Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Физико-химическая и биологическая характеристика фукоидана из Fucus vesiculosus, очищенного с помощью красильной аффинной хроматографии

Physicochemical and Biological Characterization of Fucoidan from Fucus vesiculosus Purified by Dye Affinity Chromatography
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4849083/

Представлено сравнительное исследование физико-химического, мономерного состава и биологических признаков среди различных фракций фукоидана. Общие методы очистки фукоидана обычно включают в себя много шагов. На этих этапах могут влиять важные структурные особенности и, следовательно, изменять его биологическую активность. Три очищенных фракции получают из водного экстракта Fucus vesiculosus, который затем очищают с помощью недавно разработанного протокола аффинной хроматографии на красителе. Этот протокол основан на взаимодействии с полисахаридом, обработанным красителями. Первые две фракции были получены из неочищенного осажденного фукоидана при разных значениях рН адсорбционной фазы: рН 1 и 6. Эта процедура приводила к фракциям фукоидана и 1. Другая, третья фракция: fucoidan_M, однако, была получена из буферизованного неочищенного экстракта при pH 1, исключая стадию осаждения этанола. Затем все три фракции оценивали. Результаты показали, что fucoidan_M показал наивысшее содержание серы (S%), 12,11%, с наименьшей средней молекулярной массой 48 кДа. Димеры фукозы, галактозы и уроновой кислоты / глюкозы были обнаружены во всех фракциях, хотя ксилоза была обнаружена только в фукоиданах1 и 6. В концентрации 10 мкг · мл-1 Fucoidan_6 показал самую высокую гепарин-подобную антикоагулянтную активность и мог продлить APTT и TT значительно до 66,03 ± 2,93 и 75,36 ± 1,37 с, соответственно. Кроме того, fucoidan_M продемонстрировал наивысшую эффективность против HSV-1 с IC50, равным 2,41 мкг · мл-1. Этот метод оказался кандидатом на фукоидановую очистку из его сырого экстракта, удаляющего стадию осаждения из общепринятых протоколов очистки, и продуцировал различные свойства фукоидана, полученные в результате различных условий инкубации с иммобилизованным красителем тиазин-толуидин-синий О.

Фукоидан является классом биополимеров, который имеет сульфатированную гомо- или гетерополисахаридную основу. Он особенно встречается в фибриллярной части клеточной стенки и межклеточных пространств, особенно коричневых водорослей (Phaeophyta) [1]. Точная функция фукоидана до сих пор не полностью понята и требует большего изучения, но предполагается, что она предотвращает высыхание тканей таллома, особенно когда водоросли подвергаются более низким уровням прилива или более высокой температуре летом [2]. Он также действует как сшивающий агент между целлюлозой и гемицеллюлозой и участвует в клеточной структурной целостности [3].

l-фукоза представляет собой основной повторяющийся мономер, который связан различными гликозидными связями (например, чередующимися α-1,3 и α-1,4-фукопиранозилами в фукоидане, полученном из F. vesiculosus) с образованием прямой или разветвленной цепи полисахаридные скелеты. Могут присутствовать и другие мономеры сахара, такие как галактоза, манноза, глюкоза и ксилоза, а также следы уроновых кислот, в дополнение к группам сульфатных и ацетатных сложных эфиров, которые связываются по видозависимой картине [4,5].

Первая экстракция и изоляция была проведена Кайлином примерно 100 лет назад в 1913 году [6]. С тех пор исследования фукоидана резко возросли, особенно в течение последних четырех десятилетий, благодаря многообещающим и разнообразным фармакологическим действиям (например, противовирусным, антитромботическим и антикоагулянтным, противовоспалительным, цитотоксическим и их эффектам против различных заболеваний почек и печени) [ 7].

Фукоидан свободно растворим в растворителях с более высокими диэлектрическими постоянными, такими как вода, из-за изолированных экранированных противоположных групп [8], и именно поэтому извлечение горячей воды, как в кислотных, так и в щелочных условиях, обычно является методом выбора для его экстракции. Однако растворители с более низкими диэлектрическими постоянными, такими как этанол, обычно используют для осаждения и выделения из других совместно экстрагированных природных соединений.

Для оптимизации процесса экстракции фукоидана были разработаны различные способы (например, горячая кислая или щелочная, водная экстракция с помощью фермента, микроволны или ультразвука). Тем не менее, трудоемкие и дорогостоящие методы очистки все еще применяются для получения очищенного сорта из его сырых экстрактов. Среди применяемых методов очистки — анионообменная и гель-проникающая хроматография, в зависимости от ее более высокой анионной плотности заряда и молекулярных масс.

Анионообменная хроматография имеет несколько недостатков, таких как адсорбция других кислотных соединений в щелочном рН, таких как альгинат или полифенолы, или даже свободные гидролизованные сульфатные сложноэфирные группы фукоидана, которые затем элюируются на стадии десорбции с интактным фукоиданом и искажают точное определение содержания серы ( S%). Кроме того, могут быть пропущены положительно заряженные группы четвертичного аммония из смоляных гранул, чтобы дать еще одну возможность для загрязнения и более высокого содержания азота (N%). Смола обычно требует утомительной стадии регенерации нагрузки после каждого цикла, чтобы восстановить свои функциональные группы и емкость. Основные структурные особенности фукоидана, такие как молекулярная масса, мономерный состав, содержание сульфата и положение, влияют на процессы экстракции и очистки и приводят к неточным характеристикам [9]. Кроме того, сезонные и географические факторы также участвуют в таких структурных конфликтах [10].

Недавно был разработан протокол очистки на основе аффинной хроматографии на красителе и доказал его способность избирательно захватывать интактный фукоидан из синтетических и сырых экстрактов иммобилизованными тиазиновыми красителями, например, толуидиновым синим и тиониновым ацетатом. Этот протокол проводили с помощью нескольких этапов промывки дериватизированных гранул различными растворителями для удаления неспецифических связывающих соединений перед стадией элюирования для получения высокоочищенной марки [11].

Настоящее исследование направлено на применение этого нового протокола с использованием различных условий, например, рН и одновременной экстракции и очистки для получения нескольких фракций фукоидана из коричневых макроводорослей Fucus vesiculosus в дополнение к их оценке с использованием физико-химических характеристик и мономерной композиции, а также биологической активности, таких как антикоагулянтная и противовирусная активность.

Фукоидан представляет собой переменную составляющую в бурых водорослях и обычно влияет на сезонные и географические факторы [12]. У F. vesiculosus только 12% мас. / Мас. Сухой биомассы представляет собой содержание фукоидана [13]. Поэтому необходимо провести интенсивную процедуру предварительной обработки для удаления других природных соединений (например, маннита, липидов, полифенолов и т. Д.), Которые впоследствии могут быть совместно экстрагированы или мешаться процессами очистки [14, 15]: ацетон удаляет хлорофилл, пигменты и жирные кислоты, тогда как смесь гексан: изопропанол удаляла липиды и более полярные жирные кислоты. 80% (об. / Об.) Этанола использовали для удаления основного маннита запасного пищевого материала для водорослей. Смесь этанол / вода / формальдегид при рН 2 использовалась для полимеризации полифенолов, которые обычно плотно связаны с фукоиданом и ответственны за коричневый цвет загрязненного фукоидана [16], и, наконец, 80% (об. / Об.) Этанола снова использовали для промывку и очистку биомассы от остаточного формальдегида и полифенольного комплекса.

В зависимости от результатов, описанных Hahn et al. [17], взаимодействие между толуидиновым синим и фукоиданом является достаточно сильным и не только обусловлено ионным взаимодействием, но и диспергированными взаимодействиями между сложными молекулами красителя. Эти результаты обрабатывали и применяли для переработки фукоидана при различных значениях рН: 1 и 6 из его неочищенного экстракта, а также на одной стадии путем одновременной экстракции и очистки в буфере малеиновой кислоты (МАБ) при рН 1 без стадии осаждения. Этот высококислый буферный рН был предпочтительным, чтобы помочь кислотным соединениям, несущим группы с более низкими pKa особенно сульфатными сложноэфирными группами фукоидана, быть в ионизированной форме и захвачены. Интересно, что этот метод преодолел и другие важные экономические и экологические проблемы очистки, такие как удаление стадии осаждения с этанолом или другими катионными поверхностно-активными веществами, например, цетилтриметиламмонийбромидом (CTAB). Как и другие общие методы, различные фракции могут быть также получены путем применения различных молей NaCl на стадии элюирования.

Dextran от Leuconostoc sp. (Г-н ~ 500 кДа) был выбран из-за его незначительной аффинности или взаимодействия с иммобилизованным красителем, а также из-за отсутствия S и N, которые присутствуют в буфере MES, используемом в элюирующих и красильных структурах. Инкубация раствора декстрана с шариками при тех же условиях стадии элюирования фукоиданом подтвердила отсутствие какого-либо загрязнения либо из иммобилизованного красителя, либо остатков элюента по результатам элементного анализа декстрана до и после инкубации. Результаты после инкубации показали сходное содержание C% и H% с отсутствием атомов N и S. В таблице 1 разъясняется элементный анализ (CHNS) декстрана из Leuconostoc sp. (Г-н ~ 500 кДа) до и после инкубации с дериватизированными гранулами.

Белые, пушистые и гигроскопичные порошки были получены как фукоидан_1 и фукоидан [6], тогда как фукоидан-М был коричневым. Все они растворимы в воде, редко растворяются в диметилсульфоксиде (ДМСО) и нерастворимы в этаноле.

Как показано в таблице 2, наличие следов содержания азота (N%) во всех типах фукоиданов, в отличие от эталонного фукоидана, предполагало наличие некоторых аминосодержащих соединений (например, белковых или аминосахаров) [9]. Fucoidan_M продемонстрировал самый низкий N%: 0,24% (м / м) по сравнению с другими фракциями: fucoidan_1 и fucoidan_6. Тем не менее, он показал самый высокий S%: 12,11% (м / м), что имеет решающее значение для некоторых биологических активностей (например, противовирусная активность). В результате содержание сульфатного эфира может быть рассчитано с использованием соотношения между атомом серы и маслами сульфатного эфира: 2,99582. Таким образом, содержание сульфатного эфира в фукоидане_M составляло 36,28% (мас. / Мас.), Тогда как в коммерческом фукоидане 26,6%.

Что касается сульфатных групп на каждую моносахаридную единицу, каждая единица фукозы связывается приблизительно с одной сульфатной сложноэфирной группой в молекуле фукоидана-М. Фактически это противоречит модели фукоидана, предложенной Кумаши и др. [18], который пришел к выводу о наличии двух групп сульфатных эфиров на три единицы фукозы. Таким образом, эта процедура способна в значительной степени защитить структуру сульфатного эфира от гидролиза. Следовательно, его можно использовать для определения содержания нативного сульфата фукоидана.

Поскольку на точку плавления влияют примеси и молекулярная масса, точки плавления используются для более качественных и устойчивых соотношений с измерением молекулярной массы [19]. Все органические полимеры, такие как фукоидан-расплав, и разлагаются при нагревании. Все фракции фукоиданов ведут себя в той же последовательности с повышением температуры; а именно: меняющийся цвет: желтый, коричневый, а затем черный, и отражается в развитии газа. Диапазон температур между началом плавления и точками разложения составлял 5-6 ° C для фукоидана_1 и фукоидана_M, тогда как он был широким (20 ° C) для фукоидана [6]. Fucoidan_6 доказал свою более высокую молекулярную массу, показав самую высокую температуру плавления. В таблице 3 приведено сравнение между фазами, при которых различные фракции фукоидана меняют свой цвет, расплавляются и затем разлагаются с обугливанием при более высоких температурах.

Специфические результаты оптического вращения, как показано также в таблице 3, доказали левовращающую (1) и асимметричную природу всех фракций фукоидана. Это также подтвердило присутствие 1-фукозы в качестве основного стереоизомера мономера фукозы. [α] 22589 для всех фракций фукоидана, включая эталонный аналог, были одинаковыми и значения находились в диапазоне от -117 ° для фукоидана от -6 до -130 ° для фукоидана-М. Эти значения могут быть связаны также с молекулярной массой фукоидана и содержанием фукозы. Значения также согласуются со значениями, указанными ранее: -123 ° [7].

Были измерены среднемассовая молекулярная масса (Mw), пиковая молекулярная масса (Mp) и среднечисленная молекулярная масса (Mn) для оценки характеристик длины полимерной цепи и оценки влияния применяемых различных условий экстракции и очистки. Fucodian_M имел наименьшие значения Mw, Mp и Mn с 48, 18 и 26 кДа соответственно по сравнению с другими фракциями фукоидана [11], предлагая частичный кислотный гидролиз полисахаридов в процессе экстракции и очистки [11]. Низкомолекулярный фукоидан (LMWF) может быть выгодным для улучшения скоростей диффузии фукоидана и, следовательно, уменьшения времени, необходимого для фазы адсорбции, в дополнение к его биологическому значению, например, проангиогенетической активности [20]. Влияние молярности NaCl также изучали на элюирование фукоидана% и соотношения с средними молекулярными массами. Как показано в таблице 4, увеличение молярности NaCl до 3 М приводит к увеличению% элюирования и более высокой молекулярной массы полученных фракций фукоидана. В таблице 4 приведены средние значения молекулярных весов фракций фукоидана после инкубации неочищенного экстракта при рН 1 и элюируются в зависимости от различных молярностей NaCl: 1, 2 и 3.

Поскольку мономерный состав является одним из критических факторов, влияющих на биологическую активность, он определялся для всех фракций. Как видно из таблицы 5, фукоза является основным мономером во всех фракциях фукоидана и составляет более 80%. Были также обнаружены другие мономеры, такие как галактоза и димеры уроновой кислоты / глюкозы; однако ксилоза была обнаружена только у фукоидана_1 и фукоидана [6]. Диоксиды кислот / глюкозы были обнаружены только МС; тем не менее, их количество не может быть точно определено, поскольку в дополнение к их плохому удерживающему поведению отсутствуют стандарты.

ФТ-ИК-спектроскопия была выполнена для определения основных характерных пиков фукоидана, сравнения сходства с эталонным аналогом и оценки влияния условий экстракции и очистки на химическую структуру, особенно в случае фукоидана-М. Все спектры показали сравнимую гомологию с эталонным аналогом. С помощью fucoidan_M в качестве примера был определен и интерпретирован спектр FTIR и его характерные пики, как показано на рисунке 1: широкий пик при 3465 см-1 для OH-группы моносахаридного мономера, 2984 и 2940 см-1 для алифатического C- H, пик при 1730 см-1 для вибрации растяжения C = 0 для ацетатных групп, пик при 1635 см-1 был представлен для колебаний растяжения O-C-O, 1218 см-1 для асимметричного вибрации растяжения S = O сульфатную группу, 1005 см-1 для эфирной связи C-O, 835 см-1 для C-S-O и 667 см-1, которая является характерной полосой для dexoysugar как фукоза. FTIR также обнаружил сложную картину замещения в положении C-4, продемонстрировав резкую полосу при 835 см-1 (S = O) и плечо при 815 см-1 (C-S-O).

Все эти данные согласуются с химической структурой фукоидана, предложенной Cumashi et al. [18] и подтвердил незначительный эффект метода экстракции и очистки на химическую структуру фукоидана.

Коагуляция крови инициируется либо внутренним, либо внешним путем. Два пути сливаются в общую точку превращения протромбина в тромбин и затем продолжают формировать фибриновые нити. APTT оценивает в основном влияние антикоагулянтов на собственный путь системы свертывания крови. Рисунок 2 показывает, что процесс очистки улучшал антикоагулянтную активность неочищенного фукоидана за счет увеличения APTT, где фукоидан 1 и 6 увеличивали время коагуляции до 73 и 75 с, соответственно, по сравнению с 44,8 с для неочищенного неочищенного фукоидана. Fucoidan_M увеличило время коагуляции, а также, но в меньшей степени: 51 с. Это почти похоже на эталонный аналог: 48,3 с. Эти пролонгации были значительными по сравнению с отрицательным контролем (0,9% NaCl), который зафиксировал 41,8 с.

PT обычно используется для оценки влияния антикоагулянтов на путь внешней коагуляции крови. На рисунке 3 очевидно, что все типы фукоиданов не смогли значительно увеличить ПТ по сравнению с отрицательным контролем. Они согласуются с механизмом антикоагулянтной активности фукоидана, который подобен гепарину и опосредуется главным образом ингибированием фермента фермента сериновой протеазы и / или кофактора II гепарина [21].

ТТ специфически влияет на антикоагулянты против тромбина, который катализирует стадию превращения фибриногена в фибриновые нити на последних стадиях образования тромбов. Результаты, как показано на рисунке 4, показали аналогичную картину, как на рисунке 2, где fucoidan_6 также показал наивысшую активность. Эти сходства предполагают, что корреляция между APTT и TT и увеличением в APTT может быть результатом и, как следствие, ингибирования ферментов и кофакторов общего пути больше, чем собственный путь. Fucoidan_1 и 6 длительное время коагуляции значительно до 47 и 66 с соответственно, по сравнению с 19,27 с для отрицательного контроля, тогда как fucoidan_M показал самое слабое влияние на время коагуляции. Это увеличило время коагуляции только до 23,5 с по сравнению с 31,3 и 29,2 с для эталонного и сырого фукоидана соответственно. Даже при более высоких концентрациях (например, 50 мкг · мл-1) наблюдалось нелинейное и небольшое влияние на время коагуляции и увеличивалось до 31,1 с. Эти различия между фракциями фукоидана связаны с полисахаридной цепью, молекулярной массой и удобством структуры, где достаточно длинной сахарной цепи и удобной структуры требуется даже больше, чем содержание сульфата для дезактивации тромбина [7]. Более низкий эффект фукоидана М на ТТ может быть также обусловлен его более высоким содержанием сульфата, который может быть увеличен по сравнению с пороговым значением и привел к уменьшению антикоагулянтной активности [22,23]. Тем не менее, не все фукоиданы, извлеченные из разных бурых водорослей, имеют одинаковую антитромбиновую активность и оказывают влияние на ТТ из-за ограничений фукоиданового эндогенеза [24,25].

Фукоидан проявляет свою противовирусную активность против ВПГ-1 главным образом за счет ингибирования сорбции и проникновения вируса через модификацию клеточной поверхности и, впоследствии, предотвращения образования вирусного синцития [26]. Для этого действия положение группы сульфатных эфиров очень важно и критично по сравнению с антикоагулянтной активностью. Фракция с самым высоким содержанием сульфата fucoidan_M оказывала очень сильное противовирусное действие по сравнению с другими типами. На рисунке 5 показана противовирусная активность (%) с разным серийным разведением для разных фракций фукоидана против значений HSV-1 и IC50, также были рассчитаны, как показано в таблице 6. IC50 варьировался между различными фракциями от 2,41 мкг · мл-1 для фукоидана-М до 5,69 мкг · мл-1 для фукоидана [6]. Интересно, что фукоидан обладает тем преимуществом, что он обладает меньшей цитотоксичностью, чем клинически используемые противовирусные препараты, такие как ацикловир.

Sepabeads® EC-EA (S-grade) был подарком от Resindion s.r.l. (Бинаско М.И., Италия). Диапазон размеров частиц носителя составлял 100-300 мкм со срединным диаметром пор 10-20 нм. Реагенты, используемые для измерения активности антикоагулянтов, были приобретены у Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH (Марбург, Германия). Все остальные химические вещества, включая фукоидан, выделенный из F. vesiculosus (≥95% чистой), были приобретены у Sigma Aldrich® (Сент-Луис, Миссури, США).

ВЭЖХ-насос L 7100 с автоматическим пробоотборником AS-2000 A (как Merck-Hitachi, Darmstadt, Германия), колонкой GPC_MCX 8 × 30 мм (PSS, Майнц, Германия) и детектором Shodex® RI-101 (Shimadzu Corporation, Киото, Япония) использовались для измерения средних средних значений. Спектр 100 FT-IR, (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) использовали для определения и характеристики фракций фукоидана по сравнению со ссылочным фукоиданом. Накладной шейкер Multi Bio RS-24 и термошайлер TS-100 (Biosan, Riga, Latvia) использовали для перемешивания суспензий во время процессов инкубации адсорбции и элюирования процесса очистки соответственно. Элементный анализ проводили с использованием Vario Micro cube WLD Board V 2.0.11 (Elementar Analysensysteme GmbH, Ханау, Германия). Цифровой поляриметр P-2000 (Jasco, Gross-Ulmstadt, Germany) снабжен натриевой спектральной лампой и отрегулирован на λ 589 нм для конкретного измерения оптического вращения. DigiMelt-MPA 160, SRS (Scientific Instruments GmbH, Gilching bei München, Германия) для определения точки плавления. Для измерения проводимости использовался набор измерителей проводимости (Qcond 2200, VWR International GmbH, Дармштадт, Германия). Система BCS® (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Марбург, Германия) была запрограммирована для выполнения различного протокола коагуляции и измерения времени свертывания. Измерения флуоресценции проводили с использованием Spectra-Photometer V630 (Jasco, Gross-Ulmstadt, Germany) для оценки противовирусной активности.

Биомасса свежей водоросли F.
viciculosus был собран из Северного моря в районе южных пляжей Вильгельмсхафена (Германия, 53 ° 31,236N, 8 ° 13,849E) в июле 2007 года. Биомасса водорослей промывали краном, а затем деионизировали, воду, высушивали на воздухе для два дня, затем в духовке при 50 ° C до постоянной массы и затем измельчали. 100 г высушенного водорослевого порошка перед стадией экстракции обрабатывали несколькими стадиями предварительной обработки последовательно при непрерывном перемешивании в течение ночи при комнатной температуре с использованием 1 л ацетона, смеси гексан: изопропанол (3: 2), 80% (об. / Об.) Этанола, этанол: вода: формальдегид (80: 15: 5) при рН 2 и, наконец, снова промывают 1 л 80% (об. / об.) этанола. После каждого шага суспензию центрифугировали (4000 об / мин, 10 мин) и супернатант декантировали. Предварительно обработанный порошок водорослей затем снова высушивали при 50 ° С и хранили при комнатной температуре в хорошо закрытом пластиковом контейнере.

Были применены два метода экстракции фукоидана:

Процедура А. Первый способ был выполнен путем извлечения 10 г предварительно обработанного порошка 100 мл 1% (мас. / Об.) Водного CaCl2 в течение 6 ч при 70 ° С при кипячении с обратным холодильником при непрерывном перемешивании при рН 2, как описано ранее Hahn T . и другие. [11]. После центрифугирования (4500 об / мин, 15 мин) биомассу водорослей удаляли и супернатант нейтрализовали 0,2 М карбоната аммония. Неочищенный фукоидан затем выделяли путем осаждения этанолом с конечной концентрацией 70% (об. / Об.), Охлаждения в течение ночи при 4 ° С, центрифугирования и последующей сушки осадка при 50 ° С.

Методика В: Другой способ вводили 20 мМ буфера малеиновой кислоты (МАБ) при рН 1 в качестве растворителя для 1% (мас. / Об.) CaCl 2 раствора. Предварительно обработанный порошок водорослей затем экстрагировали с использованием тех же условий, которые были упомянуты ранее в процедуре А. pH регулировали регулярно каждые 2 часа при 1 М 1 HCl, если необходимо. Центрифугирование (4500 об / мин, 15 мин) также использовали для отделения супернатанта от биомассы водорослей. Супернатант хранили в холодильнике до следующей стадии очистки.

Согласно протоколу иммобилизации, описанному HahnT, et al. [11], был приготовлен водный раствор 2 мМ толуидинового синего O (TB) и иммобилизован на EC-EA Sepabeads® для получения дериватизированных гранул.

Первые две фракции фукоидана были получены путем восстановления сырого фукоиданового порошка, полученного в соответствии с процедурой А, в концентрации 2,5 мг · мл-1 в двух разных буферных растворах: 20 мМ MAB pH 1 и 20 мМ MES pH 6 и очищали с получением фукоидан-1 и fucoidan_6, соответственно. Процедуры очистки и восстановления проводили путем инкубации 50 мг дериватизированных гранул с 1,5 мл исходных растворов в 2 мл реакционного сосуда при комнатной температуре в течение 40 часов и помещали в верхний шейкер, отрегулированный со скоростью 60 об / мин. Затем гранулы промывали водой и 0,1 М NaCl в 20 мМ МАБ при рН 2, последовательно. 1,5 мл 3 М NaCl, растворенного в 30% (об. / Об.) Этаноле в 20 мМ буфере МЭС, рН 6, использовали в качестве элюента при встряхивании (800 об / мин) при 50 ° С. Элюаты затем диализовали через мембранную трубку MWCO 3,5 кД для удаления соли и лиофилизировали в конце.

Третью фракцию fucoidan_M выделяли путем инкубации 75 мг дериватизированных гранул с 1,5 мл неочищенного экстракта, полученного процедурой B в течение 48 часов. Другие этапы промывки и восстановления выполняли, как описано ранее, с двумя другими фракциями.

Раствор декстрана с концентрацией 2,5 мг · мл-1 от Leuconostoc sp. (Г-н ~ 500 кДа) получали в том же элюенте фукоидана (3 М NaCl в 30% этаноле в 20 мМ МЭС pH 6) и инкубировали с дериватизированными гранулами в условиях, имитирующих те, которые применялись в фазе элюирования фукоиданом в течение 12 часов. Раствор, полученный после инкубации, затем диализовали, лиофилизировали и анализировали по элементам по сравнению с необработанным порошком декстрана.

Измерения молекулярной массы проводили с использованием изократического ВЭЖХ-насоса L 7100 с автоматическим пробоотборником AS-2000 A. Образцы растворяли в элюенте в концентрации 4 мг · мл-1 и смешивали с равным объемом 1 мг · мл-1 этилена гликоля в качестве маркера потока. Разделение проводили при 25 ° С с использованием колонки GPC_MCX 8 × 30 мм, которая ранее была откалибрована декстрансульфатом (аналитическим стандартным классом для ГПХ) с разным молекулярным размером (25-670 кДа). Объем инъекции составлял 10 мкл, а элюент составлял 0,05 М фосфатного буфера при рН 9,1 при объемном расходе 1 мл · мин-1. Обнаружение образцов проводили с использованием детектора Shodex® RI-101.

Две мг каждой фракции фукоидана помещали в капиллярную трубку и помещали в аппарат для плавления. Приращение температуры составляло 2 ° C · мин-1 и наблюдались и регистрировались три точки температуры, при которых начали расплавляться порошки, меняли свой цвет и, наконец, разлагались с обугливанием.

Приготавливали водный 0,4% мас. / Об. Раствор каждого фукоидана и измеряли удельное оптическое вращение при 22 ° С.

Мономерный состав различных фракций фукоидана определяли в соответствии с протоколами, разработанными Rühmann и др. [27]. Вкратце, 1 г · L-1 водный раствор трех фракций фукоидана готовили и инкубировали с 2 М трифторуксусной кислотой в течение 90 мин при 121 ° С. Мономеры фукозы, ксилозы и галактозы гидролизованных полисахаридов были обнаружены УФ-ИС, в то время как глюкоза и димеры уроновой кислоты были обнаружены МС.

APTT определяли для всех фракций фукоидана в соответствии с протоколом, описанным Anderson et al. [28] с небольшими изменениями. Все образцы готовили в изотоническом растворе 0,9% мас. / Об. NaCl. Устройство было запрограммировано на смешивание 0,6 мл плазмы с плохими тромбоцитами с 0,3 мл 10 мкг · мл-1 фукоиданового раствора. Затем каждую смесь инкубировали в течение 60 с при 37 ° С перед добавлением 0,5 мл предварительно нагретого реагента APPT и затем снова инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С. Затем добавляли 0,6 мл предварительно нагретого раствора 0,25 М CaCl2 и регистрировали время образования сгустка. Эти шаги повторяли три раза. Гепарин в концентрации 5 мкг · мл-1 и 0,9% мас. / Об. NaCl использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

PT также определялся с использованием протокола Quick [29] с некоторыми изменениями. Устройство также было запрограммировано на выполнение той же процедуры, о которой упоминалось ранее в определении APTT, но каждую плазму с плохим тромбоцитом и раствором фукоидана инкубировали в течение 3 мин при 37 ° С. Затем добавляли 0,6 мл предварительно нагретого реагента PT и время образования сгустка наблюдали и повторяли три раза. Гепарин и NaCl также использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

TT был определен с применением протокола, описанного Денсоном и Бонннаром [30]. В соотношении 3: 1 0,6 мл плотной плазмы с тромбоцитами смешивали с 0,2 мл растворов фукоидана в концентрации 10 мкг · мл-1. Затем каждую смесь инкубировали в течение 3 мин при 37 ° С перед добавлением 0,2 мл предварительно разогретого ТТ-реагента, а время образования сгустка регистрировали с тремя повторами. Гепарин (5 мкг · мл-1) и NaCl (0,9% мас. / Об.) Использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

Противовирусную активность проводили против представителя двухцепочечных ДНК (dsDNA) вирусов: Herpes Simplex virus-type 1 (HSV-1). Анализ на скрининг был основан на дозе 50 инфицирования тканей ткани (TCID50) для противовирусных препаратов и модифицирован Kleymann и Werling [31]. Исходный раствор 5 мг · мл-1 трех различных фракций фукоидана растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS) при рН 7,4, а ацикловир — в виде 10 мМ в ДМСО. 50% -ную ингибирующую концентрацию (IC50) определяли с использованием двукратного серийного разведения (10 различных концентраций) в диапазоне 0,2-100 и 0,054-28 мкг · мл-1 для растворов фукоидана и ацикловира соответственно. Каждая лунка содержала 10 000 клеток клеток Vero B4 (50 мкл раствора с 200 000 клеток / мл, предоставленного в среде Института мемориального института Roswell Park (RPMI), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и пенициллина / стрептомицина (PS)), 50 мкл патоген с 5 до 500 КОЕ HSV1 (штамм HF ATCC-VR-260), конечный объем каждой лунки затем доводился до 200 мкл культуральной средой. Отрицательный контроль проводят путем смешивания 50 мкл патогена, 50 мкл клеточных суспензий и среды 100 мкл. После соответствующего периода инкубации лунки микропланшета промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS, 200 мкл) и затем заполняли 200 мкл PBS, содержащим 10 мкг · мл-1 флуоресцеинового диацетата (FDA), который широко используется для подсчета жизнеспособных клеток и анализирует их жизнеспособность. Жизнеспособные клетки способны превращать краситель ферментативно с помощью клеточной эстеразной активности, высвобождая флуорофор из закаленного красителя нефлуоресцентного FDA. После 45 мин инкубации при комнатной температуре измеряли флуоресценцию (RFU, относительные единицы флуоресценции) с использованием 485 нм для возбуждения и 538 нм для излучения.

Впервые представлена ​​физико-химическая и биологическая оценка различных фракций фукоидана, очищенных с помощью аффинной хроматографии красителя. Эти фракции были достигнуты с помощью недавно разработанной технологии аффинной хроматографии на красителе, которая основана на специфическом образовании комплекса переноса заряда между тиазиновыми красителями и сульфатированными полисахаридами. Кроме того, разработка этой методики помогла последующей обработке экстракции и очистки одновременно путем селективного захвата фукоидана из его сырого экстракта, получая новую фракцию фукоидана, называемую фукоиданом_M. Фармакологическое сравнение между различными фракциями фукоидана показало важность длины цепи, молекулярной массы и комфортности структуры для антикоагулянтной активности, в то время как содержание и содержание групп сульфатных эфиров для антигерпетической активности.

Получение различных фракций фукоидана с этими качествами является многообещающим шагом на пути стандартизации метода экстракции фукоидана, раскрытия новых секретов структуры взаимодействия фукоидана (SAR) и выяснения его нативных и разнообразных химических структур. Это также помогает обеспечить рынок протоколом для воспроизводимого коммерческого производства фукоидана.

Авторы выражают большую благодарность Германской службе академических обменов (DAAD) и Министерству высшего образования в Египте (МЗЗ) за финансовую поддержку (Программа финансирования № 57076387). Кроме того, Med. Майкл Пюттманн и Габи Брукманн признаны за их помощь в оценке антикоагулянтов, а также для Бродера Рюманна и Йохен Шмида для анализа композиций фукоидана.

Развитие процесса: Ахмед Заед и Кай Глуффер, измерение антикоагулянтов и интерпретация результатов: Кай-глушитель, изоляция фукоидана и подготовка рукописи: Томас Хан, антивирусный анализ: Дорис Финкельмайер и Анке Бургер-Кентишер, интерпретация антивирусных результатов: Штеффен Рупп и руководитель проекта и соответствующий автор : Роланд Ульбер.

Авторы не объявили конфликта интересов.

FTIR-спектр fucoidan_M.

APPT различных типов фукоидана в концентрации 10 мкг · мл-1 с использованием 0,9% NaCl и 5 мкг · мл-1 в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно (n = 3).

PT различных типов фукоидана в концентрации 10 мкг · мл-1 с использованием 0,9% NaCl и 5 мкг · мл-1 в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно (n = 3).

TT различных типов фукоидана в концентрации 10 мкг · мл-1 с использованием 0,9% NaCl и 5 мкг · мл-1 в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно (n = 3).

Сравнение противовирусной активности против HSV-1 различных типов фукоидана при разном серийном разведении с использованием ацикловира в качестве положительного контроля. Ссылка, сырой и фукоидан-М не показаны, чтобы дать краткий и простой обзор.

Элементный анализ (CHNS) результатов декстрана из Leuconostoc sp. (Г-н ~ 500 кДа) до и после инкубации с дериватизированными гранулами при тех же условиях стадии элюирования фукоиданом. В таблице также показано ± SD (стандартное отклонение) используемого эталонного стандарта: ацетанилид.

* ± SD используемого эталонного стандарта ацетанилида; ** n.d .: не обнаружено.

Элементарный анализ (CHNS) результатов фукоидана по сравнению с коммерчески доступным чистым аналогом. В таблице также показана SD стандартного стандарта: сульфаниловая кислота.

1 Фукоидан (≥95% чистый, выделенный из F. vesiculosus), приобретенный у Sigma-Aldrich®; 2 очищенной фракции из сырого фукоидана при рН 1; 3 очищенной фракции из сырого фукоидана при рН 6; 4 очищенную фракцию, экстрагированную и взятую из неочищенного экстракта МАБ при рН 1; * не обнаружен.

Сравнение различных фракций, касающихся начала, изменения цвета и точек температуры разложения, а также специального оптического вращения [α] 22589.

1 Фукоидан (≥95% чистый, выделенный из F. vesiculosus), приобретенный у Sigma-Aldrich®; 2 очищенной фракции из сырого фукоидана при рН 1; 3 очищенной фракции из сырого фукоидана при рН 6; 4 очищенную фракцию, экстрагированную и взятую из неочищенного экстракта МАБ при рН 1; * не определено.

Влияние молярности элюента NaCl на% элюирования фукоидана и средние молекулярные массы (Mw, Mn и Mp) после стадии адсорбции при рН 1 в течение 40 ч (n = 2).

% Мономерный состав различных фракций фукоидана. Урологические кислоты / димеры глюкозы также обнаружены во всех фракциях.

1 Очищенная фракция из сырого фукоидана при рН 1; 2 очищенной фракции из сырого фукоидана при рН 6; 3 очищенного фукоидана, экстрагированного и взятого из неочищенного экстракта МАБ при рН 1; * не обнаружен.

Резюме IC50 (мкг · мл-1) различных типов фукоидана, выделенных и очищенных от F. vesiculosus против HSV-1 по сравнению с ацикловиром.

1 Фукоидан (≥95% чистый), выделенный из F. vesiculosus, приобретенный у Sigma-Aldrich®; 2 очищенной фракции из сырого фукоидана при рН 1; 3 очищенной фракции из сырого фукоидана при рН 6; 4 очищенного фукоидана, экстрагированного и взятого из неочищенного экстракта МАБ при рН 1.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *