Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Самый маленький капсидный белок опосредует связывание основного белка протеина pp150 для стабилизации ДНК-содержащих капсидов в цитомегаловире человека

The Smallest Capsid Protein Mediates Binding of the Essential Tegument Protein pp150 to Stabilize DNA-Containing Capsids in Human Cytomegalovirus
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3744435/

Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов.

Задуманные и разработанные эксперименты: ZHZ XY. Выполнены эксперименты: XD XY HG XJ GA HL SS. Проанализированы данные: XD ZHZ XY FL. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: WJB HZ. Написал документ: XD ZHZ XY FL.

Цитомегаловирус человека (HCMV) представляет собой вездесущий герпесвирус, который вызывает врожденные дефекты у новорожденных и опасные для жизни осложнения у лиц с ослабленным иммунитетом. Среди всех герпесвирусов человека HCMV содержит гораздо больший геном dsDNA в капсиде аналогичного размера по сравнению с другими, и было предложено потребовать pp150, протеин, только найденный в цитомегаловирусах, для стабилизации его капсоида, содержащего геном. Однако мало известно о том, как pp150 взаимодействует с основным капсидом. Более того, было показано, что наименьший капсидный белок (SCP), хотя он доступен для вируса простого герпеса типа 1, играет важную, но неопределенную роль в HCMV-инфекции. Здесь, путем криоэлектронной микроскопии (cryoEM), мы определяем трехмерные структуры капсида HCMV (нет pp150) и вирионов (с pp150) при субнаномном разрешении. Сравнение этих двух структур показывает, что каждая плотность плотности pp_50 состоит из двух пучков спиральных связей, соединенных длинной центральной спиралью. Корреляция между разрешенными спиралями и предсказанием вторичной структуры на основе последовательности отображает плотность тейгумента в N-концевую половину pp150. Структуры также показывают, что SCP опосредует взаимодействия между капсидом и pp150 в верхнем спиральном пучке pp150. В соответствии с этим структурным наблюдением ингибирование рибозимом экспрессии SCP в HCMV-инфицированных клетках ухудшает образование ДНК-содержащих вирусных частиц и снижает вирусный выход в 10 000 раз. Криогенная реконструкция полученных «SCP-дефицитных» вирусных частиц далее демонстрирует, что SCP требуется для функционального связывания pp150 с капсидом. Вместе наши структурные и биохимические результаты указывают на механизм, посредством которого SCP рекрутирует pp150 для стабилизации гемосодержащего капсида для производства инфекционного вируса HCMV.

Цитомегаловирус человека (HCMV) вызывает врожденные дефекты у новорожденных и угрожающие жизни осложнения у лиц с ослабленным иммунитетом, таких как больные СПИДом и реципиенты трансплантата органов. Было продемонстрировано, что самый маленький капсидный белок (SCP) — только молекулярная масса 8 кДа по сравнению с основным капсидным белком 155 кДа — является существенным для роста HCMV, но он доступен для вируса простого герпеса типа 1. Эти, казалось бы, противоречивые наблюдения были парадокс. Здесь мы решаем этот парадокс с помощью криоэлектронной микроскопии высокого разрешения (cryoEM) в сочетании с функциональными исследованиями с использованием ингибирования рибозимом. Наши структурные сравнения вириона HCMV и капсида показывают молекулярные взаимодействия на уровне вторичной структуры и предполагают, что SCP может способствовать связыванию капсида pp150, важного, цитомегаловирусспецифического тегументного белка. SCP-дефицитные частицы, образующиеся при ингибировании рибозимом SCP-экспрессии в HCMV-инфицированных клетках, не показывают плотности клеток pp150, демонстрируя, что SCP необходим для функционального связывания pp150 с капсидом. Наши результаты показывают, что SCP рекрутирует pp150 для стабилизации нуклеокапсида HCMV, чтобы обеспечить инкапсуляцию генома, который более плотно упакован в HCMV, чем в других герпесвирусах. В целом, это исследование не только устраняет вышеупомянутый парадокс, но также иллюстрирует пассивное приобретение новой важной функции SCP в производстве инфекционных вирусов HCMV.

Цитомегаловирус человека (HCMV), прототип подсемейства бетаерпервируса Herpesviridae, является ведущей вирусной причиной аномалий в родах и основным опасным для жизни патогеном у больных СПИДом и трансплантацией органов [1]. Вирион HCMV разделяет общую архитектуру с другими герпесвирусами и состоит из полиморфной оболочки, ящика с пунктиром и икосаэдрического нуклеокапсида, охватывающего линейный геном dsDNA. Геном HCMV является самым большим среди всех человеческих герпесвирусов и кодирует замечательное количество консервативных белков, а также уникальные протеины с оболочкой и тегументом, которые не имеют гомологов в альфа- или гамма-вирусах [2]. Капсидная оболочка HCMV, аналогичная оболочке вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1) и связанного с саркомой вируса герпеса (KSHV) Kaposi, состоит из четырех основных белков: основного белка капсида (MCP, закодированного UL86) [3] , малый капсидный белок (mCP, кодируемый UL85), mCP-связывающий белок (mC-BP, кодируемый UL46) [4] и самый маленький капсидный белок (SCP, кодируемый UL48.5) [5], [6 ]. Все исследованные на сегодняшний день герпесвирусы-капсиды объединяют икосаэдрическую сборку T = 16 с пентонами (пентамеры MCP), гексоны (гексамеры MCP), связывающие триплексы (гетеротримеры двух mCP и один mC-BP) и SCP, прикрепленные к кончику каждого MCP [7], [8], [9], [10], [11]. В то время как остальные три структурных белка капсида сохраняются, SCP очень расходится по размеру, аминокислотной последовательности и функции среди разных герпесвирусов. Было показано, что в HCMV важно для роста вируса [12], но его функция пока неизвестна.

Реконструкция CryoEM также выявила различные закономерности ассоциации между капсидом и вышележащими тегументными белками в ЦМВ и ВПГ. В HCMV слой высокоорганизованной нитевидной плотности тегументных белков присоединен к пентонам, гексонам и триплексам лежащего в основе нуклеокапсида [13]. Трехмерная (трехмерная) реконструкция капсида simian cytomegalovirus (SCMV), выделенного из цитоплазмы инфицированных клеток, также выявила тегументные белки, прикрепленные к капсиду [8], аналогичные HCMV. В противоположность этому, HSV-1, упорядоченные тегументные белки, связывают только пентоны и те триплексы, окружающие пентоны [14], [15], [16]. Эти наблюдения указывают на то, что вирусные белки, расположенные над консервативным капсидом, такие как тегумент и белки оболочки, эволюционировали, чтобы иметь специфические для вируса структурные и функциональные роли. Недавно биохимические и структурные исследования присвоили pp150 упорядоченным нитевидным плотностям течения CMV-вириона и предложили его функцию для стабилизации заполненного dsDNA капсидом C [17], [18], но необходимы более структурные детали, чтобы полностью понять молекулярные взаимодействия между pp150 и капсидными белками.

Здесь мы сообщаем о трехмерных структурах капсида HCMV и интактного HCMV-вириона при разрешении 6 Å и 9 Å соответственно (рис. S1). Сравнение структур капсида и вириона показывает, что на уровне вторичной структуры SCP опосредует взаимодействия между капсидом и тегументным белком pp150. Конструируя рибозим, который ингибирует экспрессию SCP в клетках, инфицированных HCMV, и криоэмульсию результирующих «SCP-дефицитных» вирусных частиц, мы также демонстрируем, что SCP требуется для связывания pp150 с капсидом, и его отсутствие приводит к только вирусным частицам, лишенным генома ДНК, тем самым выявляя, почему SCP необходим для инфекции HCMV.

Из-за большого размера частиц ЦМВ и трудностей для их очистки, разрешения предыдущих реконструкций криоэмузии были ограничены [8], [10], [13], [19]. В этом исследовании был получен высокоочищенный капсид HCMV (без рисунка 1A) и интактный вирион (содержащий тегументные белки, рисунок 1B) и отображался в электронном микроскопе с высоким разрешением 300 кВ Titan Krios. 3D-реконструкции капсида и вириона HCMV были получены при разрешении 6 Å и 9 Å соответственно (рис. S1). Улучшенные структуры являются результатом исчерпывающего усилия по обработке более 37 000 изображений капсидов и 56 000 изображений вирионов. В этих субнаметровых разрешениях могут быть идентифицированы вторичные структурные элементы, в частности α-спирали, что иллюстрируется крупными проекциями геккона в реконструкции капсида (рис. 1C-E). Молекулярные границы могут быть установлены, что позволяет нам в первый раз описать взаимодействия между упорядоченными тегументными белками и капсидными белками на уровне вторичной структуры.

(A, B) CryoEM-изображения капсида HCMV (A) и вириона (B). (C) Радиально окрашенное поверхностное представление 3D-реконструкции капсида при разрешении 6 Å, рассматриваемое вдоль трехмерной оси. Капсомеры в асимметричной единице, включая пентон и три гексана, обозначены как «5», «С», «Р» и «Е» соответственно, как в номенклатуре [39]. (D, E). Вид сверху на гексане C, выделенном в реконструкции капсида, рассматриваемой снаружи (D) или внутри (E) капсида. Α-спираль с типичной формой колбасы обозначена в (E). (F, G) MCPud. Карта плотности MCPud, обозначенная квадратом в (D), была выделена и радиально окрашена (F). В (G) тот же MCPud показан полупрозрачным желтым и наложен на атомную модель HSP-1 MCPud (пурпурная лента). Обратите внимание, что все спирали совпадают в двух структурах, но петли на кончике (стрелка) и на внешней поверхности (стрелка) HSV-1 MCPud не соответствуют карте плотности криоэмуляции HCMV MCPud, что указывает на возможные структурные различия. (H) Радиально окрашенное поверхностное представление 3D-реконструкции вириона HCMV, просматриваемого вдоль трехмерной оси. (I) Масштабирование области, обозначенной в (H). Структурные компоненты в асимметричной единице помечены, включая пентон («5»), три геккона («С», «Р» и «Е») и шесть триплексов («Та», «Тб», «Тс», «Td», «Te» и «Tf»). Пунктирная площадь демаркирует область, охватывающую Те, сегментированную для усреднения с аналогичными областями вокруг Tb и Td (см. Текст и рисунок 2).

В 6 Å реконструкции капсида HCMV обнаружены молекулярные границы среди 150 гексонов, 12 пентонов и 320 триплексов в икосаэдрической частице T = 16 (рис. 1C), что позволяет идентифицировать отдельные молекулы. В частности, верхний домен мономера MCP был извлечен из центрального гексона (фиг. 1F) и наложен на кристаллическую структуру верхнего домена HSP-1 MCP (MCPud) (код присоединения PDB 1N07) (фиг. 1G) [20] , За исключением очень незначительных различий на кончике и внешней поверхности субъединиц (стрелка и стрелка на фиг. 1G), наблюдается превосходное соответствие всех α-спиралей между HCMV и HSP-1 MCPuds, что указывает на то, что основная масса структуры MCPud сохраняется между двумя вирусами. Этот матч также демонстрирует высокое качество карты.

Кроме того, фитинг показывает, что молекулы SCP были потеряны в этом высокоочищенном образце капсида, вероятно, из-за использования моющего средства на всех стадиях очистки (см. Экспериментальные процедуры). В мягко приготовленных капсидных препаратах SCP связывает MCP в верхнем домене, как показано в предыдущих капсидных реконструкциях, полученных нами [10], [19]. Отсутствие SCP в реконструкции капсида дает преимущество для определения молекулярной границы между SCP и MCP в реконструкции вириона (см. Ниже).

Восстановление 9 мкВ вирионом HCMV показывает слой нитевидных тегументов, связанных с капсидом, в икосаэдрадно упорядоченном виде, например, в сетке, охватывающей весь капсид (рис. 1H). Три из этих плотностей тегументов располагаются поверх каждого триплекса, образуя «группу из трех» и распространяясь на вершину ближайших субъединиц в трех окружающих капсулах. Расположение и внешний вид этих плотностей тегументов сходны с размерами, украшенными анти-pp150-антителами [17], [18]. В каждой асимметричной единице капсида герпеса существует шесть квазиэквивалентных триплексов: Ta, Tb, Tc, Td, Te и Tf (рис. 1I), следуя номенклатуре [21]. Плотность тейп-группы из трех слоев в триплексах Tb, Td и Te наиболее схожа по структуре. Мы усреднили плотности в трех кубах, каждая из которых содержит одну из этих плотностей плотности группы (например, область, охватывающая Te, обозначена пунктирным квадратом на рисунке 1I) для улучшения отношения сигнал / шум (рисунок 2A) , Гелики в протеинах тегументов могут быть разрешены в усредненной плотности (как показано на рисунке 2Е). Аналогичные кубические области от реконструкции капсида были усреднены для сравнения (рисунок 2B). Это сравнение позволило нам дифференцировать плотности MCP и триплексов от плотностей, связанных с SCP и тегументными белками, а затем сегментировать из SCP и плотностей тегументов. Граница между SCP и pp150 была установлена ​​путем обращения к нашей первичной реконструкции капсида SCP [19].

(A, B) Усредненная плотность областей, окружающих триплексы Tb, Td и Te (обозначенные пунктирным квадратом на рис. 1I) из реконструкции вириона (A) или капсида (B). Два карты плотности окрашены так же, как на рисунке 1Н или 1С. (C) SCP (светло-голубая) и плотность (зеленый, пурпурный и голубой), сегментированные от плотности вириона (A), наложенной на плотности капсидов (желтый) (B). (D) Представления трех плотностей тегу (C) после выравнивания друг с другом. Наиболее заметной особенностью являются колбасные формы из-за спиралей. Пунктирной линией обозначена граница верхнего спирального пучка (UHB) и пучка нижних спиралей (LHB). (E) Голубая плотность цвета в (D) показана полупрозрачно и накладывается на цилиндры, представляющие спирали. Вершины в пучке верхних спиралей (пурпурный) и пучок нижних спиралей (голубой) соединены центральной спиралью 67 Å (CH, красный). (F) прогнозирование вторичной структуры pp150 на основе его аминокислотной последовательности. Предполагаемое место для длинной центральной спирали, обозначенное в (E), обозначено красной линией.

Три плотности тегов в усредненной группе из трех демонстрируют высокий уровень сходства и кажутся почти идентичными при отображении бок о бок (рис. 2D). Это структурное сходство между тремя плотностями тегументов указывает на то, что три копии одного и того же белка или белкового комплекса ассоциированы с каждым триплексом, который отличается от ситуации в SCMV, где интерпретируется только две копии плотности тегуса для привязки к каждому триплексу [8] , В каждой плотности потока HCMV мы разрешили два пучка спиральных, верхний и нижний, соединенные длинной центральной спиралью (~ 67 Å в длину). Верхний спиральный пучок (UHB) состоит из центральной спирали и пяти более коротких окружающих спиралей. Пучок нижних спиралей (LHB) имеет только три короткие спирали, окружающие центральную спираль (рис. 2E).

Предыдущие исследования частиц HCMV и SCMV предложили pp150 в качестве одного из кандидатов для плотности капсид-взаимодействующих плотностей тегов [8], [13], [18]. Прогнозирование вторичной структуры указывает на то, что половина терминалов C pp150 является почти полностью катушками, в отличие от N концевой половины, которая содержит много спиралей (рис. 2F). Среди этих предсказанных спиралей самый длинный из них имеет 47 остатков от a.a.195 до a.a.241 (рисунок 2F), который будет охватывать ~70 Å, поскольку каждая аминокислота в α-спирали дает осевое расстояние 1,5 Å. Эта длина ~70 Å самой длинной предсказанной спирали и измеренная длина ~ 67 Å центральной спирали, разрешенной в плотности криоэмулятора, хорошо коррелируют друг с другом, и оба они более чем в два раза превышают длину любых других предсказанных или разрешенных спиралей. Кроме того, имеется восемь других предсказанных крупных спиралей с более чем тремя спиральными витками (каждый оборот = 3,6 а.а.), а их длины (12-22 а.а.) также коррелируют с длинами восьми более коротких спиралей, разрешенных в плотности потока. Таким образом, мы заключаем, что разрешенная плотность тегументов обеспечивается только N-концевой частью молекулы pp150, тогда как С-концевая половина pp150 может быть неупорядоченной или гибкой. Этот вывод согласуется с предыдущими биохимическими данными, показывающими, что N-концевой сегмент SCMV pp150 был необходим и достаточен для связывания капсида SCMV или HCMV in vitro [22].

Мы также определили интерфейс между плотностью тегументов и капсидом. На одном конце pp150 его LHB имеет прямые контакты с триплексом (рис. 3A-C). С другой стороны, pp150 UHB взаимодействует с капсомером через одну из пяти коротких спиралей (стрелка на рис. 3D и 3E). Это взаимодействие, по-видимому, опосредовано молекулой SCP 8 кДа, которая расположена в расщелине, образованной UHB pp150 и верхней областью MCP (рисунок 3D-E). Прямой контакт между плотностями, относящимися к pp150 и SCP, предполагает прямое связывание двух молекул, хотя при этой резолюции нельзя исключать маловероятную возможность того, что связывание SCP с MCPud может теоретически изменять конформацию MCPud, вызывая ее напрямую связываться с pp150.

(A-C). Плоские срезы, показывающие, что протеин протеина pp150 связывается с капсидным триплексом с его LHB (пучок нижних спиралей). Сайты связывания на триплексе обозначены буквой «*». LHB одной молекулы в группе из трех плотностей тегов также имеет контакт с MCP. Он помечен как «#». (D) Крупный план, вид сверху области, выделенной пунктирным квадратом во вставке, показывающий взаимодействия между pp150 (голубой), SCP (голубой) и MCPud (желтый). (E) То же, что и в (D), но просматривается в направлении, указанном символом глаза в (D). Стрелка в обоих (D) и (E) указывает на α-спираль в pp150 UHB (пучок верхней спирали), который взаимодействует с SCP.

Чтобы оценить функциональную значимость SCP в опосредовании связывания pp150 с капсидом, мы построили клеточную линию, экспрессирующую рибозим, который ингибирует экспрессию SCP, когда клеточная линия инфицирована HCMV. Затем мы определили следствие этого торможения на pp150-связывание с капсидом путем криоэмиссионных анализов вирусных частиц, собранных из этой клеточной линии.

Мы построили рибозим, называемый SCP1, путем ковалентной связи 3′-конца ранее установленного варианта рибозима M1GS (V482) [23] с 18-нитровой последовательностью, комплементарной целевой последовательности мРНК HCMV SCP. Два других рибозима, SCP2 и TK1, также были разработаны и использовались в качестве контролей. SCP2 содержит ту же направляющую последовательность, что и SCP1, но имеет несколько точечных мутаций в каталитическом домене P4, который отменяет его каталитическую активность [24], тем самым служа в качестве контроля антисмыслового эффекта в наших экспериментах. TK1 нацеливается на мРНК тимидинкиназы (ТК) HSV-1 и служит в качестве контроля, чтобы определить, может ли РНК М1GS с неправильной направляющей последовательностью мишени мРНК SCP в культуре тканей. Впоследствии мы построили клеточные линии, выражающие каждый из этих трех рибозимов M1GS, и провели следующие три эксперимента.

Во-первых, мы проанализировали экспрессию мРНК SCP в HCMV-инфицированных клетках путем нозерн-блоттинга, используя уровень вирусной немелко-ранней (IE) 5-kb мРНК в качестве внутреннего контроля (рисунок 4A). Основываясь на радиоактивности меченых 32P зондов, мы оценили, что уровень экспрессии мРНК мишени был снижен на 98 ± 8%, 7 ± 4% и 3 ± 3% (в среднем три эксперимента) в клетках, экспрессирующих SCP1, SCP2 и TK1, соответственно , Кроме того, уровень белка SCP, определяемый западными аналитиками с уровнем белка MCP в качестве внутреннего и нагрузочного контроля, был снижен на 97 ± 9%, 8 ± 5% и 2 ± 1% в клетках, экспрессирующих SCP1, SCP2, и TK1 соответственно (фиг. 4C, дорожки 9-12). Таким образом, целенаправленное расщепление мРНК SCP рибозимом SCP1 значительно уменьшало экспрессию SCP в клетках, экспрессирующих SCP1, но не в клеточных линиях, экспрессирующих оба контрольных рибозима. Низкий уровень ингибирования, наблюдаемый в SCP2-экспрессирующих клетках, вероятно, был вызван антисмысловым эффектом, поскольку SCP2 имеет аффинность к связыванию с мишенью, подобную таковой у SCP1, но каталитически неактивна.

(A) Северный анализ мРНК HCMV в инфицированных клетках. Образцы РНК выделяли из родительских клеток U373MG (дорожки 1, 2, 5 и 6) или M1GS-экспрессирующих клеток (дорожки 3, 4, 7 и 8), которые были либо мак-инфицированными (дорожки 1 и 5), либо инфицированы HCMV ( MOI = 0,5-1, все остальные полосы) в течение 48 часов, разделенные денатурирующими гелями и переносятся на мембраны. Мембраны гибридизовали с зондами с радиолюбивой, содержащими последовательность мРНК HCMV (полосы 1-4) или IE 5 кб РНК (полосы 5-8). SCP1, рибозим, нацеленный на мРНК HCM HCMV для деградации; SCP2, контрольный рибозим, который связывается, но не может разрушить мРНК HCM HCMV. (B) Рост HCMV в клетках U373MG и клеточных линиях, экспрессирующих РНК M1GS. Клетки (5 × 105) инфицировали HCMV при MOI = 3. Значения — это средства, полученные из трех повторений. Стандартное отклонение обозначается ошибками. TK1, контрольный рибозим, нацеленный на мРНК тимидинкиназы HSV-1. (C) Западный анализ HCMV SCP и MCP белков. Образцы белка либо выделялись из родительских клеток U373MG, либо клеток, экспрессирующих рибозим (инфицированные клетки, полосы 9-12), или из препаратов вирусных частиц, очищенных из этих клеток (частицы HCMV, дорожки 13-15), разделенные в SDS-полиакриламидных гелях, переносится на мембраны и подвергается взаимодействию с антителами против HCP SCP (анти-SCP) и MCP (anti-MCP) [24].

Во-вторых, мы оценили влияние SCP-ингибирования на вирусный выход путем измерения вирусных титров запасов из HCMV-инфицированных клеток, которые экспрессируют рибозимы. Через 5 дней после инфицирования вирусные выходы были снижены по меньшей мере в 10000 раз в клетках, экспрессирующих SCP1, тогда как в клетках, экспрессирующих SCP2 или TK1, не наблюдалось значительного снижения (рисунок 4B).

В-третьих, чтобы выявить структурную основу снижения вирусного выхода из-за ингибирования SCP, мы отобрали вирусные частицы, выделенные из SCP1-экспрессирующих клеток путем криоэмульсии, и сравнили ее трехмерную структуру с видоризацией HCMV дикого типа. Используя MCP в качестве внутреннего и нагрузочного контроля, западные анализы показали, что SCP не был обнаружен в HCMV-частицах, выделенных из клеток экспрессии SCP1, но был легко обнаружен у вирусных частиц, выделенных из клеток, которые не выражали никаких рибозимов или экспрессированных контрольных рибозимов SCP2 или TK1 ( Рисунок 4C, полосы 13-15). CryoEM-изображения вирионов HCMV дикого типа имеют характерный внешний вид «отпечатка пальца» (рис. 1B), который является отличительной чертой инкапсудированной геномной dsDNA [14], [25]. Напротив, ни одно из изображений криоэмульсий частиц, собранных из среды культивирования клеток, экспрессирующих SCP1, не показывает рисунок отпечатка пальца (фиг. 5A), что указывает на то, что они не содержат геном вирусной ДНК и поэтому не являются инфекционными. Существование неинфекционных окутанных частиц (NIEP) в этом препарате указывает на то, что ингибирование экспрессии SCP не предотвращает сбор и капсид капсида. Кроме того, трехмерная реконструкция с разрешением 20 Å этих SCP-дефектных частиц показывает структуру без видимых плотностей тегирования, связанных с капсидом (рис. 5C). Напротив, реконструкция вирионов дикого типа при той же разреше- нию ясно показывает плотность тегументов, взаимодействующих с подстилающим капсидом (рис. 5B). Этот результат наглядно демонстрирует, что SCP необходим для функционального связывания pp150 с капсидом. Учитывая, что pp150 может функционировать в стабилизации заполненного dsDNA C капсидом [17], [18], мы считаем, что в отсутствие SCP pp150 больше не может формировать стабилизирующую сеть плотности, окружающей капсид, что предотвращает образование ДНК-содержащий вирион (фиг.5А). Однако мы не можем исключить возможность того, что отсутствие ДНК в SCP-дефицитной частице и неспособность связывать pp150 — это два несвязанных, нижележащих последствий отсутствия SCP. Следует также отметить, что, хотя отсутствие SCP препятствует связыванию pp150 с капсидом с икосаэдрической симметрией, оно не обязательно устраняет связывание pp150 с капсидным триплексом в неикосаэдрически упорядоченном режиме, что также могло бы привести к созданию карты криоэмуляции без видимых плотностей pp150.

(A) Типичные криоэмульсионные изображения SCP-дефицитных вирусных частиц, показывающих окутанные частицы без генома dsDNA. (B, C) Радиально окрашенные поверхностные изображения 3D-реконструкций вирусных частиц HCMV с диким типом (B) и SCP-дефицитом с разрешением 20 Å. Нижние панели представляют собой увеличенные виды области, содержащей триплекс, что свидетельствует о том, что pp150 присутствует в структуре дикого типа, но отсутствует в вирусных частицах с дефицитом SCP. (D, E) центральные срезы толщиной 15 Å, извлеченные из реконструкции дефектов дикого типа (D) и SCP-дефицита (E) соответственно. Концентрические оболочки плотности внутри капсида в (D) относятся к геному вирусной dsDNA, и они равномерно распределены (23 Å). Кольцо с плотностью лесов представлено в (E), но плотность ДНК отсутствует. Небольшой выпуклость на кончике MCP в (D) соответствует плотности SCP. Подобного выпуклости в соответствующем положении в SCP-дефектной реконструкции нет.

Как упоминалось выше, среди всех герпесвирусов человека HCMV имеет самый большой геном dsDNA, содержащийся в капсиде аналогичного размера. В результате расстояние между соседним dsDNA-дуплексом в капсиде HCMV составляет 23 Å [26] по сравнению с 26 Å и 25 Å для пациентов с альфа-герпесвирусом [14] и гамма-герпесом [27] соответственно. Можно предположить, что электростатическое отталкивание более плотно упакованного генома в HCMV будет оказывать более высокое давление на оболочку капсида, что может привести к нестабильности ДНК-содержащего капсида (то есть «капсида»). Действительно, на протяжении всей нашей криогенной визуализации препарата капсида HCMV не было обнаружено ни одного интактного ДНК-содержащего капсида среди более чем 30 000 изображений частиц, которые мы исследовали (рис. 1А), что резко контрастирует с ситуациями альфа-герпеса [25] и гамма-герпеса [27 ], где C капсиды могут быть легко очищены от ядер инфицированных клеток. При клонировании, включая добавление pp150, ДНК-содержащие нуклеокапсиды стабилизируются и, таким образом, обычно обнаруживаются в препаратах вирмона HCMV (рисунок 1B).

Из капсидных структурных белков SCP является наименее консервативным по разным герпесвирусам по размеру, аминокислотной последовательности и функции. Например, SCP HSV-1 имеет молекулярную массу 12 кДа и может быть доступен для роста вируса в клеточной культуре [28]. 16 KDA KSHV SCP является самым большим и имеет важное значение для сборки капсида [29], [30]. SCP с 8 кДа HCMV является наименьшим и необходим для роста вируса [12], но его функциональная роль — давняя тайна. Здесь, используя SCP-нацеливание на рибозим и реконструкцию криоэмульсии, мы даем первое доказательство того, что SCP требуется для стабилизации ДНК-содержащих HCMV капсидов и что он может сделать это путем прямого или косвенного опосредования связывания pp150 с капсидом. Насколько нам известно, эта роль является единственной функцией SCM HCMV, выявленной на сегодняшний день. Этот результат, рассматриваемый вместе с отсутствием гомолога pp150 как в альфа-, так и гамма-вирусах, указывает на то, что SCP герпесвирусов расходится в функции, хотя его расположение в разных герпесвирусах сохраняется. Возможно, SCP имеет неизвестную, несущественную функцию, сохраненную во всех герпесвирусах, но в HCMV она повторно используется pp150 в качестве партнера для стабилизации ДНК-содержащего капсида, что является важным процессом заражения HCMV.

Принимая во внимание относительно небольшой размер и существенную функцию, HCMV SCP явно обеспечивает потенциальную цель для вмешательства против HCMV-инфекции. Один из возможных способов заключается в разработке SCP-имитирующих пептидов, которые действуют как конкурентные ингибиторы связывания и функционирования pp150, тем самым предотвращая образование инфекционных вирусных частиц.

Человеческие фибробласты MRC-5 культивировали в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM) плюс 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). 20 колб (175 см2) клеток выращивали до 90% слияния и инфицировали штаммом HCMV AD169 при множественности инфекции (MOI) 0,1-1. Через 6 дней после заражения, когда половину клеток лизировали, среду собирали и центрифугировали при 10, 000 г в течение 15 мин для удаления клеточного дебриса. Осветленный супернатант собирали и центрифугировали при 80, 000 г в течение 1 часа, чтобы осадить HCMV вирионы. Гранулы ресуспендировали в общем объеме 2 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, pH 7,4) и загружали на градиент плотности сахарозы 15% -50% (мас. / Об.) И осаждали при 100000 г в течение 1 часа. Обычно мы наблюдаем три полосы рассеяния света — верхнюю, среднюю и нижнюю — содержащие в основном НИИП, вирионы и плотные тела соответственно. Средний диапазон собирали и разбавляли в PBS до общего объема 13 мл. Частицы Virion снова гранулировали при 80 000 g в течение 1 часа и ресуспендировали в 30 мкл PBS для приготовления образца криоэму.

Для получения капсидов HCMV мы инфицировали 90% конфлюэнтных клеток MRC-5 при MOI = 5. Через 3 дня после инфицирования, когда цитопатический эффект достигал 100%, клетки собирали, осаждали низкоскоростным центрифугом при 1000 г в течение 10 мин и промывали PBS. Осадок затем ресуспендировали в PBS, содержащем 0,5% NP-40 (мас. / Об.), И инкубировали на льду в течение 5 мин. Смесь центрифугировали при 1000 г в течение 10 мин к ядрам клеток гранул. Для разрушения ядерной мембраны осадок затем ресуспендировали в PBS, подвергали трем циклам замораживания (-80 ° C, 10 мин), оттаиванию (37 ° C, 3 мин) и завихрению, проходили через иглу подкожной инъекции 23 калибра для 20 и инкубировали в PBS с 2% NP-40 в течение ночи при 4 ° C. Лизат центрифугировали при 1500 г в течение 5 мин для удаления крупных частиц и затем осаждали через 30% сахарозную подушку при 100000 г в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали в PBS, содержащем 2% NP-40, разбавляли до конечного объема 13 мл и снова центрифугировали при 70 000 г в течение 1 часа. Гранулированные капсиды ресуспендировали в 30 мкл PBS и использовали для приготовления образца криоэму.

Плазмиды V482, pFL117 и pC102 содержат последовательности ДНК, кодирующие вариант РНК V482, РНК М1 и мутант С102, соответственно, управляемый промотором РНК-полимеразы Т7 [19], [24], [31]. Мутантный рибозим C102 содержит несколько точечных мутаций в каталитической области (спираль Р4). Была описана последовательность ДНК, кодирующая рибозим TK1, которая нацелена на мРНК тимидинкиназы HSV-1 [31]. Последовательность ДНК, кодирующая рибозим SCP1, была сконструирована методом ПЦР с V482 в качестве матрицы. 5 ‘и 3′ ПЦР праймеры были AF25 (5’-GGAATTCTAATACGACTCACTATAG-3 ‘) и M1SCP1 (5′-CCCGCTCGAGAAAAAATGGTGCTGAGCAAGTATACGCGTGTGGAATTGTG-3’), соответственно. Последовательность ДНК, кодирующая рибозим SCP2, была сконструирована путем введения в последовательность ДНК, кодирующей рибозим SCP1, с точечными мутациями (A347C348 → C347U348 и C353C354A355U356), которые были обнаружены в C102, и было показано, что они отменят активность рибозима [19], [24 ], [31]. Процедуры для анализа расщепления in vitro и связывания проводили, как описано ранее [24].

Последовательности ДНК, кодирующие рибозимы, субклонировали в ретровирусный вектор LXSN и помещали под контроль промотора РНК РНК. Ретровирусную ДНК, содержащую последовательность рибозима, трансфицировали в клетки U373MG человека, используя протоколы, модифицированные от Миллера и Розмана [32]. Через 48-72 ч трансфекции клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей 600 мкг / мл неомицина. Клетки затем отбирали в присутствии неомицина в течение 2 недель и клонировали клетки, устойчивые к неомицину [24].

Клетки (n = 1 × 106) либо фиктивно инфицированы, либо инфицированы HCMV при MOI 0,05-5 в 1,5 мл DMEM, дополненной 1% FBS. После 2 ч инкубации инокулум заменяли DMEM, дополненным 10% (об. / Об.) FBS. Инфицированные инфицированные клетки инкубировали в течение 4-72 ч, и из клеток выделяли общую клеточную РНК или белок, как описано ранее [24]. Образцы белка также получали из частиц HCMV, очищенных от инфицированных клеток. Фракции РНК отделяли в формальдегидсодержащих 1% агарозных гелях, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, гибридизовали с зондами РНК с радиоактивной меткой 32P, содержащими последовательности HCMV, и анализировали с помощью PhosphorImager STORM840. РНК-зонды, используемые для обнаружения РНК M1GS, транскрипта РНК РНК НВМВ и 5 мК, и мРНК SCP были синтезированы из плазмид pFL117, Cig27 и pSCP соответственно [24], [33]. РНК-зонды были синтезированы in vitro и радиоактивно мечены с использованием набора для синтеза РНК in vitro (Promega, Inc, Madison, IN).

В экспериментах на западном анализе образцы белка отделяли на SDS / 7,5% полиакриламидных гелях, сшитых с N, N «метиленбисациламидом, а затем переносили электрически на нитроцеллюлозные мембраны. Мы окрашивали мембраны с использованием антител против HCMV-белков в присутствии хемилюминесцентного субстрата (GE Healthcare) и анализировали окрашенные мембраны фосфоримагером STORM840 [24]. Количественное определение проводили в линейном диапазоне обнаружения РНК и белка.

Клетки (n = 1 × 105) инфицировали HCMV при значениях MOI, указанных в разделе «Результаты». Клетки и среду собирали с интервалом в 1 день в течение 7 дней после заражения. Вирусные запасы готовили добавлением равного объема обезжиренного молока на 10% (об. / Об.) С последующей обработкой ультразвуком. Титрами вирусных запасов определяли заражение 1 × 105 фибробластов крайней плоти человека и подсчет количества бляшек через 10-14 дней после заражения [24]. Полученные значения были средними из трех экспериментов.

Экспрессирующие Ribozyme SCP1 клетки U373MG инфицировали HCMV дикого типа при MOI = 1-5. После 2-часовой инкубации среду заменяли на свежий DMEM плюс 10% FBS для удаления любых свободных внеклеточных вирусных частиц. Через 4 дня после инфицирования вирусные частицы очищали, используя ту же процедуру, что и описанную выше для вириона HCMV дикого типа. Из-за значительно более низкого вирусного выхода в SCP1-экспрессирующих клетках в градиенте плотности не было видно четких светорассеивающих полос. Поэтому мы собрали фракцию градиента, соответствующую диапазону, охватывающему три полосы, видимые в вирионной очистке дикого типа. Эту фракцию разбавляли в PBS и центрифугировали при 80 000 г в течение 1 часа с получением вирусных частиц с дефицитом SCP. Осадок затем ресуспендировали в 10 мкл PBS, проверяли с помощью отрицательной окрашивающей электронной микроскопии, чтобы содержать вирусные частицы, и использовали для приготовления образца криоэму. Градиент остатка также собирали во фракциях по 3 мл каждый. Каждую фракцию разбавляли PBS, гранулировали, ресуспендировали в 10 мкл PBS и проверяли индивидуально с помощью отрицательной окрашивающей электронной микроскопии, чтобы подтвердить отсутствие вирусных частиц.

Аликвоту 2,5 мкл очищенного образца наносили на сетку Quantifoil R1.2 / 1,3 размером 300 меш, фильтровальную фильтровальную бумагу и мерзлую мерзлоту в жидком этане. Изображения CryoEM собирались при температуре жидкого азота в криоэлектронном микроскопе FEI Titan Krios, работающем при 300 кВ с параллельным освещением. Вирион HCMV дикого типа и SCP-дефектные изображения частиц HCMV были записаны на камеру с зарядовой связью (CCD) на галке 4k × 4k при эффективном увеличении 97, 498 × (номинальное увеличение 59 000 × на плоскости пленки), соответствующее до эффективного размера пикселя 1,538 Å / пикселя на уровне образца. Изображения капсида HCMV были записаны на пленках Kodak SO-163 при увеличении 59 000 ×, а микрофотографии были оцифрованы с помощью сканера Nikon Coolscan 9000ED с шагом 6,35 мкм / пиксель, что дало размер пикселя 1.076 Å / пиксель на образце. Во всех случаях электронная доза, используемая при формировании криоэмульсии, составляла ~ 25e- / Å2. Значения дефокусировки определялись с помощью CTFFIND [34] и находились в диапазоне от 0,5 мкм до 3 мкм под фокусировкой.

Обработка данных и 3D-реконструкции были выполнены с помощью IMIRS [35], [36]. Ориентация и параметры центра каждой частицы были уточнены относительно выступов, вычисленных из трехмерных реконструкций в итерационной процедуре, до тех пор, пока не будет достигнуто никакого дальнейшего улучшения реконструкции. Частицы выбирались на основе фазовых остатков между изображениями и проекциями. Трехмерная реконструкция была получена с использованием метода сферических гармоник, адаптированного к симметрии [36]. Окончательные реконструкции капсидов и вирионов были получены путем усреднения 20 502 частиц (выбранных из 37 460 капсидных изображений) и 11 863 частиц (выбранных из 56 297 изображений вирионов) соответственно.

Визуализация и усреднение карт плотности проводились с UCSF Chimera [37]. Области плотности, которые необходимо усреднить, сегментировали как кубики плотности аналогичного размера. Затем эти кубики плотности были сначала выровнены вручную, а затем выровнены по времени с помощью функции «fit in map» Chimera. Усредненная плотность была получена путем выполнения команды «vop add» на выровненных выше кубах плотности.

Прогнозирование вторичной структуры pp150 выполнялось с помощью PSIPRED с использованием сервера прогнозирования структуры белка [38].

Карты плотности криоэфира капсида, вириона и частиц с дефицитом SCP были депонированы в банк данных электронной микроскопии (EMDB) (код доступа 5695, 5696 и 5697 соответственно).

FSC-графики реконструкции капсидов и вириона HCMV. Исходя из критерия FSC = 0.143, разрешение для реконструкции капсида составляет 6,0 Å, а для реконструкции вириона — 8,3 Å.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим Xiaorui Zhang за начальные усилия в области клеточной культуры и подготовки образцов HCMV, Xing Zhang, Ivo Atanasov и Jiansen Jiang за помощь в cryoEM, Paul Rider и Rachael Burchfield для рибозимных экспериментов и Xiaokang Zhang за помощь в обработке данных.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *