Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Ингибирование DRP1 спасает клетки ганглиона сетчатки и их аксоны, сохраняя целостность митохондрий в мышиной модели глаукомы

DRP1 inhibition rescues retinal ganglion cells and their axons by preserving mitochondrial integrity in a mouse model of glaucoma
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4558491/

Глаукома является основной причиной необратимой слепоты и характеризуется медленным и прогрессирующим дегенерацией аксонов головы зрительного нерва и ганглиозной ячейки сетчатки (RGC), что приводит к потере зрительной функции. Хотя окислительный стресс и / или изменение динамики митохондриальной (mt), индуцированной повышенным внутриглазным давлением (IOP), связаны с этим нейродегенеративным заболеванием, механизмы, которые регулируют опосредованную дисфункцией глаукоматозную нейродегенерацию, плохо изучены. Используя мышечную модель глаукомы, DBA / 2J (D2), которая спонтанно развивает повышенный ВГД, а также систему культивирования RGC in vitro, мы показываем здесь, что окислительный стресс, о чем свидетельствует увеличение супероксиддисмутазы 2 (SOD2) и транскрипции mt (Tfam), запускает деление и потерю mt путем увеличения динамин-родственного белка 1 (DRP1) в сетчатке глаукоматозных мышей D2, а также в культивируемых RGC, подвергающихся повышенному гидростатическому давлению in vitro. DRP1 с избыточным экспрессией мутанта DRP1 K38A блокирует деление mt и вызывает последующее снижение окислительного стресса, о чем свидетельствует уменьшение экспрессии белка SOD2 и Tfam. Ингибирование DRP1 способствует выживанию RGC путем увеличения фосфорилирования Bad в серине 112 в сетчатке и сохраняет аксоны RGC, поддерживая целостность mt в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2. Эти данные свидетельствуют о важном порочном цикле, участвующем в глаукоматозной нейродегенерации, которая начинается с повышенного ВГД, вызывающего окислительный стресс; окислительный стресс затем приводит к делению mt и специфической форме дисфункции mt, которая генерирует дополнительный окислительный стресс, тем самым увековечивая цикл. Наши результаты показывают, что DRP1 является потенциальной терапевтической мишенью для улучшения опосредованного окислительным стрессом деления и дисфункции mt в RGC и его аксонах во время глаукоматозной нейродегенерации. Таким образом, ингибирование DRP1 может обеспечить новую терапевтическую стратегию защиты как RGCs, так и их аксонов при глаукоме и других оптических невропатиях.

Чрезмерная митохондриальная (мт) дезактивированная дисфункция была вовлечена в различные нейродегенеративные заболевания.1, 2, 3, 4, 5. Комплексы динаминосодержащего белка 1 (DRP1) собираются из цитозоля на митохондрии в очаговых местах деления и регулируют деление mt.6, 7 Недавние данные показывают, что посттрансляционные модификации DRP1 связаны с опосредованной дисфункцией биоэнергетической недостаточностью, синаптическим повреждением и гибелью нейронных клеток.2, 3, 8, 9, 10 Фосфорилирование DRP1 у серина 616 (S616) циклинзависимая киназа 1 / циклин B вызывает повышенную активность деления mt.11, 12 Однако фосфорилирование DRP1 в серине 637 циклической AMP-зависимой протеинкиназой ингибирует деление mt за счет снижения активности DRP1.13, 14, 15 Хотя это неясно, имеет ли фосфорилирование DRP1 и DRP1 S616 критические роли в опосредованной делением нейродегенерации центральной нервной системы (ЦНС), ингибирование активности DRP1 предотвращает деление mt и защищает от нейрона al cell death.3, 16, 17, 18, 19

Глаукома является основной причиной необратимой слепоты и затрагивает 70 миллионов человек во всем мире.20, 21. Внутриглазное давление (IOP) является основным и, возможно, самым значительным фактором риска потери зрительной функции от глаукомы. Более того, IOP является единственным изменяемым фактором риска, и сокращение ВГД является стандартным лечением. Однако снижение самого ВГД не всегда эффективно для сохранения зрительной функции у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (ПОАГ) .20, 21 Недавние исследования продемонстрировали, что дисфункция, опосредованная окислительным стрессом, связана с глаукоматозной нейродегенерацией.22, 23, 24 , 25, 26 Кроме того, растущие данные свидетельствуют о том, что ухудшение динамики mt может способствовать патогенезу в экспериментальных моделях грызунов глаукомы1, 27, 28, а также у пациентов с POAG.29, 30, 31, 32 Независимо от этого, механизмы окислительного стресс-опосредованные последствия ослабленной динамики и функции mt, а также последующая дегенерация ганглиозных клеток (RGC) сетчатки и аксонов при глаукоматозной нейродегенерации остаются неизвестными.

Мы тестируем, вызывает ли окислительный стресс, вызванный повышением уровня IOP, инициирование DRP1 и DRP1 S616, опосредованное фосфорилированием mt деления в RGC, и зонда для дегенерации в его аксоне с использованием глаукоматозной мыши DBA / 2J (D2), которая спонтанно развивает повышенные IOP.1, 33, 34 Кроме того, мы исследуем, является ли ингибирование DRP1 сверхэкспрессией доминантно-отрицательного мутанта DRP1 K38A (DRP1K38A), способствующего выживанию RGC и сохранению аксонов путем поддержания целостности mt. Здесь мы показываем, что окислительный стресс вызывает деление и потерю mt за счет увеличения активности DRP1 в глаукоматозных RGC. Кроме того, ингибирование DRP1 блокирует окислительный стресс и спасает RGCs и их аксоны, сохраняя целостность mt, указывая на то, что DRP1 может быть потенциальной терапевтической мишенью для улучшения деления и дисфункции mt-дегенерации, опосредованного окислительным стрессом, при глаукоматозной дегенерации RGC.

Чтобы определить, вызывает ли окислительный стресс, вызванный повышенным ВГД, уровни экспрессии DRP1 и его фосфорилирование S616 в глаукоматозной сетчатке, D2-Gpnmb + и pre-глаукоматозные мыши D2 получали коэнзим Q10 (CoQ10, 1%), мощный антиоксидант, 23 , 26, 35 или контрольная диета ежедневно в течение 5 месяцев, и мы исследовали уровни экспрессии белка супероксиддисмутазы 2 (SOD2) и транскрипционного фактора A (Tfam), а также фосфорилирование DRP1 и DRP1 S616. Мы обнаружили, что диета CoQ10 значительно уменьшала общую DRP1, а также экспрессию белка SOD2 и Tfam в глаукоматозной сетчатке (P <0,05; фиг. 1a). Интересно, однако, не было изменений уровня экспрессии фосфорилирования DRP1 S616, нормированного общим DRP1 (фиг. 1a). Кроме того, мы обнаружили, что диета CoQ10 значительно уменьшала экспрессию белка SOD2 на 0,79 ± 0,08 раза в сетчатке мышей D2-Gpnmb + (P <0,05; фиг. 1a); это подтверждает, что уровень окислительного стресса снижается после лечения CoQ10. Мы также обнаружили, что иммунореактивность DRP1 была увеличена во внешнем плексиформном слое (OPL) и внутренних сетчатых слоях глаукоматозной сетчатки (рис. 1b), сопровождающаяся повышенными потерями RGC, вызванными IOP (P <0,05; дополнительные фигуры S1a и b и дополнительные Таблица S1). Следует отметить, что нейроны, содержащие накопленную иммунореактивность DRP1 в цитозольной и перинуклеарной областях, были совместно помечены Brn3a-положительными RGCs в слое ганглиозных клеток (GCL) глаукоматозной сетчатки (рис. 1b).

Чтобы дополнительно определить, вызывает ли повышенное давление специфическое индуцирование окислительного стресса, а также увеличивает уровни экспрессии фосфорилирования DRP1 и DRP1 S616 в RGCs, мы затем исследовали эти изменения с использованием культивируемых RGC, подвергнутых повышенному гидростатическому давлению in vitro. В соответствии с нашими результатами in vivo мы обнаружили, что повышенное давление значительно увеличивало выработку реакционноспособных видов кислорода (ROS) и экспрессию белка SOD2 в культивируемых RGCs, сопровождающееся сниженной жизнеспособностью клеток (P <0,05, дополнительные цифры S2a-g и дополнительная таблица 2). Интересно, что повышенное давление значительно увеличивало общую экспрессию белка DRP1, но не его фосфорилирование S616 в культивируемых RGCs (дополнительный рисунок S3a). Параллельно эти результаты подтверждались повышенной иммунореактивностью DRP1 в Brn3a-положительных RGCs под давлением (дополнительный рисунок S3b).

Для исследования деления mt в сомах RGC и их аксонах in vivo мы вводили рекомбинантный адено-ассоциированный вирус-серотип 2 (AAV2), переносящий pDsRed2-Mito в глаза D2-Gpnmb + и pre-глаукоматозные мыши D2. По сравнению с мышью D2-Gpnmb + мы обнаружили, что глаукоматозная мышь D2 содержит относительно короткие митохондрии в аксоне и дендритах RGC (рис. 1c), что показывает потерю площади около 53% mt (рисунок 1c, график в середине нижней панели) , В подтверждение этих результатов анализ просвечивающей электронной микроскопии показал, что RGC-сома в GCL и ее аксоне в слое нервного волокна глаукоматозной мыши D2 содержала мелкие фрагментированные митохондрии (рис. 1d), тогда как мышь D2-Gpnmb + содержала трубчатую форму удлиненные митохондрии в обоих слоях (рис. 1d).

Чтобы дополнительно определить связь между дегенерацией аксонов и делением mt в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2, мы сначала оценили дегенерацию аксонов, измеряя максимальную проекцию интенсивности (MIP) серийного сканирования объемной сканирующей электронной микроскопии (SBEM) и измеренную плотность , площади поверхности и объемы. По сравнению с мышами C57BL (рис. 2a-d и дополнительным фильмом S1) репрезентативные изображения из томов SBEM из глаукоматозной глиальной пластинки содержали большее количество плотных отложений в дегенеративных аксонах, а также гипертрофическую астроглиальную активацию (рис. 2a и b и Дополнительный фильм S2). Интересно отметить, что MIP объемного объема SBEM из глаукоматозной глиальной пластинки содержал случайно осмиофильные липидные материалы, включая эвакуации, выпячивания и липидные капли (рис. 2a и b и дополнительный фильм S2). Кроме того, аксоны в глаукоматозной глиальной пластине содержали более высокие уровни осмиофильных липидных материалов за счет увеличения плотности, площади поверхности и объемов (рис. 2b-d).

Затем мы оценили деление mt путем измерения длины mt, площади поверхности и объемной плотности, а также образования митофагосом в аксонах глиальной пластинки у глаукоматозных мышей D2 с использованием трехмерной (3D) реконструкции пучка аксонов и митохондрий, продуцируемых SBEM наборы данных. По сравнению с мышами C57BL (рис. 3а и дополнительным фильмом S3) репрезентативные изображения сегментации mt из стеков SBEM показали чрезмерное деление и потерю mt в аксонах, сопровождающееся репрезентативным образованием образования и гипертрофической астроглиальной активацией глаукоматозной глиальной пластинки ( Рисунок 3b и дополнительный фильм S4). Кроме того, количественный анализ показал значительное уменьшение длины mt (0,77 ± 0,02 мкм), площади поверхности (1,08 ± 0,03 мкм2) и объемной плотности (0,04 ± 0,001 мкм3) в аксонах глиальной пластинки у глаукоматозной мыши D2 по сравнению с C57BL мышь (1,75 ± 0,04 мкм, длина мт, 1,74 ± 0,04 мкм2, площадь поверхности и 0,14 ± 0,003 мкм3, объемная плотность), но увеличение количества тт (0,86 ± 0,16 мкм2)
против 0,75 ± 0,09 мкм2) (P <0,001; фиг. 3c и d). Кроме того, мы обнаружили доказательства эволюции, свидетельствующие о увеличении числа деградирующих вакуолей и митофагосом, поглощающих деградированные митохондрии в аксонах глаукоматозной глиальной пластинки (рис. 3b и е), сообщая, что имеются избыточные опоры, опосредованные делением, при глаукоматозной дегенерации аксонов RGC ,

В соответствии с нашими результатами in vivo мы обнаружили деление mt в герметизированных RGC сомах in vitro (дополнительные рисунки S4a-c). Количественный анализ показал, что количество митохондрий было значительно увеличено до 1,5 ± 0,57 в RGCs под давлением (n = 20) по сравнению с контролем без давления (0,86 ± 0,3, n = 20) (P <0,001, дополнительный рисунок 4b). Напротив, длины мт были значительно уменьшены до 407 ± 244 нм в сжатых RGC (n = 174) по сравнению с контролем без давления (765 ± 492 нм, n = 182) (P <0,05, дополнительный рисунок S4b). Однако не было разницы в объемной плотности mt в культивируемых RGCs (дополнительная фиг. S4b). Трехмерные томографические реконструкции показали подробную структуру мембранной мембраны, включая расположение упаковки, форму и плотность крист (дополнительная фигура S4c). Большинство кристов в контрольных клетках имеют как трубчатые, так и пластинчатые отсеки. Однако некоторые кристы полностью пластинчатые или полностью трубчатые. В показанном примере как пластинчатые, так и трубчатые кристы вытянуты поперечно. В отличие от контрольного митохондрия (дополнительный рисунок S4c и дополнительного фильма S5), несколько пластинчатых крист также расположены продольно в митохондриях под давлением (дополнительный рисунок S4c и дополнительный фильм S6).

Чтобы дополнительно подтвердить, вызывает ли увеличение экспрессии белка DPR1 деление mt в RGCs, мы трансфицировали ген DRP1 дикого типа (WT) в культивируемых RGCs in vitro. Мы обнаружили, что увеличение экспрессии белка DRP1 вызвало деление mt с набухшей структурой cristae в митохондриях культивируемых RGCs (P <0,05; на рисунках 4a и b). Количественный анализ показал, что количество митохондрий было значительно увеличено до 0,6 ± 0,1 мкм2 в культивированных РГК, трансфецированных WT DRP1 (P <0,001; фиг. 4c). Напротив, длины mt были значительно уменьшены до 539 ± 16,8 нм в культивированных РГК, трансфецированных WT DRP1 (P <0,05; фиг. 4c). Однако не было разницы в объемной плотности mt между двумя группами (рис. 4c), предполагая, что DRP1 является ключевым фактором деления mt в RGCs.

Чтобы определить, блокирует ли ингибирование DRP1 окислительный стресс и апоптозную клеточную гибель в глаукоматозной сетчатке, мы вводили AAV2 с зеленым флуоресцентным белком (GFP), Null или pDRP1K38A в глаза D2-Gpnmb + и предглаукоматозные мыши D2 (дополнительные фигуры S5a и б). При использовании трансдукции AAV2-GFP и полной иммуногистохимии Brn3a (дополнительный рисунок S5c) мы впервые обнаружили, что эффективность трансдукции AAV2-GFP составила 19,5 ± 7,9% среди Brn3a-положительных RGCs у глаукоматозных мышей D2 (дополнительные цифры S5d-g) , При отсутствии существенных различий в ВГД (дополнительный рисунок S6) мы обнаружили, что ингибирование DRP1 значительно уменьшало уровни экспрессии белка SOD2 и Tfam в глаукоматозной сетчатке (P <0,05, фиг. 5а). Кроме того, иммуногистохимический анализ подтвердил, что ингибирование DRP1 уменьшает иммунореактивность SOD2 и Tfam в OPL и в нейронах внутренних слоев сетчатки глаукоматозных мышей D2 (рис. 5b), что указывает на возможность блокирования ингибирования DRP1 окислительным стрессом.

Чтобы дополнительно исследовать, способствует ли ингибирование DRP1 выживаемостью RGC путем модуляции апоптотического пути, мы изучили уровни экспрессии Bax и Bcl-xL, а также плохое фосфорилирование у серина 112 (S112) в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Мы обнаружили, что ингибирование DRP1 значительно повысило выживаемость RGC примерно на 31% в глаукоматозной сетчатке (рис. 6а и дополнительную таблицу S3). По сравнению с мышами D2-Gpnmb + экспрессия белка Bax была значительно увеличена в глаукоматозной сетчатке, трансдуцированной с помощью AAV2-Null (P <0,05; фиг. 6b). Однако не было различий между глаукоматозными сетчаткой, трансдуцированными с AAV2-Null и AAV2-DRP1K38A (рис. 6b). Уровни фосфорилирования Bcl-xL и Bad S112 были значительно увеличены в глаукоматозной сетчатке, трансдуцированной с помощью AAV2-Null (P <0,05; фиг. 6b). Интересно отметить, что ингибирование DRP1 достоверно восстановило экспрессию белка Bcl-xL, но показало больший рост фосфорилирования Bad S112 в глаукоматозной сетчатке (P <0,05; фиг. 6b).

Основываясь на нашем наблюдении экспрессии GFP в аксонах глиальной пластинки у предварительно глаукоматозных мышей D2 (дополнительные фигуры 7a и b), мы затем изучили, ингибирует ли DRP1 аксоны RGC, блокируя деление mt в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2. По сравнению с мышами D2-Gpnmb + (рис. 7a, b) мы впервые обнаружили большую потерю аксонов RGC за счет уменьшения иммунореактивности нейрофиламента, а также гипертрофической астроглиальной реакции путем увеличения иммунореактивности глиальных фибриллярных кислых белков (GFAP) в глаукоматозной глиальной пластине, трансдуцированной с помощью AAV2-Null (рисунки 7a и c). Однако интерес, ингибирование DRP1 частично восстанавливает иммунореактивность нейрофиламента и блокирует активацию астроцитов в глаукоматозной глиальной пластине (фиг. 7а и в).

Чтобы дополнительно подтвердить, сохраняет ли ингибирование DRP1 целостность аксонов, мы подсчитали количество аксонов в оптическом нерве (ON) после зоны перехода миелинизации (MTZ) у глаукоматозных мышей D2. По сравнению с мышами D2-Gpnmb + глаукоматозная мышь D2, трансдуцированная AAV2-Null, показала отсутствие аксонов, а также накопление и дезорганизацию миелинизации в ON. Кроме того, обильные гипертрофические астроцитные процессы заполняют область потери аксонов (рис. 7d и е). Количественный анализ показал, что ингибирование DRP1 значительно увеличивало количество аксонов в ON, сопровождающееся сохранением аксонов и их миелинизацией у глаукоматозных мышей D2 (0,47 ± 0,08 / мм2, P <0,01) по сравнению с глаукоматозными мышами D2, трансдуцированными с AAV2-Null (0,13 ± 0,04 / мм2) (фиг. 7f).

Исходя из этих результатов опосредованного ингибированием DRP1 восстановления целостности аксонов и глиальной реакции в глаукоматозной глиальной пластине, мы также определили, сохраняет ли ингибирование DRP1 структурную целостность митохондрий в аксонах glia lamina у глаукоматозных мышей D2. Неожиданно было обнаружено, что ингибирование DRP1 восстанавливает целостность мТ, продуцируя длинную трубчатую форму митохондрии в аксоне глаукоматозной глиальной пластинки (фиг. 8а и б), тогда как глаукоматозные мыши D2, трансдуцированные с AAV2-Null, содержали фрагментированные митохондрии в аксонах глиальную пластинку (фиг.8а и б). Количественный анализ показал, что ингибирование DRP1 значительно уменьшало количество митохондрий в аксонах глаукоматозной глиальной пластинки (0,40 ± 0,05 / мм2) по сравнению с глаукоматозными мышами D2, трансдуцированными с помощью AAV2-Null (0,70 ± 0,07 / мм2, P <0,01; ). Напротив, ингибирование DRP1 значительно увеличивало длину mt в аксонах глаукоматозной глиальной пластинки (835 ± 31 нм) по сравнению с глаукоматозными мышами D2, трансдуцированными с AAV2-Null (397 ± 11 нм, P <0,001; фиг. 8a). Однако существенной разницы в объемной плотности mt в аксонах между двумя группами (рис. 8a), все вместе предполагая, что ингибирование DRP1 сохраняет целостность аксонов, сохраняя целостность mt. Кроме того, томографические реконструкции подтвердили, что не было различий в диапазоне форм крист или их расположения упаковки и плотности в аксонах глиальной пластинки между двумя группами (рис. 8b и дополнительные фильмы S7 и 8), что свидетельствует о увеличении деления mt в аксонах глаукоматозной глиальной пластинки без изменения архитектуры внутренней мембраны.

Все больше доказательств того, что DRP1-опосредованное избыточное деление mt связано с нейродегенерацией в CNS.2, 3, 4, 5, 8, 9, 19, 36 Кроме того, посттрансляционные модификации DRP1 связаны с делением, синаптическим повреждением или апоптозом клеточная смерть в CNS.8, 14, 37, 38 Недавние исследования показали, что фосфорилирование DRP1 S616 и фрагментация mt значительно увеличиваются в обработанных S-нитрозоцистеином первичных кортикальных нейронах in vitro 10, а также в первичных гиппокампах, обработанных амилоидом-β нейронов in vitro и в тканях мозга при болезни Альцгеймера.39 Однако неизвестно, увеличивает ли фосфорилирование DRP1 или DRP1 S616 непосредственно индуцирует опосредованную делением дисфункцию в глаукоматозной RGC и дегенерацию ее аксона. В настоящем исследовании мы наблюдали, что увеличение общей экспрессии белка DRP1, но не его фосфорилирование S616, опосредует деление mt в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Действительно, эти результаты сильно подтверждены данными in vitro об увеличении общей экспрессии белка DRP1, но не его фосфорилировании S616 в подстрекаемых RGCs, а также индукцией деления mt в WR DRP1-сверхэкспрессирующих RGC. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что DRP1 S616, не зависящий от фосфорилирования активности DRP1, может способствовать делению и дисфункции mt при смерти RGC при глаукоматозной нейродегенерации.

Окислительный стресс считается важным патофизиологическим механизмом в дисфункции mt и глаукоматозной нейродегенерации.22, 23, 25, 40 Ранее мы продемонстрировали, что повышенный IOP инициированный mt OPA1 и выделение цитохрома c и апоптотическая гибель клеток в сетчатке глаукоматозных мышей D2, 1 27, что указывает на то, что повышенный ВГД связан с нарушением динамики т в глаукоматозной сетчатке. Кроме того, появившиеся свидетельства нашей группы показали, что окислительный стресс, вызванный повышенным ВГД, вероятно, участвует в опосредованной дисфункцией MK гибели RGC в сетчатке глаукоматозных мышей D2, о чем свидетельствуют увеличение SOD2 и Bax, а также Tfam и комплекс окислительного фосфорилирования IV экспрессию белка.23 Эти результаты свидетельствуют о том, что окислительный стресс может вызвать нарушения динамики и функции mt в глаукоматозной сетчатке. В предыдущих исследованиях сообщалось, что окислительный стресс связан с опосредованным DRP1 делением и дисфункцией mt при повреждении мозга, вызванным гипертонией41, а также гиперпролиферацией сосудистых гладкомышечных клеток при легочной артериальной гипертонии.42 Интересно, что наши данные показали, что блокирование окислительного стресса CoQ10 лечение значительно снизило общую экспрессию белка DRP1, но не фосфорилирование DRP1 S616 в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Основываясь на наших предыдущих результатах опосредованного CoQ10 промотирования выживаемости RGC и сохранения его целостности аксонов в головке ON (ONH) глаукоматозных мышей D2, 23 наши результаты сильно указывают на возможность того, что окислительный стресс, вызванный повышенным ВГД, может способствовать DRP1- опосредованного, но DRP1 S616, не зависящего от фосфорилирования деления и дисфункции mt, и впоследствии приводят к глаукоматозной дегенерации RGC.

Ингибирование активности DRP1 путем избыточной экспрессии DRP1K38A или селективными ингибиторами, такими как mdivi-1 и P110-TAT, блокирует деление и деление клеток в нейродегенерации.3, 4, 16, 17, 18, 19, 43 Кроме того, наше предыдущее исследование продемонстрировало, что mdivi-1 способствовало выживаемости RGC при ишемической травме сетчатки после острого высокого уровня ВГД, 16, что указывает на возможность того, что ингибирование DRP1 может спасти RGCs от опосредованного делением окислительного стресса, опосредованного давлением, при опосредованной давлением глаукоматозной нейродегенерации. В настоящем исследовании мы обнаружили, что ингибирование DRP1 значительно улучшало окислительный стресс, о чем свидетельствует уменьшение экспрессии белка SOD2 и Tfam в сетчатке глаукоматозных мышей D2, что свидетельствует о опосредованном DRP1 окислительном стрессе в глаукоматозной сетчатке. Поскольку усиление экспрессии Tfam было предложено в качестве важного эндогенного компенсаторного механизма, связанного с мтДНК, против нейродегенерации сетчатки, опосредованной окислительным стрессом, 23, 35, 44 наши данные свидетельствуют о том, что уменьшение экспрессии белка SOD2 и Tfam ингибированием DRP1 может отражать восстановление mt путем блокирования DRP1-опосредованный окислительный стресс в глаукоматозной сетчатке. Основываясь на этих выводах, мы предполагаем, что увеличение DRP1 играет критическую роль в дисфункции дисфункции, опосредованной окислительным стрессом, и ингибирование DRP1 может способствовать выживанию RGC, блокируя опосредованный делением окислительный стресс у пациентов с глаукоматозной нейродегенерацией.

В настоящем исследовании мы обнаружили, что ингибирование DRP1 значительно увеличивало фосфорилирование Bad S112 и сохраняло экспрессию белка Bcl-xL в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Bax противодействует Bcl-xL, который образует гетеродимеры с дефосфорилированием Bad, что инактивирует Bcl-xL, а плохое фосфорилирование устраняет эту димеризацию, которая активирует выживаемость клеток Bcl-xL.45, 46 Bcl-xL, способствуя выживанию мт-аденин-нуклеотидного обмена и предотвращали гиперполяризацию mt, поддерживая переносимость мт-мембраны.47, 48. Наши предыдущие исследования показали, что фосфорилирование Bcl-xL или Bad S112 было значительно увеличено в экспериментальных моделях мыши ишемии сетчатки и глаукомы, индуцированных повышенным IOP, 23, 35, 49, что указывает на то, что увеличение фосфорилирования Bcl-xL или Bad S112 может быть важным защитным механизмом в индуцированном давлением апоптозном пути нейродегенерации сетчатки.23, 35, 49 Эти результаты коллективно предполагают, что увеличение фосфорилирования Bad S112 или сохранение экспрессии белка Bcl-xL путем ингибирования DRP1 может представляют собой важные эндогенные компенсационные механизмы против mt-опосредованной апоптотической гибели клеток в глаукомату нейродегенерацией. Кроме того, интересно, мы обнаружили, что ингибирование DRP1 не меняет уровень экспрессии белка Bax в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Как показывают недавние данные, DRP1 способствует олигомеризации Bax и клеточному апоптотическому пути 50, 51, 52, возможно, что ингибирование DRP1 может задержать или предотвратить олигомеризацию Bax без изменения экспрессии белка Bax в глаукоматозной сетчатке. В совокупности наши результаты показывают, что ингибирование DRP1 защищает RGCs за счет увеличения фосфорилирования Bad S112 против апоптотической гибели клеток при глаукоматозной нейродегенерации.

Ранее мы продемонстрировали, что повышение IOP увеличивало экспрессию гена DNM1 в ONH, а также индуцированное деление деления и crithe mt в аксонах глиальной пластинки у глаукоматозных мышей D2.1, 53 В настоящее время в настоящем исследовании мы подтвердили деление и деградацию mt митохондрий в дегенеративных аксонах глиальной пластинки у глаукоматозных мышей D2, о чем свидетельствуют увеличенные электронно-плотные осадки липидов и образование митофагосом. Эти выводы имеют важное значение для того, чтобы показать, что измененная активность DRP1 может способствовать дегенерации аксонов, нарушая баланс динамики mt. Интересно, что впервые было обнаружено, что ингибирование DRP1 значительно сохраняет целостность аксонов, восстанавливая структурную целостность митохондрий в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2. В хорошем согласии с этими данными были свидетельства восстановления DRP1-опосредованного восстановления нейрофиламента и иммунореактивности GFAP, а также предотвращения гипертрофической астроглиальной активации в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2. Кроме того, эти результаты в значительной степени подтверждены настоящими результатами опосредованного ингибированием DRP1 сохранения целостности аксонов с интактным миелинизацией после МТЗ ОН у глаукоматозных мышей D2. С этими результатами мы предлагаем возможность того, что ингибирование DRP1 может способствовать выживанию RGC не только путем ингибирования деления и / или окислительного стресса mt, но также путем сохранения целостности mt в аксонах глиальной пластинки при глаукоматозной нейродегенерации.

Наши результаты убедительно демонстрируют, что не только повышенный окислительный стресс, вызванный IOP, вызывает избыточное деление мТ, но деление mt также приводит к опосредованной окислительным стрессом дисфункции mt в глаукоматозной RGC и дегенерации ее аксона. Таким образом, мы предлагаем важный порочный круг, связанный с глаукоматозной нейродегенерацией. Цикл начинается с повышенного ВГД, вызывающего окислительный стресс. Это затем приводит к делению mt, которое затем способствует определенной форме дисфункции mt, которая генерирует дополнительный окислительный стресс, тем самым увековечивая цикл. Дальнейшие исследования, посвященные измененным посттрансляционным модификациям опосредуемой DRP1 дисфункции mt и окислительного стресса в RGC и ее аксоне, могут помочь разработать патогенные механизмы, опосредованные дисфункцией mt, при глаукоматозной нейродегенерации.

Взрослые самки C57BL / 6, D2 и D2-Gpnmb + (D2-Gpnmb +) мыши (Лаборатория Джексона, Бар-Харбор, ME, США) и бессрочные беременные крысы Sprague-Dawley (Harlan Laboratories, Индианаполис, США, США) клеток, которые питались стандартной диетой грызунов ad libitum и сохранялись в 12-часовом световом / 12-часовом темном цикле. Все процедуры, касающиеся животных, проводились в соответствии с Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в исследованиях и в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по уходу и использованию животных в Калифорнийском университете в Сан-Дейго.

CoQ10 был приобретен у Kaneka Nutrients (Пасадена, Техас, США). AIN-93G-очищенная контрольная диета и диета, дополненная CoQ10, были разработаны Harlan Laboratories (Madison, WI, USA) .23, 35 Изучали четыре группы мышей: группу мышей D2-Gpnmb +, получавших контрольную диету (n = 25 мышей), группу D2-мышей, получавших контрольную диету (n = 70 мышей), группу мышей D2-Gpnmb +, обработанных 1% CoQ10 диетой ((об. / Об.)), Которая равна суточной дозе 1600-2000 мг / кг массы тела у 25-30 г мышей, n = 25 мышей) 23, 54 и группы мышей D2, получавших 1% CoQ10 диеты (n = 80 мышей) .23

Начальное повышение IOP обычно происходит между 5 и 7 месяцами, и в возрасте 9-10 месяцев IOP-связанная потеря аксонов на ОГ хорошо продвинута.1, 55, 56 Измерение ВГД выполнялось, как описано ранее.33, 57 Каждый из 9-месячные мыши D2, используемые в этом исследовании, имели одно измерение ВГД (для подтверждения развития спонтанного повышения ВГД более 20 мм рт. Ст., N = 25 для мышей D2, n = 33 для мышей D2, трансдуцированных с помощью AAV2-GFP или AAV2 -Null, n = 59 для мышей D2, трансдуцированных с помощью AAV2-DRP1K38A). Кроме того, каждый из неглаукомных контрольных мышей C57BL / 6 или D2-Gpnmb + (n = 21), используемых в этом исследовании, имел одно измерение ВГД. После анестезии с внутрибрюшинным (IP) инъекцией смеси кетамина (100 мг / кг, Ketaset, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, США) и ксилазина (9 мг / кг, TranquiVed, Vedeco, Inc., St. Joseph, MO, USA) для канюлирования передней камеры использовали стерилизованный, заполненный водой микроиглон с внешним диаметром 50-70 мкм. Затем микрорельеф был перемещен, чтобы свести к минимуму деформацию роговицы и обеспечить, чтобы глаз оставался в нормальном положении. Микроиглы были соединены с преобразователем давления (преобразователь артериального давления, WPI, Сарасота, штат Флорида, США), который передавал сигнал на усилитель моста (Quad Bridge, AD Instruments (ADI), Замок Хилл, NSW, Австралия). Усилитель был подключен к аналого-цифровому преобразователю (Power Laboratory, ADI) и компьютеру (G4 Macintosh, Apple Computer, Inc., Cupertino, CA, США). После измерения ВГД мы использовали глаукоматозных мышей D2, у которых была спонтанная высота ВГД, превышающая 20 мм рт.ст., 57, и мышей подтвердили, изучив повреждение аксонов ОН. 34, 55, 56, 58

Мышей анестезировали инъекцией IP смеси кетамина (100 мг / кг, Ketaset, Fort Dodge Animal Health) и ксилазина (9 мг / кг, TranquiVed, VEDCO Inc.) до дислокации шейки матки. Для иммуногистохимии сетчатки и ONHs отбирали из хориоидов и фиксировали 4% параформальдегидом в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, pH 7,4) в течение 2 ч при 4 ° С. После нескольких промывок в PBS сетчатки дегидратировали через градуированные этанолы и внедряли в полиэфирный воск. Для анализа вестерн-блоттинга немедленно использовались экстрагированные сетчатки.

РГК из постнатального 5-го дня крысы Sprague-Dawley очищали путем иммунопедагогирования и культивировали в свободной от сыворотки среде для выращивания, как описано ранее.59 Для экспонирования клеток повышенному гидростатическому давлению, как описано ранее, использовали инкубатор под давлением. 60, 61 (Gilmont Instruments, Barnant Company, Barrington, IL, USA) подключен через двухступенчатый регулятор низкого давления (сертифицированный источник 5% CO2 / 95% воздуха) (Airgas, Inc., San Diego, CA, США). Измерения для анализа pH, pCO2 и pO2 проводились с использованием портативного анализатора газового газа (iSTAT Corp., East Windsor, NJ, USA), как описано выше.

PDsRed2-Mito был получен от Clontech (Mountain View, CA, USA) и плазмиды pcDNA3-DRP1K38A в векторе экспрессии бакуловируса (Американский национальный центр регистрации информации о биотехнологии NM_005690.3) был предоставлен доктором AM van der Bliek. Для трансфекции первичных РГК 100 мкл Nucleofector Solution (Lonza, Allendale, NJ, USA) смешивали с 1 × 106 клетками, а затем 1 мкг pcDNA3 и pcDNA3-DRP1 трансфецировали с использованием устройства Nucleofector II / 2b (Lonza).

AAV2-цитомегаловирус (CMV) -pDsRed2-Mito (2,9 × 1011 GC / мл) и AAV2-CMV-DRP1K38A (5 × 1011 GC / мл) получали с использованием pAAV-CMV-челнока Applied Viromics (Fremont, CA, США). AAV2-Null и AAV2-CMV-GFP (1 × 1012 GC / мл) были приобретены у Applied Viromics. 7-месячные предварительно глаукоматозные мыши D2 и D2-Gpnmb + анестезировали IP-инъекцией смеси кетамина / ксилазина и 1% -ых пропаракаиновых глазных капель. Стеклянную иглу использовали для введения в стекловидное тело всего 2 мкл конструкций AAV2. Две инъекции конструкций AAV2, каждая 1 мкл, были доставлены в один глаз. Инъекции давали медленно в течение 1 мин, и иглу поддерживали в положении в течение дополнительных 10 минут, чтобы минимизировать потерю вектора через инъекционный тракт. В возрасте 9 месяцев мышей подвергали эвтаназии с помощью IP-инъекции смеси кетамина / ксилазина, а сетчатка и ткани ONH получали, как указано выше.

Ретины были вскрыты от склеры мышей. Ткани сетчатки или первичные РГК затем сразу же гомогенизировали в гомогенизаторе стеклянного тефлона-Поттера в буфере для лизиса (20 мМ Hepes, pH 7,5, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,5% CHAPS / полная протеаза ингибиторы, Roche Biochemicals, Indianapolis, IN, USA). Десять микрограмм объединенного белка сетчатки (n = 4 сетчатки / группы) из каждой группы разделяли PAGE и электротрансфералировали на мембраны из поливинилидендифторида. Мембрану блокировали 5% обезжиренного сухого молока / 0,5% Tween-20 / PBS в течение 1 часа и затем инкубировали с первичными антителами в течение ночи. Первичные антитела включали мышиное моноклональное антитело против DRP1 (1: 1000, BD Transduction Laboratories, Сан-Диего, Калифорния, США), кроличье-поликлональное антитело против фосфо-DRP1 S616 (1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) , кроличьего поликлонального анти-SOD2-антитела (1: 3000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), кроличьего поликлонального анти-Tfam-антитела (1: 3000, Santa Cruz Biotechnology), кроличьего поликлонального антитела против Bax (1: 500 , Santa Cruz Biotechnology), мышиное моноклональное антитело против фосфо-Bad S112 (1: 500, сигнализация клеток) и мышиное моноклональное антиактинное антитело (1: 5000, Millipore, Billerica, MA, USA). После нескольких промывок в Tween / PBS мембраны инкубировали с пероксидазой-конъюгированным козьим антимышиным IgG (1: 2000, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) или козлиным анти-кроличьим IgG (1: 2000; Bio-Rad ) и разработан с использованием определения хемилюминесценции (ECL Plus, GE Healthcare Bio-Science, Piscataway, NJ, USA). Отсканированные изображения пленки были проанализированы с помощью ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/), и плотность полос была нормализована для плотности полос для актина.

Проводили иммуногистохимическое окрашивание 7 мкм восковых участков сетчатки полной толщины и ONH или иммуноцитохимическое окрашивание культивированных RGC. Для иммуногистохимического или иммуноцитохимического анализа использовали секвенции из восковых блоков из каждой группы (n = 4 сетчатки или ONHs / группа) и покровные культуры из них (n = 3 на группу). Первичные антитела включали поликлональное антитело против Brn3a козы (1: 500, биотехнология Santa Cruz), моноклональное антитело против DRP1 мыши (1: 50, биотехнология Santa Cruz), моноклональное антитело против фосфо-нейрофиламента мыши H (SMI-32) 1: 500, Covance, Inc., San Diego, CA), кроличьего поликлонального анти-SOD2-антитела (1: 300, Santa Cruz Biotechnology), кроличьего поликлонального анти-Tfam-антитела (1: 300, Santa Cruz Biotechnology), полинейна морской свинки анти-GFAP-антитело (1: 500, Advanced ImmunoChemical, Лонг-Бич, Калифорния, США) или мышиный моноклональный антинейрофиламент (1: 100, Sigma, St. Louis, MO, USA). Для предотвращения неспецифического фона ткани инкубировали в 1% бычьего сывороточного альбумина / PBS в течение 1 ч при комнатной температуре перед инкубацией с первичными антителами в течение 16 ч при 4 ° С. После нескольких этапов промывания ткани инкубировали с вторичными антителами, антитело против конъюгированных с козьим антителом против мышиного IgA (1: 100, Invitrogen, Carlsbad, CA, США), Alexa Fluor 488, конъюгированное с красителем козьим анти-кроличьим IgG (1: 100, Invitrogen), Alexa Fluor 568 с конъюгированным с красителем ослиным анти-козьим IgG (1: 100, Invitrogen) или Cy5-конъюгированным антителом против IgG свиньи (1: 100, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) в течение 4 ч при 4 ° С и затем промывали PBS. Секции контрастировали с окрашиванием нуклеиновой кислоты Hoechst 33342 (1 мкг / мл, Invitrogen) в PBS. Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (Olympus FluoView1000, Olympus, Tokyo, Japan).

Ретины из энуклеированных глаз были расчленены как сплющенные целые крепления от 9-месячных глаукоматозных мышей D2, трансдуцированных AAV2-GFP или AAV2-DRP1K38A. Ретины погружали в PBS, содержащий 30% сахарозы в течение 24 ч при 4 ° С. Ретины блокировали в PBS, содержащем 3% сыворотки осла, 1% бычьего сывороточного альбумина, 1% рыбного желатина и 0,1% Triton X-100 и инкубировали с козлиным поликлональным анти-Brn3a-антителом (1: 500, Santa Cruz Biotechnology) и / или мышиного моноклонального антитела против фосфо-нейрофиламента H (SMI-32) (1: 500, Covance, Inc.) в течение 3 дней при 4 ° C. После нескольких этапов промывки сетчатки инкубировали с вторичными антителами, антитело против IgA IgA (IgA) IgA (1: 100, Invitrogen), ассоциированное с красителем Alexa Fluor 488 и / или Alexa Fluor-568 (1: 100, Invitrogen) в течение 24 ч и затем промывали PBS. Изображения были захвачены конфокальным микроскопом спиннинг-диска (Olympus America, Inc., Center Valley, PA, USA).

Для подсчета RGC, помеченных Brn3a, каждый квадрант сетчатки был разделен на три зоны центральной, средней и периферической сетчаткой (одна шестая, третья и пятая части радиуса сетчатки). Плотность RGC измерялась в 24 отдельных областях (2 области в центральной, средней и периферической областях сетчатки сетчатки) на одно условие двумя исследователями в масках, и оценки были усреднены. Чтобы подсчитать RGC, помеченные AAV2-GFP и Brn3a, каждый квадрант сетчатки был разделен на три зоны центральной, средней и периферической сетчаткой (одна шестая, третья и пятая части радиуса сетчатки). Плотности RGC измерялись в четырех различных областях в средней сетчатке (три шестом радиуса сетчатки), и оценки были усреднены.

Жизнеспособность клеток измеряли в первичных RGCs, культивированных в 96-луночных планшетах с использованием MTT (3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолийбромида) в соответствии с рекомендациями производителя (Cell Proliferation Kit 1, Roche Diagnostics, Индианаполис, Инн, США). Вкратце, клетки выращивали в 96-луночных планшетах с конечным объемом 100 мкл культуральной среды на лунку. Через 3 дня после воздействия повышенным гидростатическим давлением в каждую лунку добавляли 10 мкл МТТ-меченого реагента (конечная концентрация 0,5 мг / мл) и культуры инкубировали в обычном CO2-инкубаторе при 37 ° С в течение 4 часов. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора солюбилизации, и планшеты инкубировали в течение 16 ч в увлажненной атмосфере 5% -ного СО2-инкубатора при 37 ° С. Затем измеряли поглощение при 560 нм с использованием считывателя микропланшет (Spectra MAX, Molecular Devices, Corp., Саннивейл, Калифорния, США). Данные представлены как процент жизнеспособности клеток в контрольных лучах в тот же день, соответственно. 60. Внутриклеточный ROS измеряли 5- (и -6) -хлорметил-2 ‘, 7’-дихлордигидрофлуоресцеином диацетатом, ацетильным эфиром (CM-H2DCFDA, Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), хлорметильное производное H2DCFDA, полезное в качестве индикатора для ROS в клетках. Вкратце, астроциты ONH высевали на шестиходовой планшет (1,7 × 104 / лунку) и через 24 часа клетки предварительно инкубировали с 50 мкг / мл CoQ10 в течение 24 часов, а затем подвергали воздействию H2O2. Клетки отделяли трипсином / ЭДТА и загружали 20 мкМ CM-H2DCFDA при 37 ° С в течение 20 мин, а затем флуоресценцию образца измеряли немедленно с использованием проточной цитометрии (BD FACSCanto II, BD Bioscience, San Diego, CA, USA ). Каждый набор данных был собран из нескольких повторяющихся блюд каждой экспериментальной группы (n = 3).

Для обычного ЭМ два глаза из каждой группы (n = 2 мыши) фиксировали с помощью перфузии сердца с 2% параформальдегидом, 2,5% глутаральдегидом (Ted Pella, Redding, CA, USA) в 0,15 М растворе какодилата натрия (pH 7,4, Sigma) при 37 ° С и помещают в предварительно охлажденный фиксатор того же состава на льду в течение 1 часа. Следующая процедура была использована для оптимизации консервации mt и мембранного контраста.62 Сетчатки были расчленены в растворе 0,15 М натрий-какодилата и 3 мМ хлорида кальция (pH 7,4) на льду, а затем добавили 1% тетроксида осмия, 0,8% ферроцианида калия, 3 мМ хлорида кальция в 0,1 М растворе какодилата натрия (рН 7,4) в течение 1 часа, промывали охлажденной льдом дистиллированной водой, выдерживали 2% раствором уранилацетата при 4 ° С, дегидратировали с использованием градуированных этанолов и внедряли в смолу Дуркупана (Флука, Сент-Луис, Миссури, США). Аналогичная процедура использовалась для культивируемых первичных РГК из каждой группы. Ультратонкие (70 нм) участки выдерживали с помощью раствора уранилацетата и свинцовой соли и оценивали с использованием трансмиссии JEOL 1200FX EM (Japan Electron Optics, Ltd., Tokyo, Japan), работающей при 80 кВ. Изображения записывались на пленке при увеличении × 8000. Негативы были оцифрованы с разрешением 1800 точек на дюйм с использованием системы сканирования Nikon Cool, давая размер изображения 4033 × 6010 пикселей и разрешение пикселя 1,77 нм.62 Для количественного анализа количество митохондрий было нормализовано до общей площади, занимаемой аксонами в каждом изображении, которое было измерено с помощью ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Длина митохондрий измерялась с помощью ImageJ. Объемная плотность mt, определяемая как объем, занимаемый митохондриями, деленная на объем, занимаемый аксоплазмой, оценивалась с использованием стереологии следующим образом. Для каждого изображения, загруженного в Photoshop (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA), была наложена квадратная сетка 112 × 112 (112 × 112, выбранная для простоты использования с Photoshop), и подсчитаны митохондрии и аксоплазма, лежащие под перехватами , Относительный объем митохондрий выражался как отношение перехватов, совпадающих с этой органеллой относительно перехватов, совпадающих с аксоплазмой.

Разделы тканей ONH или культивируемых RGC из каждой группы разрезали при толщинах 400-500 нм. Для каждой реконструкции серия изображений с регулярными приращениями наклона собиралась с помощью электронного микроскопа JEOL 4000EX (Japan Electron Optics, Ltd.), работающего при 400 кВ. Увеличение составляло × 12 000, а разрешение пикселей составляло 1,2 нм. Пакет IMOD использовался для грубого выравнивания с точным выравниванием и реконструкцией, выполненным с использованием пакета TxBR. Сегментация тома выполнялась путем ручной трассировки в плоскостях с наивысшим разрешением с помощью программы Xvoxtrace.63. Реконструкции mt были визуализированы с использованием Analyze (Mayo Foundation, Rochester, MN, USA) или поверхностной графики Synu (Национальный центр микроскопии и Imaging Research, Сан-Диего, Калифорния, США), как описано ранее.63 Эти программы позволяют пройти через срезы реконструкции в любой ориентации и отслеживать или моделировать интересующие объекты в трех измерениях. Измерения поверхностных площадей и объемов поверхности внешней поверхности, внутренней границы и кристемы mt проводились в сегментированных объемах по программам Synuarea и Synuvolume (Национальный центр микроскопии и исследований изображений). Они использовались для определения плотности крист, определяемой как отношение: сумма объемов крист, деленная на объем т. Фильмы томографического объема были сделаны с использованием Amira (FEI, Hillsboro, OR, США).

ОНН промывали в какодилатном буфере в течение 2 ч при 4 ° С и помещали в какодилат-буфер, содержащий 2% OsO4 / 1,5% ферроцианида калия в течение 3 ч при комнатной температуре. После нескольких этапов промывки ONHs дегидратировали в серии ледяных растворов этанола с последующим охлаждением на холодном сухом ацетоне в течение 10 мин. ОНН помещали в ацетон при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем инфильтрировали восходящей серией растворов Дуркупан: ацетон. ONHs инфильтрировали 100% Durcupan, а затем отверждали при 60 ° C в течение 2 дней. ONHs были обрезаны для удаления избыточного пластика и прикреплены к алюминиевому штифту, заземленному серебряной краской и распылением, покрытым золотом-палладием перед визуализацией. Образцы были отображены на FEI Quanta FEG, оснащенном последовательной блочной системой 3View (Gatan, Inc., Pleasanton, CA, USA). Образцы были отображены в высоком вакууме с использованием тока пучка 2,5 кВ и толщины сечения 70 нм. 2D-монтаж был собран на каждой плоскости Z, чтобы увеличить поле обзора. Как только объем был собран, гистограммы для срезов по всему стеку томов были нормализованы для корректировки дрейфа интенсивности изображения во время получения. Цифровые файлы микрофотографии (.dm3) были преобразованы в формат MRC. Стеки были преобразованы в восемь бит, и объемы были вручную отслежены для реконструкции и анализа. Для анализа этих объемов мы использовали общедоступный программный пакет IMOD, специально разработанный для визуализации и анализа наборов данных EM в трех измерениях (http://bio3d.colorado.edu/imod/)64 и стереология была выполнена с использованием пользовательского плагин для IMOD.65

Данные были представлены как среднее ± S.D. или среднее значение ± S.E.M. Сравнение двух или трех экспериментальных условий оценивали с использованием непарного t-теста Стьюдента или одностороннего дисперсионного анализа и т-теста Бонферрони. P <0,05 считалось статистически значимым.

Мы благодарим AM van der Bliek для кДНК DRP1 и DRP1K38A в векторе экспрессии бакуловируса и M Terada для обработки томографического изображения. Частично эта работа была поддержана грантами NIH EY018658 (WKJ), P30EY022589 (основной грант исследования исследований) и NCRR P41 RR004050 и P41GM103412-24 (MHE) и неограниченным грантом от исследования по предотвращению слепоты (Нью-Йорк, Нью-Йорк ).

Вклад автора

KYK, GAP, MSS и WKJ планировали и проводили эксперименты и анализ. EB выполнял визуализационные эксперименты с использованием SBEM. NA и SJ выполняли анализ изображений с использованием программного обеспечения. MHE и RNW предоставили средства и инструменты и пересмотрели рукопись. KYK и WKJ написал рукопись. Все авторы обсудили результаты и прокомментировали рукопись.

адено-ассоциированный вирус-серотип 2

Центральная нервная система

Коэнзим Q10

DBA / 2J

динаминовый род 1

доминантно-отрицательный мутант DRP1 K38A

слой ганглиозных клеток

глиальный фибриллярный кислый белок

зеленый флуоресцентный белок

внутриглазное давление

внутрибрюшинный

проекция максимальной интенсивности

митохондриальная

переходная зона миелинизации

Зрительный нерв

На головке

наружный плексиформный слой

первичная открытая глаукома

сетчатка ганглиона сетчатки

активные формы кислорода

серин 112

серин 616

последовательная блочная электронная микроскопия

супероксиддисмутаза 2

mt транскрипционный фактор A

дикий тип

трехмерный

Дополнительная информация сопровождает этот документ на веб-сайте Cell Death and Disease (http://www.nature.com/cddis)

Под редакцией А. Веркрацкого

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Окислительный стресс увеличивает DRP1, но не его фосфорилирование на Ser616, и вызывает деление mt в сомах RGC и их аксонах глаукоматозных мышей D2. (a) Ретины глаукоматозных мышей D2 значительно увеличивали общую экспрессию белка DRP1, а также экспрессию белка SOD2 и Tfam. Однако диета CoQ10 значительно уменьшала общую экспрессию белка DRP1, а также экспрессию белка SOD2 и Tfam в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Интересно, что фосфорилирование DRP1 S616 не было изменено среди экспериментальных групп. Кроме того, диета CoQ10 значительно уменьшала экспрессию белка SOD2 в сетчатке мышей D2-Gpnmb + по сравнению с мышами D2-Gpnmb +, которые получали контрольную диету. Значения — среднее ± S.D. * Значительно при P <0,05 по сравнению с мышами D2-Gpnmb +, обработанными контрольной диетой или глаукоматозными D2-мышами, получавшими контрольную диету. (б) сетчатка глаукоматозной мыши D2 увеличивала иммунореактивность DRP1 в OPL (стрелка), а также INL и GCL по сравнению с мышью D2-Gpnmb +. Следует отметить, что нейроны (стрелки), содержащие накопленную иммунореактивность DRP1 в цитозольной и перинуклеарной области, совместно мечены иммунореактивностью Brn3a в GCL глаукоматозной сетчатки. Шкала шкалы: 20 мкм (все панели). (c) Морфологию митохондрий оценивали в сетчатке путем трансдукции AAV2-pDsRed2-Mito. Используя двойную иммуногистохимию для Brn3a и SMI-32, DsRed2-Mito экспрессируется в митохондриях RGC somas, которые были положительными для Brn3a, а также в митохондриях его аксона и дендритов, которые были положительными для SMI-32 у мышей D2-Gpnmb + , Глаукоматозные мыши D2 содержали относительно короткие митохондрии в аксоне и дендритах RGC по сравнению с мышью D2-Gpnmb +. Обратите внимание, что анализ площади поверхности показал около 53% потери площади поверхности. Шкала шкалы: 20 мкм (все панели). (d) По сравнению с D2-Gpnmb + mouse, электронная микроскопия глаукоматозных мышей D2 показала небольшие округлые митохондрии, также показывающие истощение cristae (стрелки) в RGC soma в GCL и его аксоне в NFL. OPL, наружный плексиформный слой; INL, внутренний ядерный слой; IPL, внутренний плексиформный слой; GCL, слой ганглиозных клеток; НФЛ, слой нервных волокон. Шкала шкалы: 1 мкм (все панели)

3D-реконструкция эволюций в аксонах глиальной пластинки у глаукоматозных мышей D2. (a) Репрезентативные отдельные части SBEM (левые панели) из томов SBEM (средние панели), содержащие в общей сложности 200 ломтиков при толщине сечения 80 нм в глиальной пластинке C57BL и глаукоматозных мышей D2, показывают поразительные различия в возникновении вывихов, выступов и липидные капли. MIP томов SBEM отображаются с инвертированным контрастом изображения (белый — самый высокий EM-сигнал, черный — нет сигнала, правые панели). Обратите внимание на большее содержание белого осмиофильного материала в образце D2. (б) Репрезентативные реконструкции эволюций (зеленые сферы) в глиальной пластинке C57BL и глаукоматозных мышей D2. (c) Схематическое представление с областью глиальной пластинки иммуногистохимического сбора данных. (d) Количественный анализ плотности, площади поверхности и объема осмиофильных материалов в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2. Значения являются средними ± S.E.M.

3D-реконструкция деления mt в аксонах глиальной пластинки у глаукоматозных мышей D2. (a и b) Митохондриальная сегментация из томов SBEM. Реконструированные митохондрии (синий) в каждом пучке аксонов (зеленый) глиальной пластинки от C57BL и глаукоматозных мышей D2. SBEM-стеки показали 1951 (а) и 438 (б) прослеживаемые митохондрии, возникающие как случайно разноцветные объекты в разных размерных видах в глиальной пластине из C57BL и глаукоматозных мышей D2, соответственно. Репрезентативные митохондрии имеют различные цвета, а глаукоматозная мышь D2 показывает деление и потерю mt, а также образование трещин (стрелка) в аксонах и гипертрофическую астроглиальную активацию (звездочку) в глиальной пластине. Справа: примеры небольших подмножеств соседних митохондрий, подчеркивающих различия в длинах. Шкала шкалы: 1 мкм (средняя); 2 мкм (все панели внизу). (c) Схематическое представление с областью глиальной пластинки сбора данных SBEM. (d) Количественный анализ длин мт, площади поверхности, количества на площадь и объемов в аксонах глиальной пластинки. Значения являются средними ± S.E.M. * Значительно при P <0,05 и *** значимо при P <0,001 по сравнению с мышами C57BL. (e) Аутофагия митохондрий (митофагия) проявляется в аксонах глиальной пластинки глаукоматозных мышей D2. На левой панели изображено EM изображение эвакуатора, содержащего деградирующие вакуоли в аксонах глиальной пластинки, а правая панель показывает EM-изображение еще большего проявления, показывающее большее количество деградирующих вакуолей. Обе вставки показывают митофагозу, поглощающую деградированную митохондрию. Шкала шкалы: 2 мкм (все панели)

Увеличение DRP1 вызывает деление mt в RGCs in vitro. (a) Сверхэкспрессия WT DRP1 значительно увеличила экспрессию белка DRP1 в культивируемых RGC. Значения — среднее ± S.D. * Значительно при P <0,05 по сравнению с контрольными RGC, трансфецированными контрольным вектором. (b) Репрезентативные 2D-изображения из анализа проницаемой электронной микроскопии (TEM) показали, что сома в культивируемых RGCs, трансфецированных WT DRP1, имела небольшие округлые митохондрии и раздутую структуру крист. Стрелки указывают на противоположные концы участка деления. Шкала шкалы: 500 нм (все панели). (c) Количественный анализ показал, что RGCs-трансфецированный WT DRP1 показал увеличение числа и уменьшение длины митохондрий. Однако не было разницы в объемной плотности mt между WT DRP1 и контролем. Значения являются средними ± S.E.M. * Значительно при P <0,05 по сравнению с контрольными РГК, трансфецированными контрольным вектором

Ингибирование DRP1 защищает РГК от окислительного стресса у глаукоматозных мышей D2. (a) Сверхэкспрессия DRP1K38A значительно уменьшала уровни экспрессии белка SOD2 и Tfam в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Значения — среднее ± S.D. * Значительно при P <0,05 по сравнению с D2-Gpnmb +, трансдуцированным с AAV2-Null или глаукоматозными D2-мышами, трансдуцированными AAV2-Null. (б) Сверхэкспрессия DRP1K38A уменьшала иммунореактивность SOD2 и Tfam в OPL, INL, IPL и GCL. OPL, наружный плексиформный слой; INL, внутренний ядерный слой; IPL, внутренний плексиформный слой; GCL, слой ганглиозных клеток. Шкала шкалы: 20 мкм (все панели)

Ингибирование DRP1 защищает RGC путем модуляции апоптотического пути у глаукоматозных мышей D2. (a) Количественный анализ иммуногистохимии всего растения для Brn3a показал, что избыточная экспрессия DRP1K38A способствовала выживанию RGC у глаукоматозных мышей D2. Значения — среднее ± S.D. * Значительно при P <0,05 по сравнению с D2-Gpnmb +, трансдуцированным с AAV2-GFP. Шкала шкалы: 50 мкм (a, верхние панели); 100 мкм (a, нижние панели). (б) Сверхэкспрессия DRP1K38A не блокировала повышенную экспрессию белка Bax, но значительно уменьшала уровни белка Bcl-xL и фосфорилирования Bad S112 в сетчатке глаукоматозных мышей D2. Значения - среднее ± S.D. * Значительно при P <0,05 по сравнению с мышами D2-Gpnmb +, трансдуцированными AAV2-Null или AAV2-GFP, или глаукоматозными D2-мышами, трансдуцированными AAV2-Null; ** Значительно при P <0,01 по сравнению с мышами D2-Gpnmb +, трансдуцированными с AAV2-Null

Ингибирование DRP1 предотвращает аксональную дегенерацию и астроглиальную активацию в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2. (а) GFAP и нейрофиламентная двойная иммуногистохимия. Сверхэкспрессия DRP1K38A частично сохранялась в нейрофиламенте и GFAP-иммунореактивности в глиальной пластинке глаукоматозных мышей D2. Шкала шкалы: 20 мкм (a, верхние панели); 5 мкм (a, нижние панели). (b) Происхождение поперечных сечений в а показано в глиальной пластине из продольного участка мышей D2-Gpnmb + (открытый бар). (c) Количественный анализ показал, что избыточная экспрессия DRP1K38A достоверно сохранила иммунореактивность GFAP в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2. Значения — среднее ± S.D. * Значительно при P <0,05 по сравнению с мышами D2-Gpnmb +, трансдуцированными мышами AAV2-Null или глаукоматозными D2, трансдуцированными AAV2-Null. Анализ обычной электронной электронной микроскопии (ТЕА). (d) D2-Gpnmb + мыши, трансдуцированные с AAV2-Null, показали нормальную здоровую морфологию миелинированных аксонов в ON. Напротив, глаукоматозные мыши D2, трансдуцированные AAV2-Null, показали отсутствие аксонов, а также накопление и дезорганизацию миелинизации в ON. Стоит отметить, что обильные гипертрофические астроцитные процессы заполняют область потери аксонов. Однако сверхэкспрессия DRP1K38A показала сохранение структуры аксонов и миелинизации в ON глаукоматозных мышей D2. Шкала шкалы: 2 мкм (все панели). (e) Схематическое представление с областью ON для сбора данных 2D EM из продольного участка мышей D2-Gpnmb + (бар). (f) Количественный анализ показал, что чрезмерная экспрессия DRP1K38A значительно увеличила количество аксонов в ОН глаукоматозных мышей D2 (n = 26 изображений). Значения - среднее ± S.D. * Значительно при P <0,05 по сравнению с мышами D2-Gpnmb +, трансдуцированными с AAV2-Null; ** Значительно при P <0,01 по сравнению с мышами D2-Gpnmb +, трансдуцированными мышами AAV2-Null или глаукоматозными D2, трансдуцированными AAV2-Null

Ингибирование DRP1 сохраняет морфологию mt в аксонах глиальной пластинки у глаукоматозных мышей D2. Электронная томография генерировала 3D-реконструкцию митохондрий высокого разрешения в глиальной пластине глаукоматозных мышей D2, трансдуцированных с помощью AAV2-Null или AAV2-DRP1K38A. (a) показаны срезы (толщина 1,36 нм) через середину томографических томов EM митохондрий. Количественный анализ сверхэкспрессированного DRP1K38A показал увеличение количества mt, но уменьшение длины mt в аксонах RGC глиальной пластинки у глаукоматозных мышей D2. Однако статистической разницы в объемной плотности mt не было. Значения являются средними ± S.E.M. ** Значительно при P <0,01 и *** Значительно при P <0,001 по сравнению с глаукоматозными мышами D2, трансдуцированными с AAV2-Null. Шкала шкалы: 500 нм (все панели). (б) Поверхностные объемы сегментированных митохондрий предоставляют информацию о форме и архитектуре кристе. Внешняя мембрана mt показана синим (сделана полупрозрачной, чтобы лучше визуализировать cristae), а cristae - в разных цветах

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *