Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Левожелудочковая дисфункция и лиганды CXCR3 при гипертонии: от экспериментов на животных до экспериментального исследования на уровне населения

Left Ventricular Dysfunction and CXCR3 Ligands in Hypertension: From Animal Experiments to a Population-Based Pilot Study
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4624781/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: JAS WMB HAS-B. Выполнил эксперименты: Y-MG RA. Проанализированы данные: Y-MG RA. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: LT. Написал документ: JAS Y-MG RA WMB. Просмотрел рукопись: LT.

Обнаружение дисфункции левого желудочка (LV) на ранней стадии является ключевым фактором в борьбе с эпидемией сердечной недостаточности. В экспериментах по профилированию протеомов у мышей, подвергнутых либо аортальному обвязке, либо ложному, циркулирующий моноксин CXCR3-лигандов, индуцированный интерфероном-γ (МИГ) и индуцибельным интерфероном-10 (IP10) интерфероном-γ, был в 5-40 раз выше, чем в течение восьми недель. Мы оценили диагностическую ценность циркулирующих лигандов NT-pro BNP и CXCR3 (MIG, IP10, интерферон-индуцибельный Т-клеточный альфа-хемо-аттрактант [I-TAC]) у пациентов с гипертонией (≥140 / 90 мм рт. Ст.), Связанных с субклинической (n = 19) или симптоматическая (n = 16) диастолическая дисфункция LV при эхокардиографии и здоровом контроле. NT-pro BNP, MIG, IP10, I-TAC все увеличились (p ≤ 0,014) по категориям ухудшения дисфункции левого желудочка. У пациентов с симптоматическим заболеванием MIG, IP10 и I-TAC увеличились на 210% (p = 0,015), 140% (p = 0,007) и на 120% (p = 0,035) больше, чем у NT-pro BNP. Оптимальные пределы дискриминации, полученные максимизацией индекса Юдена, составили 246 пмоль / л, 65 пг / мл, 93 пг / мл и 24 пг / мл соответственно. Коэффициенты шансов, связанные с четырьмя биомаркерами, были значительными (p ≤ 0,010), от 4,00 для IP10 до 9,69 для MIG. При настройке для NT-pro BNP лиганды CXCR3 сохраняли значимость (p ≤ 0,028). Добавление оптимизированных пороговых значений для лигандов CXCR3 к NT-pro BNP, усиленное (p ≤ 0,014), интегрированное улучшение дискриминации и улучшение чистой реклассификации. В заключение, соглашаясь с концепцией о том, что воспаление играет ключевую роль в патогенезе дисфункции ЛЖ, МИГ, IP10 и I-TAC, добавляют диагностическую точность сверх NT-pro BNP.

Из-за этических ограничений данные доступны по запросу от соответствующего автора W. Matthijs Blankesteijn. Заинтересованные исследователи могут связаться с доктором W. Matthijs Blankesteijn по адресу wm.blankesteijn@maastrichtuniversity.nl.

Сердечная недостаточность является основной проблемой общественного здравоохранения, затрагивающей более 23 миллионов пациентов во всем мире [1]. Повышенная долговечность [2] и недавно улучшенная выживаемость после первого диагноза [1] объясняют, почему распространенность сердечной недостаточности будет продолжать расти на 50% в течение следующих 10-15 лет. Связанная с этим инвалидность влечет за собой высокие затраты на здравоохранение, превышающие расходы на рак [2]. После первоначального диагноза оценочная смертность составляет 25-28% в течение 1 года и 48-65% через 5 лет [1]. Сердечная недостаточность является прогрессивным состоянием, начиная с простого присутствия факторов риска, таких как гипертония или диабет (этап А) [3]. Следующий шаг включает в себя бессимптомные изменения сердечной структуры и функции, примером которых является гипертрофия левого желудочка или ослабленная релаксация (стадия B) [3]. Наконец, пациенты прогрессируют до клинически открытой сердечной недостаточности (этапы C и D), инвалидности и смерти [3].

Инструменты скрининга, которые могут идентифицировать пациентов с сердечной недостаточностью в начале длительного бессимптомного течения заболевания, имеют решающее значение для борьбы с эпидемией сердечной недостаточности. Такие инструменты не только обеспечивают своевременное вмешательство, но также помогают в характеристике лежащих в основе молекулярных механизмов и более эффективных таргетирующих вмешательств. Циркулирующие [4] или мочевые [5] биомаркеры, отражающие воспаление [6], окислительный стресс [7], повреждение кардиомиоцитов [8] или ремоделирование левого желудочка [5,9], легко доступны и позволяют часто проводить повторную оценку. Воспаление является движущей силой в причинении повреждения миокарда в самых разных условиях, сердечных повреждениях, связанных с ишемией миокарда, инфарктом миокарда и вирусным миокардитом [10,11]. Наше текущее исследование было направлено на выявление новых воспалительных биомаркеров дисфункции левого желудочка путем выполнения экрана из 40 воспалительных биомаркеров, включая лиганды CXCR3 [12], в сыворотке, полученной от мышей, подвергнутых аортальной обвязке. Затем мы оценили биомаркеры, идентифицированные в экспериментах на животных, в качестве инструментов скрининга в исследовании случай-контроль, вложенном в исследование FLEmish по окружающей среде, генам и результатам в области здравоохранения (FLEMENGHO) [13,14].

Комитет по животноводству и использованию Маастрихтского университета одобрил экспериментальные исследования у мышей C57BL / 6J (Harlan Laboratories, Horst, The Netherlands). Как подробно описано в другом месте [15], мы вызвали перегрузку давления в аортальной полосе. Контрольные животные подвергались такой же хирургической процедуре без фактического затягивания лигатуры (обман). Мы оценивали сократимость левого желудочка через 4 или 8 недель после вмешательства при уретановой анестезии (+ dP / dt [16,17]), незадолго до того, как животные (n = 30) умерщвлялись от кровотечения из-за взятия крови из брюшной аорты. Затем давали сгущать в течение 4 часов при 4 ° С перед центрифугированием при 2000 г в течение 10 минут. Затем сыворотку удаляли, немедленно аликвотировали и хранили при -80 ° С. Определяли профиль 40 медиаторов воспаления, используя набор протектора мышей Proteome Profiler Mouse Cytokine, панель A (R & D systems, Abingdon, United Kingdom) с улучшенным детектированием флуоресценции, как описано ранее. Мембраны инкубировали с 1 мл объединенной сыворотки, полученной от 4 до 6 животных на группу. Общий объем 1000 мкл (максимально возможный объем) был нанесен на мембрану. Чтобы определить 40 внеклеточных цитокинов полуколичественным образом, мы выполнили инструкции производителя, доступные в Интернете по адресу http://www.rndsystems.com/product_detail_objectname_ProteomeProfilerArray.aspx. Мы модифицировали этот протокол после шага 9 для получения полуколичественных измерений с использованием считывания флуоресценции [18].

FLEMENGHO — крупномасштабное семейное исследование по генетической эпидемиологии сердечно-сосудистых фенотипов, для которого набор был начат в 1985 году и продолжался до 2008 года [13,14]. Комитет по этике Университета Лёвена одобрил исследование FLEMENGHO. Участники дали письменное информированное согласие. Как сообщалось ранее [5], мы выбрали 35 случаев и 35 контролей из когорты [19], которые с 2005 по 2010 год подвергались эхокардиографии, включая тканевую допплеровскую визуализацию с помощью сканера Vivid7 Pro (GE Vingmed, Horten, Norway), сопряженного с От 2,5 до 3,5 МГц. Мы следовали рекомендациям Американского общества эхокардиографии [20] для сбора данных и автономного анализа. Случаями были пациенты с гипертонической болезнью с асимптоматической (n = 19) или симптоматической (n = 16) диастолической дисфункцией левого желудочка, а контроль был нормотензивным здоровым контролем [5]. Диагноз дисфункции левого желудочка основывался на ранее опубликованных возрастных эхокардиографических критериях ослабленной релаксации и повышенном давлении на левый желудочек [5,19]. Участники сообщили о сердечно-сосудистых, одышканых и респираторных симптомах, заполнив вопросники Лондонской школы гигиены [21] и потребление лекарств и характеристики образа жизни через стандартизованный вопросник, управляемый наблюдателем. Артериальное давление дважды измеряли в положении лежа на спине, после эхокардиографии, с использованием проверенного устройства [22] OMRON 705IT (OMRON Healthcare Europe BV, Nieuwegein, Нидерланды). Гипертензия была артериальным давлением не менее 140 мм рт.ст. систолического или 90 мм рт. Ст. Диастолическим или использовала антигипертензивные препараты. Индекс массы тела составлял вес в килограммах, деленный на высоту в квадрате метра.

После того, как участники постигали не менее 6 часов, образцы венозной крови были взяты для измерения уровня холестерина в сыворотке крови, глюкозы в плазме и биомаркеров. Диабет выявлялся с использованием противодиабетических препаратов, глюкозы в плазме по меньшей мере 7,0 ммоль / л, самооценки диагноза или диабета, зарегистрированных на практике или в больничных отчетах [23]. Ослепывая клинические данные, мы измеряли уровни циркулирующих воспалительных биомаркеров с помощью иммуноферментного анализа на основе ферментов (ELISA) с использованием набора человеческих клеток CXCL9 / MIG Quantikine ELISA Kit, набора для иммунизации человека CXCL10 / IP10 Quantikine и человеческого CXCL11 / I-TAC Quantikine ELISA (R & D Systems, Миннеаполис MN). Мы также определили плазменный N-концевой проатриальный натрийуретический пептид (NT-pro BNP) с помощью конкурентного иммуноферментного анализа, предназначенного только для исследования (Biomedica Gruppe, Vienna, Austria) [24]. Стандартные уровни NT-proBNP варьируются от 0 до 1000 пмоль / л (медиана, 208 пмоль / л, 95-е, процентили 300 пмоль / л) [24]. Из-за недостаточного объема проб плазмы максимальное количество случаев и контролей, проанализированных в нашей нынешней рукописи, составило 31 и 32 соответственно; минимальные цифры были 29 случаев и 29 контролей.

Мы сравнили средства по t-тесту или ANOVA и пропорциям точным тестом Фишера, используя программное обеспечение SAS, версия 9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Значение было двухсторонним

α-уровень 0,05 или менее. Мы нормировали распределения циркулирующих биомаркеров логарифмическим преобразованием. Мы смоделировали шансы быть случайным по отношению к циркулирующим биомаркерам логистической регрессией. Мы использовали смешанные модели для проверки нулевой гипотезы, которая возрастает в новых биомаркерах у пациентов с дисфункцией левого желудочка, были идентичны наблюдаемым для NT-pro BNP. Мы определили оптимальные пределы дискриминации для биомаркеров, максимизируя индекс Юдена (чувствительность плюс специфичность минус 1) [25]. Мы оценили диагностическую точность воспалительных биомаркеров, используя интегрированное улучшение дискриминации (IDI) и улучшение сетевой реклассификации (NRI) [26]. IDI — это разница между скручиваниями дискриминации базовых моделей и базовыми моделями, расширенными с помощью предикторной переменной. Наклон дискриминации представляет собой разницу в прогнозируемых вероятностях (%) между случаями и контролями. NRI представляет собой сумму процентных ставок субъектов, реклассифицированных правильно на случаи и средства контроля.

Мы оценивали сердечную гемодинамику у мышей, подвергнутых поперечной аортальной обвязке, и в контрольных контрольных до и после добутаминовой инфузии. Исходный уровень + dP / dt до инфузии добутамина был сходным у полосатых и контрольных животных, усреднение (SE) 129 ± 7 против 155 ± 3 мм рт.ст. / с через 4 недели и 149 ± 20 против 156 ± 13 мм рт.ст. / с при 8 недель. Однако при максимальной стимуляции добутамином (6-7 нг / г / мин) увеличение + dP / dt ослаблялось (p <0,05) в полосатом сравнении с контрольными мышами, в среднем 239 ± 19 против 298 ± 17 мм рт.ст. / с в течение 4 недель и 215 ± 19 против 296 ± 8 против мм рт.ст. / сут через 8 недель.

В экспериментах по профилированию протеомов 5 из 40 цитокинов выделялись как минимум в 2 раза выше регулируемых (рис. 1). Они включали в порядок степень регуляции: монокин, индуцированный интерфероном-γ (MIG [CXCL9]), индуцируемый интерфероном-γ-протеин 10 (IP10 [CXCL10]), лейкоцитарный лейкоцитарный протеин-2 (MIP-2) интерлейкин 16 (IL-16) и растворимая молекула межклеточной адгезии 1 (sICAM-1). MIG и IP-10 являются лигандами рецепторов CXCR3, которые преимущественно экспрессируются Т-лимфоцитами и естественными киллерами [27]. Рецепторы CXCR3 также связывают индуцируемый интерфероном Т-клеточный альфа-химио-аттрактант (I-TAC [CXCL11]) [27]. Основываясь на наших текущих экспериментах на мышах и доступной литературе [12,27], мы провели MIG, IP10 и I-TAC далее в исследовании случай-контроль, вложенном в эхокардиографические исследования FLEMENGHO.

После поперечного сужения аорты (TAC) профили экспрессии увеличивались как минимум в два раза (пунктирная линия). MIG, IP10, MIP-2, IL-16 и sICAM-1 указывают на монокин, индуцированный интерфероном-γ (CXCL9), индуцируемый интерфероном-10 протеин 10 (CXCL10), лейкоцитарный протеин-2 мышиного макрофага, интерлейкин 16 и растворимую межклеточную адгезию молекулы 1, соответственно.

По сравнению с здоровым контролем (таблица 1) пациенты с субклинической дисфункцией левого желудочка были старше и имели более высокий индекс массы тела, артериальное давление и чаще при лечении диуретиками и β-блокаторами (p ≤ 0,029). По сравнению с пациентами с субклинической диастолической дисфункцией левого желудочка (таблица 1), больные с симптомами были старше, имели более высокий уровень глюкозы в плазме, имели более высокую распространенность ишемической болезни сердца и чаще при лечении вазодилататорами (p ≤ 0,032). Эхокардиографические измерения здорового контроля и пациентов с субклинической или симптоматической дисфункцией левого желудочка приведены в таблице S1.

LV указывает на левый желудочек. Среднее артериальное давление — диастолическое артериальное давление плюс одна треть различия между систолическим и диастолическим артериальным давлением. Ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы включали ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента и блокаторы рецепторов ангиотензина типа 1. Вазодилататорами были блокаторы кальциевых каналов и α-блокаторы. Значения P для трендов по категориям были значительными (p ≤ 0,025), за исключением доли женщин и курильщиков, а также средних значений частоты сердечных сокращений и холестерина в сыворотке (p ≥ 0,39). Значимость разницы с левой смежной группой:

* p ≤ 0.05

† p ≤ 0,01; а также

‡ p ≤ 0.001.

Циркулирующие уровни MIG, IP10, I-TAC и NT-pro BNP увеличились (p ≤ 0,014) по категориям ухудшения дисфункции левого желудочка (таблица 2). По сравнению с здоровым контролем уровни циркуляции четырех биомаркеров были одинаковыми у пациентов с субклинической дисфункцией левого желудочка (p ≥ 0,14), тогда как у пациентов с симптомами они были значительно выше (p ≤ 0,011) (таблица 2). У пациентов с симптоматическим заболеванием, MIG, IP10 и

LV указывает на левый желудочек. Уровни биомаркера — это геометрические средства (межквартильные диапазоны).

Значение с здоровым контролем:

* p ≤ 0.05

† p ≤ 0,01; а также

‡ p ≤ 0.001.

I-TAC увеличился на 210% (p = 0,015), 140% (p = 0,007) и 120% (p = 0,035) больше, чем у NT-pro BNP (рис. 2). Максимально увеличивая индекс Юдена, оптимальные пределы дискриминации MIG, IP10, I-TAC и NT-pro BNP соответственно составляли 65 г / мл, 93 пг / мл, 24 пг / мл и 246 пмоль / л (таблица S2). В таблице 3 показаны коэффициенты шансов на дисфункцию левого желудочка по отношению к биомаркерам. В нескорректированных анализах отношение шансов, связанное с четырьмя биомаркерами, было значительным (p ≤ 0,010), от 4,00 для IP10 до 9,69 для MIG. При настройке для NT-pro BNP лиганды CXCR3 сохраняли значимость (p ≤ 0,028). Коэффициенты шансов составляли 6,95 для MIG, 3,74 для IP10 и 12,3 для I-TAC. Добавление оптимизированных порогов для лигандов CXCR3 к базовым моделям, включая NT-pro BNP самостоятельно или в сочетании с индексом массы тела и массы тела (таблица 4), значительно улучшило IDI (p ≤ 0,038) и NRI (p ≤ 0,005), за исключением IP10 в моделях также включая индекс возраста и массы тела (p = 0,42). Анализ чувствительности, в котором мы вычислили коэффициенты шансов (таблица S3), IDI и NRI (таблица S4), с биомаркерами, выраженными в непрерывном масштабе, были в значительной степени подтверждающими, хотя значение IDI было достигнуто только для трех лигандов CXCR3, базовой модели, включая NT-pro BNP.

Поэтому вертикальная ось выражает среднее отношение пациентов к среднему значению во всех здоровых контролях, комбинированных.

Сокращения биомаркеров указаны в таблице 2. Коэффициенты (95% доверительные интервалы) выражают риск, связанный с концентрацией биомаркера выше оптимизированного порога.

Сокращения биомаркеров указаны в Таблице 2. Улучшение чистой реклассификации является суммой процентов субъектов, реклассифицированных правильно в случаях и контролях. Интегрированное усиление дискриминации — это различие между дискриминационными склонами расширенной и базовой моделей. Наклон дискриминации представляет собой разницу в прогнозируемых вероятностях между случаями и контролем. Случаями были пациенты с субклинической или симптоматической диастолической дисфункцией левого желудочка. Контроль был здоровым человеком.

Основной вывод нашего исследования состоял в том, что, проведя беспристрастный экран для воспалительных биомаркеров в мышиной модели сердечной недостаточности, мы идентифицировали кластер из трех связанных хемокинов, которые присутствовали в повышенных концентрациях в плазме пациентов с симптоматической диастолической дисфункцией левого желудочка. Эти три лиганда CXCR3 улучшили диагностическую точность сверх NT-pro BNP, как показано в результате интегрированного улучшения дискриминации и улучшения сетевой реклассификации.

Сердечная недостаточность является серьезной и растущей проблемой общественного здравоохранения со сложной этиологией [28]. Диагноз сердечной недостаточности, особенно на ранней стадии, когда клинические симптомы все еще мягкие, даже отсутствует, остается проблемой. Несколько циркулирующих биомаркеров в настоящее время рассматриваются при диагностике и лечении сердечной недостаточности. BNP и NT-proBNP представляют собой натрийуретические пептиды, которые высвобождаются из миокарда при чрезмерном растяжении. Их уровни циркуляции повышены у пациентов с сердечной недостаточностью и полезны для подтверждения диагноза у пациентов с одышкой [3]. Тропонин Т и я — маркеры повреждения миокарда при сердечной ишемии или инфаркте миокарда. После введения высокочувствительного анализа применение тропонина Т и I распространилось на травму миокарда как следствие прогрессирующей сердечной недостаточности [4]. Ван и его коллеги оценили 10 биомаркеров, в том числе натрийуретический пептид B-типа (BNP) и NT-pro BNP у 3209 участников, посещающих обычный цикл исследования Framingham Heart Study [29]. Во время медианного наблюдения в течение 7,4 года 207 участников умерли, а 169 имели первое крупное сердечно-сосудистое событие. В моделях пропорционального риска Кокса с корректировками, применяемыми для обычных факторов риска, BNP, но не NT-pro BNP, был сильным предиктором. Исследователи Framingham также объединили циркулирующие биомаркеры в мультимаркерные баллы [4]. Однако добавление мультимаркерных оценок к обычным факторам риска привело лишь к небольшим улучшениям в стратификации риска. Как было рассмотрено в другом месте [30], эти результаты Фремингема [4] иллюстрируют необходимость разработки новых биомаркеров с более высокой диагностической и прогнозной величиной при использовании отдельно или в комбинации.

В последнее десятилетие исследовательское сообщество прилагало большие усилия для выявления новых биомаркеров, которые позволили бы лучше описать процесс заболевания, лежащий в основе дисфункции левого желудочка, и улучшить стратификацию прогноза и успеха фармакотерапии. С-реактивный белок является независимым предиктором неблагоприятных исходов у пациентов с острой или хронической сердечной недостаточностью [28]. Другие биомаркеры, которые установили связь между сердечной недостаточностью и воспалением, включают фактор некроза опухоли-альфа [31] и провоспалительные (например, интерлейкин-6 [32]) и противовоспалительные (интерлейкин-10 [33]) цитокины.

Воспалительные биомаркеры, вероятно, содержат ценную информацию относительно молекулярных механизмов, инициирующих дисфункцию левого желудочка, и ее прогрессирование до симптоматической сердечной недостаточности. В настоящем исследовании мы сосредоточились на циркулирующих лигандах CXCR3, MIG, IP10 и I-TAC. Эти CXCR3-агонистические цитокины участвуют в аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит и системная красная волчанка [12]. Они играют определенную роль в наборе иммунных клеток на участки воспаления. Гипертензивные пациенты также имеют повышенные уровни циркулирующих MIG, IP10 и I-TAC [34-37]. Является ли это причинным или просто отражает повреждение органов-мишеней, в настоящее время неизвестно. В этом контексте следует отметить, что у наших пациентов с дисфункцией левого желудочка среднее кровяное давление повышалось, в то время как большинство получали антигипертензивные препараты. Однако все лиганды CXCR3 показали более высокие средние уровни у пациентов с симптоматической дисфункцией левого желудочка, несмотря на то, что артериальное давление, как правило, было ниже у этих пациентов. Эти наблюдения показывают, что повышенные уровни MIG и I-TAC являются не только результатом повышенного кровяного давления, но также коррелируют со степенью дисфункции левого желудочка.

Важным предварительным условием для биомаркера является его участие в болезни. Это просто невинный наблюдатель или причинная составляющая патологического процесса [4]? Воспалительные медиаторы приводят к кардиологическому ремоделированию в ответ на ишемию, миокардит и прививку [38,39]. Однако гипертония, вероятно, была причиной дисфункции левого желудочка у наших участников. Хотя гемодинамический стресс может вызвать воспалительное состояние в миокарде, воспалительные триггеры не совсем достоверны [10]. Ликеры CXCR3 MIG, IP10 и I-TAC участвуют в рекрутировании иммунных клеток, особенно T-лимфоцитов, в места воспаления [12, 40]. Увеличение инфильтрации CD4 + Т-лимфоцитов связано с быстрым ухудшением функции выброса в модели спонтанной гипертензии крысы [41]. Хотя точные роли различных подтипов T-лимфоцитов в воспалительной реакции на сердечный гемодинамический стресс еще не были полностью выяснены, наши текущие данные подтверждают участие лигандов CXCR3 в дисфункции левого желудочка.

Одним из ограничений настоящего исследования является то, что из-за экспериментальной установки мы не смогли идентифицировать источник лигандов CXCR3, которые были увеличены в циркуляции пациентов с дисфункцией левого желудочка. Индуцируемая экспрессия IP10 была продемонстрирована в моноцитах, эндотелиальных клетках и фибробластах [42, 43] и регулирует репаративный ответ в экспериментальной модели инфаркта миокарда [44]. Насколько нам известно, ни одно из предыдущих исследований не сообщало о функциональных эффектах агонистов CXCR3 на ответ сердца на гемодинамическую перегрузку. Для решения этого вопроса потребуется дополнительная работа на животных моделях. Другие проблемы, которые необходимо решить после этого экспериментального исследования, являются независимым подтверждением точности диагностики циркулирующих лигандов CXCR3 у пациентов с ранними стадиями дисфункции левого желудочка и подтверждения этих новых маркеров с точки зрения результатов и ответов на лечение.

В заключение, дисфункция левого желудочка связана с повышенными уровнями циркуляции лигандов CXCR3 MIG, IP10 и I-TAC. Добавление уровней этих хемокинов к модели прогнозирования риска обеспечило значительную чистую реклассификацию и улучшение интегрированной дискриминации. Однако для обоснования результатов нашего экспериментального исследования необходимы дальнейшие экспериментальные, клинические и эпидемиологические исследования.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы с благодарностью признают Жака Дебеца, Питера Лендерса, Агнешку Стшелецку и Лили Вервуор за помощь в экспериментах на животных (Маастрихтский университет) и Линде Кастерс, Аннике Де Соте, Мари-Жанне Джехул, Дейзи Тейс и Ханне Труйенс за их вклад в Изучение фламандского населения (Университет Лёвена).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *