска передачи матери-плода (4). Кроме того, HCMV-сероположительные женщины с ребенком в дневном стационаре защищены от вторичной инфекции от салата HCMV своими детьми (5). Эти наблюдения показывают, что естественный иммунитет HCMV защищен от передачи HCMV как в вертикальном, так и в горизонтальном режимах; это понятие было принято в качестве обоснования для разработки и разработки живых аттенуированных вакцин HCMV, таких как вакцина Таун (6-8). Однако иммунитет от естественной инфекции может не обеспечивать полной защиты от суперинфекции (9). Здоровые серопозитивные женщины могут приобретать вторичную инфекцию, диагностировать либо на основе вирусного пролития, либо путем вывода серологических ответов на антигены, отличные от тех, которые были вызваны их предшествующей HCMV-инфекцией (10). Важно отметить, что суперинфекция у женщин может приводить к врожденной передаче (11, 12), а дети, рожденные с такими врожденными инфекциями, могут вызывать осложнения, подобные, но обычно более мягкие, чем те, которые вызваны первичной материнской инфекцией (13, 14). Отсутствие полной защиты с помощью естественного иммунитета может быть связано с дефектным иммунитетом хозяина к HCMV, как это описано у реципиентов трансплантата при иммуносупрессии. Это также может быть связано с воздействием вирусных инокулятов с высокой инфекционностью, таких как обнаруженные в моче и слюне малыша (15). Наконец, антивирусные антитела, индуцированные естественной инфекцией, могут иметь специфичность штамма, и при этом обстоятельство предопределяющий иммунитет матерей может быть неэффективным для защиты от врожденной передачи другого штамма HCMV. Понимание зависимости от деформации ответов на антитела имеет важные последствия для развития вакцины.

HCMV представляет собой двухцепочечный ДНК-вирус с геномной способностью кодировать по меньшей мере 20 гликопротеинов (16, 17). Ввод HCMV требует согласованных усилий нескольких гликопротеиновых комплексов. Гликопротеин B (gB) представляет собой слитый белок класса III (18-20). Его фузогенная активность должна запускаться через взаимодействие с комплексами, содержащими гликопротеины H (gH) и L (gL) (18, 21, 22). Тримерный комплекс, который включает gO (gH / gL / gO), опосредует проникновение вируса в фибробласты, а недавние сообщения показывают, что gH / gL / gO может участвовать в вирусном проникновении во все типы клеток (23-25). Пентамерный комплекс, состоящий из gH / gL, связанный с pUL128, pUL130 и pUL131, определяет вирусный тропизм для эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток и лейкоцитов, скорее всего, через рецептор-опосредованный путь эндоцитоза (20, 26-31). Характеристика in vitro очищенных моноклональных антител (MAbs) выявляет две категории противовирусных антител: одна нейтрализует инфекцию эпителиальных клеток и преимущественно распознает эпитопы, расположенные на пентамерном комплексе, тогда как другая нейтрализует инфекцию фибробластов, а также эпителиальных клеток и распознает эпитопы, расположенные либо на gB или комплексе gH / gL / gO (27, 32-35). Неизвестно, какая категория антител более важна для предотвращения HCMV-инфекции in vivo.

Недавно мы сообщали о вакцине, состоящей из репликационно-дефектного штамма AD169, в котором был восстановлен пентамерный комплекс. Кандидат, получивший название V160, в настоящее время находится под клинической оценкой и, как было показано, способен вызывать как гуморальные, так и клеточные иммунные ответы в доклинических моделях животных (36). Важно отметить, что он предназначен для представления всех соответствующих антигенов, включая пентамерный комплекс, в иммунную систему в естественных конформациях. Чтобы устранить проблему защиты от натяжения V160, мы собрали панель нейтрализующих MAbs, нацеленных на пентамерный комплекс. Эти MAbs, полученные из одного привитого кролика и трех здоровых здоровых доноров, использовали в качестве зондов для идентификации восьми иммуногенных сайтов на пентамерном комплексе. Антитела со специфичностью к семи из этих сайтов могут нейтрализовать панель первичных изолятов HCMV. Кроме того, иммунные сыворотки от V160-вакцинированных резус-макак были способны конкурировать с этими нейтрализующими MAb, с эффективным покрытием деформации, как оценивается нейтрализацией.

Раньше мы идентифицировали 11 элитных нейтрализующих MAbs у вакцинированного кролика, который признал пентамерный комплекс (27). Позже мы идентифицировали и клонировали 10 антител, основанных на нейтрализации из B-клеток памяти, выделенных из трех здоровых доноров-доноров с естественной HCMV-инфекцией, и они были обнаружены как пентамер-специфичные MAb. Мы собрали эти нейтрализующие MAbs, включая 10 человеческих и 11 кроличьих MAbs, чтобы исследовать уникальные нейтрализующие эпитопы на этом комплексе антигенов.

Сначала мы подтвердили проточной цитометрией, что выбранные MAbs из панели могут распознать пентамерный комплекс в его нативной форме на вирусных частицах (37). Вирус V160, восстановленный с помощью пентамерного комплексного выражения, может быть помечен всеми проверенными МАБ (рис.1А). Напротив, вирус AD169, который не обладает экспрессией пентамерного комплекса, не может быть помечен большинством MAbs, кроме 58,5 и 3-15 (фиг.1B). Этот результат предположил, что существуют некоторые общие эпитопы между gH / gL / gO и пентамерным комплексом.

Биохимические характеристики MAbs, специфичные для пентамерного комплекса. (A и B). Для оценки реактивности выбранных MAbs на вирусные частицы, измеренные проточной цитометрией, вирус V160 с восстановленной экспрессией пентамерного комплекса gH (A) и вируса AD169 (B) смешивали с каждым MAb, как указано, а затем окрашивали флуоресценции вторичного антитела. Контрольные образцы инкубировали с поликлональными антителами от серонегативного донора. Антитела, связанные с обоими вирусами, обозначены красным цветом. Представленные данные представляют собой два эксперимента. (C) Относительное аффинность связывания определяли количественным ELISA и выражали как EC50, который определяется как концентрация IgG, необходимая для достижения максимального связывания 50%. EC50 определяли с помощью четырехпараметрического подгонки, и если была плохая подгонка, назначался произвольный EC50 100 мкг / мл. Рекомбинантный пентамерный комплекс (PENTAMER) или гомодимер gH / gL (DIMER) получали на основе вирусной последовательности штамма Towne. (D) Вестерн-блот-анализ MAbs для денатурирования и снижения вирусных антигенов AD169.

Чтобы лучше понять специфичность антител к обычному стечению gH / gL или к области, уникальной для пентамерного комплекса, мы проверили связывание этих MAbs с растворимыми формами пентамерного комплекса gH / gL / pUL128-131 (где pUL128-131 представляет собой pUL128 , pUL130 и pUL131) и димер gH / gL, на которые соответственно ссылаются как пентамер, так и димер. Ранее сообщалось, что оба рекомбинантных комплекса сохраняют конформационные нейтрализующие эпитопы в качестве антигенов, сравнимых с мембраносвязанными формами (38). Относительные аффинности этих MAbs к антигенам оценивали и вычисляли как эффективную концентрацию IgG, необходимую для достижения 50% максимального сигнала в ELISA (EC50). Девять антител могут связываться как с пентамером, так и с димером (фиг.1C), что указывает на их специфичность к части gH / gL комплекса, а восемь могут связываться только с пентамером, что указывает на их специфичность к эпитопу, включающему по меньшей мере один из три компонента pUL128-131. Четыре антитела (15,1, 58,5, 223,4 и 347,3) не реагировали ни на пентамер, ни на димер в ELISA. Кроме того, стоит отметить, что два связующих gH / gL, 1-32 и 70,7, не маркировали вирус AD169 (фиг.1A и B), хотя эти два эпитопа должны теоретически присутствовать в комплексе gH / gL / gO , Таким образом, неспособность антител 1-32 и 70,7 реагировать на вирус AD169 предполагала, что их эпитопы на комплексе gH / gL / gO не были легко доступны на вирусной оболочке, возможно, из-за интерференции gO.

Затем мы измерили реактивность этих MAbs на денатурирование вирусных белков с помощью Вестерн-блоттинга с предположением, что вирусные белки после обработки детергентом и восстанавливающим агентом будут лишены какого-либо конформационного эпитопа. На фиг.1D ни один из 17 MAbs не реагирует на какие-либо вирусные белки, что указывает на то, что они, вероятно, нацелены на конформационные эпитопы. Четыре MAbs (15,1, 58,5, 223,4 и 347,3) реагировали с антигеном около 125 кДа от денатурированного вируса V160 в Вестерн-блотах. Затем эти MAb идентифицировали для реагирования на линейные эпитопы, расположенные на остатках gH 26-43, которые специфичны для AD169 (данные не показаны). Этот результат согласуется с наблюдением, что эти MAb не реагируют ни на пентамер, ни на димер, поскольку оба рекомбинантных комплекса, используемых в ELISA, были сконструированы с gH на основе аминокислотной последовательности штамма Towne (27).

Для дальнейшей группировки этой группы антител на основе их сайтов распознавания мы использовали интерферометрию biolayer для измерения конкуренции при попарных антителах. Результаты конкурса представили семь уникальных иммуногенных сайтов пентамера (таблица 1). Среди семи иммуногенных сайтов только участок 5 частично перекрывался с участком 6, в то время как конкуренция не наблюдалась среди мест 1, 2, 3, 4, 6 и 7, что указывает на то, что эти участки содержат неперекрывающиеся эпитопы. Мы не включили MAb 1-125 в этот эксперимент, так как наш более ранний эксперимент с использованием отдельных биотинилированных MAbs в качестве зондов в соревновании ELISA показал, что MAb 1-125 эффективно конкурирует с сайтом 2 антителами 1-85 и 1-150 (данные не показаны).

Обобщение попарного ингибирования антител

Биосенсоры, покрытые рекомбинантным растворимым пентамерным комплексом, подвергали макетной обработке (PBS) или насыщали 15 мкг / мл антителом 1 до воздействия 15 мкг / мл антитела 2. Если антитела 1 и 2 конкурируют за связывание, связывание антитела 2 будет уменьшаться на предварительная обработка антителом 1 по сравнению с ложной обработкой. Процент ингибирования для каждого антитела 2 рассчитывали путем нормализации этих сигналов до полного сигнала связывания при манекере. Ингибирование ≥70% заштриховано. Отрицательный сигнал указывает на то, что связывание антитела 2 увеличивается в присутствии антитела 1. Это может быть вызвано синергетическим связыванием между двумя независимыми эпитопами или взаимозависимым взаимодействием антитело-антитело.

b S1, сайт 1 и т. д.

c Антитело.

Для подтверждения и сопоставления множественных иммуногенных сайтов на пентамере, выявленных с помощью биохимических характеристик, мы проанализировали негативные окрашивающие ЭМ двумерные (2D) средние классы пентамера, связанные репрезентативными антителами из участков с 1 по 7 (рис.2). Средние значения 2D-класса показали, что свободный пентамер содержит три различимые области с криволинейной областью 1, слабо связанной с областью стебля областей 2 и 3, длиной приблизительно 4 нм и 7 нм соответственно. Мы обнаружили, что Fab 270.7 связан с пентамером в домене 2, тогда как эта Fab также связана с гомодимером gH / gL во внутренней области, которая, как известно, содержит gL и N-конец gH (33). Он предположил, что домен 1, вероятно, состоит из pUL128-131, домена 2 gL и N-конца gH и домена 3 C-конца gH, что соответствует предыдущему докладу (33). Кристаллическая структура вируса Эпштейна-Барра (EBV) gH / gL (PDB 3PHF), которая имеет сходство последовательностей 24% с HCMV gH / gL (39), может быть наложена на изображение 2D-класса пентамера-270.7, поддерживая назначение для доменов 2 и 3. Было обнаружено, что сайты с 1 по 4 антитела нацеливаются на кончик домена 1, что согласуется с наблюдением, что сайт с 1 по 4 антитела связан только с пентамером, а не с областью стебля gH / gL (фиг.1С) , Сайт 5 MAb 1-32 нацелился на один конец домена 2, а сайт 6 MAb 270.7 нацелился на другую сторону домена 2. Сайт 7 MAb нацелился на сторону домена 3. Поскольку домены 2 и 3 были сохранены в gH / gL, 2D изображения согласуются с наблюдением, что сайт 5-7 антител, связанных как с пентамером, так и с гомодимером gH / gL (фиг.1С).

Отрицательные окрашивающие средние среднеквадратичные значения среднеквадратичного значения гомогенного рекомбинантного пентамера и gH / gL и их комплексов с различными Fab. Три домена пентамера помечены красными цифрами. Структура EBV gH / gL (PDB 3PHF) показана в виде лент с цветным пурпуром gL и серым цветом gH. Изображения в пунктирных овалах обозначают указанную Fab.

Трехмерные (3D) реконструкции были выполнены для пентамера, связанного Fab 2-25, 1-85 и 1-103, а 3D-карты восстановленной плотности с разрешением 35-40 Å показаны на фиг.3A. Кристаллические структуры EBV gH / gL (PDB 3PHF) и анти-gB Fab (PDB 4OSU) были вручную установлены в 3D-структуру EM для облегчения интерпретации (39, 40). Оверлея gH / gL стеблей трех изображений (рис.3A, левые три диаграммы), мы обнаружили, что только одна область 1 может принимать разные ориентации в этих комплексах, что указывает на ее гибкость ориентации (рис.3A, правая панель), согласующаяся с предыдущего доклада (34). Сравнивая три структуры с ранее зарегистрированными (EMD-6436, -6347, -6438), мы обнаружили, что сайт 3 является уникальным сайтом, который ранее не описывался. Сайты 1 и 2 близки к ранее зарегистрированному сайту связывания, признанному 2C12 (34), и для окончательного сравнения потребуется исследование конкурентного связывания.

EM 3D-реконструкция пентамера, связанного Fabs, и сводная диаграмма идентифицированных иммуногенных сайтов. (A) Структуры пентамера, связанные с Fab 2-15, Fab 1-85 или Fab 1-103, и их наложение, которое поворачивалось на 180 ° по горизонтали относительно отдельных структур. Метод случайного конического наклона (RCT) использовался для восстановления трехмерных структур. Поверхностный рендеринг был сгенерирован с использованием пакета визуализации Chimera. Чтобы помочь интерпретации структуры, кристаллические структуры EBV gH / gL (PDB 3PHF) и анти-gB Fab (PDB 4OSU) были вручную установлены в EM 3D-карту с использованием химеры. Гликопротеин gH окрашен в серый цвет, а gL окрашен в желтый цвет. Числа с 1 по 3 коррелируют с областями, видимыми в среднем диапазоне EM 2D (рис.2). (B) Диаграмма, показывающая четыре иммуногенных региона (IR) и восемь иммуногенных сайтов пентамера HCMV, нацеленных на 20 нейтрализующих антител. Стрелки показывают приблизительные положения иммуногенных сайтов на основе EM-изображений.

Из биохимических характеристик, конкуренции при попадании антител и картирования ЭМ-эпитопа можно было бы назначить в общей сложности четыре иммуногенных области (ИК) на пентамерном комплексе (фиг.3В). IR1 состоял из pUL128, pUL130 и pUL131, показанных как домен 1 в средних значениях пентамера EM 2D. Четыре неперекрывающиеся конформационные иммуногенные сайты (сайты 1-4) были идентифицированы в IR1 из нашей коллекции MAb, а еще 3 или 4 уникальных сайта существуют в IR1 из других отчетов (34). IR2 состоял из gL и N-конца gH, показанного как домен 2 в средних пентамерах EM 2D. В IR2 были идентифицированы два частично перекрывающиеся конформационные иммуногенные сайты (сайты 5 и 6). IR3, показанный как домен 3 в средних значениях пентамера, состоял из C-конца gH с одним иммуногенным сайтом (сайт 7). IR4 располагался в первых 40 аминокислотах gH с одним линейным иммуногенным сайтом (сайт 8), обычно используемым для различения штаммов AD169 и Towne (41).

Затем мы оценили нейтрализующую функцию антител по отношению к каждому идентифицированному сайту, со спекуляцией о том, что каждый сайт может быть вовлечен по-разному в процесс вирусного входа. Мы тестировали нейтрализационные потенции этих антител как в клетках ARPE-19, так и в MRC-5 (фиг.4).

Потенциалы IR1-IR4-антител в нейтрализации HCMV в клетках ARPE-19 и MRC-5. Представительные антитела к каждому иммуногенному сайту (и ИК) инкубировали при титровании с HCMV. Затем смеси наносили на клетки ARPE-19 (красные круги) или клетки MRC-5 (синие квадраты), события вирусной записи регистрировались путем определения вирусной немедленной ранней экспрессии генов, а IC50s определяли как концентрацию IgG для достижения 50% -ной вирусной ингибирование входа, были рассчитаны с использованием четырехпараметрической подгонки. Представленные данные представляют собой три эксперимента.

Как и ожидалось, антитела IR1, все специфичные для пентамера, продемонстрировали самую эффективную противовирусную функцию в клетках ARPE-19, причем эффективность была более чем примерно в тысячу раз выше, чем у гиперинмунного глобулина CMV (CMV-HIG). Однако этот класс антител не мог ингибировать проникновение вируса в клетки MRC-5, как сообщалось ранее о сильных нейтрализующих антителах против вирусного эпителиального входа (27).

IR2 и IR3 антитела, за исключением 1-32, ингибировали проникновение вируса в клетки ARPE-19 и MRC-5, хотя они были примерно в 100 раз менее эффективны, чем большинство IR1-антител в клетках ARPE-19, что согласуется с предыдущие наблюдения (27, 32, 33, 35). Тот факт, что антитела IR2 и IR3 проявили сходные потенции в обеих клетках APRE-19 и MRC-5, предположил, что IR2 и IR3 могут быть вовлечены в общий механизм вирусной активации, такой как взаимодействие с gB, независимо от клеточного тропизма. 1-32 был уникальным IR2 MAb без противовирусной активности в фибробластах. Среднее исследование класса 2D 2D показало, что Fab 1-32 был направлен на домен 2 с приблизительным углом 180 ° против стека gH / gL, режим связывания значительно отличался от режима других антител gH / gL, таких как 124,4 и 270,7 ( Фиг.2). Мы предположили, что хотя его сайт связывания находится в домене gH / gL, уникальный угол связывания может указывать на то, что эпитоп 1-32 находится за пределами области, участвующей в вирусном проникновении в фибробласты, такой как взаимодействие с gB.

IR4 антитела в этом исследовании ингибировали вирусный вход в APRE-19, но не клетки MRC-5. Эти антитела, по-видимому, отличались от AP86-связывающих сывороток, которые связываются с N-концевым линейным эпитопом gH gH и нейтрализуют AD169 в фибробластах (42). Это может указывать на наличие нескольких эпитопов в N-концевой области gH, включая распознаваемые антителами IR4, и механизм нейтрализации этих антител может быть сложным и специфичным для конкретного типа клеток.

Потенциалы нейтрализации этих антител в разных типах клеток предполагали, что IR1, необходимый для проникновения вируса в эпителиальные клетки, ответственен за высокоэффективные ответы на антитела и что IR2 и IR3 необходимы для ответов антител для защиты различных типов клеток, включая фибробласты , Все три IR являются критическими областями, которые должны быть включены в рациональный дизайн вакцины.

Чтобы решить вопрос о опосредованном антителом покрытии штаммов HCMV, мы затем определили, могут ли IR-специфические антитела нейтрализовать генетически определенные клинические изоляты. Одиннадцать изолятов с полноразмерной информацией о геноме были отобраны и культивированы в клетках ARPE-19 (таблица 2). Например, эти изоляты были разнообразны в последовательностях gO, как сообщалось ранее (43), а среднее расстояние аминокислот для gO среди этих штаммов до уровня в V160 было рассчитано как 20,3% (таблица 3). Однако эти штаммы имели относительно высокое сходство с штаммом вакцины, когда сравнивали их последовательности пентамерного комплекса, причем расстояния аминокислот составляли от 0,2 до 2,3% (таблица 3).

Клинические изоляты и лабораторные штаммы HCMV

Анализ расстояния между белками на выбранных антигенах между клиническими изолятами и V160

Протеиновые расстояния оценивались с использованием алгоритма в PhyML с использованием модели молекулярной эволюции PAM. Значения в таблице были преобразованы с расстояния, взяв 1 минус расстояние и умножив его на 100, чтобы получить процентное сходство. Глобальные значения представляют собой средний процент сходства между полными вирусными последовательностями, полученными от NCBI GenBank (n = 194).

Эти изоляты вместе с двумя лабораторными штаммами затем тестировали в анализах вирусной нейтрализации в клетках ARPE-19 (фиг.5). IR1, IR2 и IR3 нейтрализуют все тестируемые штаммы HCMV, согласующиеся с анализом подобия последовательности пентамерного комплекса и предполагая, что сайты с 1 по 7 были высококонсервативными среди этих штаммов. Напротив, IR4-антитела проявляли различные потенции против разных штаммов, предполагая, что антитела к сайту 8 специфичны по штамму. Из-за специфичности штамма синтетические пептиды, соответствующие сайту 8, использовались в качестве инструментов для серологического подтверждения суперинфекции (41). Нейтрализация этих вирусных штаммов согласуется с наблюдением, что большинство наших антител скринировали и отбирали на основе нейтрализации и обнаружили, что они нацелены на антигены, составляющие пентамерный комплекс, причем ни один из них не является сильно изменяющимся антигеном, таким как gO. Наконец, антитела к сайту 6 и 7 были эффективны против этих штаммов, предполагая защиту от заражения этих штаммов в клетках MRC-5. Эти результаты подтвердили важность сайтов с 1 по 7 при разработке вакцин HCMV для широкого покрытия деформаций.

Потенциалы антител в нейтрализации 11 клинических изолятов и 2 лабораторных штамма в клетках ARPE-19. Представительные антитела с каждого иммуногенного участка инкубировали при титровании с HCMV-вирусом и затем наносили на клетки ARPE-19. События вирусной записи были зафиксированы путем иммунного окрашивания вирусной немедленной ранней экспрессии гена спустя 24 часа. IC50, показанные на оси y, были рассчитаны с использованием четырехпараметрической подгонки. Обозначения антител и их классификация по ИК-областям отмечены на оси х. CMV-HIG был включен в качестве ссылки. Информация о деформации приведена в таблице 2. Показанные данные представляют собой два эксперимента.

Функциональная карта семи консервативных иммуногенных сайтов позволила нам оценить качество ответных антител к вакцинам. В качестве примера пять макак резуса были иммунизированы на неделях 0, 8 и 24 с помощью вакцины, не содержащей репликации V160, составленной с помощью адъюванта Iscomatrix. Иммунные сыворотки оценивали в анализах вирусной нейтрализации в клетках ARPE-19. Эпителиальные нейтрализующие титры достигли максимума после трех прививок на 26 неделе и поддерживались через неделю 64 (фиг.6А).

Оценка V160-индуцированных ответов антител в макаках резуса. (A) Нейтрализационные титры пяти макак резуса, иммунизированных вакциной V160 HCMV. Вакцину вводили на неделе 0, 8 и 24 (красные наконечники стрел), и сыворотки, собранные в указанные моменты времени, оценивали на нейтрализующие активности в клетках ARPE-19. Нейтрализующие титры определяли с помощью обратных разведений в сыворотке для достижения 50% -ного снижения вирусной активности. Представленные данные представляют собой два эксперимента. (B) AbI50 титров иммунной сыворотки резуса по сравнению с CMV-HIG. Любое количество 1 было назначено на сыворотку, если не было обнаруженной активности. Горизонтальные черные полосы представляют собой геометрические средние титры AbI50 для шести сайтов. Сыворотки от A10L106 на 26 неделе и A10R088 на 36 неделе были недоступны для тестирования. (C) титры нейтрализации четырех иммунных сывороток на неделе 36 против 11 клинических изолятов и 2 лабораторных штамма в клетках ARPE-19. Символы условных обозначений для изолятов HCMV показаны на рисунке 5. В панелях B и C значения CMV-HIG нормализуются до начальной концентрации 10 мг / мл для приближения концентрации IgG в сыворотке.

Чтобы оценить, содержат ли иммунные сыворотки антитела со специфичностью к каждому иммуногенному сайту, мы измеряли титр ингибирования связывания антител (последнее разбавление сыворотки, которое ингибирует ≥50% связывания антитела [AbI50]) каждой из иммунных сывороток в течение недель 0 , 26 и 36 против панели зондирующих антител из шести сайтов. Сайт 3 был исключен из этого анализа, так как ни иммунная сыворотка резуса, ни CMV-HIG не могли эффективно конкурировать с MAb 1-103, связывающимся с пентамером в ELISA (данные не показаны). На неделе 0 ни одна из пяти обезьян не имела ранее существовавшего титра AbI50, тогда как на 26-й неделе все четыре тестируемые обезьяны продемонстрировали надежные ответы на антитела к шести сайтам (фиг.6В). Хотя на 36-й неделе ответы на вызванные вакциной антитела ослабевали во всех случаях, титр AbI50 для сайта 4 был сохранен в четырех проверенных обезьянах, а титры AbI50 для сайтов 1 и 7 были сохранены в трех из четырех проверенных обезьян. Результаты показали, что вакцинация выявила антитела, нацеленные на множественные сайты пентамерного комплекса, что указывает на возможность защиты от вирусной инфекции в эпителиальных клетках (сайты 1, 2 и 4 антитела) и фибробластов (сайты 6 и 7 антител) на основе функциональных анализ MAbs на рисунке 4.

Затем мы сравнили ответы на специфические для сайта ответы на антитела в иммунной сыворотке резуса с иммунными ответами от естественной инфекции у людей. Поскольку CMV-HIG получают из плазмы доноров с высоким титром антител против HCMV и оценивали на профилактику против врожденной инфекции HCMV (44, 45), мы измеряли 50% ингибирующие концентрации (IC50s) CMV-HIG и вычисляли AbI50, которые представляют собой средние титры сыворотки от естественной инфекции (рис.6B). Сравнение показало, что ответы на антитела, индуцированные V160, нацелены на сайты, сходные с таковыми из естественной инфекции, и пиковые титры AbI50 на неделе 26 находились в диапазоне концентраций CMV-HIG.

Мало того, что титр AbI50 показал качество ответов на антитела, он также был хорошим показателем антивирусных функций в сыворотке, поскольку среднее геометрическое (GM) титров AbI50 по отношению к шести сайтам тесно коррелировало с титрами нейтрализации с коэффициентом корреляции 0,93 (R2 = 0,87, P = 0,0008).

Наконец, мы оценили способность иммунной сыворотки резуса перекрестно нейтрализовать клинические изоляты. Как показано на фиг.6C, все 4 недели протестированной иммунной сыворотки в течение недели могут нейтрализовать эти вирусные изоляты, при этом потенции ранжируются аналогично титрам AbI50 и близко соответствуют концентрациям CMV-HIG. Этот результат подтвердил, что вакцинация V160 у нечеловеческих приматов может вызывать антитела с антивирусной активностью против клинических изолятов и также предполагает, что конкуренция против всех шести зондовых антител может служить суррогатом для оценки способности иммунных сывороток нейтрализовать потенциально генетически разнообразные полевые штаммы.

Из-за его важности для разработки вакцины HCMV мы решили проанализировать качество противовирусных антител путем вакцинации по сравнению с теми, которые были получены при естественной инфекции. Наша работа привела к созданию карты иммуногенных сайтов пентамера HCMV, комплекса вирусного антигена, который, как известно, подвергся воздействию мощных нейтрализующих антител. Обилие иммуногенных сайтов в IR1 соответствовало недавно полученному наблюдению (33), а также нашему предыдущему докладу о том, что растворимый пентамер, а не гомодимер gH / gL, может истощать более 75% эпителиальной нейтрализующей активности в CMV- HIG (38).

Типичный геометрический титр AbI50 для шести сайтов служил индикатором качества антител, индуцированных вакцинами, поскольку он предлагал не только антивирусную активность, но также и специфическую защиту типа клеток типа ARPE-19 или MRC-5 in vitro. Абсолютное значение AbI50 также может быть использовано для определения количества каждого типа антител в иммунных сыворотках. Например, когда CMV-HIG конкурирует с шестью зондовыми антителами при 0,05 мкг / мл, титры AbI50 CMV-HIG варьируются от 15 до 47, а IC50s CMV-HIG в анализе вирусной нейтрализации варьируются от 210 до 650 мкг / мл. По этой оценке только крошечная доля общего CMV-HIG (оценка 0,01-0,02%) связывается с каждым иммуногенным сайтом с прочностью, аналогичной прочности зондовых антител. Тем не менее предельное присутствие 0,01-0,02% сильнодействующего антитела, такого как антитело к сайту 1, которое имеет IC50 0,2 нг / мл в анализе вирусной нейтрализации, может способствовать большей части нейтрализующей активности CMV-HIG ( IC50, приблизительно 1000 нг / мл). Поэтому, хотя титры AbI50 оказались низкими в этом исследовании, они выявили редкие, но очень сильные нейтрализующие антитела в иммунных сыворотках.

Наша коллекция антител была получена как у людей с естественной HCMV-инфекцией, так и у животных, вакцинированных цельной вирионной вакциной, и их потенции in vitro против вирусной инфекции были сопоставлены с эффективностью CMV-HIG. В этом отношении эти антитела являются полезными инструментами для идентификации защитного компонента в иммунных сыворотках, индуцированных вакцинами. Ранее Lilleri et al. сообщили, что у беременных женщин с первичной HCMV-инфекцией раннее появление (<30 дней) ответа антитела на эпитопы в IR1 связано со значительно сниженным риском внутриутробной передачи HCMV (46). Их исследование показало, что антитела с специфичностью IR1 коррелируют с защитой от передачи плода у матери. CMV-HIG был оценен для профилактики врожденной инфекции HCMV, но с эффективностью 31% и 60% в двух отдельных исследованиях (44, 45) соответственно, и наши результаты показывают, что CMV-HIG содержит менее 0,02% IR1-антител , В этом отношении IR1-специфичные MAbs, если они используются в качестве терапевтических средств, могут обеспечить лучшие клинические результаты, чем CMV-HIG.

Антитела, нанесенные на семь из восьми иммуногенных сайтов пентамера, показали нейтрализующее покрытие на панель из 11 клинических изолятов. Этот результат предположил, что антитела от естественной инфекции, вероятно, защищают in vitro от штаммов, вызывающих суперинфекцию HCMV. Таким образом, HCMV-серопозитивные индивидуумы, которые поддаются суперинфекции, могут иметь недостаток в своем естественном иммунитете к HCMV. Серологическое исследование 360 HCMV-серопозитивных женщин показало геометрический средний нейтрализующий титр для когорты 1: 7500; однако около 5% испытуемых нейтрализуют титры ниже 1: 1000 (47). Кроме того, неясно, играет ли роль в суперинфекции дефектный клеточный иммунитет у HCMV-серопозитивных субъектов. Во-вторых, суперинфекция может быть связана с вирусными титрами инокулята. Было проведено исследование человеческих проблем, в котором HCMV-серопозитивные субъекты были подвергнуты обследованию патогенным штаммом Толедо, и результаты подтверждают эту гипотезу, поскольку серопозитивность HCMV была защищена от инокуляции заражения 10 и 100 PFU, но не 1000 PFU, из вируса Толедо (48). Наконец, также возможно, что нейтрализующая активность сыворотки, измеренная in vitro, может действительно не отражать антивирусный иммунитет у хозяина.

В заключение мы выделили четыре IR, содержащих восемь иммуногенных сайтов на пентамере, антиген для нейтрализующих антител. Функциональная характеристика этих сайтов позволила оценить качество ответных антител к вакцинам. Макаки резуса, вакцинированные V160, генерировали разнообразные ответы на антитела к пентамеру, а их иммунные сыворотки демонстрировали нейтрализацию против группы клинических изолятов HCMV. Анализ специфических для сайта ответов на антитела представляет собой полезный инструмент для анализа иммунных ответов, индуцированных V160, за их роль в эффективности вакцины против врожденной инфекции HCMV.

Кролики MAbs выделяли из животных, иммунизированных ревертантным вирусом AD169, как сообщалось ранее (27). Человеческие MAbs были выделены из клеток В памяти из трех здоровых людей с естественной HCMV-инфекцией. Вкратце, ячейки памяти B были обогащены с использованием набора B-Cell памяти EasySep (StemCell). Обогащенные В-клетки памяти культивировали в предельном разведении в 96-луночных планшетах с U-образным основанием с гамма-облученными фидерными клетками, экспрессирующими человеческий CD40L в полной среде RPMI, дополненной интерлейкином-21 (50 нг / мл) (Invitrogen). Супернатант собирали на 14 день и подвергали скринингу на нейтрализацию вируса и / или активность связывания, как описано ранее (27). Суммарную РНК из клеток в положительных лунках выделяли и превращали в кДНК с использованием набора обратной транскрипции (Invitrogen), а гены IgG выделяли с помощью ПЦР с использованием праймеров, которые были описаны ранее (49). Рекомбинантные антитела экспрессировали с помощью переходной трансфекции в клетках HEK293 и очищали с помощью аффинной хроматографии на белке A (50). Чистоту и целостность антител оценивали с помощью SDS-PAGE.

Для анализа вестерн-блоттинга денатурированные и уменьшенные образцы V160 анализировали на капиллярной системе вестерн-блоттинга Simon (ProteinSimple), как описано выше (51). Вкратце, образец V160 смешивали с буферным образцом, содержащим SDS и дитиотреитол (DTT), а затем нагревали в течение 10 мин при 70 ° C. Разделение SDS-PAGE происходило в капиллярном и вирусном антигенах, которые были исследованы с каждым первичным антителом в течение 90 мин, а затем в течение 60 мин с вторичным антителом либо антитело против кроликов с пероксидазой хрена (HRP) из ProteinSimple, либо антитело против человеческого IgG с HRP от Jackson ImmunoResearch. Сигнал хемилюминесценции измеряли при шести разных временах экспозиции. Для ELISA рекомбинантный димер или пентамер иммобилизуют при 1 мкг / мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) на 96-луночных планшетах FluoroNunc MaxiSorp при 4 ° С в течение ночи. Затем планшеты блокировали 3% обезжиренным молоком в PBS-0,05% Твин 20. Матки при титровании в PBS инкубировали в течение 1,5 ч, а планшеты промывали затем, а затем инкубировали с HRP-конъюгированным козьим антикроликом или античеловеком IgG (Southern Biotech) в течение 30-60 мин. Флюорогенный субстрат HRP, 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин (ADHP) (Virolabs), добавляли при 100 мкл на лунку в течение 3-5 мин для получения резоруфина, а флуоресцентные сигналы с возбуждением при 531 нм и эмиссией при 595 нм (Виктор III, PerkinElmer). Эффективная концентрация MAb для достижения максимального связывания 50% (EC50) была рассчитана с использованием четырехпараметрической подгонки, как описано ранее (27). Связывание антител с HCMV-частицами, измеренное проточной цитометрией, проводили, как описано ранее (37). Вкратце, препараты вируса V160 или AD169 инкубировали с каждым MAb с последующим удалением несвязанного MAb, инкубацией с меченым Alexa Fluor 488 вторичным антителом и удалением несвязанного вторичного антитела. Потоковый цитометр запускался на сигнале рассеяния бокового света от частиц HCMV. В качестве контролей использовали отрицательный поликлональный IgG человека и кролика.

Анализ конкуренции проводили на Octet HTX с использованием биосенсоров NTA (FortéBio). Антитела разводили до 15 мкг / мл в PBS и помещали в 384 микропланшеты с наклонным днищем. Все биосенсоры были регидратированы PBS в течение по меньшей мере 10 минут, загружены рекомбинантным пентамером (38) при 5 мкг / мл в PBS в течение 900 с, а затем промыты в PBS в течение 60 с. Группу из 16 биодатчиков загружали в течение 2000 с либо PBS в качестве контроля, либо антитело 1 при концентрации 15 мкг / мл для достижения насыщения. Биосенсоры затем промывали в PBS в течение 60 с и переносили в лунки, содержащие различные антитела (антитело 2), чтобы получить 1500 с общего времени связывания. Уменьшение ассоциации антител 2 в присутствии антитела 1 было нормировано полным связыванием в отсутствие антитела 1 (контроль PBS), чтобы рассчитать процент конкуренции. Процедуру повторяли для остальных 15 антител, как для антитела 1.

Fabs генерировали из выбранных антител и смешивали с пентамером или димером gH / gL при молярном соотношении 5: 1 в течение 1 часа. Затем комплексы разделяли методом эксклюзионной хроматографии и наносили на дымовые разряды дырчатых углеродных сеток и окрашивали 2% -ным формиатом уранила. Сетки были отображены с использованием электронного микроскопа FEI Tecnai T12, работающего при 120 кэВ, и оснащенного камерой FEI Eagle 4k × 4k с зарядовой связью (CCD). Изображения с тензором (0 °, 60 °) регистрировались с использованием Leginon при номинальном увеличении × 67 000 с номинальной недофокусировкой от -2 до -1 мкм и электронными дозами от ~ 25 до 30 e / A2.

Обработка изображений и реконструкция модели выполнялись с использованием программного пакета Appion. Индивидуальные частицы были выбраны с использованием автоматических протоколов сбора как на отрезках, так и на наклонных изображениях, а оставшиеся частицы были подвергнуты нескольким раундам безрейтингового выравнивания и классификации с использованием пакета обработки XMIPP. Реконструкции случайных конических наклонов (RCT) выполнялись с использованием пар частиц из типичных средних классов для получения 3D-карт комплексов. Номинальное разрешение 3D-карт составляет от ~ 35 до 40 Å, при этом критерий разрешения корреляции Фурье равен 0,5 (FSC0,5). Пакет визуализации химеры использовался для получения поверхностного рендеринга каждого комплекса и для соответствия рентгеновской структуре EBV gH / gL (PDB 3PHF) в EM-картах.

Ревертантный вирус AD169 описан ранее (36, 52), а первичные клинические изоляты были недавно выделены и культивированы или получены у Джеймса Вальдмана, Марии Ревелло и Эйна Мерфи. Вирус был культивирован в клетках ARPE-19 и очищен ультрацентрифугированием, как описано ранее (47). Вирусную инфективность оценивали с помощью 50% -ной аналитической дозы инфицированной дозы (TCID50). Анализ вирусной нейтрализации, основанный на иммуноокрашивании, был описан ранее (53).

Резус-макаки (Macaca mulatta) поддерживались в Исследовательском центре Новой Иберии (NIRC), Новая Иберия, Лос-Анджелес. Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, а протоколы исследований были одобрены комитетами по организации и уходу за животными. Макаки резуса анестезировали, и вакцины доставляли внутримышечно в объемах по 0,5 мл в дельтовидные мышцы. Вакцина V160 была описана ранее (36) и была сформулирована до инъекции 30 мкг / доза Iscomatrix адъювантом, предоставленной CSL Ltd. (Виктория, Австралия).

Конкурс ELISA использовался для определения титра ингибирования антитело-связывающего антитела (AbI50) против группы из семи антител (2-18, 1-125, 1-103, 57,4, 1-32, 124,4 и 3-16), каждый представляющий собой один иммуногенный сайт. Рекомбинантный пентамерный комплекс иммобилизуют при 0,3 мкг / мл в PBS на 96-луночных планшетах FluoroNunc MaxiSorp при 4 ° С в течение ночи. Затем планшеты блокировали 3% обезжиренным молоком в PBS-0,05% Твин 20. Сыворотку резуса при титровании в PBS смешивали с 0,05 мкг / мл либо биотинилированного человеческого антитела, либо небиотинилированного кроличьего антитела, а затем смесь инкубировали в предварительно покрытой оболочке Плита в течение 1,5 ч. Планшеты промывали затем, а затем инкубировали с HRP-конъюгированными агентами обнаружения, либо стрептавидином (BD Pharmingen), либо козлиным кроличьим IgG (Southern Biotech) в течение 30-60 мин. ADHP добавляли при 100 мкл на лунку в течение 3-5 мин для получения резоруфина и измеряли флуоресцентные сигналы с возбуждением при 531 нм и эмиссией при 595 нм (Victor III, PerkinElmer). Титры AbI50 определяли как последнее разбавление сыворотки, которое ингибирует ≥50% связывания антитела.

Аналогичный конкурентный ELISA использовался для определения IC50 ЦМВ-HIG в ингибировании той же панели зондирующих антител, связывающихся с соответствующими эпитопами. Кристаллы ингибирования были сконструированы для каждого иммуногенного участка, и для определения IC50 (мкг / мл) проводился четырехпараметрический подход к логистической кривой. Затем среднюю концентрацию IgG в сыворотке человека в 10 000 мкг / мл затем делили на IC50 для получения титров AbI50 CMV-HIG.

Информация о последовательности для некоторых вирусных штаммов, перечисленных в таблице 2, определялась секвенированием следующего поколения, и последовательности были описаны в другом месте (54). Эти штаммы включают VHL / E (номер доступа GenBank KX544841), VR3908 (KX544833), VR7863 (KX544838), VR5235 (KX544837), VR5022 (KX544835), UxcA (KX544840), NR (KX544831), sub 22 (KX544834) и sub 24 (KX544832).

Мы благодарим Джеймса Вальдмана, Марию Грацию Ревелло и Эйна Мерфи за их щедрые подарки от первичных клинических изолятов HCMV. Мы также благодарим ветеринарный персонал NIRC за помощь в исследовании вакцинации макаки резуса. Мы с благодарностью признаем NanoImaging Services Inc. за то, что вы проводите EM-презентацию и 3D-реконструкцию.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *