Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

CMV-промотор, управляемый кодон-оптимизированным выражением, изменяет тип сборки и морфологию восстановленного HERV-K (HML-2)

CMV-Promoter Driven Codon-Optimized Expression Alters the Assembly Type and Morphology of a Reconstituted HERV-K(HML-2)
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4246225/

Семейство HERV-K (HML-2) содержит наиболее недавно интегрированные и наиболее хорошо сохранившиеся эндогенизированные провирусные последовательности в геноме человека. Все известные элементы, тем не менее, подвергаются мутациям или делециям, которые делают экспрессируемые частицы неинфекционными. Более того, эти постпозиционные мутации препятствуют анализу общих биологических свойств этого древнего семейства вирусов. Таким образом, выражение консенсусных последовательностей и последовательностей элементов с реверсированными пост-инсерционными мутациями очень помогло преодолеть это ограничение. Мы исследовали морфологию частиц недавно восстановленного элемента HERV-K113, названного oriHERV-K113, с использованием тонкоточной электронной микроскопии (EM) и могли продемонстрировать, что сильная сверхэкспрессия путем замещения 5’LTR для промотора CMV и оптимизации частичного кодона изменила вирус тип сборки и морфология. Это включало преобразование из регулярного С-типа в морфологию типа А с массой цитоплазматических незрелых ядер, привязанных к клеточной мембране, и мембран везикул. Сверхэкспрессия разрешала выпуск и созревание вирионов, но уменьшала содержание конверта. Более слабого повышения вирусной экспрессии Staufen-1 было недостаточно для индукции этих морфологических изменений.

HERVs составляют более 8% человеческого генома, и на наших хромосомах имеется более 500 000 отдельных элементов. Эти элементы получены из бывших экзогенных ретровирусов, которые инфицировали зародышевые клетки или их клетки-предшественники и с тех пор переносились по вертикали из поколения в поколение [1]. HERVs обычно очень древние и классифицируются в разные семьи. Действительно, члены некоторых семейств HERV можно идентифицировать в обезьянах Старого Света и Нового Света в соответствующих хромосомных локусах, указывая, что их интеграция произошла в предковском примате, который жил в момент времени, предшествующий расколу между группами более 35 миллионов лет назад [ 2,3].

Самые молодые (т. Е. Наиболее интегрированные) ретровирусные элементы принадлежат к семейству HERV-K (HML-2). Поскольку они используют лизин (K) тРНК, чтобы перенести их обратную транскрипцию и связаны с вирусом опухоли молочной железы мыши (MMTV), эти провирусы вместе с девятью другими семействами называются HERV-K (HML). Это соотношение отражено в аббревиатуре HML, что означает «человеческий MMTV-подобный». Элементы семейства HERV-K (HML-2) встречаются исключительно в приматах Старого Света, включая людей. Действительно, несколько членов специфичны для людей, предлагая интеграцию после отделения человеческих и шимпанзе-родов около пяти миллионов лет назад.

Во время их пребывания в геноме хозяина эндогенные ретровирусы подвергались мутациям и делециям. Очищающий выбор, который сохраняет открытые рамки кадра, был зарегистрирован только для нескольких последовательностей HERV [4]. Поэтому самые последние интегрированные провирусы, как правило, лучше всего сохраняются. В настоящее время известно более 90 хорошо сохранившихся провирусов HERV-K (HML-2) в геноме человека [5]. Эти элементы все еще имеют открытые рамки считывания, кодирующие функциональные вирусные белки. Более того, экспрессия белка, а также сбор и высвобождение неинфекционных частиц HERV-K (HML-2) наблюдались в тератокарцином и меланомах и в клеточных линиях, полученных из них [6,7]. Хотя это еще не продемонстрировано, нельзя исключать, что некоторые люди, живущие сегодня, несут провирусы, кодирующие инфекционные элементы HERV-K (HML-2), или что инфекционные вирусы могут возникать из-за рекомбинации между неинфекционными элементами [8]. Такие события рекомбинации, восстанавливающие функциональные провирусы от инактивированных эндогенных элементов, не будут иметь приоритета и уже зарегистрированы у животных [9,10]. В последнее время было получено множество знаний об основной биологии HERV-K (HML2) и различных аспектах взаимодействия вируса с хозяином, выразив конструированные консенсусные последовательности и восстановленный элемент HERV-K113 (oriHERV-K113), в котором синонимичные пост- вставные мутации были возвращены [11,12,13].

В этом текущем исследовании мы сгенерировали и экспрессировали модифицированную CMV-промоторную и частично кодоновую версию восстановленного молекулярного клона HERV-K113 (oriHERV-K113), описанного ранее [11]. По сравнению с oriHERV-K113 высокая экспрессия варианта, оптимизированного кодоном (называемая oricoHERV-K113), приводит к неожиданному переключению с C-типа на морфологию типа A, как показано тонкопленочной электронной микроскопией.

Генерация pBSK-oriHERV-K113 («oriHERV-K113») описана в другом месте [11]. Вкратце, провирусную последовательность HERV-K113 (GenBank AY037928) амплифицировали из плазмиды BAC-библиотеки RP11-12X [14] и клонировали в вектор pBlueskript SK + (pBSK) (Agilent Technologies, Inc., Cedar Creek, NE, USA ). 25 несинонимических мутаций и три мутации в 3’LTR были идентифицированы как постинтернациональные мутации путем выравнивания с другими элементами HERV-K (HML-2) [11,15,16] и впоследствии были скорректированы с помощью многосайтового направленного мутагенеза (QuikChange® , Agilent Technologies, Inc.). pcDNA-oricoHERV-K113 («oricoHERV-K113») состоит из генома oriHERV-K113 с областями, оптимизированными кодонами для усиления экспрессии белка в клетках млекопитающих. Была синтезирована полная провирусная последовательность oricoHERV-K113 (Geneart, Regensburg, Germany) и клонирована за промотором CMV в pcDNA3.1 (Lifetechnologies, Carlsbad, CA, USA). Конструирование человеческого вектора экспрессии Staufen-1 было описано ранее [17].

Клетки HEK 293T и HeLa культивировали в полной модифицированной Dulbecco среде Eagle (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, l-глутамином (2 мМ), пенициллином (50 ед / мл) и стрептомицином (50 мкг / мл).

Для анализа электронной микроскопии и Вестерн-блотов клетки 2,4 × 106 или 5 × 105 НЕК 293Т или HeLa высевали в 100-миллиметровые чашки или 6-луночные планшеты (ТЭС, Трасадинген, Швейцария) соответственно, а затем трансфицировали плазмидами с использованием фосфата кальция или комплект Qiagen Polyfect Kit (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Через 2-4 дня после трансфекции образцы культуральной среды собирали, осветляли при 3345 × g в течение 8 мин и фильтровали (0,45 мкм) для удаления клеточного мусора. Для образцов, полученных из чашек 100 мм, супернатанты затем центрифугировали при 175000 × g в течение 3 часов при 4 ° C через 20% сахарозную подушку в роторе Beckman SW32Ti. Гранулы вируса ресуспендировали в 60 мкл 0,05 М буфера Hepes, pH 7,2 для Вестерн-блот-анализа. Для получения клеточных лизатов трансфицированные клетки ресуспендировали в буфере для лизиса клеток (1% Triton-X 100, 20 мМ Tris pH 7,7, 150 мМ NaCl), содержащем полный коктейль ингибитора протеазы (Roche Diagnostic, Mannheim, Germany).

Процедура получения образцов для электронной микроскопии была опубликована в другом месте [15]. Короче говоря, через 2 дня после трансфекции клетки фиксировали 2,5% глутаральдегидом в 0,05 М Hepes (pH 7,2) в течение 1 часа при комнатной температуре перед уборкой (скребкой) и центрифугированием при 2000 × g. Клеточные гранулы постфиксировали OsO4 (1% в ddH2O, Plano, Wetzlar, Germany), окрашивали ацетатом уранила (2% в ddH2O, Merck, Дармштадт, Германия), обезвоживали поэтапно в градуированном спирте, погружали в пропиленоксид и встроенный в Epon (Serva, Heidelberg, Germany) с полимеризацией при 60 ° C в течение 48 часов. Ультратонкие срезы (60-80 нм) разрезали с использованием ультрамикротома (Ultracut S или UCT, Leica, Германия) и окрашивали 2% уранилацетатом и цитратом свинца. Для пост-внедренного иммуноокрашивания клетки фиксировали 4% параформальдегидом и 0,1% глутаральдегидом. Их дегидратировали градуированным спиртом и внедряли в Lowicryl (HM20) в соответствии с методикой прогрессивного понижения температуры. Тонкие срезы, нанесенные на сетчатые сетки с никелевой сеткой 300hexa, были инкубированы на капельках блокирующего буфера (5% сухого молока в PBS) в течение 30 минут, а затем в блокирующем буфере с крысиным анти-CA, крысиным анти-p15 (обе поликлональные сыворотки были получены в лаборатория авторов) или козьи анти-GFP (Rockland Immunochemicals for Research, Limerick, PA, USA) и 5 ​​нм антитело против крысы / козьего антитела (BB International, Cardiff, UK) в течение 1 часа. После фиксации 0,1% глутаральдегидом в 0,05% -ном буфере Hepes в течение 15 мин образцы выдерживали 2% уранилацетата и 0,2% свинцового цитрата. Передаточная электронная микроскопия проводилась с ЭМ 902 (Zeiss), работающим при 80 кВ, и изображения были оцифрованы с использованием камеры с зарядовой связью с медленным сканированием (Pro Scan, Scheuring, Germany).

Вирусные лизаты или гранулированные вирусные частицы смешивали с 5 × буфером для образца и нагревали в течение 10 мин при 98 ° С, прежде чем подвергали электрофорезу додецилсульфат-полиакриламидному гелевому электрофорезу (SDS-PAGE). Белки переносили на мембрану PVDF (Roth, Karlsruhe, Germany) с помощью полусухого электрофореза (Biorad, München, Germany). После блокировки в PBS с 5% обезжиренным молочным порошком и 0,1% Твин, мембраны зондировали с помощью специфических крыс анти-СА-сыворотки, как описано ранее [15], и вторичного конъюгированного с корой антитела против пероксидазы хрена (Sigma-Aldrich, Гамбург, Германия). Β-актин детектировали с помощью мышиного моноклонального антитела мыши AC-40 с контролем HRP (Sigma-Aldrich). Белки визуализировали с использованием суперлюминесцентного субстрата SuperSignal West Dura (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) и рентгеновской пленки Kodak Medical.

Ранее мы описали 25 несинонимичных постпозиционных мутаций в провирусе HERV-K113, первоначально характеризуемом Тернером и сотрудниками [11,14,15,16]. Реверсия этих 25 мутаций и реверсия трех предполагаемых дополнительных пост-инсерционных мутаций в 3’LTR молекулярного клона (для получения клона, называемого oriHERV-K113) позволили экспрессировать дефектные репликации ретровирусные частицы в трансфецированных клеточных линиях человека [ 11].

Чтобы повысить относительно низкие уровни экспрессии частиц, мы также построили молекулярный клон, в котором части генома oriHERV-K113 были оптимизированы по кодону, оставляя неизменными потенциальные регуляторные последовательности и области перекрывающихся рамок считывания [15]. Для дальнейшего усиления экспрессии мы заменили вирусный 5’LTR промотором CMV и назвали полученный молекулярный клон почти полной длины «oricoHERV-K113» (рис. 1А).

Геномная организация и экспрессия восстановленной человеческой эндогенной ретровирусы (HERV-K) человеческой MMTV-like-2 HERV-K (HML-2) последовательности «oriHERV-K113» и вариант с частичным кодоном с промотором CMV «oricoHERV-K113» , (A) Для восстановления потенциальной инфекционной последовательности предшественников элемента HERV-K (HML-2) 25 несинонимических предполагаемых пост-инсерционных мутаций (обозначенных черными стрелками, нижняя стрелка относится к кадре считывания) в HERV- Последовательность генома K113 (AY037928) была возвращена для генерации oriHERV-K113. В oricoHERV-K113 части генома oriHERV-K113 были оптимизированы по кодону (в коробке зеленым) для достижения максимальной экспрессии в клетках млекопитающих, оставляя потенциальные регуляторные последовательности или перекрывающиеся области в геноме неизменными. 5’LTR-область была заменена промотором CMV (красный). Числа, заданные для начала и конца областей, оптимизированных для кодонов, относятся к последовательности genbank AY037928. (B) Вестерн-блоттинг внутриклеточных белков Gag, обработанных фрагментов и промежуточных продуктов деградации после трансфекции молекулярных клонов в клетках HEK 239T с использованием специфичной для Gag (CA) -специфической антисыворотки для обнаружения. Показаны полосы, предположительно представляющие белки Gag-Pro, Gag и CA. Удаление и повторное зондирование мембраны с помощью специфичного для β-актина моноклонального антитела продемонстрировали, что те же количества клеточного лизата загружали для ложных, oriHERV-K113 и oricoHERV-K113 трансфецированных клеток, соответственно.

Вестерн-блот-анализ трансфецированных клеток HEK 293T с использованием капсид-специфической антисыворотки показал, что экспрессия Gag из oricoHERV-K113 была по меньшей мере в 50 раз выше, чем у oriHERV-K113 (рисунок 1B).

Затем мы попытаемся проанализировать морфологическое влияние модулированной экспрессии ретровирусных белков тонкостенным ЭМ-анализом клеточных линий человека, трансфицированных oricoHERV-K113.

Как сообщалось ранее [11], oriHERV-K113 продуцирует частицы с незрелыми и конденсированными зрелыми ядрами, и многие пики огибающей хорошо видны на вирусной мембране (рис. 2А, В).

Тонкоразмерные электронные микрофотографии образования частиц oriHERV-K113 и oricoHERV-K113 после трансфекции полноразмерными молекулярными клонами. (A) В клетках HEK 293T наблюдаются как незрелые частицы oriHERV-K113 с кольцеобразными структурами белков Gag (отмеченные стрелками), так и зрелые формы с конденсированными сердечниками (отмеченными стрелкой). (B) Env сильно внедряется в вирусную мембрану (стрелки). (C) Популяризация частиц oriHERV-K113 имеет типичную морфологию C-типа с сборкой оболочек Gag на клеточной мембране во время почкования (стрелка указывает на начинающую стадию). (D) oriHERV-K113, полученных в клетках HeLa. (E, F) oricoHERV-K113, трансфицированные клетки HEK 293T, продуцируют большое количество частиц, которые выстраиваются в линию с клеточной мембраной и отображают морфологию A-типа, преимущественно с предварительно собранными кольцами белка Gag, прикрепленными к мембранам. (G) oricoHERV-K113 иногда формирует начинающие цепи со структурами, напоминающими морфологию C-типа (стрелки). (H) Включение Env в вирусную мембрану oricoHERV-K113, по-видимому, очень низкое. Показана освобожденная зрелая частица, продуцируемая клетками HeLa (I) Immunostaining EM с CA-специфической антисывороткой. (J) Immunostaining EM с p15-специфической антисывороткой и антисывороткой GFP (K). (L) Нет контроля трансфекции.

Общее производство вирусных частиц низкое, и только несколько начинающих этапов или кластеров выпущенных незрелых и зрелых частиц на клетку. Секции клеток с вирионами oriHERV-K113 были относительно редкими. Только около одной из 20-30 секций клеток содержали частицы. Многообещающая морфология oriHERV-K113 обычно является С-типом, несмотря на то, что она является бетаретровирусом в соответствии с его региональной областью поля [18]. Молекулы Gag начинают сборку на клеточной мембране в выпуклой формации, которая напоминает букву «C» (рис. 2C). Мы никогда не наблюдали полного закрытия кольца Gag во время поздних этапов почкования, что указывало на практически сопутствующее завершение оболочки Gag и ущемление вириона. В цитоплазме клеток, трансфецированных oriHERV-K113, не было также незрелых вирусоподобных частиц. Результаты, полученные после трансфекции полноразмерного молекулярного клона oriHERV-K113 в клетки HeLa, были аналогичны результатам с клетками HEK 293T (рисунок 2D).

Картина различна в клетках, трансфицированных oricoHERV-K113. В этих клетках частицы с полностью закрытыми оболочками Gag выстраиваются в линию на внутренней листе плазматической мембраны (рис. 2Е, F) и в некоторых клетках также на цитоплазматической стороне везикулярных мембран. Цитоплазматическая сборка частиц, имеющих полностью закрытые незрелые ядра, напоминает регулярную ретровирусную морфологию A- и B-типа и сопоставима с формой сборки типичных бетаретровирусов, включая мышиную MMTV и Mason Pfizer Monkey Virus (MPMV) [19]. Многие из трансфицированных клеток проявляют почкованные цепи в выступах плазматической мембраны (рис. 2G). Хотя преобладают внутриклеточные частицы, незрелые и зрелые вирионы также присутствуют вне клеток (рис. 2G, H), что указывает на некоторую степень высвобождения частиц из клетки. Включение Env в вирусную мембрану, по-видимому, значительно ниже, чем у частиц, вырабатываемых oriHERV-K113, причем очень мало пиков присутствуют на почкообразных структурах или выпущенных частицах (рис. 2G, H). Выражение oricoHERV-K113 в клетках HeLa приводит к морфологиям, аналогичным тем, которые наблюдаются в клетках HEK 293T (рисунок 2H). Чтобы подтвердить идентичность частиц oricoHERV-K (HML-2), мы провели иммуноокрашивание EM на тонких срезах трансфицированных клеток HEK 293T, встроенных в Lowicryl. Внутри- и внеклеточные вирусные частицы были специально маркированы специальной антисывороткой CA и p15, но не с анти-GFP-контролем (рис. 2I-K). В нетрансфицированных клетках не наблюдалось никаких вирусных частиц (рисунок 2L).

Для дальнейшего демонстрации высвобождения вирионов из клеток, трансфецированных oricoHERV-K113, супернатант трансфицированных клеток HEK 293T осаждали ультрацентрифугированием и внедряли для тонкого разреза EM. Как показано на фиг.3, гранулы содержат высокие доли исключительно зрелых вирионов с относительно большими, обычно концентрическими сферическими или многоугольными электронными плотными сердечными структурами на фоне загрязняющих микросом (рис. 3). В соответствии с наблюдениями, сделанными в предыдущем эксперименте, шипы едва заметны на поверхности частиц oricoHERV-K113. Поэтому наши данные демонстрируют эффективное высвобождение и созревание ретровирусных частиц из клеток, трансфецированных oricoHERV-K113.

Вирусные частицы в супернатанте трансфицированных клеток HEK 293T. Клетки трансфицировали полноразмерным молекулярным клоном oricoHERV-K113, а вирионы в супернатанте гранулировали ультрацентрифугированием и внедряли для тонкого разреза EM. Почти все частицы показывают конденсированное ядро ​​зрелых вирионов.

Недавно мы описали взаимодействие кодированных белков HERV-K (HML-2) Rec и Gag с белком Staufen-1 человека и отметили 20-кратное увеличение продукции oriHERV-K113 в клетках, сверхэкспрессирующих Staufen-1 [17].

Чтобы повысить экспрессию oriHERV-K113 Staufen-1 настолько сильно, насколько это возможно, и оценить потенциальный переключатель в морфологии, мы вначале оптимизировали коэффициент трансфекции oriHERV-K113 и Staufen-1 экспрессионных плазмид. Как показано на фиг.4, пик экспрессии Gag связан с промежуточным количеством ДНК Staufen-1; то есть с соотношением 4: 1 oriHERV-K113 к ДНК Staufen-1.

Совместная экспрессия белка Staufen-1 человека усиливает продукцию белка oriHERV-K113. Обнаружение Вестерн-блоттинга с использованием специфической антисыворотки Gag (CA) внутриклеточного белка HERV Gag через 48 ч после совместной трансфекции клеток HEK 293T с фиксированным количеством молекулярного клона с полной длиной oriHERV-K113 и уменьшением количества экспрессии Staufen-1 вектор. Показаны предполагаемые Gag-Pro, Gag и обработанные капсидные белки. Время экспозиции было оптимизировано для отображения различий экспрессии. Это было слишком мало для визуализации белков Gag на полосе 6 (без избыточной экспрессии Staufen-1).

Морфология вирусных частиц, полученных трансфицированными клетками HEK 293T при оптимизированных опосредованных Staufen-1 условиях улучшения, также анализировалась тонкостенным ЭМ. Несмотря на опосредованное Staufen-1 усиление, приводящее к значительно большему количеству вирусных частиц, не было доказательств для переключателя типа C-A (рисунок 5A, верхняя панель). Однако даже при усилении Staufen-1 уровни экспрессии Gag были все еще ниже, чем у клеток, трансфецированных oricoHERV-K113 (фиг. 5B). Как и ожидалось, совместная трансфекция Staufen-1 не изменила морфологию частиц oricoHERV-K113 (рис. 5А, нижняя панель) и оказала лишь минимальное усиливающее влияние на экспрессию белка oragHERV-K113 Gag (рис. 5B), что вероятно, связано с высоким исходным уровнем экспрессии белка из этой конструкции.

Тонкое сечение EM производства частиц oriHERV-K113 и oricoHERV-K113 после совместной трансфекции полноразмерных молекулярных клонов с помощью Staufen-1 в соотношении 4: 1 для усиления продуцирования белка. (A) Верхняя панель: EM частиц, полученных oriHERV-K113 после совместной трансфекции с помощью Staufen-1. Никаких изменений в морфологии C-типа не наблюдается, несмотря на усиление производства белка Staufen-1. Нижняя панель: тот же эксперимент с oricoHERV-K113, никакого влияния на морфологию A-типа можно увидеть в результате умеренного усиления Staufen-1. (B) Вестерн-блоттинг экспрессии Gag белка, опосредованного Staufen-1, в лизате клеток HEK 293T. Клетки трансфицировали с помощью oriHERV-K113 и Staufen-1 (отношение 4: 1), oricoHERV-K113, oricoHERV-K113 и Staufen-1 (соотношение 4: 1), только Staufen-1 и с пустым вектором в качестве контрольного контроля (слева правильно). Внутриклеточный гаг был обнаружен специфической антисывороткой Gag (CA) -протеина. В качестве контроля загрузки мембрану снимали и повторно исследовали специфическим моноклональным антителом ß-актин.

Кодон-оптимизация ретровирусных последовательностей обычно используется для усиления экспрессии белка в эукариотических клетках [20, 21]. Для структурных вирусных белков это достигается двумя основными способами: во-первых, он повышает эффективность трансляции у рибосомы и, во-вторых, высвобождает транскрипты из ядерных ограничений, связанных с контролем нуклеоцитоплазматического переноса нециклированных или частично сращенных вирусных мРНК , В попытке повысить экспрессию oriHERV-K113, воссозданного элемента HERV-K (HML-2), мы оптимизировали кодоны больших участков генов, кодирующих Gag, Pro, Pol и Env. Регионы, содержащие предполагаемый сайт упаковки, скользкие сайты, сайты сплайсинга и элемент Rec-responsive, остались неизменными [15]. Кроме того, относительно слабый промотор 5’LTR был заменен более сильным промотором CMV. Полученная конструкция была названа «oricoHERV-K113».

При трансфекции в эукариотические клетки наблюдалось резкое увеличение уровней цитоплазматического гага по сравнению с таковыми в клетках, трансфицированных oriHERV-K113. Интересно отметить, что в трансфектантах oricoHERV-K113 тонкопленочная электронная микроскопия выявила наличие множества цитоплазматических частиц с явно собранными оболочками Gag. Такие внутриклеточные частицы с незрелыми ядрами никогда не наблюдались в клетках, экспрессирующих oriHERV-K113, где наблюдались только начинающие стадии или выпущенные незрелые и зрелые вирионы. Это согласуется с более ранними наблюдениями в клеточных линиях тератокарциномы [6,22] и с документированными морфологиями вирионов или подобных вирусу частиц, генерируемых консенсус-последовательностями HERV-K (HML-2) [12,13]. В этих сообщениях частицы, распущенные на клеточной мембране с обычной морфологией С-типа [23,24], даже если транскрипция консенсусных последовательностей приводилась в действие CMV-промотором [12,13]. Исходя из этих наблюдений, мы предполагаем, что одного CMV-промотора недостаточно, чтобы вызвать образование закрытых незрелых внутриклеточных ядер HERV-K113. Верно ли это, или же оптимизация кодонов уже достаточна для индукции внутриклеточных частиц, необходимо разрешить в экспериментах с соответствующими векторами. Первоначально ретровирусы классифицировались по их внешнему виду и почковому фенотипу, как показано ЭМ [23,24] (см. [25]). Морфология С-типа обычно ассоциируется с онковирусами и лентивирусами, где образование незрелого ядра происходит одновременно с почкованием на клеточной мембране. В случае ретровирусов B- и D-типа сборка незрелых капсидов происходит в цитоплазме с последующим переносом на клеточную мембрану. Кроме того, полностью собранные незрелые цитоплазматические ядра прототипа ретровируса MMTV прототипа B-типа обозначены как частицы A-типа [24]. Необычными группами в этом отношении являются внутриклеточные частицы A-типа клеток грызунов, которые кодируются эндогенными элементами и которые собираются и зарождаются в цистерны эндоплазматического ретикулума [26]. Что касается морфологии, то очень обильные частицы oricoHERV-K113 лучше всего классифицируются как A-тип. Подавляющее большинство частиц привязано к плазматической мембране или к мембранам везикулярных структур. Зачастую цепочки очень часто встречаются с неполными незрелыми ядрами, хотя иногда наблюдаются регулярные стадии почкования. Принимая во внимание эти наблюдения, мы предполагаем, что частицы A-типа oricoHERV-K113 собираются на мембранах. Независимо от того, ограничены ли узлы сборки плазменной мембраной или происходит ли сборка в везикулярных мембранах, неизвестно. Частицы типа А, явно присутствующие снаружи везикул, могут быть объяснены пассивным переносом во время эндоцитотических процессов. Низкая частота вирусных частиц внутри этих пузырьков, осажденных вирионами, указывает на то, что почкование в просвет не происходит или очень неэффективно.

В отличие от ситуации с везикулами, высвобождение вирионов oricoHERV-K113 в супернатант очень эффективно. Тонкий разрез ЭМ вирусных гранул из супернатантов экспрессирующих клеток oricoHERV-K113 обнаруживает большое количество частиц. Однако в настоящее время неясно, в какой степени частицы типа А могут покинуть ячейку или высвобождаются гранулированные частицы с помощью бутонизации типа С, происходящей параллельно с образованием частиц типа А. Каким бы ни был доминирующий почтенный фенотип, выброшенные частицы имеют зрелые ядра. Эффективный выход и созревание oricoHERV-K113 подтвержден вестерн-блоттингом и измерением активности RT в супернатантах (данные не показаны). Эти данные показывают, что частичная оптимизация кодонов oriHERV-K113 не препятствует переключению считывающих кадров, производству белков-предшественников Gag-Pro и Gag-Pro-Pol или высвобождению активной протеазы и обратной транскриптазы. Эти результаты согласуются с результатами, полученными нами ранее, путем выражения только области Gag-Pro-Pol oricoHERV-K113 [15]. Использование сильной промоторной и частичной оптимизации кодонов oricoHERV-K113 не улучшало экспрессию Env в той же степени, что и для Gag-polyproteins. Как следствие, шипы на oricoHERV-K113-частицах редко наблюдаются. Является ли уровень экспрессии Env или клеточного отношения Env to Gag ролью в формировании частиц HERV-K (HML-2) типа A, необходимо определить и в настоящее время исследуется.

Несмотря на значительный импульс, невозможно было привести oriHERV-K113 в производство частиц типа А сверхэкспрессией Staufen-1, связывающего партнера белка Rec [17]. Однако повышенные уровни экспрессии Gag были все еще значительно ниже, чем те, которые наблюдались только у oricoHERV-K113. Поэтому мы одобряем гипотезу о том, что критический уровень выражения, необходимый для получения частиц A-частиц с HERV-K (HML-2), не был достигнут.

Независимо от того, сформирован ли этот тип частиц in vivo и есть ли у них соответствующая биологическая роль, это также вопрос спекуляции. В этом контексте можно предположить, что такие ядра могут потенциально переноситься из клетки в клетку или могут играть роль в событиях ретротрансплантации, способствующих пролиферации HERV-K (HML-2) после эндогенизации. Какую бы биологическую роль и лежащий в ее основе молекулярный механизм морфологического переключателя не сообщалось в этой статье, несомненно, что EM продолжит играть ключевую роль в будущих исследованиях, направленных на пролить свет на эти проблемы.

Мы хотели бы поблагодарить Гудруна Холланда и Ларса Мёллера за помощь в электронной микроскопии и Стивена Норли за полезные обсуждения и советы. Работа была частично поддержана пожертвованием от наследия Хайнца Куте де Мусона.

OH проводили очистку белка, иммунизацию и характеристику сывороток крыс, проводили анализ экспрессии и составляли документ. VL и AZ проводили электронную микроскопию, концентрации вирусов и анализы активности RT. KH и SM провели эксперименты, проводимые в Штауфене. VL и NB восстановили исходную последовательность HERVK113 (oriHERV-K113) путем выравнивания последовательности и мутагенеза. NB задумал и скоординировал исследование. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *