Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Применение кофеина предотвращает воспаление сетчатки и потерю ганглиозных клеток сетчатки на животной модели глаукомы

Caffeine administration prevents retinal neuroinflammation and loss of retinal ganglion cells in an animal model of glaucoma
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4897621/

Глаукома — вторая ведущая причина слепоты во всем мире, характеризующаяся прогрессирующим повреждением зрительного нерва и потерей ганглиозных клеток сетчатки (RGCs), сопровождающаяся повышенной воспалительной реакцией с использованием микроглиальных клеток сетчатки. Этиология глаукомы пока неизвестна, и, несмотря на то, что повышенное внутриглазное давление (IOP) является основным фактором риска, точные механизмы, ответственные за дегенерацию RGC, остаются неизвестными. Кофеин, который является антагонистом рецепторов аденозина, является наиболее широко потребляемым психоактивным препаратом в мире. Несколько доказательств свидетельствуют о том, что кофеин может ослаблять нейровоспалительные реакции и защищать от повреждения центральной нервной системы (ЦНС). Мы использовали хорошо охарактеризованную животную модель глаукомы, чтобы исследовать, контролирует ли введение кофеина нейровоспламенение и вызывает нейропротекцию. Кофеин или воду вводили ad libitum, а глазную гипертензию (OHT) индуцировали лазерной фотокоагуляцией лимбальных вен у крыс Sprague Dawley. Здесь мы показываем, что кофеин способен частично уменьшать ВГД у глазных гипертензивных животных. Что еще более важно, мы обнаружили, что употребление кофеина предотвращает опосредуемый сетчаткой нейровоспалительный ответ, опосредуемый сетчаткой, и ослабляет потерю RGC у животных с окулярной гипертензией (OHT). Это исследование открывает возможность того, что антагонисты с кофеином или аденозиновым рецептором могут быть терапевтическим вариантом для управления потерей RGC при глаукоме.

Глаукома представляет собой группу прогрессирующих нейродегенеративных многофакторных заболеваний, характеризующихся потерей ганглиозных клеток сетчатки (РГК), раскопкой зрительного нерва и дегенерацией аксонов, что приводит к необратимой потере зрения1. Хотя этиология глаукомы до сих пор не полностью выяснена, первичным возрастом и повышением внутриглазного давления (ВГД) считаются основные факторы риска возникновения заболевания. Существующие в настоящее время методы лечения глаукомы направлены на сокращение ВГД, единственного изменяемого фактора риска2. Однако у нескольких пациентов болезнь все еще прогрессирует, несмотря на эффективный контроль ВГД. Поэтому необходимо разработать новые терапевтические стратегии, направленные на нейропротекцию RGCs3.

В настоящее время признано, что дегенерация RGCs в человеческой и экспериментальной глаукоме сопровождается нейровоспалительной реакцией, включающей клетки микроглии сетчатки и увеличение продуцирования медиаторов воспаления, таких как фактор некроза опухоли (TNF) и интерлейкин-1β (IL-1β) 4567. Кроме того, была описана и предложена ранняя и обостренная активация микроглиальных клеток сетчатки, что позволило внести вклад в дегенеративный процесс8910, предполагая, что контроль реактивности микроглии может предотвратить глаукоматозную потерю RGCs111213.

Аденозин A2A-рецептор (A2AR) является важной лекарственной мишенью в центральной нервной системе (ЦНС), поскольку было показано, что его блокада обеспечивает надежную нейропротекцию в различных ядовитых состояниях головного мозга, а именно через контроль за опосредованными микроглиами нейровоспалительными процессами14. Недавно мы показали, что блокада A2AR обеспечивает защиту RGCs от повреждений, вызванных повышенным гидростатическим давлением в органотипических культурах сетчатки15, а также в модели животных с высоким уровнем ИОП, индуцированных IOP-индуцированным I68. Мы также продемонстрировали, что блокада A2AR предотвращает реактивность микроглии сетчатки и связанный с ней нейровоспалительный ответ, что указывает на контроль опосредованного микроглиами нейровоспламенения в качестве механизма, управляемого антагонистом A2AR, для обеспечения защиты сетчатки16.

Кофеин — наиболее широко употребляемый психоактивный препарат в мире. В ЦНС эффекты, оказываемые кофеином, при нетоксичных дозах опосредуются антагонизмом аденозиновых рецепторов17. Кофеин, блокируя A2AR, способен предотвратить синаптотоксичность, экситотоксичность и потерю нейронов18192021. Кроме того, было также сообщено, что кофеин обладает противовоспалительными свойствами в ЦНС22, а именно, ослабляя опосредованное микроглии нейроинфламутирование23.

Принимая во внимание нейропротективные свойства кофеина в мозге, опосредованные блокадой A2AR, вместе с нашими предыдущими исследованиями, мы теперь выдвигаем гипотезу о том, что кофеин может оказывать нейрозащиту на РГК в моделях глаукомы, контролируя нейровоспалительный ответ.

Поэтому основная цель этой работы состояла в том, чтобы исследовать, что введение кофеина модулирует нейровоспламенение сетчатки и предотвращает потерю RGCs в животной модели (крысы Sprague Dawley) окулярной гипертензии (OHT), полученные лазерной фотокоагуляцией (LP) трабекулярной сетки и лимбальные вены. Хотя эта модель не полностью имитирует глаукоматозную оптическую невропатию человека, она широко используется для оценки анатомических и функциональных изменений, связанных с глаукоматозным повреждением, таких как потеря РГК и нарушение ретроградного переноса аксонов в оптическом нерве24252627.

Окулярная гипертензия, вызванная ЛП лимбального и эписклерального сосудов взрослых крыс, вызывает анатомические и функциональные изменения, связанные с глаукомой, такие как потеря РГК и нарушение ретроградного переноса аксонов зрительного нерва2425. Мы воспользовались этой моделью глаукомы для животных, чтобы исследовать способность кофеина модулировать нейровоспалительный ответ сетчатки и оценить ее нейропротективную роль.

Кофеин (1 г / л) вводили в питьевую воду, начиная с 2 недель до индукции OHT и до конца исследования. Вес животных и потребление жидкости регистрировались у всех животных во время лечения (таблица 1). Никаких существенных изменений не наблюдалось при поступлении жидкости или весе между питьевой водой животных или кофеином.

Поскольку потребление кофеина может меняться IOP28, ВГД измеряли у всех животных до индукции OHT (базального) и в дни 1, 2, 3, 5 и 7 после OHT-индукции с тонометром отскока (рис.1). Базальный ВГД был одинаковым во всех группах (в качестве эталона IOP у контрольных животных составлял 10,8 ± 0,2 мм рт. Ст., N = 22). Как и ожидалось, 1-дневный ВГД индукции после OHT значительно увеличился как у животных, употребляющих воду и кофеин (49,5 ± 1,8 и 51,2 ± 1,5 мм рт. Ст. Соответственно, n = 37, p <0,0001 по сравнению с базальным ВГД). У этих животных ВГД сохранялся в течение всего эксперимента. Тем не менее, 3-дневная индукция после ОНТ, ВГД у животных, употребляющих кофеин с ОНТ, статистически ниже по сравнению с водопоглощающими животными, подвергнутыми ОНТ (43,9 ± 1,5 мм рт.ст. и 51,2 ± 1,8 мм рт.ст. соответственно, р <0,001) , Этот эффект поддерживали до конца исследования, а на 7-й день после индукции ОНТ ВГД водопотребителей с ОНТ составлял 54,1 ± 2,5 мм рт.ст., а у животных, употребляющих кофеин с ОНТ, ВГД составляло 40,3 ± 2,8 мм рт.ст. (p <0,001). Администрация кофеина сама по себе не изменяла ВГД.

В ЦНС, включая сетчатку, фармакологические действия кофеина оказывают главным образом антагонисты рецепторов аденозина29. Было зарегистрировано, что мозговые вредные условия подавляют A1R и повышают уровень A2AR. Поэтому мы оценили, может ли OHT изменять выражение A1R и A2AR. Никаких существенных изменений в экспрессии мРНК A1R (фиг.2) не было обнаружено в 2 проанализированных моментах (3 и 7 дней после индуцирования OHT). Тем не менее, через 3 дня после ОНТ мы обнаружили значительное увеличение экспрессии A2AR по сравнению с контрольными животными (изменение в 2,3 раза, n = 5, p <0,05), которое поддерживали до 7 дней после OHT (в 2,4 раза n = 7, p <0,05).

Поскольку хроническое воспаление играет важную роль в патофизиологии глаукомы 30, мы оценили уровни мРНК и белка провоспалительных маркеров TNF и IL-1β. Как показано на фиг.3А, 3 дня с OHT значительно увеличивали уровни мРНК TNF и IL-1β (4,3 ± 0,6 и 6,8 ± 0,9 раза-изменение контроля соответственно, n = 7, p <0,01). Аналогично, через 7 дней с OHT уровни мРНК этих цитокинов были все еще значительно увеличены по сравнению с контролем (2,8 ± 0,6 и 3,2 ± 0,3 раза для TNF и IL-1β соответственно, n = 7, p <0,05) , Введение кофеина у животных ОНТ значительно ингибировало индуцированную OHT повышенную регуляцию уровней мРНК TNF и IL-1β (n = 7, p <0,05) в обоих временных точках без изменения экспрессии как TNF, так и IL-1β в сетчатки водолазных контрольных животных (контрольная группа).

Затем мы количественно определяли уровни белка TNF и IL-1β с помощью ELISA в экстрактах сетчатки (фиг.3B). В сетчатке контрольных животных экспрессия TNF и IL-1β составляла 74,6 ± 8,6 и 150,5 ± 12,6 пг / мкг общего белка соответственно. Через 3 и 7 дней после индуцирования OHT уровни белка IL-1β были значительно увеличены (соответственно 314,7 ± 44,3 и 424,1 ± 51,2 мкг / мкг общего белка, n = 8-9, p <0,01 и p <0,001), когда по сравнению с контрольными животными. У животных, употребляющих кофеин, через 3 дня OHT уровни IL-1β в сетчатке несколько уменьшились до 194,9 ± 8,1 пг / мкг общего белка по сравнению с питьевой водой животных. Более того, через 7 дней после ОНТ введение кофеина значительно уменьшало IL-1β до 140,9 ± 7,1 пг / мкг общего белка (n = 7, p <0,001). Через 3 дня OHT уровни белка TNF не изменялись в экстрактах сетчатки как в воде, так и в пищу для кофеина, по сравнению с контрольными животными. Тем не менее, через 7 дней OHT уровни белка TNF значительно увеличились до 127,4 ± 13,7 пг / мкг общего белка (n = 9, p <0,05), что было предотвращено введением кофеина (29,9 ± 7,98 мкг / мкг белка, n = 8, p <0,0001). Администрация кофеина, по сути, не изменяла уровни белка этих двух цитокинов.

Активация микроглии появляется на ранней стадии сетчатки животных моделей глаукомы9, предполагая роль этих клеток на ранних стадиях заболевания3031. Поэтому мы оценили, может ли введение кофеина модулировать реактивность микроглии, вызванную OHT.

По qPCR мы оценивали уровни мРНК двух маркеров реактивности микроглии, основного комплекса гистосовместимости класса II (MHC-II) (фиг.4А) и транслокаторного белка (18 кДа) (TSPO) 323334 (фиг.4В), а также CD11b, общий маркер микроглии (фиг.4C) и триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках 2 (TREM2), который связан с фагоцитарной емкостью микроглии (фиг.4D). Через 3 и 7 дней OHT наблюдалось значительное увеличение уровней мРНК MHC-II (3,5 ± 0,8 и 19,8 ± 2,2 раза, соответственно, n = 7, p <0,05 и p <0,001). Введение кофеина значительно предотвращало индуцированное OHT увеличение экспрессии MHC-II (изменение 1.2 ± 0.8 и 4.4 ± 0.3 раза в течение 3 и 7 дней OHT соответственно: n = 7, p <0,05 и p <0,01). Иммунореактивность для MHC-II была в основном обнаружена в ганглиозном клеточном слое у животных OHT и была локализована с Iba1, общим маркером микроглии (фиг.4E). В соответствии с результатами qPCR иммунореактивность MHC-II в сетчатке была увеличена у животных с OHT в течение 7 дней; эффект, который не наблюдался у животных, употребляющих кофеин с ОНТ.

Экспрессия мРНК TSPO (фиг.4B) также была отрегулирована через 3 и 7 дней OHT (11,6 ± 1,5 и 19,8 ± 1,2-кратное изменение соответственно, n = 7, p <0,001). Введение кофеина несколько уменьшало уровни мРНК, кодирующей TSPO (изменение в 6,7 ± 0,8 раза) через 3 дня у животных ОНТ, и снижение достигало статистической значимости через 7 дней у животных с ОНТ, употребляющим кофеин (в 4,3 ± 0,8 раза) n = 7, p <0,05), по сравнению с животными, пьющими воду.

Затем мы оценивали уровни экспрессии CD11b и обнаруживали значительную регуляцию уровней мРНК после 7 дней OHT (1,9 ± 0,2-кратное изменение, n = 7, p <0,05). Это повышение регуляции было предотвращено введением кофеина (изменение 1,1 ± 0,2 раза, n = 7, p <0,01). Выражение TREM2 также оценивали для оценки фагоцитарной активности микроглии. OHT в течение 3 и 7 дней значительно увеличивало экспрессию мРНК TREM2 на 5,5 ± 1,0 и 2,3 ± 0,32 раза-изменение соответственно (n = 7, p <0,05 и p <0,01), а кофеин предотвращал индуцированное OHT увеличение TSPO (1,8 ± 0,4 и 0,9 ± 0,2-кратное изменение в течение 3 и 7 дней соответственно: n = 7, p <0,05 и p <0,01). Введение кофеина как такового не меняло экспрессии провоспалительных маркеров.

Сообщалось о реакционной способности Microglia в контралатеральном глазу (без OHT) 3536. Поэтому мы оценили способность кофеина модулировать реактивность микроглии в контралатеральных глазах.

Экспрессия мРНК, кодирующей MHC-II и TSPO (фиг.5A, B) в контралатеральном глазу, была значительно повышена после 7 дней OHT (3,8 ± 0,2- и 3,0 ± 0,3-кратное изменение, p <0,01 и p <0,001 соответственно, n = 7). Введение кофеина уменьшало экспрессию MHC-II и TSPO в контралатеральных глазах, значительно для MHC-II (изменение 1,5 ± 0,2 раза, p <0,05, n = 6). По иммуногистохимии, подобно глазам OHT, иммунореактивность MHC-II обнаруживается в микроглии (Iba1-позитивные клетки) в GCL (фиг.5C). Введение кофеина ингибировало индуцированное OHT увеличение иммунореактивности МНС-II в контралатеральных глазах.

Изменения в структуре зрительного нерва и ретроградном аксональном переносе РГК были описаны на глаукоматозных моделях животных2437. Поэтому у животных ОНТ мы оценивали влияние введения кофеина как на целостность зрительного нерва, так и на перенос аксонов в РГК. Структурную целостность зрительного нерва оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (фиг.6А). Мы обнаружили, что OHT увеличивает частоту дегенеративных профилей аксонов с дезорганизованной и аномальной миелиновой оболочкой (табл. 2). Интересно отметить, что у животных, употребляющих кофеин, этот эффект, по-видимому, частично ослабляется, при этом животные с ожогами, содержащими кофеин, демонстрируют уменьшенное количество дезорганизованных миелиновых структур (фиг.6А и табл. 2).

Ретроградный перенос аксонов был оценен после применения Флюроголд (ФГ) в обоих высших колликулах, цели 98% RGCs38. Применение FG после индукции OHT является установленным методом оценки ухудшения ретроградного переноса аксонов RGC путем подсчета общего количества FG-положительных клеток в сетчатых сетчатых сетчатых сетчатых сетчатых сетчатых сетчатых сетчатых сетях (FG + -labeled RGCs) 26. Карты изодальности позволили нам визуализировать распределение FG + -RGCs в сетчатке (рис. 6B). У контрольных животных, питьевой воды или кофеина общее количество клеток FG + составляло 73,698 ± 1,611 и 78,125 ± 1,096 клеток соответственно (n = 5) (фиг.6C), как и в предыдущих отчетах24. Это число было значительно снижено до 19 619 ± 3 990 клеток (n = 4, p <0,05) у животных с OHT в течение 7 дней. У животных с OHT введение кофеина не предотвращало индуцированное OHT уменьшение количества FG + -меченых RGCs (17,630 ± 2,102 клеток, n = 4, p <0,05).

Принимая во внимание защитные свойства введения кофеина39, мы оценили потенциальный защитный эффект кофеина против дегенерации RGCs, вызванных OHT. В сетчатых сетчатых сетках RGC были помечены антителом, которое распознает Brn3a, маркер RGCs40 (фиг.7A), и общее число было подсчитано автоматически (фиг.7B). У контрольных животных общее количество РГК на сетчатку составляло 70,861 ± 1,258 (n = 5), как и в предыдущих работах24. Возникновение OHT в течение 3 дней приводило к уменьшению количества Brn3a-положительных клеток до 44 746 ± 6 151 клеток (n = 4) и 50,021 ± 6,151 клеток (n = 4) у животных питьевой воды и кофеина, соответственно. Увеличение OHT до 7 дней привело к дальнейшему значительному снижению RGCs в питьевой воде животных (24 621 ± 3 443 Brn3a-положительных клеток, n = 7, p <0,01). Однако введение кофеина животным с OHT в течение 7 дней значительно предотвращало потерю RGC, индуцированных OHT (44,027 ± 5,841 Brn3a-положительных клеток, n = 7, p <0,05). Введение кофеина животным с нормальным ВГД существенно не изменяло количество RGC (68,169 ± 1,840 Brn3a-положительных клеток, n = 6).

В настоящей работе показано, что введение кофеина предотвращает воспаление сетчатки глаза, реактивность микроглии и обеспечивает защиту РГК в животной модели глаукомы.

Подобно тому, что происходит в хронических ядовитых состояниях мозга4142, OHT вызвало усиление A2AR, что побудило гипотезу, что манипуляция с этим рецептором может контролировать нейродегенерацию. Ранее сообщалось, что повышенное гидростатическое давление для имитации OHT in vitro увеличивает экспрессию A2AR, главным образом в микроглии сетчатки, расположенной внутри слоя ганглиозных клеток15. Поскольку действия кофеина оказывают главным образом блокирование аденозиновых рецепторов, включая высокоаффинные A1R и A2AR17, повышение регуляции A2AR с помощью OHT показало, что эффекты кофеина у животных OHT опосредуются антагонизмом A2AR.

Кофеин оказывает благотворное влияние на модели животных, которые, как ожидается, ухудшают показатели памяти, такие как болезнь Паркинсона, хронический стресс, диабет 2 типа, дефицит внимания и гиперактивность, судороги в раннем возрасте или амнезия, вызванная алкоголем21. Сообщалось также о воздействии кофеина на глазные ткани, например, на предотвращение диабетической катаракты у животных, питающихся галактозой, и на снижение толщины роговицы43. Последствия потребления кофеина в ВГД еще не выяснены. Хотя некоторые авторы полагают, что потребление кофеина может увеличить ВГД у пациентов с нормотензивной глаукомой или глазной гипертензией28, другие показали, что кофеин не оказывает существенного влияния на ВГД у пациентов с глаукомой44. Поэтому мы регулярно измеряли ВГД у животных и обнаружили, что введение кофеина способно уменьшить ВГД животных ОНТ, не мешая животным с нормальным ВГД. Тем не менее, эффект опускания кофеина в IOP может быть недостаточным для объяснения эффектов, вызываемых кофеином, поскольку IOP у животных, пиющих кофеин, по-прежнему повышен (на 30% выше базального IOP45).

Глаукоматозный ущерб сопровождается ранней активацией микроглии и повышенной экспрессией воспалительных медиаторов68912464748. Было высказано предположение, что контроль реактивности микроглии может представлять собой терапевтическую стратегию для лечения глаукомы. Снижение реактивности микроглии путем облучения или фармакологической обработки или уменьшение экспрессии TNF обеспечивает защиту на животной модели глаукомы111249. В нескольких исследованиях показано, что кофеин обеспечивает защиту мозга в моделях нейродегенеративных заболеваний2029 и предотвращает опосредованные микроглии нейровоспалительные реакции23. Действительно, животные ОНТ, обработанные кофеином, продемонстрировали снижение активации микроглии и более низкие уровни медиаторов воспаления, демонстрируя, что кофеин предотвращает опосредованное микроглии нейровоспаление, вызванное OHT. Повышенная экспрессия MHC-II была также обнаружена у мышей контралатеральных глаз3536. Примечательно, что кофеин также снижает активность микроглии в контралатеральных глазах (без OHT).

Хотя мы не оценивали вклад других типов клеток, ответственных за воспалительную среду в сетчатке, мы не можем отказаться от вклада макролиальных клеток, которые также могут вызывать воспалительные медиаторы50. Тем не менее, введение кофеина не предотвращало повышающую регуляцию GFAP, индуцированную OHT, маркер активности астроглиальных клеток и клеток Мюллера (дополнительные данные, фиг.1), предполагая, что кофеин, по-видимому, предпочтительно модулирует ответы микроглии. Это соответствует предыдущим исследованиям, в которых сообщается о неспособности A2AR модулировать активацию астроглиальных клеток1851.

В нескольких исследованиях показано, что перенос аксонов в зрительном нерве нарушается при глаукоме человека и модели крысы OHT, предшествующей потере RGCs24263852. В этой модели OHT приводит к валлерианской дегенерации53, которая достигает высшей точки в смерти RGC2652. Фактически, предыдущие исследования показали, что часть выжившей популяции RGC после одной недели ОНТ демонстрирует нарушение ретроградного переноса аксонов, подтверждая доказательства того, что не все РГК немедленно погибают после нарушения транспорта аксонов2526.

В этой работе мы обнаружили, что кофеин не способен предотвратить дефицит в аксональном транспорте, вызванный OHT. Несмотря на то, что у питомцев с кофеином с OHT была обнаружена более сохранившаяся структура зрительного нерва, этого было недостаточно для преодоления повреждения, вызванного OHT, и он не смог улучшить перенос аксонов. Тем не менее, наблюдается значительное ослабление потери RGCs, вызванных семи днями OHT у животных, употребляющих кофеин. Глаукоматозная травма зрительного нерва и головка зрительного нерва, по-видимому, связана со значениями ВГД, но подробный механизм еще предстоит выяснить26. На самом деле, предыдущие отчеты с использованием отдельных моделей повышения IOP продемонстрировали, что повреждение аксонов в зрительном нерве коррелирует с величиной и продолжительностью подъема IOP3754.

Хотя большая часть гибели клеток происходит впоследствии с дегенерацией аксонов, опосредованный глиом воспалительный ответ также способствует успеху повреждения. Фактически, активация микроглии в модели животного глаукомы происходит до потери RGCs9. В модели LP-индуцированного OHT наличие маркеров реактивности микроглии в сетчатке после 3 дней OHT сопровождается уменьшением числа RGCs56. Кроме того, маркеры реактивной микроглии присутствуют в зрительном нерве и оптическом тракте после 7 дней индукции OHT56. Следовательно, кофеин, блокируя A2AR, может ослаблять реакционную способность микроглии, защищая таким образом сому RGCs. Будучи ответом микроглиальных клеток в задержке зрительного нерва, представляется правдоподобным предположить, что эффекты кофеина могут не наблюдаться в течение 7 дней. Кроме того, аденозиновые рецепторы могут быть непосредственно не связаны с целостностью ретроградного переноса аксонов, и поэтому кофеин, возможно, не сможет изменить функциональный ущерб, вызванный OHT. Действительно, как обсуждалось выше, функциональное ухудшение ретроградного переноса аксонов напрямую коррелирует с увеличением IOP3754.

Примечательно, что мы не наблюдали никакого вредного влияния, связанного с введением кофеина, ни у животных с нормальным ВГД, ни с ОНТ. Фактически, кофеин способен уменьшить нейровоспалительный ответ и увеличить выживаемость РГК у животных с ОНТ в механизме, не зависящем от снижения ВГД.

Здесь мы демонстрируем, что потребление кофеина, как описано в других нейродегенеративных заболеваниях, предотвращает потерю RGCs, связанных с глаукомой. Принимая во внимание результаты, полученные в этой работе, вместе с нашими предыдущими работами1516, селективные антагонисты A2AR в сочетании с агентами снижения IOP можно было бы рассматривать как потенциальную терапевтическую стратегию лечения глаукомы.

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по этическим и животным исследованиям Университета Мурсии и соответствовали руководящим принципам ARVO и Европейского союза для использования животных в исследованиях. Взрослые самки крыс Sprague Dawley, от 8 до 10 недель, (Charles River Laboratories, L’Arbresle, France) были размещены на животных объектах Университета Мурсии, Испания, и им была предоставлена ​​стандартная диета для грызунов и вода ad libitum, в 12 ч свет / 12 ч темного цикла. Недавние исследования показывают, что повреждение одного глаза может привести к значительным молекулярным и структурным изменениям интактного контралатерального глаза35365758. Поэтому сравнения проводились с использованием группы контрольных животных.

Животные были рандомизированы для приема кофеина или нормальной питьевой воды. Кофеин (1 г / л, Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США) подавали в питьевую воду в течение двух недель до индукции ОНТ и поддерживали до конца эксперимента. Выбранная доза кофеина была основана в предыдущей работе, в которой сообщалось о защитных эффектах потребления кофеина59.

Животные были разделены на 6 экспериментальных групп: 1) контроль (нетронутый и питьевой воды); 2) кофеин (обычный ВГД и употребление кофеина); 3) питьевая вода +3 дня OHT; 4) кофеин, употребляющий +3 дня OHT; 5) питьевая вода +7 суток OHT; 6) кофеин выпивает +7 сут. OHT.

Чтобы избежать эффекта снижения уровня ВГД анестезирующих агентов, измерения ВГД проводились у нестерилизованных крыс, которые были обучены, как описано ранее 60. ВГД измеряли в обоих глазах до операции (базальный) и в дни 1, 2, 3, 5 и 7 после операции с тонометром отскока, специально предназначенным для грызунов (Tonolab®, Icare, Espoo, Finland). В IOP считалось повышенным, когда среднее количество собранных измерений ВГД увеличивалось на 30% по сравнению с базальным IOP45.

OHT был индуцирован в левых глазах анестезии [внутрибрюшинная инъекция крыс ксилазина (10 мг / кг) и кетамина (60 мг / кг)] за один сеанс ожогов диодным лазером (Виридис офтальмологический фотокоагулятор-532 нм, Quantel Medical, Clermont -Ferrand, France), как мы описали ранее242738. Во время выздоровления местная мазь, содержащая Tobramycin, была применена к глазам, чтобы предотвратить высушивание роговицы.

Спустя один день после лазерной фотокоагуляции 3% флюороглифа (FG; Fluorochrome Inc., Engelwood, CO, USA), разведенного в 10% в диметилсульфоксиде, наносили на поверхность обоих высших колликулов (SCi), как описано ранее 243861. Ретины анализировали через 6 дней после трассировки через 7 дней после индукции OHT.

Всех животных подвергали эвтаназии с помощью внутрибрюшинной передозировки 20% пентобарбитала натрия, а затем транскрипционно перфузировали физиологическим раствором, а затем 4% (мас. / Об.) Параформальдегида (PFA).

Ретины с обоих глаз были расчленены, а затем проницаемы 0,5% Triton X-100 в PBS, после чего замораживались при -70 ° C в течение 15 минут, а затем новое полоскание в 0,5% Triton X-100. Brn3a детектировали путем инкубации с антителом козьего анти-Brn3a (1: 750, C-20, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany), полученным в PBS с 2% сыворотки Tween-20 и 2% нормальной ослиной в течение ночи при 4 ° С. Вторичное обнаружение проводили с Alexa Fluor 568 осликом против козьего конъюгированного вторичного антитела (1: 500, Life Technologies, Thermo-Fisher, Madrid, Spain). Наконец, сетчатки тщательно промывали в PBS и монтировали с помощью слоя RGC вверх и покрывали анти-затухающим раствором.

Глаза были энуклеированы и постфиксированы в 4% PFA в течение 1 часа. Затем роговицу осторожно удаляли и наглазник фиксировали еще 1 час в 4% PFA. После промывки в PBS ткань была криоконсервирована в 15% сахарозе в PBS в течение 1 часа, затем 30% сахарозы в PBS в течение 1 часа. Наглазники помещали в среду для замораживания тканей с 30% сахарозы в PBS (1: 1) и хранили при -80 ° C. Ткань была разделена на криостат (толщина 18 мкм), и секции были установлены на стеклянных слайдах Superfrost Plus.

Щитки сетчатки были проницаемы с 0,1% Triton X-100 в PBS, а затем блокаде с 10% нормальной сывороткой коз и 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 1 часа. Затем срезы инкубировали с первичными антителами следующим образом: кроличьи анти-Iba1 (1: 1000, Wako, Osaka, Япония), кроличьи анти-MHC-II (1: 200, AbDSerotec, Oxford, UK) или мышиные анти- GFAP (1: 500, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), в PBS с 1% BSA, в течение ночи, при 4 ° C. Вторичное обнаружение было выполнено с помощью Alexa Fluor 568 козьего антимышиного и Alexa Fluor 488 козьего кролика (все 1: 500; Life Technologies, Carlsbad, USA). Ядра были контрастированы с DAPI (Life Technologies, Carlsbad, США), а кусочки были установлены с Glycergel (DAKO, Glostrup, Дания).

Препараты наблюдали с помощью конфокального микроскопа (LSM 710, Zeiss, Oberkochen, Germany) на микроскопе Axio Observer Z1 с использованием объектива DIC M27 с маслом ECF-Neofluar 40x / 1,30.

Образцы оптического нерва собирали примерно на 1 мм от оптического хиазма и фиксировали 2,5% глутаральдегидом в 0,1 М натрий-какодиловом буфере (рН 7,2), дополняли 1 мМ хлоридом кальция в течение 2 часов. После промывки в том же буфере постфиксирование проводили с использованием 1% тетроксида осмия в течение 1 часа. Образцы затем промывали в буфере и дегидратировали в градуированной серии этанола (30-100%), импрегнировали и внедряли в эпоксидную смолу (Fluka Analytical, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Для оценки всего нерва и отдельных аксонов ультратонкие срезы (70 нм) были установлены на медных сетках (300 меш) и окрашены 2% уранилацетатом (15 мин) и 0,2% свинцовым цитратом (10 мин). Наблюдения проводились с использованием электронного микроскопа Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI) при 100 кВ.

Изображения электронной микроскопии были замаскированы независимым наблюдателем при повреждении аксонов зрительного нерва (1-й степени от 0 до 25%, 2-й степени от 25 до 75%, 3-й степени = от 75 до 100% аксонов с миелиновыми расстройствами) , Второму независимому наблюдателю было предложено оценить подмножество изображений, и κ-статистика была рассчитана для измерения соглашения между наблюдателями. Было найдено сильное соглашение между наблюдателями (κ = 0,607, p <0,001). Результаты были представлены как распределение частот каждого сорта, приписываемого каждому животному.

Сетчатые сетчатки были осмотрены и сфотографированы с помощью микроскопа (Axioscop 2 Plus, Zeis, Oberkochen, Германия), оснащенного камерой с цифровым разрешением (ProgRes ™ c10, Jenoptic, Jena, Germany) и компьютерным приводом с компьютерным управлением (ProScan ™ H128, компания Prior Scientific Instruments, Кембридж, Великобритания), связанная с системой анализа изображений (Image-Pro Plus 5.1 для Windows®, Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Фотомонтажи всех монстров были построены из 154 последовательных кадров, захваченных на микроскопе бок о бок, без зазора или перекрытия между ними.

Отдельные изображения, сделанные для каждого фотомонтажа сетчатки, обрабатывали для оценки общего количества клеток FG + и клеток Brn3a + в каждой сетчатке с помощью специальной подпрограммы подсчета клеток для автоматического подсчета помеченных клеток в каждом кадре, как описано ранее 4062.

Плотность клеток FG + и Brn3a + RGCs (клеток / мм2) по всей сетчатке была рассчитана и представлена ​​на картах изодупличности, как описано 40.

Суммарную РНК экстрагировали из сетчатки крыс с использованием реактива Trizol. Образцы РНК растворяли в 16 мкл воды Мили-Q и определяли общую концентрацию РНК с использованием NanoDrop ND1000. Амплификацию кДНК проводили в соответствии с инструкциями производителя, используя 1 мкг общей РНК (NZYTech, Лиссабон, Португалия). Полученную кДНК обрабатывали RNAse-H в течение 20 мин при 37 ° С и для анализа qPCR готовили разведение 1: 2. Все образцы хранили при -20 ° C до анализа.

Загрязнение геномной ДНК оценивали с помощью обычной ПЦР для β-актина с использованием интрон-охватывающих праймеров (таблица 3), как описано ранее63. SYBR Полученная в реальном времени количественная ПЦР (qPCR) проводилась с использованием StepOnePlus, как описано ранее15. Значения Ct были преобразованы в «относительное количественное определение» с использованием ранее описанного метода 2-ΔΔt64. Четыре кандидата домохозяйств (Tbp, Hprt, Ywhaz и Rhodopsin) были оценены с использованием NormFinder (надстройка Microsoft Excel) 65, а Yhwaz был идентифицирован как наиболее стабильный ген.

Уровни белка IL-1β и TNF количественно определяли с помощью ELISA в соответствии с инструкциями производителя (Peprotech, London, UK). Вкратце, общие сетчатки лизировали в 20 мМ имидазол-HCl, 100 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ NaF, 1% Triton X-100, дополненную ингибиторами протеазы и фосфатазы (Roche, Basel , Швейцария). Затем лизаты обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 16000 г в течение 10 мин при 4 ° С и при 10000 г в течение 5 мин при 4 ° С соответственно. Супернатант собирали и хранили при -80 ° С до использования.

Концентрация цитокинов каждого образца была нормирована на общую концентрацию белка (определяемую с помощью анализа белка бицинхониновой кислоты).

Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (с.е.). Нормальность данных оценивали по критерию нормальности Шапиро-Вилка. Данные анализировали с использованием теста Kruskall-Wallis, затем с помощью множественного сравнительного теста Dunn или двухстороннего ANOVA с последующим тестом множественного сравнения Tukey, как показано в легендах фигур. Статистический анализ был выполнен в Prism 6.0 Software для Mac OS X (GraphPad Software, Inc).

Как процитировать эту статью: Мадейра, М. Х. и др. Администрация кофеина предотвращает воспаление сетчатки и потерю ганглиозных клеток сетчатки на животной модели глаукомы. Sci. По донесению
6, 27532; doi: 10.1038 / srep27532 (2016).

MH Madeira является получателем стипендии PhD от Фонда науки и технологий (FCT, Португалия, SFRH / BD / 75839/2011). Работа была поддержана FCT (PTDC / BIM-MEC / 0913/2012, PEst-C / SAU / UI3282 / 2011-2013 и UID / NEU / 04539/2013) Португалия, КОМПЕТЕ-ФЕДЕР (FCOMP-01-0124-FEDER -028417), AIBILI, Португалия, Министерство экономики и конкурентоспособности Испании: SAF-2015-67643, ISCIII-FEDER «Una manera de hacer Europa» PI13 / 00643 и Red Temática de Investigación Cooperativa en Oftalmología RETICS: RD12 / 0034/0014 , и Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología Región de Murcia 19881 / GERM / 15, Испания.

Авторские вклады M.H.M., M.V.S., A.F.A., M.A.B. и A.R.S. задумал и разработал эксперименты. M.H.M., A.O.M. и F.N.N. провели эксперименты. M.H.M., A.O.M., F.N.N., M.V.S., A.F.A., M.A.B. и A.R.S. проанализировали данные. M.V.S., A.F.A., M.A.B. и A.R.S. внесены с помощью реагентов / материалов / инструментов анализа. M.H.M., A.O.M., F.N.N., M.V.S., A.F.A., M.A.B. и A.R.S. пишет газета. Все авторы-авторы прочитали и утвердили окончательный вариант рукописи.

Вода или кофеин (1 г / л) вводили ad libitum крысам Sprague Dawley, в течение 2 недель до индукции OHT и до конца эксперимента. ВГД измеряли с помощью тонометра отскока. Результаты выражены в мм рт. Ст. И представляют собой среднее ± с. М. От 22 до 37 независимых экспериментов. **** p <0,0001, значительно отличается от контрольных животных; +++ p <0,001, значительно отличается от контрольных животных OHT; Двухсторонний ANOVA, а затем многократный сравнительный тест Tukey.

Выражение мРНК A1R и A2AR оценивали с помощью qPCR в сетчатке контрольных животных и животных с 3 или 7 днями OHT. Результаты представлены в виде изменения складки по сравнению с контрольными животными и представляют собой среднее ± 5 м. От 5 до 7 независимых экспериментов. #p <0,05, значительно отличается от контрольных животных; Kruskall-Wallis, а затем сравнительный тест Dunn.

Влияние введения кофеина на нейровоспалительную реакцию сетчатки в глазах, подвергнутых OHT, оценивали с помощью qPCR и ELISA. (A) экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF оценивали с помощью qPCR. Результаты представлены как изменение складки по сравнению с контрольными животными и представляют среднее ± s.e.m из 5-7 независимых экспериментов. (B) Уровни белка сетчатки IL-1β и TNF количественно определяли с помощью ELISA. Результаты выражены в pg / мкг белка и представляют среднее ± s.e.m из 5-10 независимых экспериментов. * p <0,05, ** p <0,01 и **** p <0,0001, что значительно отличается от контрольных животных; #p <0,05, значительно отличается от воды, питаящей животных с 3-дневным OHT; + p <0,05, ++ p <0,01 и ++++ p <0,0001, значительно отличается от воды, питаящей животных с 7-дневным OHT; Kruskall-Wallis, а затем сравнительный тест Dunn.

Влияние введения кофеина на экспрессию мРНК маркеров микроглиальных клеток. (A) MHC-II, (B) TSPO, (C) CD11b и (D) уровни мРНК TREM2 оценивали с помощью qPCR. Результаты представлены как изменение смены по сравнению с контролем, из 5-7 независимых экспериментов. (E) Секции сетчатки были иммунизированы для Iba1 (общий маркер микроглии, зеленый) и MHC-II (активированный маркер микроглии, красный), а затем были отображены в конфокальном микроскопе. Ядра были окрашены DAPI (синий). Репрезентативные изображения, полученные из 5 независимых экспериментов. Результаты представлены как изменение складки по сравнению с контролем и представляют среднее ± s.e.m из 5-7 независимых экспериментов. * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001, что значительно отличается от контроля; #p <0,01, значительно отличается от воды, питаящей животных с 3-дневным OHT; + p <0,05, ++ p <0,01 и ++++ p <0,0001, значительно отличается от воды, питаящей животных с 7-дневным OHT; Kruskall-Wallis, а затем сравнительный тест Dunn.

Влияние введения кофеина на активированную OHT активацию микроглии в контралатеральном глазе оценивали с помощью qPCR для оценки экспрессии мРНК маркеров активации микроглиальных клеток MHC-II (A) и TSPO (B). Результаты представлены как изменение смены по сравнению с контролем, из 5-7 независимых экспериментов. (C) Секции сетчатки были иммунизированы для Iba1 (общий микроглиальный маркер, зеленый) и MHC-II (активированный маркер микроглии, красный), а затем были отображены в конфокальном микроскопе. Ядра были окрашены DAPI (синий). Репрезентативное изображение, полученное из 5 независимых экспериментов. Результаты представлены как изменение складки по сравнению с контролем и представляют среднее ± s.e.m из 5-7 независимых экспериментов. ** p <0,01 и *** p <0,001, что значительно отличается от контроля; + p <0,05, значительно отличается от контралатерального глаза воды, питаящей животных с 7-дневным OHT; Kruskall-Wallis, а затем сравнительный тест Dunn.

(A) Структурные изменения оптического нерва наблюдались с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Репрезентативные изображения полутонких поперечных сечений контроля, питьевой воды и кофеина, которые подвергаются воздействию 7 дней OHT. Изменения у аксонов, в том числе дегенерирующие аксоны и расщепление миелина (стрелки), наблюдаются у животных ОНТ. Шкала шкалы: 2 мкм. (B) Ретроградный перенос аксонов оценивали с помощью применения FG в верхнем колликулюсе через 1 день после индукции OHT, и были смоделированы полностью смонтированные FG-меченые сетчатки. Репрезентативные карты изоплотности, показывающие топологическое распределение FG-положительных RGCs, с использованием цветового кода, в соответствии со значением плотности ячейки в пределах 28-ступенчатой ​​цветовой шкалы от 0 (темно-синий) до 2500 или выше RGCs / mm2 (красный). (C) Количественная оценка FG-положительных клеток. График представляет среднее значение ± s.e.m. от числа FG-положительных клеток, от 5 до 7 независимых экспериментов. * p <0,05, существенно отличается от контроля; Kruskall-Wallis, а затем сравнительный тест Dunn.

Сетчатые сетчатки были иммунизированы для Brn3a (красный, RGC-маркер), и для оценки выживаемости RGC были созданы карты изодальности. (A) Репрезентативные карты изоплотности, демонстрирующие топологическое распределение меченых Brn3a RGCs, с использованием цветового кода в соответствии со значением плотности ячейки в пределах 28-ступенчатой ​​цветовой шкалы от 0 (темно-синий) до 2500 или выше RGCs / mm2 (красный). (B) График представляет среднее значение ± s.e.m. от числа Brn3a-положительных клеток, от 5 до 7 независимых экспериментов. ** p <0,01, существенно отличается от контроля; + p <0,05, значительно отличается от воды, питаящей животных с 7-дневным OHT; Kruskall-Wallis, а затем сравнительный тест Dunn.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *