Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Рекомбинантный вирус псевдощели (PRV), выражающий люмиферазу светлячков, эффективно экранированный для однонаправленных РНК CRISPR / Cas9 и противовирусных соединений

Recombinant Pseudorabies Virus (PRV) Expressing Firefly Luciferase Effectively Screened for CRISPR/Cas9 Single Guide RNAs and Antiviral Compounds
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4848585/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

В Китае с 2011 года появился вариант вируса псевдорецепции (PRV), который не защищен коммерческими вакцинами и не изучен хорошо. Геном PRV является большим и трудным для манипулирования, но вполне возможно использовать кластерные, регулярно промежуточные короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas9. Однако идентификация однонаправленной РНК (sgRNA) посредством скрининга имеет решающее значение для системы CRISPR / Cas9 и традиционно является временной и трудоемкой и не подходит для быстрого и высокопроизводительного скрининга эффективных PRG sgRNA. В этом исследовании мы разработали рекомбинантный PRV-штамм, экспрессирующий люциферазу светлячков и усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) в качестве репортерного вируса для PRV-специфических экранов sgRNA и быструю оценку противовирусных соединений. Активность люциферазы проявлялась только через 4 часа после заражения и стабильно выражалась через 10 проходов. В доказательстве основного экрана мы смогли идентифицировать несколько специфических рРНК-специфических PRV и подтвердили, что они ингибировали репликацию PRV с использованием традиционных методов. Используя репортерный вирус, мы также идентифицировали варианты PRV, лишенные функции гена US3, US2 и US9, и показали активность анти-PRV для хлорохина. Наши результаты свидетельствуют о том, что репортер PRV-штамм станет полезным инструментом для основных исследований вирусологии, а также для разработки мер профилактики и профилактики PRV.

Псевдорабиальный вирус (PRV) относится к семейству Herpesviridae [1,2] и является этиологическим агентом псевдорабицидов (PR), также известного как болезнь Ауески. PR вызывает значительные экономические потери для мировой индустрии свиней [1], но в значительной степени контролируется не менее 30 лет с использованием вакцины Bartha-K61. Однако в Китае появился новый вариант PRV, и вакцина Bartha-K61 не обеспечила полную защиту [3,4,5,6]. Полноразмерное геномное секвенирование показало, что вариант PRV, вызывающий вспышку, относится к новому генотипу [7]. Учитывая остроту вспышки и необходимость новой вакцины, необходимы дополнительные исследования вариантов ПРВ.

Из-за большого генома PRV манипулировали основными исследованиями вирусологии с использованием методов гомологичной рекомбинации (HR) [8] или бактериальной искусственной хромосомы (BAC) [9]. Оба традиционных метода имеют значительные недостатки. Например, частота и эффективность ожидаемой рекомбинации с помощью HR достаточно низки; и мутагенез BAC доступен только для вирусных изолятов, для которых был получен полезный БАК. Поэтому CRISPR / Cas9 может применяться к новым изолятам по мере их появления в природе, причем единственной задержкой является необходимость иметь данные последовательности для проектирования направляющих РНК. Кроме того, введение маркеров отбора лекарственных средств или частей плазмид BAC в вирусный геном может влиять на вирусную функцию [10]. Однако генетическая манипуляция необходима для определения функции генов и развития вакцины.

С развитием альтернативных технологий, таких как нуклеазы цинкового пальца (ZFN), транскрипционные активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs) и CRISPR / Cas9 [11,12], редактирование генома стало значительно менее сложным. Эти подходы используют нуклеазу для специфического нацеливания на ген, расщепление ДНК для индуцирования двухцепочечных разрывов на целевом сайте. Разрыв ДНК вызывает механизмы восстановления клеточной ДНК, включая ошибочное гомологичное концевое соединение (NHEJ) и гомологично-направленный ремонт (HDR) [13]. Настройка разрушения гена с использованием ZFN или TALEN требует разработки конкретных белков для нацеливания на каждый сайт dsDNA [14,15], который требует нескольких недель и требует трудоемкости и времени. Однако выпадение гена или выпадение гена в рекомбинантах можно получить за короткий период, просто трансфицируя систему CRISPR / Cas, что является эффективным и удобным [16,17,18].

Система CRISPR / Cas9, полученная из бактериальной адаптивной иммунной системы, была использована для успешного редактирования многих вирусов [18,19,20,21]. Одним из ключевых факторов, влияющих на редактирование ДНК с использованием системы CRISPR / Cas9, является эффективный скрининг для однонаправленных РНК (sgRNAs), который должен быть подтвержден полиморфизмом длины амплифицированного фрагмента (AFLP), анализом эндонуклеазы I T7 (T7E1), анализом рассогласования расследователей, или секвенирование ДНК. Эти методы занимают много времени, кропотливы и минимально чувствительны [22]. Геном PRV содержит высокое содержание GC, что затрудняет амплификацию ПЦР. Таким образом, все традиционные подходы являются субоптимальными для эффективного скрининга PRG sgRNAs.

Здесь, чтобы устранить недостатки, присущие скринингу для PRG sgRNAs, мы применили новый подход и использовали PRV, содержащую люциферазу светлячков, для проверки PRV-специфического скрининга sgRNA. Затем мы применили репортерный вирус для разработки новых инактивированных штаммов PRV и продемонстрировали его полезность в анализах антивирусного скрининга.

Клетки Vero и клетки MARC 145 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Eagle (DMEM, GIBCO, Grand Island, NY, USA). Все культуральные среды были дополнены 10% инактивированной теплом фетальной бычьей сывороткой (FBS, GIBCO, Life technologies) и антибиотиками (0,1 мг / мл стрептомицина и 100 МЕ / мл пенициллина). Ранее был описан штамм PRV HeN1 (номер доступа GenBank: KP098534.1) [5,7]. PRRSV HuN4 (номер доступа GenBank: EF635006.1).

Плазмиду HR сконструировали в векторе экспрессии pcDNA3.1 (+) (Clontech, PaloAlto, CA, USA). Во-первых, pcDNA3.1 (+) переваривали с использованием PmeI для удаления множественного сайта клонирования (MCS) между ним (от Afl II до Apa I). Затем использовали сайт мутагенеза, чтобы вставить 5 ‘BamHI и 3’ NotI сайты, которые фланкируют ген устойчивости к неомицину. Кроме того, были созданы сайты для EcoRI, SalI и XhoI, за которыми последовала сигнальная последовательность SV40 poly (A). Затем BamHI и NotI использовали для удаления гена EGFP из плазмиды pEGFP-N1 (Clontech, PaloAlto, CA, USA) и использовали для замены гена неомицина (вектор Tang-EGFP). Ген люциферазы светлячков затем амплифицировали из вектора pGL3-Basic (Promega, Madison, WI, USA) и клонировали в вектор Tang-EGFP между сайтами NheI и PmeI. Правое и левое гомологичные руки были клонированы из штамма PRV HeN1 с помощью ПЦР и вставлены между промотором CMV и сигналом poly (A) SV40. Конечную плазмиду называли вектором Tang-Luc-EGFP-HR. sgRNAs, участвующие в этом исследовании, были разработаны с использованием онлайн-инструмента CRISPR Design Tool [23] и нацелены на открытые рамки считывания gE, US2, US3 и US9. Оптимизированный кодоном SpCas9 и химерная направляющая РНК-экспрессионная плазмида PX330 были подарками Фэн Чжана [17,24]. Плазмиду PX330 переваривали с использованием BbsI (Thermo Scientific fermentas, Waltham, MA, USA), и были построены конструкции CRISPR / Cas9. Все конструкции в этом исследовании были проверены путем секвенирования. Используемые праймеры представлены в таблице 1.

Геном PRV HeN1 экстрагировали, как описано ранее [7, 25]. Клетки Vero совместно трансфектировали 1 мкг генома PRV, 1 мкг плазмиды g9-gE1 плазмы cas9 и 3 мкг плазмиды Tang-Luc-EGFP-HR с использованием реагента для трансфекции ДНК X-tremeGENE HP (Roche, Basel, Switzerland ) в соответствии с инструкциями производителя. Через 40 часов после трансфекции клетки собирали и затем подвергали трем циклам замораживания-оттаивания. Рекомбинантный PRV очищали из клеточных лизатов путем очистки бляшек (выбран EGFP +) в клетках Vero, покрытых 1% агарозы с низкой температурой плавления и 2% FBS в DMEM. После 10 раундов очистки все бляшки были EGFP + при исследовании флуоресцентной микроскопией.

Вирусные титры определяли с помощью блока формирования бляшек (PFU) или 50% -ной дозы инфекции культуры ткани (TCID50) в клетках Vero. Для сравнения кинетики роста родительских и EGFP-экспрессирующих вирусов клетки Vero были инфицированы PRV HeN1 дикого типа или рекомбинантным PRV-Luc-EGFP в дозе 200 TCID50. Клетки собирали через 24, 48, 72 и 96 ч после инфицирования (hpi), а титр вируса определяли PFU или TCID50 в указанные моменты времени.

Клетки временно трансфицировали указанными плазмидами с использованием реагента для трансфекции ДНК X tremeGENE HP (Roche, Basel, Switzerland) в соответствии с инструкциями производителя. Сорок восемь (48) hpi клетки собирали и один раз промывали PBS, а затем лизировали в буфере для лизиса RIPA, содержащем коктейль ингибитора протеазы (Roche, Basel, Switzerland). Белки в клеточных лизатах разделяли SDS-PAGE, переносили в PVDF-мембраны (Millipore, Milford, MA, USA) и зондировали указанными антителами для обнаружения.

Плазмиды CRISPR / Cas9 трансфицировали в клетки Vero, а через 12 ч клетки были инфицированы 0,01 кратным количеством инфекции (MOI) PRV HeN1 или PRV-Luc-EGFP. Уровни экспрессии указанных белков оценивали в указанные моменты времени после инфицирования с помощью Вестерн-блоттинга или активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа люциферазы (Promega, Madison, WI, USA). Для антивирусного анализа монослои с 90% конфлюентными клетками Vero в 12-луночных планшетах обрабатывали циклоспорином A (CsA) (Beyotime, Jiangsu, China) или хлорохином (Sigma, St. Louis, MO, USA) в течение 4 ч, а затем инфицированных PRV HeN1 или PRV Luc-EGFP. Эффекты антивирусных соединений определяли на основе экспрессии вирусного белка и активности люциферазы, как описано выше. Для CsA ингибировать исследования вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), клетки MARC 145 инфицировали штаммом 0,1 MOI PRRSV HuN4 и инкубировали 12 ч при 37 ° C. Клетки фиксировали 80% -ным этанолом в течение 30 мин и окрашивали конъюгированным сополимером SR-30 FITC (Rural Technologies, Brookings, SD, США) в течение 3 часов. и изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа. Влияние CsA и хлорохина на жизнеспособность клеток определяли окрашиванием Trypan Blue (Sigma, St. Louis, MO, USA).

Поскольку гликопротеин E (gE) не нужен для репликации PRV in vitro [26, 27], мы выбрали эту область для вставки гена люциферазы светлячков. Во-первых, были сконструированы плазмиды, содержащие люциферазу светлячков и EGFP, фланкированные гомологичными рукавами, обозначенными вектором Tang-Luc-EGFP-HR (фиг. 1A). Для генерации рекомбинантных вирусов клетки Vero трансфицировали очищенным геномом PRN HeN1, Tang-Luc-EGFP-HR и gRNA-gE1 (специфическая конструкция CRISPR / Cas9 gE, которая использовалась для повышения эффективности HR, наши неопубликованные данные). Сорок восемь (48) hpi, вирусы собирали и очищали бляшками. После 10 раундов очистки экспрессия EGFP была подтверждена флуоресцентной микроскопией (фиг. 1B) и экспрессия люциферазы светлячков была подтверждена люциферазной активностью (фиг. 1C). Активность люциферазы была обнаружена уже на 4 hpi и достигла более высокого уровня через 36 часов (рисунок 1C). Чтобы определить, влияет ли экспрессия люциферазы светлячков и EGFP на репликацию вируса PRV-Luc-EGFP, для PRV-HeN1 и PRV-Luc-EGFP выполнялись одношаговые кривые роста. Мы обнаружили, что PRV-Luc-EGFP реплицируется значительно медленнее, чем PRV-HeN1 (рисунок 1D). Мы также оценили устойчивость рекомбинантного вируса и обнаружили, что активность люциферазы из PRV-Luc-EGFP стабильна по меньшей мере через 10 проходов (фиг. 1Е).

Чтобы проверить, может ли PRV-Luc-EGFP использоваться для скрининга sgRNA, мы разработали и построили несколько конструкций CRISPR / Cas9, которые были специфичными для US3, US2 и US9 соответственно (таблица 1). Короче говоря, эффективные конструкции CRISPR / Cas9 нарушали бы геном PRV и ингибировали репликацию вируса, тем самым уменьшая активность люциферазы. Для тестирования разработанных sgRNAs клетки Vero трансфицировали конструкциями CRISPR / Cas9, инфицированных PRV-Luc-EGFP через 12 часов, а затем активность люциферазы измеряли 24 hpi. Как показано на фиг.2А, sgRNAs US3-L3, US2-3 и US9-2 значительно уменьшают количество активности люциферазы. Чтобы подтвердить снижение вирусной репликации, мы также оценили влияние sgRNAs на экспрессию вирусного белка вестерн-блоттингом. В соответствии с результатами анализа люциферазы клетки, трансфецированные sgRNAs US3-L3, US2-3 и US9-2, имели значительно уменьшенные уровни US3 (рисунок 2B). Разрывы ДНК запускают путь восстановления NHEJ, который иногда приводит к введению мучительных мутаций, а затем инактивирует экспрессию генов. Затем мы проверили, будут ли sgRNAs инактивировать специфические гены PRV. PRV-HeN1, обработанный US3-L1, US2-3 и US9-2, собирали для очистки бляшек. Пять (5) очищенных бляшек были случайным образом отобраны для определения, были ли они инактивированы на основе экспрессии US3, и из этих 60% (3/5) были уменьшены или не были выражены в US3 (рисунок 2C). Никаких нарушений в gI-белках не наблюдалось, указывая на целевую специфичность sgRNA (рисунок 2C). Одна из бляшек, лишенных экспрессии US3 (бляшка 4), была секвенирована и обнаружила отсутствие двух пар оснований в области US3 (рисунок 2D). PRV-штаммы, лишенные экспрессии US2 и US9, были получены с использованием аналогичных методов (рис. 2E, F). Эти результаты свидетельствуют о том, что PRV-Luc-EGFP является мощным инструментом для эффективного скрининга для sgRNA CRISPR / Cas9.

Очень мало противовирусных соединений, которые эффективны против PRV in vitro и ни у кого in vivo. Таким образом, эффективный анализ in vitro для скрининга противовирусных соединений против PRV, вероятно, будет способствовать контролю PR. Поэтому в качестве доказательства принципа мы оценили противовирусные эффекты хлорохина и CsA с использованием PRV-Luc-EGFP и подтвердили результаты с помощью PRV HeN1. Клетки Vero предварительно обрабатывали в течение 4 ч хлорохином или CsA, а затем инфицировали PRV-Luc-EGFP в течение 24 часов. Активность люциферазы снижалась в зависимости от дозы с увеличением содержания хлорохина (рис. 3А-С).

Напротив, у CsA не было ингибирующей активности против PRV-Luc-EGFP (рисунок 4A). В соответствии с этим, инфекция PRV HeN1 не ингибировалась CsA (рисунок 4B, C). Мы одновременно использовали PRRSV как положительный контроль антивирусных эффектов CsA. Используя конъюгированное FITC антитело, направленное против белка N в PRRSV, CsA сильно ингибирует репликацию PRRSV (рисунок 4D). В совокупности эти результаты показали, что PRV-Luc-EGFP является полезным инструментом для скрининга противовирусных соединений.

Генетическая манипуляция крупными сложными ДНК-вирусами, такими как PRV, имеет решающее значение для понимания их биологии и разработки новых стратегий борьбы. Поэтому в этом исследовании мы разработали новый штамм PRV, выражающий люциферазу светлячков, для использования в качестве инструмента в будущих исследованиях. Экспрессия люциферазы обнаруживалась уже на 4 hpi, что указывает на то, что репортерный вирус сможет сократить время анализа антивирусных экранов и улучшить чувствительность к анализу. Кроме того, когда геномы PRV были обрезаны системой CRISPR / Cas9, экспрессия люциферазы ингибировалась, указывая на то, что репортерный вирус является мощным инструментом для идентификации специфических ргВНК PRV, что поможет нам лучше редактировать геном PRV. Наконец, используя репортерный вирус, мы успешно разработали инактивированные штаммы PRV US2, US3 и US9 и продемонстрировали, что хлорохин ингибирует репликацию PRV, тогда как CsA нет.

Система CRISPR / Cas9 имеет множество отличительных преимуществ в качестве инструмента для редактирования генома, который является одновременно эффективным и удобным по сравнению с другими методами [16,17,18]. Ранее мы использовали разрывы ДНК, вызванные системой CRISPR / Cas9, которые ингибируют PRV-репликацию для развития штамма gE- / gI- / TK-PRV для скрининга для sgRNA PRV с использованием анализов образования бляшек или Вестерн-блоттинга; однако эти методы требуют 3-4 дней (наши неопубликованные данные пересмотрены в вирусологии). Текущая репортерная система на основе люциферазы дает результаты в гораздо более короткие сроки (4 часа), что позволяет ускорить развитие вакцины и фундаментальные исследования. Для больших геномных вирусов система CRISPR / Cas9 была удобным инструментом для встраивания чужих репортерных генов в геноме [18,21].

Хлорохин представляет собой 9-аминохинолин, который хорошо известен для противомалярийной активности и противовирусной активности против некоторых вирусных инфекций [28]. Для успешного проникновения многих вирусов требуется воздействие низкого внутриклеточного рН. Хлорохин оказывает прямое противовирусное действие, ингибируя зависящие от рН стадии жизненного цикла вируса для некоторых членов флавивирусов, ретровирусов и коронавирусов [28]. Было показано, что хлорохин ингибирует репликацию вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1) [29] и может ингибировать PRV по тем же механизмам, но это еще предстоит подтвердить. CsA представляет собой грибковый метаболит, который оказывает глубокое воздействие на иммунную систему и потенциально является селективным иммуносупрессивным средством [30]. Противовирусные эффекты CsA происходят от ингибирования репликации вируса путем блокирования циклофилинов, которые полезны для некоторых вирусов [31,32]. Сообщается, что CsA ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека-1 [33], вируса гепатита C [34,35], PRRSV и вируса конского артериита [31]. Что касается вирусов герпеса, в частности, было показано, что CsA ингибирует репликацию HSV-1 [36,37]. Интересно отметить, что в нашем исследовании CsA не проявлял ингибирующей активности против PRV в клетках Vero. Отсутствие противовирусной CsA-опосредованной противовирусной активности может быть связано с тем, что репликация PRV не связана с циклофилинами в клетках Vero.

В заключение мы разработали маркированный PRV с люциферазой, который был мощным инструментом для скрининга sgRNA и противовирусных соединений. Репортерский вирус, вероятно, имеет полезность для базовых исследований новых вариантов PRV и разработки мер по борьбе с вирусами и профилактике.

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (грант № 31302065) и Национальной программой исследований и развития высоких технологий Китая (№ 2011AA10A212).

Ян-Донг Тан, Сюэ-Хуэй-Кай, Тун-Цин Ан и Чжи-Юнь Тянь разработали эксперимент и написал статью. Янь-Донг Тан, Цзи-Тин Лю, Квинг-Ционг Фанг, Тонг-Юнь Ван и Мин-Ся Сан провели эксперименты. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Строительство и идентификация PRV-Luc-EGFP. (A) Схема, показывающая сайты рекомбинации, используемые для модификации генома PRV и вставки вектора-донора Tang Luc-EGFP-HR с использованием системы CRISPR / Cas9; (B) Репрезентативное изображение, показывающее анализ бляшек для очистки PRV-Luc-EGFP. На левой панели показано формирование флуоресцентной зеленой бляшки после семи раундов очистки бляшек. Правая панель показывает ту же область в ярком поле; (C) экспрессия люциферазы в клетках Vero в разные моменты времени после инфицирования PRV-Luc-EGFP (0,1 MOI); (D) Однократная кривая роста рекомбинантного вируса (PRV-Luc-EGFP; зеленый) по сравнению с родительским вирусом (HeN1; красный); (E) Стабильность PRV-Luc-EGFP. Активность люциферазы измеряли от прохождения 1 через проход 10.

Эффективное скрининг sgRNA с использованием PRV-Luc-EGFP и идентификация штаммов PRV с инактивированными генами US3, US2 или US9. (A) скрининга sgRNA с использованием PRV-Luc-EGFP. Конструкции Cas9 и векторный контроль были трансфицированы индивидуально в клетки Vero. Двенадцать (12) часов спустя клетки были инфицированы PRV Luc-EGFP и была обнаружена активность люциферазы 24 hpi; (B) Репрезентативное изображение, показывающее экспрессию US3 с помощью Вестерн-блоттинга в клетках, инфицированных PRV-HeN1, скрининг одной и той же панели sgRNAs, как в (A); (C) Репрезентативное изображение, показывающее экспрессию US3 и gI в пяти случайно выбранных бляшках, которые были обработаны sgRNA US3-L3 с помощью Вестерн-блоттинга. Инактивированные вирусы идентифицировали на основании отсутствия экспрессии US3 (например, бляшки 4). Последовательность была использована для подтверждения того, что вирусы, которые считаются инактивированными, имеют нефункциональные гены для US3 (D); US2 (E); и US9 (F). Изображения в A, B и C показывают репрезентативные результаты из трех независимых экспериментов.

Хлорохин ингибирует репликацию PRV. (A) Хлорохин ингибирует репликацию PRV Luc-EGFP. Клетки Vero предварительно обрабатывали указанными количествами хлорохина и через 4 часа инфицировали PRV-Luc-EGFP (0,01 МОИ). Через 24 ч оценивали активность люциферазы; Хлорохин ингибирует PRV HeN1, который обнаруживается экспрессией gI (B); и CPE (C). На изображениях представлены репрезентативные результаты трех независимых экспериментов.

Циклоспорин A (CsA) не влияет на репликацию PRV. (A) клетки Vero предварительно обрабатывали указанными количествами CsA и через 4 часа инфицировали PRV-Luc-EGFP (0,01MOI). Через 24 ч оценивали активность люциферазы; (B) клетки Vero предварительно обрабатывали указанными количествами CsA и через 4 часа инфицировали PRV HeN1 (0,01MOI). Через 24 ч экспрессию gI оценивали по Вестерн-блоту (представительное изображение); (C) Репрезентативные изображения, показывающие цитопатический эффект HeN1 на клетках Vero, предварительно обработанных разным количеством CsA; (D) клетки Marc145 предварительно обрабатывали указанными количествами CsA и затем инфицировали 0,1 МОИ PRRSV. Двенадцать (12) hpi, N-белок был обнаружен иммунофлюоресценцией. На изображениях представлены репрезентативные результаты трех независимых экспериментов.

Последовательности праймеров и sgRNAs, используемые в этом исследовании.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *