Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Морфогенетический белок 2 костей индуцирует легочный ангиогенез через пути Wnt-β-catenin и Wnt-RhoA-Rac1

Bone morphogenetic protein 2 induces pulmonary angiogenesis via Wnt–β-catenin and Wnt–RhoA–Rac1 pathways
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2615088/

Переписка с Марлен Рабиновичем: marlener@stanford.edu

Эта статья распространяется в соответствии с условиями лицензии Attribution-Noncommercial-Share Alike-No Mirror Sites в течение первых шести месяцев после даты публикации (см. Http://www.jcb.org/misc/terms.shtml). Через шесть месяцев он доступен по лицензии Creative Commons License (Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported, как описано в http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/).

Мутации в костном морфогенетическом белковом (BMP) рецепторе II (BMPRII) связаны с апоптозом эндотелиальных клеток легочной артерии (PAEC) и потерей небольших сосудов, наблюдаемых при идиопатической легочной артериальной гипертензии. Учитывая низкую пенетрантность мутаций BMPRII, аномалии в других сходящихся сигнальных путях могут быть необходимы для развития болезни. Мы предположили, что BMPRII поддерживает нормальную функцию PAEC, рекрутируя сигнальные пути Wingless (Wnt), чтобы способствовать распространению, выживанию и подвижности. В этом исследовании сообщается, что BMP-2 посредством BMPRII-опосредованного ингибирования GSK3-β индуцирует накопление и транскрипцию β-catenin (β-C), необходимую для выживания и пролиферации PAEC. В то же время BMP-2 опосредует фосфорилированный Smad1 (pSmad1) или, с потерей BMPRII, pSmad3-зависимой рекрутинги Disheveled (Dvl) для стимулирования передачи сигналов RhoA-Rac1, необходимых для подвижности. Наконец, используя анализ ангиогенеза у тяжелых комбинированных иммунодефицитных мышей, мы демонстрируем, что как активация RoA-Rac1, так и Dvl-опосредованная активация необходимы для роста сосудов in vivo. Эти данные свидетельствуют о том, что набор в каноническом и неканоническом пути Wnt необходим для опосредованного BMP-2 ангиогенеза.

Сокращения, используемые в этой статье: ActR, рецептор активина; β-C, β-катенин; BMP, костный морфогенетический белок; BMPR, рецептор BMP; Dvl, взломанный; EC, эндотелиальная клетка; ERK, внеклеточная рецепторзависимая киназа; hPAEC, человеческий ПАЭС; ИФА, идиопатический ПАУ; LEF, связывающий фактор лимфоидного энхансера; LIMK, доменная киназа LIM; NLK, NEMO-подобная киназа; PAEC, легочная артерия EC; ЛАГ, легочная артериальная гипертензия; pERK, фосфорилированный ERK; pSmad, фосфорилированный Smad; SCID, тяжелый комбинированный иммунодефицит; SMC, клетка гладкой мускулатуры; TCF, Т-клеточный специфический транскрипционный фактор; Wnt, Wingless; WT, дикий тип.

Морфогенетические белки костей (BMP) являются членами надсемейства TGF-β белков, которые координируют пролиферацию, дифференцировку и выживание клеток в эмбриогенезе и гомеостазе взрослого организма (Attisano and Wrana, 2002). BMP-2, -4 и -7 оказывают свои биологические эффекты, взаимодействуя с рецепторами рецептора серина / треонинкиназы BMP-рецептором IA (BMPRIA; ALK3) или BMPRIB (ALK6) и их корецептором BMPRII. События сигнализации в нисходящем направлении включают в себя фосфорилирование Smad1 / 5/8, взаимодействие с комедиатором Smad4, ядерную транслокацию и транскрипцию гена. Хотя многие биологические эффекты BMPs были связаны с зависимыми от Smad путями, Smad-независимые MAPK-пути (JNK, p38 и внеклеточная рецепторзависимая киназа 1/2 [ERK1 / 2]) также играют активную роль в BMP-сигнализация (Massague, 2003).

Учитывая диапазон биологических функций, контролируемых сигнализацией BMP, большое внимание было направлено на понимание того, как дисфункция в этом пути способствует развитию болезни. Идиопатическая легочная артериальная гипертензия (PAH [IPAH]) является заболеванием, связанным с аберрантной функцией BMPRII. Различные гетерозиготные потери функциональных мутаций в BMPRII наблюдаются в 25% спорадических и 70% семейных случаев ИФА, в которых пенетрант составляет всего 20% (Deng et al., 2000; Thomson et al., 2000; Machado et al. , 2001). Тем не менее, снижение экспрессии BMPRII наблюдается у пациентов с IPAH без мутации BMPRII и с более распространенными приобретенными формами PAH, например, связанных с врожденным пороком сердца (Roberts et al., 2004).

IPAH является редким заболеванием (от одного до двух вновь выявленных случаев на миллион человек в год) с пристрастием к молодым женщинам (соотношение между женщинами и мужчинами 2,3: 1) и медианным возрастом при постановке диагноза 36,4 года (Rich et al., 1987 ). В отсутствие лечения у пациентов с ИПАГ средняя выживаемость составила 2,8 года (Massague, 2003; Humbert et al., 2004a). Как IPAH, так и более распространенные приобретенные формы ЛАГ характеризуются прогрессирующим увеличением сопротивляемости легочного сосуда, обусловленным потерей небольших периферических легочных артерий, возникающих в результате апоптоза эндотелиальных клеток (ECs, Teichert-Kuliszewska et al., 2006) и окклюзии более крупных проксимальных легочных артерий, возникающих в результате пролиферации гладких мышечных клеток (SMC) и отложения внеклеточного матрикса. На поздних стадиях заболевания у некоторых из этих окклюдированных сосудов и вокруг них обнаружены аберрантные каналы EC, отражающие расширение устойчивых к апоптозу групп EC (Tuder and Voelkel, 2002), которые могут возникать из эндогенных или циркулирующих клеток-предшественников (Asosingh et al., 2008). Текущая терапия включает оральные и внутривенные средства с сосудорасширяющими свойствами, которые улучшают симптомы, но не предотвращают или не предотвращают прогрессирование заболевания, оставляя трансплантацию легкого с присущей ей высокой смертностью и заболеваемостью как единственный выбор для пациентов с конечной стадией заболевания (Humbert et al., 2004b).

Работа над трансгенными животными способствовала нашему пониманию связи между аберрантной сигнализацией BMP и легочной сосудистой патологией. Гомозиготная делеция BMPRII (Beppu et al., 2000) и BMPRIA (Mishina et al., 1995) приводит к летальности во время гаструляции, тогда как мыши, гетерозиготные по BMPRII, являются относительно нормальными, но могут развиваться более тяжелая легочная гипертензия и ремоделирование сосудов при воздействии высоких уровни серотонина (Long et al., 2006) или при инъекции липоксигеназы (Song et al., 2005).

Эксперименты, проведенные в EC (ECP) легочной артерии человека (PAECs [hPAECs]), показывают, что потеря BMPRII RNAi ухудшает способность BMP-2 повышать выживаемость PAEC в проапоптотических условиях (Teichert-Kuliszewska et al., 2006). Однако hPAECs, культивируемые у пациентов с IPAH и документированными мутациями BMPRII, демонстрируют повышенную пролиферацию по сравнению с EC от здоровых доноров (Masri et al., 2007), и это может объяснять аберрантный ангиогенез в просвете и адвентиции сосудов с плексогенным обструктивным артериопатии, наблюдаемой в продвинутом ИФА. Тем не менее, клетки пациентов с IPAH нарушены в их способности образовывать тубулярные структуры в культуре (Masri et al., 2007), и это может быть причиной их неспособности восстановить потерянный дистальный легочный сосудистый слой. Таким образом, всестороннее понимание нормального регулирования функции EC посредством сигнализации BMPRII является необходимым первым шагом в оценке того, как аномалии приводят к заболеванию.

Взаимодействие между BMP и участниками сигнального пути Wingless (Wnt) связано с развитием эмбрионального развития легких, поскольку как сигнальные каскады BMP, так и Wnt координируют определение судьбы стволовых клеток и приверженность морфогенезу ветвления легких (Chen et al., 2005). В других органах BMPs (Deckers et al., 2002; Langenfeld and Langenfeld, 2004; Chen et al., 2005; Raida et al., 2005) и Wnts (Ishikawa et al., 2001; Masckauchan et al., 2005) участвуют в ангиогенезе, связанном с развитием и болезнью.

Wnts могут сигнализировать через канонический β-катенин (β-C) -зависимый путь через взаимодействие с рецепторным комплексом, состоящим из белка Frizzled и ассоциированного с белком липопротеинового рецептора белка (LRP5 или 6). Цитоплазматический белок Disheveled (Dvl) рекрутируется, что облегчает ингибирование GSK3-β. Это защищает β-C от ubiquitination и позволяет ему накапливаться в цитоплазме и перемещаться в ядро, где оно взаимодействует с другими факторами транскрипции и активирует гены, участвующие в поддержании, пролиферации и выживаемости клеток, таких как c-myc, cyclin D1, VEGF , сурвивина и аксина2 (Bain et al., 2003; Rawadi et al., 2003; Logan and Nusse, 2004; Chen et al., 2005). Wnts также может активировать неканоническую (т. Е. Не-β-зависимую) сигнализацию, наиболее изученным из которых является путь Wnt-RhoA-Rac1, вовлеченный в полярность ткани (Axelrod and McNeill, 2002) и в скоординированном движении клеток во время эмбриологического развития (Habas et al., 2003).

В этом исследовании мы показываем, что BMP-2 набирает канонические и неканонические сигнальные пути Wnt для продвижения распространения, выживания и миграции PAEC. Канонические β-C-опосредованные сигналы требуют активации BMP-2 фосфорилированного ERK (pERK), чтобы опосредовать инактивацию GSK3-β, тогда как неканоническая сигнализация включает активацию фосфорилированного Smad1 (pSmad1) BMP-2 для приема Dvl и активации RhoA и Rac1. Канонический путь зависит от взаимодействия BMP-2-BMPRII, тогда как в отсутствие BMPRII BMP-2 может стимулировать подвижность, сигнализируя через рецептор активности IIa (ActRIIa), чтобы опосредовать pSmad3 вербовкой Dvl к пути RhoA-Rac1. Наконец, мы расширяем наши наблюдения до модели ангиогенеза in vivo и показываем, используя анализ штекера Matrigel у тяжелых комбинированных иммунодефицитных (SCID) мышей (Skovseth et al., 2007), что BMP-2 стимулирует ангиогенез в β-C- и Dvl-зависимым образом.

Основываясь на предыдущем исследовании (Langenfeld and Langenfeld, 2004), мы решили использовать BMP-2 в качестве лиганда для исследования передачи сигналов BMPRII в hPAEC. Эндогенное продуцирование Wnt1, -2, -3a, -4, -9a и -16 в PAEC было зарегистрировано с использованием полуколичественной RT-PCR для скрининга для всех членов семейства Wnt (рис. S1, доступный по адресу http: // www .jcb.org / CGI / содержание / полный / jcb.200806049 / DC1). Наше решение использовать Wnt3a в наших экспериментах было основано на его способности активировать как канонические (Nusse, так и Varmus, 1992) и неканонические (Endo et al., 2005) сигнальные пути. Мы впервые голодали hPAEC в течение 24 часов в 0,1% сыворотке, добавляли 10 нг / мл BMP-2 или 100 нг / мл Wnt3a и измеряли количество клеток через 24 часа. 50 нг / мл VEGF-обработанных клеток и клеток, подвергнутых воздействию 0,1% сыворотки, использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Как BMP-2, так и Wnt3a значительно увеличивают количество клеток hPAEC (рис. 1 A). Чтобы проверить влияние тех же лигандов на выживаемость hPAEC, клетки были сыворотки, голодавшие в течение 24 часов, и подвергались в течение еще 24 часов без сыворотки в присутствии или отсутствии BMP-2 или Wnt3a. Тесты Caspase 3/7 показывают, что как BMP-2, так и Wnt3a уменьшают апоптоз по сравнению с контрольными средствами, обработанными транспортным средством (фиг.1А). Чтобы исследовать, стимулирует ли BMP-2 или Wnt3a миграцию hPAEC, клетки высевают на бусины Cytodex 3 и внедряют в витронектиновые гели в присутствии BMP-2 или Wnt3a в течение 48 часов. Оба BMP-2 и Wnt3a способствовали миграции hPAEC способом, подобным тому, который наблюдался при VEGF, положительный контроль, определяемый расстоянием, перенесенным из шариков (фиг.1А).

BMP-2 и Wnt3a способствуют распространению, миграции и выживанию hPAEC при увеличении транскрипционной активности β-C и генов-мишеней. (A) Количество клеток, каспаза 3/7 апоптоза и микропереходные анализы миграции шариков hPAEC в присутствии или отсутствии 10 нг / мл BMP-2 или 100 нг / мл Wnt3a. Для индуцирования апоптоза использовали бессывороточные условия, тогда как 50 нг / мл рекомбинантного человеческого VEGF использовали в качестве положительного контроля пролиферации и подвижности. (B) Показатели западных иммуноблотов (верхний) и денситометрии (снизу) для β-C, нормализованных к α-тубулину, в ответ на стимуляцию BMP-2 и Wnt3a, как в анализах A (C) TOPflash luciferase. hPAEC были трансфецированы репортерными плазмидами люциферазы TOPflash или FOPflash (отрицательный контроль) или Renilla (контроль эффективности трансфекции). Через 6 ч после стимуляции BMP-2 и Wnt3a лизаты анализировали на активность люциферазы по сравнению с Renilla. CON, управление. (D) Типичные иммуноблоты для c-myc, VEGF, cyclin D1 и сурвивина в лизатах hPAEC, стимулированных Wnt3a или BMP-2, как описано в A. Значения были нормализованы для α-тубулина. Шкалы ошибок представляют среднее значение ± SEM из четырех различных экспериментов, выполненных в трех повторениях. *, P <0,01; **, P <0,001; ***, P <0,0001 (против нестимулированного контроля).

Wnt3a связан с канонической сигнализацией β-C в различных клетках, включая EC (Wright et al., 1999). Учитывая сходство биологических ответов в hPAECs, мы предложили, чтобы BMP-2, как и Wnt3a, мог активировать сигнализацию β-C, чтобы индуцировать экспрессию генов-мишеней Wnt. Иммуноблоты с использованием антитела, которое распознает активную нефосфорилированную форму β-C, проводили на лизатах из hPAECs, стимулированных в течение 6 или 8 часов с помощью BMP-2 или Wnt3a. Мы наблюдали, что оба агониста индуцируют значительное повышение уровня активного β-C в течение 10-30 минут стимуляции (рис.1B). Используя конфокальную микроскопию, повышенные уровни ядерного β-C были продемонстрированы в BMP-2-стимулированных hPAEC в течение 1 часа (рис. S2, доступный по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806049/ DC1). Чтобы связать наблюдаемое увеличение активного β-C с изменениями в транскрипции мишеней-мишеней, мы, нуклеотизированные клетки, с промотором-репортерным фактором фактора роста (LEF) / Т-клеточного специфического транскрипционного фактора (TCF) (TOPflash) или с отрицательным контрольной плазмиды (FOPflash) с последующим измерением люциферазы. Через 6 ч стимуляции люцифераза была значительно увеличена в трансплантированных TOPflash hPAEC, стимулированных либо BMP-2, либо Wnt3a по сравнению с нестимулированными или FOP-флеш-трансфицированными клетками (фиг.1C).

Затем мы связали индуцированное Wnt3a- и BMP-2 увеличение активности транскрипции β-C до нижестоящих генных мишеней, которые могут быть замечены в наблюдаемых функциональных изменениях. Иммуноблоты проводили с использованием антител к VEGF 121, c-myc, cyclin D1 и сурвивину, учитывая их установленную роль в распространении, выживаемости и миграции EC (He et al., 1998; Tetsu and McCormick, 1999; Zhang et al., 2001а, б). Лизаты, полученные до 4 ч после стимуляции либо агонистом, показали увеличение уровней этих белков (фиг.1D).

Поскольку BMP-2 и Wnt3a увеличивают активность транскрипции β-C и целевые белки, потенциально связанные с пролиферацией, выживаемостью и миграцией hPAEC, мы затем определили, необходима ли β-C для этих функций. hPAECs были нуклеофинированы с siRNA-дуплексами, разработанными против β-C, что достигало ~ 75% нокдауна всего белка β-C через 24 ч после трансфекции (фиг.2А). Количество клеток (фиг.2В) показывает, что hPAEC, обработанные β-C siRNA, не проявили повышенного пролиферативного ответа на BMP-2 и Wnt3a по сравнению с hPAEC, трансфецированными нетрагирующей siRNA. Наши эксперименты по выживанию показали, что потеря β-C изменила преимущество выживаемости, вызванное BMP-2 и Wnt3a в ответ на лишение сыворотки (фиг.2С). Однако потеря β-C-усиленной BMP-2- и Wnt3a-опосредованной подвижности (фиг.2D). Эти данные повысили вероятность того, что как Wnt3a, так и BMP-2 могут одновременно активировать β-C-независимый путь, необходимый для подвижности клеток.

Нокдаун β-C снижает ответ на распространение и выживаемость hPAECs на BMP-2 и Wnt3a, но усиливает их миграционный ответ. (A) Западные иммуноблоты для β-C и α-тубулина hPAEC, нуклеофагированные с контролем без таргетинга (CON RNAi) и β-C-специфической siRNA (βC RNAi). ***, P <0,0001 (по сравнению с контролем без таргетинга). (B-D). Пролиферацию клеток (B), активность каспазы 3/7 (C) и анализ клеточной миграции (D) с использованием клеток, нуклеофагированных с немаркирующей или β-C-специфической siRNA, выполняли, как показано на фиг.1. среднее значение ± SEM из трех разных экспериментов, выполненных в трех повторениях. **, P <0,001 (BMP-2 или Wnt3a против нестимулированного контроля без таргетинга); #, P <0,01 и ##, P <0,001 (β-C-специфическая siRNA против соответствующего контрольного контроля).

Мутации в BMPRII в IPAH приводят к потере экспрессии и функции (Humbert et al., 2004a). Для изучения биологического воздействия дефицита BMPRII на пролиферацию, миграцию и выживаемость hPAEC мы провели эксперименты по нокдауну с использованием пула siRNA, разработанного против последовательности BMPRII, и достигли снижения уровня белка на уровне ~75% в течение 24 ч (фиг.3А) , Это также связано с уменьшением активности TOPflash в исходных условиях и в ответ на BMP-2 (фиг.3В).

Нокдаун BMPRII уменьшает BMP-2-опосредованное распространение и выживание hPAEC, но усиливает их миграционный ответ. (A) Западные иммуноблоты для BMPRII и α-тубулина в hPAECs, нуклеофицированные с нездоровым контролем (CON RNAi) и BMRII siRNA (BMPRII RNAi). Строки ошибок обозначают среднее значение ± SEM для трех разных оценок. ***, P <0,0001 (против управления без таргетинга). (B) Анализ активности TOPflash. **, P <0,001 (против контроля без таргетинга); ##, P <0,001 (по сравнению с BMP-2-стимулированным контролем без таргетинга). (C-E), пролиферацию клеток (C), активность каспазы 3/7 (D) и анализ миграции клеток (E) с использованием клеток, нуклеотированных с немаргирующей или BMPRII-специфической siRNA, как на рисунке 1. (B-E) Бары ошибок представляют среднее ± SEM из трех разных экспериментов, выполненных в трех повторениях. *, P <0,01 и **, P <0,001 (против нестимулированного контроля без таргетинга); ##, P <0,001 (против BMP-2- или Wnt3a-стимулированного контроля без таргетинга).

При установке нокдауна BMPRII hPAECs не смогли размножаться в ответ на BMP-2 по сравнению с контрольными. Однако, когда hPAECs стимулировали Wnt3a или VEGF, нокдаун BMPRII не оказывал существенного влияния на пролиферацию (фиг.3C). Аналогично, защита от апоптоза, назначаемого BMP-2, была потеряна при нокдауне BMPRII, но это не повлияло на реакцию Wnt3a (фиг.3D). Однако потеря BMPRII, аналогичная потере β-C, привела к увеличению BMP-2-, но не Wnt3a-опосредованной подвижности hPAEC (рис.3 E).

Поэтому мы провели эксперименты, чтобы (а) рассмотреть, как BMP-2 через BMPRII может стимулировать регуляцию гена β-C, чтобы влиять на пролиферацию и выживаемость, и (b) установить, как BMP-2 может регулировать подвижность клеток с помощью β-C-независимого путь.

Регулирование уровней β-C в клетках млекопитающих в значительной степени зависит от целевого фосфорилирования GSK3-β, за которым следует убиквинирование и протеасомная деградация (Logan and Nusse, 2004). GSK3-β можно инактивировать целевым фосфорилированием серина 9 или 21, что позволяет накапливать β-C (Cohen and Frame, 2001). Известно, что несколько путей киназы ингибируют GSK3-β, среди которых наиболее эффективны IP3 / Akt, p38 и ERK1 / 2 (Cohen and Frame, 2001; Ding et al., 2005; Thornton et al., 2008). Учитывая, что известно, что BMP активируют эти же пути через Smad-независимые механизмы (Sugimori et al., 2005; Jin et al., 2006), мы исследовали, была ли активирована активация Akt, ERK1 / 2 и p38, опосредованной BMP-2 в hPAECs, связанных с инактивацией GSK3-β. Мы не наблюдали никаких изменений в опосредованном BMP-2 фосфорилировании Akt и p38 (неопубликованные данные) в отличие от быстрой индукции фосфорилирования ERK1 / 2. Чтобы определить, является ли BMP-2 через BMPRII медиатором pERK1 / 2 и необходим ли pERK1 / 2 для накопления β-C и активности транскрипции, мы стимулировали контроль и BMPII siRNA-обработанные hPAEC с BMP-2 в течение 1 часа. Случайное увеличение pERK1 / 2 с фосфорилированием (т.е. инактивацией) GSK3-β и последующее накопление β-C было отменено в клетках, обработанных BMPII siRNA (рис. S3, доступный по адресу http://www.jcb.org/ CGI / содержание / полный / jcb.200806049 / DC1). В качестве контроля мы показали, что hPAECs, обработанные BMPII siRNA, реагируют на стимуляцию Wnt3a увеличением как транскрипционной активности β-C, так и TOPflash (неопубликованные данные).

Чтобы определить требование для pERK1 / 2 в регуляции активности GSK3-β, мы инкубировали hPAEC с BMP-2 в присутствии PD98059, известного ингибитора пути ERK1 / 2. Мы показываем, что BMP-2 не активирует ERK1 / 2, когда присутствует PD98059, и что это связано как с отсутствием фосфорилирования GSK3-β, так и с накоплением β-C (фиг.4А). Аналогичные результаты были получены с использованием доминантно-отрицательной (Δ) ERK-конструкции (аденовирусного вектора, содержащего FLAG-маркированную конструкцию ERK2-AEF с мутированными сайтами фосфорилирования, фиг. S4 A, доступную по адресу http://www.jcb.org/cgi/ содержание / полный / jcb.200806049 / DC1). Отсутствие накопления β-C с стимуляцией BMP-2 также коррелировало с подавленной транскрипционной активностью β-C, о чем свидетельствует снижение репортерной активности TOPflash в присутствии PD98059 (рис. S4 B).

BMP-2 активация активности транскрипции β-C в hPAEC зависит от ERK. (A) Западные иммуноблоты hPAEC, стимулированные BMP-2 в присутствии или отсутствии 10 мкМ PD98059. Клетки были исследованы для pERK, общего ERK, GSK3-β и β-C. (B) Западные иммуноблоты hPAEC, трансфицированные доминантно-негативными (Δ) Smad1 или -3 конструкциями и стимулированные 10 нг / мл BMP-2 в течение 1 часа. Клетки были исследованы для активных β-C и α-тубулина в качестве контроля загрузки (CON). (C) Западные иммуноблоты hPAEC, инкубированные с BMP-2 10 нг / мл в присутствии или в отсутствие 500 нг / мл DKK 1 в течение 1 часа. Блоты исследовали для активного β-C и α-тубулина в качестве контроля загрузки. Строки ошибок обозначают среднее ± SEM для трех разных экспериментов, выполненных в трех повторениях. **, P <0,001 и ***, P <0,0001 (против контроля).

Хотя активация β-C, опосредованной BMP-2, по-видимому, зависит от активации ERK1 / 2, мы также исследовали потенциальный вклад pSmads (Labbe et al., 2000) и / или аутокринной передачи сигналов Wnt (Fischer et al., 2002) в этом процессе. Мы обнаружили, что BMP-2-опосредованное накопление β-C в hPAEC, трансфецированное либо доминантно-отрицательной (Δ) Smad1, либо Smad3-конструкцией способом, аналогичным таковому только трансфицированных вектором hPAECs (фиг.4В). Чтобы определить, может ли BMP-2 опосредовать накопление β-C посредством продуцирования и внеклеточного высвобождения Wnts, мы лечили hPAEC с 500 нг / мл DKK 1. DKK 1 взаимодействует с LRP 5/6, чтобы препятствовать образованию рецепторного комплекса и Wnt- (Glinka et al., 1998). Не было никакого уменьшения в BCP-2-индуцированном накоплении β-C в любом носителе или DKK 1-обработанных hPAEC (фиг.4C).

Хотя наши вышеупомянутые результаты показывают, что BMP-2 через BMPRII может набирать β-C для регулирования пролиферации и выживания hPAECs, они не объясняют BMPRII- и β-C-независимый механизм, участвующий в BMP-2-опосредованной подвижности hPAEC. Как показано в одном из исследований, Wnt3a может сигнализировать через β-C-независимый путь RhoA-Rac1 для координации эмбриологических событий, таких как гаструляция (Habas et al., 2003). В CHO и нейронных клетках этот путь способствует изменениям цитоскелета, которые способствуют миграции клеток посредством образования ламеллиподий и филоподий (Boutros et al., 1998; Habas et al., 2003; Kishida et al., 2004; Endo et al., 2005 ). Активация пути Wnt-RhoA-Rac1 приводит к целенаправленной индукции нисходящих белков, таких как LIM-доменная киназа (LIMK) и ROCK I / II, которые участвуют в стабилизации актинового цитоскелета и сокращения актин-миозина соответственно (Yang et al. , 1998; van Nieuw Amerongen и van Hinsbergh, 2001; Sandquist et al., 2006).

Используя вытягивающие анализы для осаждения активных форм RhoA и Rac1, мы показали значительное увеличение активных RhoA и Rac1 в течение 4-х периодов в hPAEC, стимулированных как BMP-2, так и Wnt3a (фиг.5). Активация RhoA и Rac1 во времени совпала с увеличением активности β-C, поддерживая одновременное использование как канонической, так и неканонической сигнализации BMP-2 и Wnt3a.

BMP-2 и Wnt3a увеличивают уровни активных RhoA и Rac1 в hPAEC. Активные исследования RhoA и Rac1 были проведены на hPAEC, голодавших в течение 24 часов с последующей инкубацией с 10 нг / мл BMP-2 или 100 нг / мл Wnt3a в течение 1 и 4 ч. Показаны типичные иммуноблоты для RhoA и Rac1 наряду с денситометрией. Уровни активного RhoA и Rac1 были измерены против общих RhoA и Rac1 в клеточных лизатах. Строки ошибок обозначают среднее ± SEM для трех разных экспериментов с трехкратными оценками. *, P <0,01 и **, P <0,001 (против контроля [CON]).

Dvl является необходимым промежуточным звеном в передаче сигналов как канонических, так и неканонических путей Wnt (Boutros et al., 1998; Logan and Nusse, 2004). По-видимому, выбор любого сигнального пути зависит от доступности конкретных доменов Dvl DIX, PDZ и DEP (Axelrod et al., 1998; Boutros et al., 1998; Li et al., 1999; Wang et al. ., 2006). Хотя DIX и PDZ в основном участвуют в канонической передаче сигналов, DEP, по-видимому, требуется для неканонических функций (Axelrod et al., 1998; Boutros et al., 1998; Moriguchi et al., 1999; Wang et al., 2006). Чтобы показать, что активация RhoA и Rac1 в hPAEC связана с BMP-2 через Dvl, мы трансфицировали конструкторы Dvl с меткой GFP, содержащие различные усеченные версии белка (рис.6 A), и оценили их влияние на активацию RhoA-Rac1. Как показано на фиг.6 (B и C), клетки, трансфецированные Dvl-GFP дикого типа (WT) или DDL-DFP, демонстрируют повышенную активность RhoA и Rac1 при стимуляции BMP-2. Тем не менее, в клетках, трансфицированных DDL-GFP-трансфецитом, имеются данные о притупленной активации RhoA и неспособности активировать Rac1. В DEP + Dvl-GFP также не наблюдается значительного увеличения RhoA с стимуляцией BMP-2; хотя базовые уровни активного Rac1 повышены, дальнейшее увеличение с BMP-2 не происходит. Это указывает на то, что в дополнение к домену DEP домен PDZ необходим для активации нормальной активности RhoA-Rac1 в ответ на BMP-2.

BMP-2 набирает домены PDZ и DEP Dvl для активации RhoA и Rac1 и индуцирует подвижность hPAEC. (A) Диаграмма, иллюстрирующая структуру четырех конструкций Dvl-GFP, используемых в экспериментах, описанных в этом исследовании. (B и C) Dvl, проиллюстрированные в A, были индивидуально нуклеофицированы в hPAECs для оценки воздействия на активацию RhoA (B) и Rac1 (C) в присутствии 10 нг / мл BMP-2. Эксперименты с вытяжкой выполнялись и анализировались, как показано на рис. 5. Таблицы ошибок обозначают среднее ± SEM для трех разных экспериментов с трехкратными оценками. *, P <0,01 и **, P <0,001 (против контроля [CON]). (D) Анализ миграции микроскопов буфера hPAECs, нуклеотидированных конструкциями Dvl, и подвергался воздействию BMP-2, как в A. ***, P <0,0001 (против WT и ΔDIX не стимулировали). (E) Репрезентативные конфокальные изображения hPAECs с нуклеотидной обработкой GFP-метками Dvl-конструкций. Клетки замораживали в течение 24 ч и инкубировали с BMP-2, как в B. Actin маркировали Alexa Fluor 555-phalloidin (красный), а ядра окрашивали DAPI (синий). Количественное определение распределения Dvl в цитоплазме и периферии проводили, как описано в Материалах и методах. ***, Р <0,0001 (по сравнению с базовой линией). (D и E). Бары ошибок обозначают среднее ± SEM для трех разных экспериментов с четырьмя оценками. Бары, 10 мкм.

Мы оценили подвижность клеток в hPAEC, трансфицированных конструкциями Dvl-GFP, высеянных на шарики из микроносителей и подвергавшихся воздействию BMP-2 в течение 48 часов. Клетки, несущие либо конструкцию WT Dvl-GFP, либо ΔDIX Dvl-GFP, показали значительную миграционную реакцию на BMP-2 по сравнению с нестимулированными клетками (фиг.6D). Как и предсказывали наши предыдущие эксперименты, этого не происходило в клетках, трансфицированных DEP + или DEP Dvl-GFP. Чтобы показать, что эффекты конструкций Dvl не зависели от сигнализации β-C, мы исследовали лизаты BMP-2-стимулированных hPAECs, трансфецированных каждой из конструкций Dvl для изменения накопления β-C. Мы не обнаружили ухудшения ответа β-C в любых экспериментальных условиях, что свидетельствует о том, что каноническая сигнализация не требуется для модуляции подвижности hPAEC (рис. S5 A, доступный по адресу http://www.jcb.org/cgi/ содержание / полный / jcb.200806049 / DC1).

Несколько доказательств свидетельствуют о том, что участие в сигнале RhoA-Rac1 требует переноса Dvl на клеточную мембрану для участия в сигнальных комплексах (Yu et al., 2007). Чтобы представить доказательства, подтверждающие эту функцию в hPAEC, мы использовали иммунофлуоресценцию и конфокальную микроскопию для выявления изменений в Dvl после стимуляции BMP-2 и Wnt3a и обнаружили, что распределение Dvl изменяется, чтобы ввести филоподии и ламеллиподии после стимуляции BMP-2 и Wnt3a (рис. S5B).

Конфокальные изображения клеток, трансфецированных WT, и мутантные GFP-меченые конструкции были использованы для изучения периферической и центральной локализации Dvl в ответ на стимуляцию BMP-2 и были количественно определены, как описано в Материалах и методах (рис.6 E). После стимуляции BMP-2 как WT Dvl-GFP, так и DIX Dvl-GFP (фиг.6 E, зеленый) распространяются на ламеллиподии и филоподии и совместно распределяются с актином на клеточной мембране (фиг.6 E, желтый); то есть значительное увеличение периферийного распределения по центру Dvl очевидно. BMP-2-стимулированные и нестимулированные hPAEC, трансфецированные ΔDEP Dvl-GFP, показывают дискретные флуоресцентные гранулы в перинуклеарном распределении с ограниченным образованием ламеллиподий (фиг.6 E) и не имеют периферического перераспределения. Клетки, трансфицированные конструкцией DEP + Dvl-GFP, демонстрируют интенсивное периферическое перераспределение Dvl на клеточных мембранах, но образование ламеллиподий притупляется, а филоподии не наблюдаются.

Чтобы показать, что перемещение Dvl требуется для моторики hPAEC, индуцированной BMP-2, hPAEC, трансфицированные конструкциями Dvl-GFP, высевали в боросиликатные стерильные двухкамерные слайды с плотностью 15 000 клеток на лунку. Используя временную видеомикроскопию, мы следили за движением клеток, трансфицированных Dvl-GFP в течение> 10 ч. BMP-2-стимулированные hPAEC двигались быстрее и покрывали большее расстояние по сравнению с нестимулированными элементами управления (рис.7, A и C). Захваченные изображения также показывают, что в присутствии BMP-2 Dvl-GFP переходит в мигрирующий передний конец клеток и концентрируется в местах, богатых филоподами и ламеллиподиями (фиг.7А и видео 1 и 2, доступный по адресу http: //www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806049/DC1). Эта функция теряется в BMP-2-стимулированных мутантных DEP-Dvl-GFP-трансфицированных клетках (фиг.7В и видео 3 и 4). Эти клетки также не могут увеличить пройденное расстояние и скорость, несмотря на стимуляцию BMP-2 (фиг.7С).

BMP-2 облегчает перераспределение Dvl в филоподии и ламеллиподии в hPAEC. (A и B). Живые изображения, полученные за 10-часовой период клеток, нуклеофагированных Dvl-GFP (A) или DEP Dvl-GFP (B), и стимулировали либо с помощью транспортного средства, либо с помощью 10 мкг / мл BMP-2. Стрелки указывают на отмеченное присутствие сигнала GFP в переносимом переднем конце трансфицированных Dvl-GFP клеток, инкубированных с BMP-2. См. Видеоролики 1-4 (см. Http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806049/DC1). (C) Расстояние и скорость контроля и BMP-2-стимулированные клетки, трансфицированные Dvl-GFP и ΔDEP Dvl-GFP. Расстояние измеряли путем построения координат ядер ядра каждые 10 мин в течение 10 ч и добавления расстояния между точками. Скорость рассчитывалась путем деления расстояния по времени (10 ч). Строки ошибок обозначают среднее ± SEM для трех разных экспериментов с трехкратными оценками. ***, P <0,001 (по сравнению с базовой линией). Бары, 10 мкм.

Осталось определить, как BMP-2 может регулировать Dvl-опосредованную активацию RhoA и Rac1. Недавнее исследование стромальных клеток костного мозга показало, что Smad1, один из трех Smads, ассоциированных с сигнализацией BMP, может взаимодействовать с Dvl и подавлять каноническую активность Wnt, предпочтительно отделяя Dvl от белков, которые способствуют фосфорилированию β-C ( Liu et al., 2006). Поскольку BMP-2 опосредует активацию Smad1 в аортальных и пупочных ВЭВ человека (Langenfeld and Langenfeld, 2004), мы предположили, что в hPAEC BMP-2 регулирует активность Dvl через Smad1. Поэтому мы трансфицировали hPAECs конструкцией, кодирующей доминантно-негативный Smad1 (ΔSmad1), и исследовали, будет ли это мешать активации и подвижности RhoA-Rac1, опосредованной BMP-2. Этот мутант Smad1 содержит замену четырех аминокислот, SSVS на AAVA, в экзоне 7 на C-конце и, следовательно, не может быть фосфорилирован; эта же конструкция также не может связываться с Dvl в анализах иммунопреципитации (Liu et al., 2006). Анализы пробоя показывают, что при установке ΔSmad1 hPAECs, стимулированные BMP-2, не могут активировать RhoA или Rac1 (фиг.8А). В соответствии с этим наблюдением анализы на основе микроносителей показывают, что hPAECs, экспрессирующие ΔSmad1, также не могут мигрировать в ответ на BMP-2 (фиг.8B), что также подтверждает необходимость функционального Smad1.

Набор Dvl по BMP-2 требует Smads и не зависит от функционального статуса BMPRII. (A) Проводили эксперименты по вытягиванию активного RhoA и Rac1 на hPAEC, нуклеотидированные либо с векторной, либо с доминантно-отрицательной (Δ) Smad1-конструкцией и инкубированные с 10 нг / мл BMP-2, как описано на фиг.6 **, P < 0,001 (против контроля [CON]). (B) Анализ на микрошарие с использованием hPAECs, нуклеотированных с вектором (V) или ΔSmad1, был выполнен, как на фиг.6 D. ***, P <0,0001 (по сравнению с контролем); ##, P <0,001 (против вектора, только стимулированного BMP-2). (C) Западные иммуноблоты BMP-2-стимулированных hPAEC, трансфецированных BMPII siRNA или беззахватной контрольной siRNA. Клявки исследовали для фосфорилирования и общего Smad1 и -3. **, P <0,001 и ***, P <0,0001 (против контроля). (D) Западные иммуноблоты hPAEC, трансфецированные siRNA как для BMPRII, так и для ActRIIa, с последующей стимуляцией 10 нг / мл BMP-2 в течение 1 часа. Клявки исследовали для фосфорилирования и общего Smad1 и -3. **, P <0,001 и ***, P <0,0001 (против контроля). (E) Анализ микрошарных гранул с использованием hPAECs, нуклеотидированных с BMPII siRNA, вместе с векторным или доминантно-отрицательным Smad3 (ΔSmad3). **, Р <0,001 (BMP-2-стимулированный вектор или ΔSmad3 по сравнению с соответствующим нестимулированным контролем RNAi); +++, Р <0,0001 (BMP-2-стимулированный или нестимулированный вектор BMPRII RNAi или ΔSmad3); ###, P <0,0001 (вектор против ΔSmad3). Строки ошибок обозначают среднее ± SEM для трех разных экспериментов с трехкратными оценками.

В клетках с уменьшенным BMPRII усиленная миграция в ответ на BMP-2 предложила альтернативный путь передачи сигналов, что привело к увеличению неканонической активности. Хотя активация Smad1 / 5/8 заметно снижается при настройке мутаций BMPRII (Yang et al., 2005), BMPs все еще могут сигнализировать в SMC с человеческими легочными артериями путем набора BMPRIA и ActRIIa, другого члена семейства рецепторов TGF-β (Yu et al., 2005). Известно, что ActRs сигнализируют с помощью Smad2 и -3. Более того, Smad3 может взаимодействовать с Dvl в клетках млекопитающих (Warner et al., 2005). Поэтому мы предположили, что в условиях снижения доступности BMPRII BMP-2 все еще может набирать Dvl, активируя Smad3.

Мы показываем, что в BMPRII-дефицитных клетках BMP-2 не активирует pSmad1, а активирует pSmad3 (фиг.8C). Чтобы связать активацию Smad3 с сигнализацией через альтернативный рецептор рецептора BMP-2 ActRIIa, мы заразили siRNA для BMPRII и ActRIIa (или беззатратного контроля) в hPAEC и собирали лизаты клеток в течение 1 часа. Мы достигли 80% нокдауна ActRIIa, что сопоставимо с BMPII (неопубликованные данные). BMP-2-опосредованная активация Smad3 теряется в клетках, дефицитных как в BMPRII, так и в ActRIIa (фиг.8D).

Чтобы проверить функциональную значимость этого альтернативного пути при сохранении BMP-2-опосредованной миграции hPAEC, мы трансфицировали hPAECs либо доминантно-отрицательным Smad3 (ΔSmad3), либо пустым вектором. Этот ΔSmad3 был показан в одном исследовании, чтобы он не мог взаимодействовать с Dvl или фосфорилироваться с помощью рецепторов TGF-β (Warner et al., 2005). Тесты на микрочиповые шарики показывают, что клетки, содержащие как нокдаун BMPRII, так и ΔSmad3, не смогли реагировать на стимуляцию BMP-2, тогда как те клетки с нокдауном BMPRII проявили повышенную подвижность (рис.8 E). Таким образом, при установке уменьшенного BMPRII активация Smad3 с помощью BMPRII-независимых путей компенсирует уменьшенную сигнализацию Smad1 для сохранения подвижности hPAEC.

Ангиогенез требует скоординированной пролиферации, миграции и выравнивания эндотелия для формирования функциональных трубчатых структур (Adams and Alitalo, 2007). Подходы современной клеточной культуры не могут полностью воспроизвести сложную биологическую среду, в которой происходит рост сосудов. По этой причине мы применили хорошо разработанный анализ ангиогенеза для изучения влияния опосредуемой BMP-2 канонической и неканонической сигнализации у неповрежденной мыши (Skovseth et al., 2002, 2007). Мы имплантировали пробирки Matrigel, содержащие hPAEC, трансфецированные либо c-РНК β-C, либо безглазничную siRNA у мышей SCID, а спустя 14 дней оценивали образование микрососудов, присутствие гибридных эндотелиальных трубок мышиного человека и количество мышиных и человеческих EC в пределах (см. Материалы и методы). По сравнению с исходным уровнем (рис.9, А и Е), обогащенные BMP-2 пробки Matrigel (фиг.9, B и F), содержащие hPAEC, трансфецированные неаргирующей siRNA, показали большее количество как hPAEC, так и мышиных EC (фиг.9 I ). Кроме того, сосудистые трубки, состоящие из как мышиных, так и человеческих клеток (среднее из двух пробирок на 40 × сильное поле) и микрососудов, содержащих эритроциты (в среднем от двух до трех микрососудов на поле с высокой мощностью 40 ×), были исключительно видны в этом экспериментальном группы (фиг.9, B и F). Напротив, обогащенные BMP-2 пробки Matrigel, содержащие β-C-дефицитные клетки (фиг.9, C и G), не показали ни гибридных микрососудов, ни расширения hPAEC. Интересно отметить, что в этих пробок количество ЭВ мышей увеличилось в ответ на БМП-2 (рис. 9 I).

Набор для канонических и неканонических сигнальных путей необходим для образования микрососудов, индуцированных BMP-2, у мышей SCID. (A-H). Представленные изображения иммунофлуоресценции (A-D) и H & E (E-H) показывают появление нестимулированных (A и E) и BMP-2-стимулированных (B и F) контролей и β-C RNAi-обработанных ( C и G) и ΔDEP Dvl-трансфецированные (D и F) клетки через 14 дней после имплантации в мышей SCID. Человеческий и мышиный CD31 помечены соответственно зелеными и красными флуоресцентными антителами, а ядра окрашены в синий цвет с помощью DAPI. Гибридные сосуды, содержащие зеленые и красные EC (B) в сочетании с RBC-наполненными сосудами (F), наблюдаются в условиях стимуляции BMP-2 (стрелки), но не тогда, когда hPAECs трансфицировали β-C RNAi (C и G) или с ΔDEP (D и H). (I и J). Количественный анализ среднего количества человеческих (H) и мышиных (M) клеток, обнаруженных на 40 × поле. Проводились сравнения между неиммулированным контролем и β-C RNAi-обработанным (I) или ΔDEP-трансфицированным (J) по сравнению с BMP-2-стимулированными аналогами. Строки ошибок обозначают среднее ± SEM для четырех разных экспериментов. *, P <0,01; **, P <0,001; ***, P <0,0001 (по сравнению с тем же контролем линии [CON], человека или мыши). ##, P <0,001; ###, P <0,0001 (человеческий против мышиного). +++, P <0,0001 (специфическое для линии управления и экспериментальное [βC RNAi или ΔDEP]). Бары: (A-D) 10 мкм; (E-H) 30 мкм.

Чтобы изучить влияние дисфункциональной неканонической передачи сигналов Wnt на ангиогенез, мы внедрили пробирки Matrigel, содержащие hPAEC, трансфицированные доминантно-отрицательной Dvl-конструкцией ΔDEP в мышей SCID. Через 14 дней, несмотря на значительный ответ роста роста мыши и человека на BMP-2 по сравнению с нестимулированным контролем, не было обнаружено никаких признаков образования микрососудов или гибридных труб (рис.9, D, H и J). В совокупности эти эксперименты показывают, что in vivo BMP-2 стимулирует ангиогенную реакцию путем набора канонических и неканонических сигнальных путей Wnt.

Потеря небольших предкапиллярных артерий является отличительной чертой IPAH и вторичных форм PAH и, как полагают, является результатом травмы и восприимчивости EC к апоптозу. Предыдущие исследования связывают потерю BMPRII с развитием IPAH и склонностью EC к апоптезе (Teichert-Kuliszewska et al., 2006; Masri et al., 2007). В нашем исследовании рассматривается, почему это происходит, и могут ли те же механизмы объяснять другие функции, необходимые для регенерации сосудов, то есть пролиферацию и миграцию. В этом исследовании мы впервые сообщаем, что лиганд BMPRII набирает канонический сигнальный путь Wnt для продвижения выживаемости и пролиферации hPAEC путем активации ERK1 / 2 и стимулирует Dvl-опосредованный неканонический RhoA-Rac1 путь для индуцирования миграции путем активации Smad1. Помимо выявления механизмов, которые связаны с потерей сосудов у пациентов с ИФА, эти результаты могут помочь лучше понять аберрантный ангиогенез при таких нарушениях, как злокачественность, и могут привести к новым возможностям стимулировать рост новых кровеносных сосудов при заболеваниях и регенерации тканей.

Потеря EC в больших артериях была связана с стимуляцией пролиферации SMC посредством высвобождения активного TGF-β (Sakao et al., 2006). Кроме того, появление устойчивых к апоптозу ЭЦ, которые размножаются и переносятся гораздо более надежно, чем EC здоровых доноров (Masri et al., 2007), могут объяснить аберрантный ангиогенез в просвете и адвентицию сосудов с плексогенной обструктивной артериопатией в передовой IPAH. Тем не менее, клетки из пациентов с ИЛАГ нарушаются в их способности образовывать тубулярные структуры в культуре (Date et al., 2004; Masri et al., 2007), и это может объяснить их неспособность воссоздать потерянный дистальный легочный сосудистый слой. В неопубликованных данных мы имеем доказательства того, что эти устойчивые к апоптозу EC могут иметь конститутивную сигнализацию через β-C, как это происходит с онкогенным β-C (Peifer, 1997).

Хотя наше исследование показывает, что pERK1 / 2, а не pSmad1 / 5/8 или pSmad2 / 3, необходим для накопления β-C, он не исключает возможности того, что другие сигнальные молекулы, активированные или ингибируемые BMP, могут также играть роль в опосредующего накопление β-C. Помимо pERK1 / 2 (Ding et al., 2005), BMP могут запускать независимую от Smad сигнализацию с использованием киназных путей, таких как JNK, которые могут также нацеливаться на GSK3-β для ингибирования (Moule et al., 1997; Cohen and Frame, 2001; Ding et al., 2005). Было также показано, что сигнализация BMP активирует MAPK TAK1 (Yamaguchi et al., 1995), который нацелен на NEMO-подобную киназу (NLK), эндогенного ингибитора канонической передачи сигналов Wnt, которая действует путем вмешательства в связывание ДНК β-C-TCF транскрипционный комплекс (Ishitani et al., 1999, 2003). Хотя наши результаты подтверждают способность BMP-2 повышать активность β-C в hPAEC, возможно, что ось BMP-TAK1-NLK может действовать для модуляции транскрипционных ответов, чтобы предотвратить чрезмерную экспрессию гена и тонко настраивать биологические эффекты. Дальнейшие исследования должны быть направлены на исследование степени, в которой киназы, отличные от MAPK, или регулирование оси NLK-TAK1 могут модулировать опосредованную BMP-2 активацию канонической передачи сигналов Wnt.

Предыдущие работы по передаче сигналов BMP были сфокусированы на pSmad-зависимой транскрипции генов, таких как индийский ежик (Seki and Hata, 2004), Tlx2 (Tang et al., 1998) и ингибитор дифференцировки (Miyazono and Miyazawa, 2002), которые участвующих в регуляции клеточных процессов, связанных с ангиогенезом. Способность активировать β-C предполагает, что BMPs могут вызывать более широкий набор генных мишеней, чем считалось ранее. Это согласуется с нашим нахождением, что как BMP-2, так и Wnt3a увеличивают c-myc, VEGF, сурвивин и cyclin D1, которые являются белками, которые опосредуют выживаемость и пролиферацию hPAEC. Вполне вероятно, что взаимодействие между β-C и pSmad1 / 5/8 и, возможно, другими BMP-опосредованными факторами транскрипции, такими как рецептор-активированный пролифератором пероксисом (Hansmann et al., 2007), регулирует профиль экспрессированных генов (Labbe et al. ., 2000; Ху и Розенблюм, 2005). Также возможно, что существует связь между BMP и Wnt для ограничения уровня экспрессии генных мишеней, когда присутствуют оба агониста, или чтобы генная экспрессия сохранялась, несмотря на потерю функциональных мутаций в BMPRII. Таким образом, гаплоинтенсивность BMPRII может стать более проникающей, когда сопутствующие изменения в сигнале Wnt.

Направленная миграция необходима для того, чтобы EC сходились на участках, где необходимо создать суда (Adams and Alitalo, 2007). Предыдущие исследования показывают, что BMP-2 индуцирует эндотелиальную миграцию и образование сосудистой трубки, но без дальнейшего изучения задействованных механизмов (Deckers et al., 2002; Langenfeld and Langenfeld, 2004). Недавние исследования, описывающие взаимодействия между цитоплазматическим хвостом BMPRII и белками, участвующими в регуляции динамики цитоскелета, такие как LIMK (Foletta et al., 2003) и Tctex-1 (Machado et al., 2003), указывают на функциональную связь между сигналами BMP и подвижность клеток. Было бы интересно исследовать в будущих исследованиях, будет ли взаимодействие с цитоскелетом и с LIMK потеряно в мутантах BMPRII, поскольку никакие функциональные исследования еще не связывали это с изменениями подвижности клеток.

Наши эксперименты, демонстрирующие повышенную миграцию hPAEC в ответ на BMP-2 и Wnt3a, предполагали, что оба лиганда могут использовать не-β-C-зависимый путь передачи сигналов Wnt. Wnt3a может набирать Dvl для активации RhoA и Rac1 (Kishida et al., 2004; Endo et al., 2005), которые представляют собой небольшие GTPases, которые координируют функции подвижности клеток (т. Е. Цитоскелетные перегруппировки, которые позволяют ретракцию основания клетки и расширение переднего фронта через образование ламеллиподий и филоподий).

Это исследование показывает не только то, что Dvl набирается BMP-2, но этот процесс зависит от pSmad. Высококонсервативные PDZ и DEP-домены в Dvl, которые ранее были идентифицированы в Drosophila melanogaster, как требуется для передачи сигналов RhoA-Rac1 и подвижности клеток (Axelrod et al., 1998; Wang et al., 2006), необходимы для BMP-2 для индуцирования hPAEC миграция. Таким образом, потенциальный способ, с помощью которого pSmads мог бы модулировать переход между канонической и неканонической сигнализацией, заключался бы в их способности взаимодействовать с DIX-доменом Dvl. Это ограничило бы взаимодействие Dvl с белковыми партнерами, необходимыми для активации β-C, при воздействии доменов PDZ и DEP для активации активации RhoA-Rac1 и подвижности клеток.

Как Dvl разделяется между канонической и неканонической сигнализацией, в настоящее время не известно, но возможно, что взаимодействие между Dvl и pSmads происходит в другом субклеточном кубе, разделяющем этот пул Dvl от доступного для канонической активности. В соответствии с этой идеей наблюдается наблюдение, что Dvl накапливается либо в везикулах (Capelluto et al., 2002), либо ассоциируется с актином (Torres and Nelson, 2000).

Неожиданным было обнаружение того, что BMP-2 может контролировать подвижность, несмотря на сокращение BMPRII. Мы обнаружили, что, когда BMPRII отсутствует, BMP-2, используя рецепторные комплексы, содержащие BMPRIA / B и TFF-рецептор-суперсемейный ActRIIa, сигнализирует через Smad2 / 3, чтобы сохранить подвижность в hPAEC. Аналогичное взаимодействие BMPRIA с ActRIIa наблюдалось при делеции BMPRII в легочных артериальных SMC (Yu et al., 2005), но функциональные последствия измененной сигнализации не были исследованы. Мутации в рецепторах TGF-β также могут способствовать развитию ЛАГ у пациентов с геморрагической наследственной телеангиэктазией (Cottin et al., 2007). Однако неясно, являются ли мутации в других членах суперсемейства TGF-β рецепторов склонностью к ПАУ при потере функции BMPRII. В EC, выделенных из плексогенных поражений, было обнаружено снижение TGF-β-RII, что указывает на то, что аномальная передача сигналов через этот рецептор может способствовать развитию сосудистой патологии (Yeager et al., 2001).

Было бы интересно дополнительно исследовать роль рецепторов полярности плоских клеток в опосредованных BMP-2- и Wnt3 неканоническом сигнале Dvl-RhoA-Rac1 для оценки того, является ли этот путь важным для установления полярности ЕС и при наборе перицитов и являются ли эти особые особенности зависят от BMPRII. Этот путь имеет решающее значение для сходящегося расширения; т.е. медиальной конвергенции и интеркаляции удлиненных мезенхимных клеток вдоль переднезадней оси, что приводит к удлинению и сужению оси тела. Действительно, упорядоченный разветвляющийся морфогенез, наблюдаемый при нормальном ангиогенезе в легких и в других тканях, сильно указывает на то, что может присутствовать сигнализация полярности плоских клеток (Lamalice et al., 2007).

На рисунке 10 показаны наши предлагаемые модели того, как BMP-2 рекрутирует каноническую сигнальную Wnt, чтобы способствовать росту и выживаемости hPAEC (рис. 10 A) и неканонической сигнализации, чтобы вызвать подвижность (рис. 10 B). Наши эксперименты показывают, как BMPs регулируют основные функции EC, необходимые для нормального ангиогенеза, путем набора двух сигнальных путей Wnt. Эта передача сигналов BMP и Wnt в ангиогенезе согласуется с замечанием о том, что удаление Frizzled 5 (Ishikawa et al., 2001) или целенаправленная эндотелиальная делеция BMPRIA (неопубликованные данные) приводят к ранней эмбриональной летальности, связанной с глубоким дефектом в сосудистой сети желточного мешка , Хотя известно, что BMP может подавлять Wnt5a (Suzuki et al., 2003), теперь также следует учитывать, что эти лиганды регулируют обычную трактовку тонкой настройки экспрессии генов и клеточной функции.

Схема, иллюстрирующая, что регулирование распространения, выживания и миграции в hPAEC зависит от перекрестного разговора между путями BMP и Wnt. (A) BMP-2 и Wnt3a способствуют увеличению β-C-опосредованной транскрипционной активности и повышающим регуляцию генных мишеней, вовлеченных в пролиферацию и выживание. (B) Однако миграция является результатом Smad1 или, с уменьшенным BMPRII, зависимым от Smad3 набором Dvl, который позволяет избирательно активировать RhoA, Rac1 и нисходящие мишени, связанные с реорганизацией цитоскелета и подвижностью клеток.

Рекомбинантные BMP-2 человека, α-тубулиновые антитела, коктейль ингибитора протеазы и коктейль I и II ингибитора фосфатазы были приобретены у Sigma-Aldrich. PD98059 получали из EMD. Рекомбинантные мышиные Wnt3a и VEGF человека были приобретены у R & D Systems. Для Invitrogen были получены FBS, PBS, MEM, оптимизированная MEM, средняя 200, небольшая добавка для роста сыворотки, гентамицин / амфотерицин, мембраны из поливинилидендифторида, Lipofectamine 2000, пролонгированная золотая антифауда с DAPI и Alexa Fluor 488- и 592-меченые антитела. Анти-VEGF и антисурвивин были получены от Abcam. Анти-Dvl-антитело было получено от Santa Cruz Biotechnology, Inc. Антициклин D1, Anti-pERK1 / 2 и -total ERK½ и GSK3-β были получены из технологии Cell Signaling. В Millipore были приобретены активные β-C, Rac1 и RhoA-антитела, система анализа репортеров TCF и реагенты для анализа RhoA и Rac1. Нуклеофектор II и реагенты были приобретены у Amaxa, Inc. Анти-c-myc антитело и обработанные тканевой культурой слайды были получены из BD. Бусины Cytodex 3, HRP-конъюгированные кроличьи и мышиные вторичные антитела, а также комплекты ECL и ECL Plus были заказаны у GE Healthcare. Двойной набор люциферазы и каспазы 3/7 был получен от Promega. Покровные стекла Labtek II и все дуплексы siRNA были приобретены у Thermo Fisher Scientific.

Первичные hPAECs из крупных сосудов (Invitrogen и ScienCell) выращивали в средах ЕС, дополненных 2% FBS, 1 мкг / мл гидрокортизона, 10 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг / мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг / мл гепарин и гентамицин / амфотерицин, субкультивированные при соотношении 1: 4 в чашках 100 мм (Corning) и используемые в проходах 4-8. Клетки были истощены в среде 200 с 0,1% FBS и гентамицином / амфотерицином в течение 24 часов перед добавлением агониста или носителя. Избежание изменений среды позволяет последовательно определять пролиферацию β-C и EC в ответ на дозу использованного BMP-2.

hPAECs высевали на 25 000 клеток на лунку на 24-луночные планшеты в среде для роста и оставляли на ночь. Клетки промывали три раза PBS и инкубировали в среде для голодания в течение 24 часов с последующей стимуляцией агонистами в течение 24 часов. Клетки трипсинизировали и подсчитывали в гемоцитометре (Bright-Line, Hausser Scientific).

Для анализов каспазы 3/7 клетки высевали на 96-луночный планшет (4 лунки на состояние и 5000 клеток на лунку), оставляли на ночь и инкубировали в течение 24 часов в бессывороточной среде для индукции апоптоза в присутствии или отсутствие BMP-2 или Wnt3a. Клетки инкубировали в течение 1 часа в 100 мкл Caspase 3/7 Luciferase Reagent Mix (Promega), и общую люминесценцию измеряли в люминометре 20/20 (Turner Biosystems, Inc.).

Гранулы клеточной культуры Cytodex 3 суспендировали в 1 × PBS, автоклавировали и осторожно перемешивали в чашках Петри, содержащих 10 мл клеточной среды, с последующим осторожным перемешиванием. Затем добавляли 1 мл hPAEC (105 клеток / мл) и инкубировали в течение ночи, чтобы обеспечить прикрепление к шарикам. После того, как клетки выросли до слияния над шариками, к раствору, содержащему MEM и витронектину, pH 7,6, добавляли 1 мл гранул с покрытием, которые можно было отверждать. Клетки инкубировали в течение 30-60 мин с последующим добавлением 1,5 мл клеточной среды с агонистом или без него к поверхности каждого геля. Через 48 ч клеточную миграцию определяли количественно путем деления каждого блюда на четыре квадранта и отбора трех гранул в каждом для дальнейшего анализа. Миграция определялась количественно расстоянием, которое каждая ячейка перемещалась от центра борта. Среднее расстояние, пройденное на квадрант, затем использовалось для вычисления среднего расстояния, перемещаемого клетками в каждой пластине. Использовался микроскоп (DMRIRBA, Leica) с головным переключателем канала Plan Apochromat 40 × NA 0.85.

Клетки высевали в четырехкамерные стекла из полистирольного стекла (15 000 клеток на камеру). Для экспериментов по стимуляции клетки подвергали голоданию в течение 24 часов и стимулировали BMP, как указано в легендах фигуры. Затем клетки фиксировали в течение 10 мин в 4% параформальдегиде, а затем три промывки с PBS. Для экспериментов с нативным распределением Dvl в hPAECs клетки пермеабилизировали ледяным 1 × PBS, содержащим 0,1% Triton X-100 и ослиной сывороткой в ​​течение 20 минут, а затем инкубацией в течение ночи с козьим анти-Dvl (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) при RT, промывали в 1 × PBS и инкубировали с ослиным антикоагульным антителом Alexa Fluor 555 (Invitrogen) в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем меченым флаконом с флавоидином Alexa Fluor 488 в течение 20 мин для окрашивания актиновых филаментов. Для экспериментов с клетками, обработанными нуклеотидами с различными конструкциями Dvl с маркировкой GFP, окрашивание актином проводили путем инкубации Alexa Fluor 555-phalloidin (Invitrogen) в течение 20 минут после проницаемости с 0,1% Triton X-100 в PBS. Перед монтажом слайды обрабатывали раствором Gold Antifade, содержащим DAPI, и хранили при 4 ° C до анализа.

Конфокальный анализ проводился на конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе (SP2 AOBS, Leica) с использованием переключателя канала Plan Apochromat 63 × NA 1.32-0.60 для определения областей, представляющих интерес для слайдов, и получение изображения выполнялось с использованием конфокальной сборки 1347 (версия 2.5, Leica), установленная на ПК Leica Confocal (операционная система Windows XP). Изображения обрабатывались и сохранялись в формате JPEG с помощью Photoshop Creative Suite 2 (Adobe Systems).

Для количественной оценки распределения GFP в PAEC, трансфицированных различными конструкциями Dvl, интенсивность сигнала GFP в клеточных процессах и перинуклеарная область измерялась в шести случайно выбранных секторах с использованием программного обеспечения ImageJ (National Institutes of Health). Среднее значение было рассчитано, а отношение периферийной к центральной интенсивности GFP составлено и использовано для статистического анализа. Для каждого условия использовалось в общей сложности четыре ячейки. Результаты были проанализированы с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad Software, Inc.).

hPAEC промывали три раза ледяным 1 × PBS, и лизаты готовили добавлением буфера для лизиса для буферизации (10 мМ Tris HCl, 1% SDS и 0,2 мМ PMSF), содержащего ингибиторы протеазы и фосфатазы, соскабливая в микроцентрифуге объемом 1,5 мл пробирке и кипячении в течение 10 мин перед центрифугированием. Супернатанты переносили в свежие микроцентрифужные пробирки и хранили при -80 ° С. Концентрацию белка определяли по анализу Lowry (Bio-Rad Laboratories). Равные количества белка загружали на каждую полосу 4-12% бис-трис-геля и подвергали электрофорезу в восстановительных условиях. После блоттинга мембраны из поливинилидендифторида блокировали в течение 1 часа (5% сухого молока в 0,1% TBS / Tween) и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. Связывание вторичных HRP-антител визуализировалось ECL или ECL Plus. Нормализацию для полного клеточного белка осуществляли путем перерисовки мембраны моноклональным антителом мыши против α-тубулина (Sigma-Aldrich).

Плазмиды, кодирующие формы WT, ΔDEP, ΔDIX и DEP + Dvl, были связаны с тегом GFP и клонированы в векторах pCS, как описано ранее (Axelrod et al., 1998). Аденовирус, содержащий доминантно-отрицательную форму ERK1 / 2, был приобретен из биореакторов Seven Hills. Мутантные конструкции Smad1 и Smad3, содержащие три заместителя серина к аланину в их С-концевой последовательности и клонированные в векторах pCMV5, были предоставлены J. Massague (Memorial Sloan-Kettering Institute, Нью-Йорк, Нью-Йорк). Трансфекцию плазмид проводили с использованием Nucleofector II (программа T-23) с комплектом Nucleofection Basic Endothelial Cell (Amaxa, Inc.). Все эксперименты проводились через 24 часа после нуклеофекции.

Для достижения нокдауна гена, siRNA-дуплексы, специфичные для β-C (On-Target Plus, Invitrogen, GenBank / EMBL / DDBJ, № NM_001012329 и NM_020248), ActRIIa (On-Target Plus; Invitrogen; GenBank / EMBL / DDBJ. NM_001616) и BMPRII (On-Target Plus, Invitrogen, GenBank / EMBL / DDBJ, № NM_001204) были трансфицированы в PAEC с использованием нуклеофекции, как описано в предыдущем разделе. Эффективность нокдауна оценивали через 48 часов после нуклеофекции путем измерения уровней белка в клеточных лизатах с использованием западного иммуноблота.

Для измерения β-C-опосредованных изменений экспрессии генов мы использовали репортерный анализ TOPflash / FOPflash TCF / LEF. Конструкция TOPflash содержит промотор с восемью доменами связывания TCF / LEF1, обнаруженными в промоторах генов-мишеней β-C, связанных с геном люциферазы, тогда как конструкция FOPflash имеет мутированные сайты связывания и служит отрицательным контролем. hPAECs трансфицировали либо плазмидой в Nucleofector II (программа T-23) с использованием набора базовых эндотелиальных клеток. Через 24 часа в среде для голодания клетки стимулировали, а производство люциферазы измеряли через 6 часов в люминометре с использованием набора Dual Luciferase (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Ренилла-плазмида (Promega) cotransfection была использована для контроля эффективности трансфекции.

hPAECs промывали три раза ледяной 1 × PBS. Клеточные лизаты были приготовлены путем добавления 500 мкл ледяного магниевого лизисного буфера (10 мМ Tris HCl, 1,0% SDS, 0,2 мМ PMSF и 100 × протезазы и ингибиторов фосфатазы, коктейли I и II, Millipore) в клетки и соскабливания в 1,5 мл микроцентрифужной пробирки на льду перед холодным центрифугированием при 14000 об / мин в течение 10 мин. Супернатанты переносили в свежие микроцентрифужные пробирки и хранили при -80 ° С.

Активные формы RhoA или Rac1 осаждали с использованием гранул глутатиона, содержащих рхотекин или PAK1, соответственно, согласно протоколу изготовителя (Millipore). Короче говоря, лизаты инкубировали с суспензией, содержащей гранулы глутатиона в течение 1 ч при 4 ° С с постоянным вращением. В конце этого периода шарики осаждали центрифугированием лизатов при 14000 относительной центрифугической силе в течение 20 с. После трехкратного промывания ледяным буфером бусины ресуспендировали в буфере Лаэмми, кипятили и подвергали анализу Западного иммуноблота, как описано выше.

Через 48 ч после трансфекции клеткам разрешалось прикреплять и распространять покровные стекла в инкубаторе и просматривать на перевернутом микроскопе (Axiovert 35; Carl Zeiss, Inc.) с масляной иммерсионной линзой Plan Apochromat 100 × (Carl Zeiss, Inc.) и конденсатор на короткое расстояние. Микроскоп также оснащен нагретой ступенью, дифференциальной контрастной оптикой и эпифлуоресценцией. Фильтры и световые дорожки контролировались колесом фильтра и жалюзи (Ludl Electronic Products Ltd.). Для визуализации GFP однополосный фильтр возбуждения для FITC использовался в комбинации с светоделителем Pinkel # 1 и фильтром выбросов (Chroma Technology Corp.). Тканевую культуральную среду без фенольного красного поддерживали теплым и забуференным в СО2-инкубаторе. Температуру ступени поддерживали при 37 ° С с помощью автоматического термостата. Изображения были собраны с использованием камеры с зарядовой связью (C2400, B & W) с интеграцией на кристалле и цифровым процессором изображения (Argus 20; PerkinElmer). Приобретенные изображения были собраны во временных последовательностях с использованием программного обеспечения Openlab (PerkinElmer) и сохранены в виде видеороликов QuickTime (Apple, Inc.). Расстояние, пройденное клетками, вычислялось путем регистрации положения ядра в отдельных кадрах с использованием программного обеспечения ImageJ и построения графика по оси x-y с последующим измерением расстояния между каждой из отдельных точек. Общее расстояние было получено из общей суммы этих значений. Скорость измерялась путем деления общего расстояния во времени (10 ч) с использованием следующей формулы: S = D / t, где S = скорость, D = расстояние и, t = время. Для каждого измерения использовалось всего четыре ячейки.

Эксперименты на животных были одобрены Институциональным советом Стэнфордского университета в соответствии с руководящими принципами Американского физиологического общества. Заготовки Matrigel, содержащие hPAEC, были приготовлены, как описано ранее (Skovseth et al., 2007), и через 48 ч после трансфекции ~ 1,0 × 106 клеток суспендировали в охлажденном 500 мкл / штепселе Матригеля Фактор роста Уменьшенный раствор (BD), к которому добавляли рекомбинантный Добавляли BMP-2 до конечной концентрации 10 нг / мл или носитель. Пробки были имплантированы в задней части SCID-мышей (Charles River Laboratories), анестезированных подкожной инъекцией коктейля кетамин / ксилазин. Для каждого экспериментального состояния каждому животному было имплантировано четыре пробки, и им оставалось оставаться на месте в течение 14 дней. В конце этого периода животных гуманно убивали, а твердые пробки Matrigel удаляли и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 часов и вставляли в парафин. Готовили секции гематоксилин и эозин (H & E). Образцы незапечатанной ткани были дважды помечены меченым Alexa Fluor 488 с анти-человеческим CD31 и меченым Alexa Fluor 555 с антимышиной CD31 с целью идентификации человеческих и мышиных EC соответственно, а также DAPI для окрашивания ядер. 10 изображений на слайд были захвачены с использованием 40 × объектива иммунофлуоресцентного микроскопа (DM RA2, Leica) и проанализированы с помощью программного обеспечения Openlab. Присутствие микрососудов (определяемых как трубки, заполненные красными кровяными клетками) было зарегистрировано с использованием разделов H & E, а количество человеческих и мышиных клеток на состояние было количественно определено с использованием вышеупомянутых методов иммунофлюоресценции.

Значения из нескольких экспериментов выражаются как среднее ± SEM. Статистическая значимость определялась с использованием одностороннего анализа дисперсии, за которым следуют многочисленные сравнительные тесты Бонферрони, если не указано иное. Значение P <0,05 считалось значимым. Количество экспериментов и номер выборки в каждой группе указаны в легендах фигур.

На рисунке S1 показаны полуколичественные данные RT-PCR для всех 19 известных лигандов Wnt, обнаруженных в hPAECs в начале исследования. На фиг.22 показаны конфокальные изображения hPAEC, стимулированных BMP-2 в течение 1 часа и помеченные первичным антителом, специфичным для β-C, и меченым Alexa Fluor 488 вторичным антителом. На фиг.53 показано, что hPAEC, обработанные с помощью BMPII siRNA, не могут накапливать β-C при стимуляции BMP-2, что коррелирует с неспособностью фосфорилировать как ERK1 / 2, так и GSK3-β. На фиг.54 показана потеря BMP-2-опосредованного накопления β-C и транскрипционной активности в присутствии доминантно-отрицательного ERK (ΔERK). На фиг.55 показано как отсутствие влияния мутантных Dvl-конструкций на BMP-опосредованное накопление β-C и периферическое перераспределение Dvl в BMP-2- или Wnt3a-стимулированных ПАЭ. Видео 1 и 2 показывают hPAEC, трансфицированные WT Dvl на базовой линии (видео 1) и в присутствии BMP-2 (видео 2). В видеороликах 3 и 4 показано, что hPAEC, трансфицированные ΔDEP, подвергаются тем же условиям, что описаны для видеороликов 1 и 2. Дополнительный материал в Интернете доступен по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200806049/DC1.

Мы хотели бы поблагодарить доктора Михала Бентал-Кроуд за ее неоценимую помощь в подготовке рисунков для этой рукописи и докторов. Роэл Нуссе, Дэвид Корнфилд и Гленн Розен в Стэнфордском университете за их полезные научные обсуждения. Мы также благодарим Qicong Hu, который помог в сжатии видеофайлов для этого представления.

Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья R01 HL074186 М. Рабиновичу и пожертвованием Центра стенокардии для легочных сосудистых заболеваний в Стэнфордском университете. Вице-адмирал de Jesus Perez был профинансирован как Национальным Институтом Здоровья T32 Training Grant, так и Американской Ассоциацией Постдокторской Ассоциации. J.D. Axelrod был поддержан Национальным институтом здоровья гранта R01GM059823. T.-P. Аластало финансировался последипломными стипендиями от Фонда Сигрида Юселиуса, Фонда Инструментария, Финского фонда сердечно-сосудистых исследований и Академии Финляндии.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *