Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Прямое ингибирование Ренина с помощью Aliskiren защищает от миокардиальной ишемии / реперфузионной травмы путем активации синтазы оксида азота в спонтанно гипертензивных крысах

Direct Renin Inhibition With Aliskiren Protects Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury by Activating Nitric Oxide Synthase Signaling in Spontaneously Hypertensive Rats
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3959716/

Д-р Чжан, Хань и Мэн внесли одинаковый вклад в эту работу.

Мы протестировали гипотезу о том, что прямое ингибирование ренина с помощью алискирена защищает от травмы ишемии / реперфузии миокарда (I / R) у спонтанно гипертензивных крыс (SHR) и изучает механизм его возникновения.

Мужские SHR обрабатывали (перорально, 4 недели) физиологическим раствором или алискиреном (30 или 60 мг кг-1 день-1) и подвергали 30-минутной окклюзии левой нисходящей окклюзии левой и последующей 6 или 24 часов реперфузии. Только более высокая доза значительно снижала систолическое артериальное давление, более низкая доза вызывала меньшее кажущееся понижение, которое было незначительным. Несмотря на эту разницу в эффекте снижения артериального давления, обе дозы увеличили фракцию выброса и фракционное сокращение и уменьшили размер инфаркта миокарда в равной степени. I / R уменьшал сердечную экспрессию фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), фосфо-Akt и фосфоэндотелиальной синтазы оксида азота (фосфо-eNOS), но увеличивала экспрессию индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS); эти изменения были отменены aliskiren. Кроме того, алискирен уменьшал образование супероксидных анионов и увеличивал циклический гуанозин-3′-5′-монофосфат, показатель биоактивного оксида азота, в миокарде. Он также уменьшил экспрессию металлопротеиназы-миокарда-2, матричной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (ТИМП-1) после I / R. При приготовлении сердца Лангендорфа пагубные сердечные эффекты I / R были отменены алискиреном, и эти защитные эффекты были отменены ингибированием NOS или PI3K. В параллельном исследовании, хотя специфическое ингибирование iNOS уменьшало образование малонового альдегида плазмы и генерацию супероксида миокарда, оно не влияло на пагубные эффекты I / R на структуру и функцию миокарда.

Прямое ингибирование ренина защищает от повреждения I / R миокарда путем активации пути PI3K-Akt-eNOS.

Травма ишемии / реперфузии миокарда (I / R) является важным осложнением острой окклюзии коронарной артерии и последующей реканализации, независимо от того, является ли она спонтанной или терапевтической. После острого инфаркта миокарда терапевтическая реканализация коронарной артерии с помощью тромболитической терапии или чрескожного коронарного вмешательства используется для минимизации размера инфаркта. Однако реоксигенация ишемического сердца может привести к необратимой потере функции миокарда. Многие сигнальные молекулы постулируются для модуляции повреждения I / R, включая реактивные виды кислорода и оксид азота (NO). Многие исследования продемонстрировали, что NO играет фундаментальную биологическую роль в защите сердца от травмы I / R2, и большинство исследований, изучающих роль NO в модуляции тяжести I / R-травмы в неоконсервативном миокарде, пришли к выводу, что NO имеет защитный эффект.3-4 Кроме того, показано, что как l-аргинин (субстрат для биосинтеза NO), так и NO-доноры улучшают повреждение I / R in vivo.3-4

Aliskiren является первым пероральным эффективным ингибитором ренина, который может быть использован клинически, и он может предлагать преимущества при сердечно-сосудистых заболеваниях, превышающих те, которые достигаются с помощью традиционных стратегий блокирования ренин-ангиотензиновой системы (RAS). 5. RAS играет центральную роль в регулировании и обслуживании кровяного давления. При гипертонии и сердечной недостаточности блокада RAS традиционно достигается путем ингибирования продуцирования ангиотензина II (Ang II) с использованием ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента или ингибирования влияния Ang II на его основной рецептор с использованием блокаторов рецепторов АТ-1. Обе эти стратегии повышают активность ренина в плазме (PRA) и концентрацию ренина в плазме. Несколько исследований показали прямую связь между уровнем PRA и риском сердечно-сосудистых заболеваний 6-7; в частности, PRA проявляет сильную связь с возникновением сердечно-сосудистых событий, особенно инфаркта миокарда, среди пациентов с гипертонической болезнью.7

Недавние данные свидетельствуют о том, что aliskiren улучшает биодоступность NO и, следовательно, ограничивает атеросклероз на животных моделях.8-9 Кроме того, aliskiren может регулировать экспрессию и фосфорилирование эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) сосудистой эндотелия, а также фосфорилирование вышерасположенной протеинкиназы B (Akt), в Наследуемые гиперлипидемические кролики Watanabe.8 Фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K) и ее нижестоящая мишень Akt представляют собой консервативное семейство ферментов сигнальной трансдукции, которые участвуют в регуляции клеточной активации, воспалительных реакциях и апоптозе.10 Активация PI3K / Akt-зависимой сигнализации было показано, что предотвращает апоптоз кардиомиоцитов и защищает миокард от повреждения I / R. 10-11

Мы предположили, что прямое ингибирование ренина с помощью алискирена будет защищать от травмы I / R миокарда в SHR, посредством активации сигнализации PI3K / Akt, приводящей к фосфорилированию и активации eNOS с результирующим увеличением биосинтеза NO.

Мужчины, спонтанно гипертензивные крысы (SHR) и крысы Wistar-Kyoto (WKY) были приобретены у лабораторий Vital River в Пекине, Китай. Животных кормили лабораторной диетой с водой и выдерживали в постоянных условиях окружающей среды, с 12-часовыми циклами света / темноты. Эксперименты с животными проводились в соответствии с руководящими принципами Принципов лабораторного ухода за животными и Руководства по уходу и использованию лабораторных животных. Это исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными в Нанкинском медицинском университете (№ утверждения NJMU-ERLAUA-20100112).

В возрасте от 8 до 10 недель WKY и SHR назначались на фиктивные операции или лигирование коронарной артерии с последующей реперфузией (см. Ниже); и в последнем случае также обрабатывали носителем (физиологический раствор) или алискирен (Новартис, Швейцария); aliskiren вводили в 2 разных дозах в SHR: 30 мг кг-1 день-1 (alis-L) или 60 мг кг-1 день-1 (alis-H). Aliskiren или носитель вводили в равном объеме, через желудочный зонд, один раз в день в течение 4 недель. В каждой группе WKY и SHR было 15-20 крыс (обман, транспортное средство, alis-L, alis-H). Систолическое артериальное давление (САД) измеряли плетизмографией хвостовой мантии (MedLab-U / 4C501H, компанией Medease) у сознательных крыс до начала лечения и в конце 4-недельного периода лечения.

Крыс анестезировали пентобарбиталом натрия (40 мг / кг внутрибрюшинно [i.p.]), учитывая атропин (0,1 мг / кг путем подкожной инъекции), чтобы уменьшить выделения в дыхательных путях и искусственно вентилироваться. Интраоперационный мониторинг адекватной анестезии проводился путем защемления пальцев ног. Ишемия миокарда была вызвана обнажением сердца через левый грудной надрез и размещение шовного шва 6/0 с прорезями вокруг левой передней нисходящей коронарной артерии. Через 30 минут ишемии высвобождали слизь, и миокард реперфузировали в течение 6 часов (для измерения сердечной функции) или 24 часа (для определения размера инфаркта, вестерн-блоттинга и биохимических анализов). Sham-обработанный SHR подвергся только левой торакотомии. Стенд грудной клетки закрывали через 30 минут после торакотомии в случае обработанного sham SHR или сразу после освобождения slipknot в случае SHR, подвергающегося I / R, и животным разрешалось восстанавливаться. Через 6 часов реперфузии крыс анестезировали путем ингаляции изофлурана (от 0,5% до 1,5%, испарителя Isoflurane, Matrx VIP3000) и закрепляли на позиционной платформе в положении лежа на спине. Сердечную функцию оценивали эхокардиографией с использованием GE Vivid 7 (GE, USA), оснащенного линейным преобразователем S12 с фазовой матрицей 14 МГц; все измерения проводились одним наблюдателем, который был ослеплен обработкой. Все измерения были усреднены в течение 5 последовательных сердечных циклов. Образцы крови и сердечной ткани были получены после 24 часов реперфузии.

Сердца извлекали из крыс Sprague-Dawley (весом от 220 до 250 г) после i.p. инъекции гепарина (1000 МЕ) с последующим i.p. после 5 минут пентобарбитала натрия (60 мг / кг). После удаления восходящую аорту канюлировали и сердце подвергалось ретроградной перфузии с модифицированным буфером Кребса-Хенслейта (NaCl 115 ммоль / л, KCl 4,6 ммоль / л, KH2PO4 1,2 ммоль / л, MgSO4 1,2 ммоль / л, CaCl2 1,8 ммоль / Л, NaHCO3 25 ммоль / л и глюкозы 11 ммоль / л), уравновешенную 95% O2 / 5% CO2 до pH 7,3-7,4. Перфузия была начата в не рециркулирующем аппарате перфузии сердца Лангендорфа, достигая базального перфузионного давления ≈70 мм рт. И перфузионный раствор, и сердце поддерживали при 37 ° С. После 20-минутного периода стабилизации сердца подвергали 30-минутной перфузии ингибитором NOS-NG-нитро-1-аргининметилестером (l-NAME 100 мкмоль / л, Sigma), ингибитором PI3K вортманнином (100 нмоль / л; Merck ), aliskiren (200 нг / мл), алискирен (200 нг / мл) плюс l-NAME (100 мкмоль / л), алискирен (200 нг / мл) плюс вортманнин (100 нмоль / л) или только буфер Кребса-Хенслейта (Рисунок 1). По истечении этого времени I / R-травма была произведена, подвергая сердца 30-минутной нормотермической ишемии с последующей реперфузией в течение 60 минут с помощью l-NAME (100 мкмоль / л), wortmanin (100 нмоль / л), aliskiren ( 200 нг / мл), алискирен (200 нг / мл) плюс l-NAME (100 мкмоль / л), алискирен (200 нг / мл) плюс вортманнин (100 нмоль / л) или буфер Кребса-Хенслейта соответственно. Баллон с заполненной жидкостью вставляли в левый желудочек через митральный клапан и накачивали, чтобы дать конечное диастолическое давление левого желудочка от 4 до 10 мм рт. Баллон был прикреплен полиэтиленовой трубкой (PE50) к датчику давления, подключенному к Сердечному анализатору (BL420, TME Technology), и давление левого желудочка непрерывно измерялось. Положительный и отрицательный пики первой производной давления левого желудочка (+ dP / dtmax и -dP / dtmax, соответственно) были получены из кривой давления левого желудочка.

Схематическая иллюстрация различных экспериментальных методов лечения в перфузионных экспериментах Лангендорфа. l-NAME указывает на метиловый эфир NG-нитро-1-аргинина; KHB, Krebs-Henseleit.

После этого сердца замораживали перед тем, как нарезать кусочки толщиной 2 мм, используя острое лезвие. Затем срезы инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в растворе 1% хлорида трифенилтетразолия в фосфатном буфере (рН 7,4) .12 Размер инфаркта выражали как отношение инфарктной зоны (без окрашивания тетразолием) к целому как определено компьютеризированной планиметрией.

Образцы крови были получены из правой сонной артерии, смешанной с динатрием ЭДТА (15 мг / мл) и центрифугировали при 1000 г в течение 15 минут при 4 ° С. Креатинкиназу (CK), миелопероксидазу (MPO) и малондиальдегид (MDA) количественно определяли в полученных таким образом супернатантах. Уровни CK, MDA и MPO определяли спектрофотометрически при 340 нм (CK), 532 нм (MDA) и 460 нм (MPO) в соответствии с инструкциями производителя (наборы от Genesys). Каждое измерение выполнялось в двух экземплярах.

Образцы сердечной ткани гомогенизировали в буфере для лизиса (Tris-HCl 50 ммоль / л, NaCl 250 ммоль / л, EDTA 10 ммоль / л, NaF 4 ммоль / л, фенилметилсульфонилфторид 1,0 ммоль / л, лейпептин 10 мкг / мл, NP- 40 0,5%, Triton X-100 1%). Гомогенаты помещали на лед в течение 40 минут, а затем центрифугировали при 500 г в течение 15 минут при 4 ° С. Супернатанты, содержащие сердечные лизаты, использовали для измерения циклического гуанозин-3 ‘, 5’-монофосфата (цГМФ) с использованием набора cGMP ELISA (R & D Systems).

Уровни миокарда матричной металлопротеиназы (MMP) -2 и MMP-9, а также тканевого ингибитора металлопротеиназ (ТИМП) -1 измерялись в гомогенатах сердечной ткани с использованием MMP-2, MMP-9 и TIMP-1 ELISA комплекты, соответственно (Cusabio Biotech Co Ltd), в соответствии с инструкциями производителя. Каждое измерение выполнялось в двух экземплярах.

Образцы сердечной ткани гомогенизировали и центрифугировали, как описано выше, для вестерн-блоттинга. Супернатант использовали для измерения образования супероксидного аниона с помощью люмигенин-усиленной хемилюминесценции. Световая реакция между супероксидом и люцигенином (5 мкмоль / л) была обнаружена в 96-луночном микропланшетном люминометре (GloMax, Promega) во время инкубации в HEPES-модифицированном буфере Кребса (рН 7,4). Кроме того, сердца, удаленные из SHR, сразу же замораживали в среде для встраивания OCT Tissue-Tek (Sakura Finetek), затем разрезали на секции толщиной 5 мкм и помещали на стеклянные слайды. Дигидроэтидий (DHE, 2 мкмоль / л) наносили на каждую секцию ткани, а слайды инкубировали в защищенной от света увлажненной камере при 37 ° С в течение 15 минут. Затем слайды исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии (Olympus).

Все данные выражаются как среднее ± SD. Их анализировали парными t-тестами или односторонним ANOVA с последующими пост-hoc-тестами. Непараметрические тесты использовались для данных с неоднородностью дисперсии (Stata13.0). Значение Р <0,05 (2-хвостовое) считалось статистически значимым.

Таблица показывает систолическое артериальное давление и массу тела в каждой из 7 групп лечения до и в конце 4 недель лечения. Как и ожидалось, систолическое кровяное давление увеличилось с возрастом в SHR, в то время как у крыс WKY это не изменилось. В группах SHR-sham и SHR-транспортных средств систолическое артериальное давление было выше в конце лечения, чем в начале. В SHR лечение с высокой дозой алискирена (60 мг кг-1 день-1, Alis-H) предотвращало возрастной рост САД в гораздо большей степени, чем малидная доза алискирена (30 мг кг-1 день-1 , Alis-L), и, действительно, Alis-H уменьшал SBP значительно по сравнению с SHR-носителем, тогда как Alis-L этого не делал. Вес тела увеличивался в течение лечения во всех 7 группах, и на это не влияло лечение алискиреном.

Систолическое артериальное давление и масса тела до и после 4 недель лечения с Алискиреном в 7 исследовательских комиссиях (n = 6-8)

Alis-H указывает на высокую дозу алискирена (60 мг кг-1 день-1); Alis-L, малые дозы алискирена (30 мг кг-1 день-1); ANOVA, анализ дисперсии; SHR, спонтанно гипертензивные крысы; WKY, крыс Wistar-Kyoto.

P <0,001 по сравнению с группой SHR-sham до лечения парными t-тестами.

P <0,01 по сравнению с группой SHR-носителя до лечения парными t-тестами.

P <0,01 по сравнению с группой SHR-носителя после обработки, анализируемой односторонним ANOVA с последующими пост-hoc-тестами.

Влияние алискирена на отношение размера / площади риска инфаркта (AR) у крыс SHR и WKY определяли методом красителя Эванса-синего / трифенилтетразолия. Несмотря на вышеупомянутые различия в влиянии на кровяное давление между группами SHR-Alis-H и SHR-Alis-L, аналогичное снижение наблюдалось при соотношении размеров / AR для инфаркта в обеих этих группах по сравнению с обработанным SHR-носителем группа (рисунок 2А); Аналогично, Alis-L уменьшал размеры инфаркта / AR и размер инфаркта / левого желудочка (LV) в WKY, несмотря на отсутствие заметного влияния на кровяное давление (рисунок 2B).

Влияние алискирена на травму I / R миокарда у крыс SHR и WKY. Aliskiren уменьшал инфаркт миокарда I / R в обоих случаях (A) SHR и (B) WKY. AR, область риска; LV, площадь левого желудочка (n = 5-6). C, Типичные следы M-режима при эхокардиографии, указывающие на улучшение (→, эндокард в боковой стенке, ⇒, эндокард в септальной стенке, ↔, внутренний диаметр левого желудочка). LVIDd, внутренний диаметр левого желудочка на концевой диастоле; LVIDs, внутренний диаметр левого желудочка в концевой систоле; (D) фракции выброса и (E) фракционного сокращения в левых желудочках крыс SHR и WKY после миокардиального I / R (n = 6-7). Sham, фиктивная операция; Транспортное средство, только I / R; Alis-L, I / R и совместную обработку алискиреном 30 мг кг-1 день-1; Alis-H, I / R и совместную обработку алискиреном 60 мг кг-1 день-1. Для A, D и E, *** P <0,001 по сравнению с SHR-Sham; † P <0,05, †† P <0,01, ††† P <0,001 против SHR-Vehicle; ‡‡‡ P <0,001 против WKY-Sham; §§§P <0,001 против WKY-Vehicle. Для B, ** P <0,01 против WKY-Vehicle. Alis-H указывает на высокую дозу алискирена; Alis-L, низкая доза алискирена; AR, область риска; I / R, ишемия / реперфузия; LV, левый желудочек; SHR, спонтанно гипертензивные крысы; WKY, крыс Wistar-Kyoto.

Сердечную функцию у обработанных aliskiren крыс SHR и WKY измеряли эхокардиографией, а типичные трассы M-режима для каждой из 7 групп показаны на рисунке 2C. Тридцать минут ишемии с последующим 6 часами реперфузии приводили к уменьшению фракции выброса (EF) и фракционного сокращения (FS) в обработанном транспортном средстве по сравнению с крыльями, обманутыми крыльями, как SHR, так и WKY. Лечение Aliskiren улучшило функцию миокарда у крыс SHR и WKY (рис. 2D и 2E) даже при более низкой дозе; и при специфическом исследовании в SHR 2 дозы алискирена улучшали EF и FS до равных степеней.

Мы измерили плазму CK, потому что это важный показатель степени повреждения I / R миокарда. Тридцать минут ишемии с последующим 24 часом реперфузии увеличивали CK, и это увеличение было полностью аннулировано обработкой либо Alis-L, либо Alis-H (фиг. 3A).

Влияние алискирена на показатели окислительного стресса, лейкоцитарной активности, поражения миокарда и активности матриксной металлопротеиназы (MMP), после введения I / R миокарда в SHR. Aliskiren уменьшал уровни в плазме (A) CK, (B) MPO и (C) MDA (n = 6), а также миокардиальную экспрессию (D) MMP-2, (E) MMP-9 и (F) тканевого ингибитора металлопротеиназы (ТИМП) -1 (n = 4-6). Sham, фиктивная операция; Транспортное средство, только I / R; Alis-L, I / R и совместную обработку алискиреном 30 мг кг-1 день-1; Alis-H, I / R и совместную обработку алискиреном 60 мг кг-1 день-1. * P <0,05, *** P <0,001 против Sham. † P <0,05, †† P <0,01, ††† P <0,001 против транспортного средства. Alis-H указывает на высокую дозу алискирена; Alis-L, низкая доза алискирена; CK, креатинкиназа; I / R, ишемия / реперфузия; MDA, малоносный альдегид; МПО, миелопероксидаза; SHR, спонтанно гипертензивные крысы.

Тканевая вербовка нейтрофилов и их активация приводят к высвобождению MPO в кровоток. По сравнению с группой, работающей под контролем, активность плазмы MPO была увеличена с помощью I / R миокарда, как и ожидалось. Это увеличение было полностью предотвращено как Alis-L, так и Alis-H (рис. 3B). Плазма MDA является чувствительным индикатором напряжения окислителя всего организма. Мы обнаружили увеличение MDA плазмы в группе, обработанной транспортным средством, в результате I / R миокарда по сравнению с группой, подверженной риску; и это увеличение было отменено как Alis-L, так и Alis-H (рис. 3C).

Показано, что повышенная активность матриксных металлопротеиназ (ММР) после острого инфаркта миокарда является опосредующим ремоделированием желудочков.13-14 По сравнению с ложнодействующим SHR экспрессия MMP-9 миокарда возрастала после I / R, и это повышение было отменено обеими дозами aliskiren (Рисунок 3Е). И миокардиальный MMP-2, и тканевый ингибитор экспрессии металлопроеиназ (TIMP) -1 уменьшались при высоких дозах алискирена, тогда как эффект низкой дозы алискирена на обоих из них был несущественным (рис. 3D и 3F).

Сообщается, что путь PI3K-Akt-eNOS играет защитную роль в I / R.10 миокарда. Хотя aliskiren увеличивает уровни сосудистых eNOS, фосфо-eNOS и фосфо-Akt 15, неясно, делает ли он тот же следующий сердечный I / R, и может ли какое-либо результирующее увеличение биосинтеза NO вносить свой вклад в его кардиозащитные эффекты. Мы обнаружили, что 30 минут ишемии с последующим 24-часовым реперфузией уменьшали экспрессию субъединицы p85α PI3K, фосфо-Akt и фосфо-eNOS (без изменения общего Akt или eNOS) по сравнению с животными, обманутыми животными; оба Alis-L и Alis-H аннулировали все эти изменения (рис. 4A, 4C и 4D). Напротив, I / R увеличил экспрессию iNOS, и это увеличение было отменено как Alis-L, так и Alis-H (рисунок 4B).

Влияние алискирена на миокардиальную сигнализацию PI3K-Akt-eNOS и экспрессию iNOS, пост I / R в SHR. Показаны анализы вестерн-блоттинга миокарда (A) субъединицы p85α PI3K (n = 4), (B) iNOS (n = 3), (C) фосфо-Akt (n = 5) и (D) фосфо-eNOS (п = 5). PI3K, фосфо-Akt и фосфо-eNOS (без соответствующего изменения общего Akt или общего выражения eNOS), и iNOS увеличилось в ответ на I / R, и все эти изменения были отменены aliskiren. p85α и iNOS выражены как денситометрическое отношение к α-тубулину, фосфо-Akt в качестве денситометрического отношения к общему Akt и фосфо-eNOS в качестве денситометрического отношения к общему eNOS. Sham, фиктивная операция; Транспортное средство, только I / R; Alis-L, I / R и совместную обработку алискиреном 30 мг кг-1 день-1; Alis-H, I / R и совместную обработку алискиреном 60 мг кг-1 день-1. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 против Sham. † P <0,05, †† P <0,01, ††† P <0,001 против транспортного средства. Alis-H указывает на высокую дозу алискирена; Alis-L, низкая доза алискирена; eNOS, эндотелиальная синтаза оксида азота; I / R, ишемия / реперфузия; iNOS, индуцибельная синтаза оксида азота; PI3K, фосфатидилинозитол-3-киназа; SHR, спонтанно гипертензивные крысы.

Чтобы выяснить, могут ли эти эффекты на передачу сигналов PI3K / Akt / NO влиять на наблюдаемый кардиозащитный эффект алискирена после I / R, мы использовали анализ перфузии Лангендорфа. Сердца перфузировали ингибитором NOS l-NAME, ингибитором ингибитора PI3K или соответствующим транспортным средством, с или без алискирена, затем подвергали ишемии в течение 30 минут и реперфузии в течение 60 минут. l-NAME или только вортманнин не влияли на размер инфаркта, коронарный поток, + dp / dtmax или -dp / dtmax; напротив, aliskiren заметно уменьшал размер инфаркта, увеличивал коронарный поток и увеличивал как + dp / dtmax, так и -dp / dtmax. Все эти эффекты aliskiren были отменены путем объединения его с l-NAME или с вортманнином (рис. 5A-5D).

Роль передачи сигналов PI3K-Akt-eNOS и iNOS в опосредовании защитного действия алискирена (Alis) на сердечную структуру и функцию после I / R. В перфузионной модели Langendorff I / R aliskiren уменьшал размер инфаркта (A, n = 5-9), увеличивал коронарный поток (B, n = от 6 до 13) и увеличивал как + dp / dtmax (C, n = 3 до 9) и -dp / dtmax (D, n = 3-9); все эти эффекты aliskiren были отменены ингибированием NOS с помощью l-NAME или ингибированием PI3K с помощью вортманнина, тогда как l-NAME и сам вортманнин не влияли на эти параметры в отсутствие алискирена. Pre-I, пред ишемия. В SHR in vivo, в то время как aliskiren отменил нарушение сердечной функции, вызванное I / R (Vehicle), оцениваемое фракцией выброса (E, n = 6) и фракционным сокращением (F, n = 6), специфическое ингибирование iNOS с использованием 1400 Вт либо самостоятельно, либо в сочетании с алискиреном не оказывали никакого эффекта. Sham, фиктивная операция; Транспортное средство, только I / R; Alis-L, I / R и совместную обработку алискиреном 30 мг кг-1 день-1; Alis-H, I / R и совместную обработку алискиреном 60 мг кг-1 день-1. Для A, * P <0,05 против транспортного средства. Для B через D, *** P <0,001 против pre-I. Для E и F, *** P <0,001 по сравнению с SHR-Sham. Для B через F, † P <0,05, †† P <0,01 против транспортного средства. Для B через D, ‡ P <0,05, ‡‡ P <0,01, ‡‡‡ P <0,001 против aliskiren. Alis-H указывает на высокую дозу алискирена; Alis-L, низкая доза алискирена; eNOS, эндотелиальная синтаза оксида азота; I / R, ишемия / реперфузия; iNOS, индуцибельная синтаза оксида азота; l-NAME, метиловый эфир NG-нитро-1-аргинина; PI3K, фосфатидилинозитол-3-киназа; SHR, спонтанно гипертензивные крысы.

Чтобы дополнительно исследовать возможную роль iNOS во время I / R миокарда, мы использовали селективный ингибитор iNOS, 1400 Вт, который вводили внутрибрюшинно за 30 минут до ишемии с последующим 6 или 24 часами реперфузии. SHR, подвергнутый I / R и обработанный 1400 Вт, не улучшал функции миокарда по сравнению с животными, обработанными транспортным средством, и 1400 Вт не оказывало заметного влияния на улучшение функции, вызванное алискиреном в любой дозе (рис. 5Е и 5F), несмотря на то, влияние как на системный окислительный стресс, так и на генерацию аниона миокарда супероксида (см. ниже).

NO проявляет большую часть своих биологических воздействий в тканях млекопитающих путем связывания с растворимой гуанилилциклазой в тканях-мишенях, тем самым катализируя образование цГМФ и последующую активацию цГМФ-зависимой протеинкиназы (ПКГ). Передача сигналов NO / cGMP / PKG способствует релаксации гладких мышц сосудов и дезагрегации тромбоцитов.16 cGMP также является чувствительным показателем биологической активности NO. Поэтому мы измеряли влияние I / R, а также на сопутствующее лечение алискиреном на уровни миокарда cGMP в SHR. Мы обнаружили, что миокардиальный цГМФ был уменьшен на I / R и что это снижение было отменено как Alis-L, так и Alis-H (рис. 6A).

Влияние алискирена как на системный окислительный стресс, так и на образование суароксида миокарда в SHR после I / R. A, миокардиальный цГМФ, показатель биоактивного NO, был уменьшен на I / R в SHR, и этот эффект был отменен алискиреном (n = 4-6). B, Репрезентативные микрофотографии окрашенных дигидроэтидием кардиальных срезов, показывающие увеличение окрашивания после I / R в SHR, которое отменено алискиром. C, хемилюминесценция Люцигенина подтвердила, что I / R увеличивает генерацию аниона миокарда супероксида в SHR и что это увеличение аннулируется алискиреном (n = 3). D, системный окислительный стресс, оцениваемый плазмой MDA, увеличивается на I / R как в SHR, так и в WKY, и это увеличение отменяется алискиреном. Также показано влияние 1400 Вт в SHR, демонстрируя аналогичное аннулирование при увеличении плазменной MDA, без добавления эффекта выше и выше одного алискирена (n = 4-6). E, генерация аниона миокардиального супероксида, оцененная хемилюминесценцией люцигенина, увеличивается на I / R как в SHR, так и в WKY, и это увеличение отменяется алискиреном. Также показано влияние 1400 Вт в SHR, демонстрируя аналогичное аннулирование при увеличении супероксидного аниона без дополнительного эффекта выше и выше одного алискирена (n = 4-6). Sham, фиктивная операция; Транспортное средство, только I / R; Alis-L, I / R и совместную обработку алискиреном 30 мг кг-1 день-1; Alis-H, I / R и совместную обработку алискиреном 60 мг кг-1 день-1. * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с SHR-фикцией. † P <0,05, †† P <0,01 против SHR-носителя. ‡ P <0,05 против WKY-Sham. §P <0,05 против WKY-Vehicle. Alis-H указывает на высокую дозу алискирена; Alis-L, низкая доза алискирена; цГМФ, циклический гуанозин-3 ', 5'-монофосфат; I / R, ишемия / реперфузия; MDA, малоносный альдегид; NO, оксид азота; SHR, спонтанно гипертензивные крысы; WKY, крыс Wistar-Kyoto.

Считается, что реактивные виды кислорода играют важную роль в травме I / R; кроме того, как указано выше, мы обнаружили, что I / R миокарда увеличивает системные маркеры окислительного стресса и что они отменяются алискиреном. В сердечной ткани I / R увеличивало производство супероксидных анионов, и это увеличение было отменено путем обработки либо Alis-L, либо Alis-H (фиг. 6B и 6C). Аналогичным образом, предварительная обработка крыс с 1400 Вт до ишемии миокарда уменьшала увеличение как плазменной MDA, так и продуцирования сердечного супероксида, по сравнению с животными, обработанными транспортным средством (рис. 6D и 6E); кроме того, он делал это в той же степени, что и алискирен, несмотря на отсутствие эффекта (в отличие от алискирена) на сердечную функцию.

Все вместе мы сообщаем, что ингибирование ренина алискиреном ослабляет размер инфаркта миокарда и защищает сердечную функцию после острой окклюзии коронарных артерий и последующей реперфузии и что эти эффекты алискирена могут быть связаны с активацией передачи сигналов NO посредством стимуляции PI3K / Akt / eNOS путь.

Настоящее исследование демонстрирует, что прямое ингибирование ренина с помощью алискирена приводит к кардиопротекции в ответ на сердечный I / R в SHR. Мы показали, что aliskiren предотвращает большую часть миокардиального повреждения I / R; что эти полезные действия связаны со снижением окислительного стресса, снижением накопления лейкоцитов и увеличением биодоступности NO, а также увеличением передачи сигналов PI3K / Akt / eNOS; и, в модели Лангендорфа, что положительные эффекты алискирена на повреждение сердца и функцию после I / R полностью отменены ингибированием биосинтеза NO с l-NAME или сигналом PI3K восходящего потока с вортманнином, но не путем селективного ингибирования iNOS с 1400W.

В предыдущем исследовании Вуд и др. Показали, что алискирен 30 мг кг-1 день-1 не изменяет среднего артериального давления в SHR17. В нашем исследовании мы показали небольшое (но незначительное) снижение САД с этой дозой алискирена, тогда как , при более высокой дозе (60 мг кг-1 день-1) это эффективно и значительно уменьшало САД. То, что более низкая доза алискирена влияет на САД меньше, может быть связана с его относительной видовой специфичностью. Ингибиторы ренина человека гораздо менее эффективны в отношении ренина крысы и мыши.18 Как ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, так и блокаторы рецепторов ангиотензина стимулируют выработку ренина почек, нарушая ингибирующую обратную связь Ang II на юкстагломерулярных клетках; в результате увеличение ренина в конечном итоге восстанавливает уровни Ang II.19 Aliskiren является единственным устно активным прямым ингибитором ренина, который в настоящее время доступен для клинического применения. Он блокирует генерацию Ang I из ангиотензиногена, начального и предельно-скоростного уровня RAS, путем ингибирования активного ферментативного сайта ренина. В нашем исследовании кардиопротекторные действия алискирена были очевидны и действительно равны в дозах 30 и 60 мг кг-1 день-1, несмотря на дифференциальное влияние двух доз на кровяное давление, что указывает на то, что наблюдаемые кардиопротективные эффекты прямого ингибирования ренина не были просто следствием снижения кровяного давления.

При травме I / R миокарда возникают дисфункция левого желудочка и сердечная недостаточность. Настоящее исследование демонстрирует, что сердечная функция заметно улучшается, а размер инфаркта значительно снижается при лечении алискиреном SHR после I / R. Ранее Алискирену предлагали защитную роль при сердечно-сосудистых заболеваниях. Было обнаружено, что оно усиливает как продукцию базального, так и ацетилхолин-стимулированного NO и улучшает эндотелийзависимую вазорелаксацию в сегментах грудной аорты от наследуемых гиперлипидемических кроликов Watanabe.8 В нескольких исследованиях также показано, что алискирен снижает атеросклероз на животных моделях, частично не зависит от изменений артериального давления.9,20 Алискирен также предотвращает сердечно-сосудистые осложнения и травмы поджелудочной железы у мышей с диабетом 2-го типа, 21 улучшает функцию эндотелия коронарных артерий и уменьшает сердечную гипертрофию в SHR и снижает уровни PRA и ангиотензина в этих SHR через 1 неделю лечения как в плазме, так и в тканях.22

Имеются данные о том, что активация Akt может оказывать антиатерогенное действие путем фосфорилирования eNOS на Ser1177.23 PI3K, восходящей киназе Akt, может активировать этот фермент путем фосфорилирования его на Ser473. Мы исследовали роль пути PI3K-Akt-eNOS в наблюдаемых алискирен-индуцированных изменениях сердец SHR после I / R. Кардиальная экспрессия PI3K, оцениваемая по его субъединице p85α, была увеличена в группах, обработанных алискиреном. Мы также обнаружили, что aliskiren восстановил ослабление в фосфо- / общ. Akt и фосфо- / общее количество eNOS в миокарде из SHR после I / R без изменения общей экспрессии Akt или eNOS. Кроме того, лечение алискиреном уменьшало снижение уровня цГМФ в миокарде (индекс биоактивного NO) после I / R.

Чтобы прояснить, защищает ли защитный эффект алискирена от повреждения и функции миокарда после травмы I / R, зависит от увеличения сигналов eNOS и NO через активацию пути PI3K-Akt-eNOS, мы исследовали эффект совместного введения NOS ингибитор l-NAME или ингибитор PI3K вортманнина в изолированном рабочем сердце с использованием перфузионного анализа Лангендорфа. Мы обнаружили, что, действительно, как l-NAME, так и wortmannin отменили эффекты алискирена на повреждение I / R миокарда как по структуре (размер инфаркта), так и по функции (коронарный поток + dp / dtmax, -dp / dtmax). В параллельном исследовании мы лечили крыс с 1400 Вт, селективным ингибитором iNOS, за 30 минут до I / R, для изучения роли iNOS в этом явлении. Мы обнаружили, что ингибирование iNOS не влияло на функцию миокарда после I / R, либо в отсутствие, либо в присутствии алискирена, что указывает на то, что NON-продуцирование NO не играет важной роли в модуляции сердечной функции в этой ситуации.

NO не поглощает супероксидный анион и не защищает от нарушения функции эндотелия сосудов. 24-25 Существует накопление доказательств того, что окислительный стресс вызывает повреждение I / R, а виды реактивного кислорода и свободные радикалы уже давно признаны в качестве основных медиаторов повреждения I / R.26 Поэтому мы исследовали потенциальный вклад окислительного стресса в защитный эффект алискирена против повреждения I / R. Предыдущие исследования показали, что активированные нейтрофилы являются основным источником свободных радикалов кислорода при реперфузии после длительной ишемии миокарда in vivo 27, а МПО является маркером активированных нейтрофилов, который высвобождается в кровоток.28 Мы подтвердили, что, действительно, MPO уровни были выше после I / R; однако, лечение aliskiren восстановило уровни MPO до нормального. MDA, один из конечных продуктов в процессе перекисного окисления липидов, также использовался для оценки вызванной кислородом опоры на свободные радикалы.29 В нашем исследовании уровень MDA в плазме в обеих группах, обработанных алискиреном, был ниже, чем в обработанном транспортным средством группа. Кроме того, генерация аниона миокарда супероксида в ответ на I / R была ослаблена обработкой алискиреном. Следовательно, алискирен может ослаблять окислительный стресс, по крайней мере частично, за счет уменьшения накопления нейтрофилов с образованием в результате образования супероксидного аниона. Однако, поскольку 1400 Вт уменьшали окислительный стресс и производство супероксида миокарда в той же степени, что и алискирен, но не благоприятно влияли на изменения I / R в структуре или функции миокарда, наши данные показывают, что положительный эффект прямого ингибирования ренина, наблюдаемый на эти параметры обусловлены не его ослабляющим окислительным напряжением, а скорее прямым действием NO, генерируемым через eNOS.

Изменения в системе MMP / TIMP и развитие гипертрофии левого желудочка связаны с переходом от компенсированной декомпенсированной сердечной недостаточности.30-31 MMP-9, в частности, является важным биомаркером для развития после инфаркта 32 и вносит важный вклад в риск разрыва левого желудочка, так что его генетическая делеция ослабляет смертность после инфаркта.33 Мы обнаружили увеличение экспрессии MMP-9 в инфарктной области левого желудочка, и как экспрессия MMP-2, так и MMP-9 ингибировались алискиром. Мы также обнаружили, что выражение TIMP-1 подавляется aliskiren. В совокупности эти результаты показывают, что общий эффект алискирена заключается в ослаблении цикла активации / дезактивации деградации матрицы в контексте I / R.

Ограничением метода хвостовой манжеты для измерения артериального давления, как используется в этом исследовании, является его относительная нечувствительность по сравнению с телеметрией. Тем не менее, несмотря на отсутствие чувствительности метода, мы наблюдали четкую разницу в том, что более высокая доза алискирена привела к снижению артериального давления, которое было явно больше — и более легко обнаруживалось — чем уменьшило дозу алискирена; и действительно, сокращение с прежним, в отличие от последнего, было значительным. Это подтверждает аргумент о том, что, по-видимому, равные эффекты алискирена более низкой и более высокой дозы по другим параметрам, измеренным в нашем исследовании, не были исключительно связаны с уменьшением артериального давления.

В заключение наши данные показывают, что в SHR aliskiren является кардиозащитным в контексте I / R миокарда, преимущественно посредством активации пути PI3K-Akt-eNOS. Это первая демонстрация, показывающая, что прямое ингибирование ренина активирует этот путь, что приводит к последующим функциональным эффектам и имеет важные потенциальные последствия в отношении новых стратегий профилактики и лечения травмы I / R миокарда.

Эта работа была щедро поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (№ 81330004, 81170083 и 81200196), Национальной программой фундаментальных исследований Китая (973) (№ 2011CB503903, 2012CB517503), Британским фондом сердца (No PG / 12/16/29943) и PAPD.

Никто.

Эта работа была оказана при поддержке Центра совместных исследований в области трансляционной медицины сердечно-сосудистых заболеваний. Мы также хотели бы поблагодарить профессора Филиппа К. Мура из Школы медицины Йонг Ло Лин, Национального университета Сингапура, Сингапур, для пересмотра английского языка.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *