Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Мыши с индуцированной мутацией в коллагеном 8A2 развивают большие глаза и устойчивы к повреждениям ганглиозных клеток сетчатки в экспериментальной модели глаукомы

Mice with an induced mutation in collagen 8A2 develop larger eyes and are resistant to retinal ganglion cell damage in an experimental glaucoma model
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3374490/

Первые два следователя внесли одинаковый вклад в эту работу

Изучить восприимчивость к травме глаукомы, поскольку на нее могут влиять мутации в компонентах соединительной ткани глаз.

Мыши, гомозиготные для индуцированной N-этил-N-нитрозомочевинной G257D-обменной (Gly-Asp) мутантной мутации (Aca23) в их гене коллагена 8A2, были исследованы для измерения внутриглазного давления (IOP), осевой длины и ширины, количества ганглиозных клеток сетчатки ( RGC) и инфляционные ответы. У трехмесячных гомозиготных мутантов Aca23 и дикого типа (WT) мышей на 6 недель наблюдалось повышенное ВГД, вызванное инъекцией микрошариков полистирола. Дополнительные Aca23 и контрольные контрольные образцы были изучены в возрасте от 10 до 18 месяцев.

Мыши Aca23 не имели существенного отличия от WT на уровне ВГД, и в обоих штаммах IOP увеличивался с возрастом. В многопараметрических моделях осевая длина и ширина были значительно больше в Aca23, чем WT, с возрастом становились более крупными и были больше после воздействия глаукомы (n = 227 мышей). Из данных теста на инфляцию оценки результатов склерального стресса у мышей Aca23 были сходны с мышами, имеющими возрастное и младшее WT C57BL / 6 (B6), тогда как оценки деформаций для Aca23 были значительно меньше, чем для группы WT в среднем возрасте, склеры и в некоторых более ранних склеральных мерах (p <0,001; n = 29, 22, 20 глаз в Aca23, старше WT, младший WT, соответственно). При хроническом повышении ВГП глаза Aca23 увеличивались на 9% в длину и 7% по сравнению с необработанными другими глазами (р <0,05, <0,01). При аналогичной повышенной экспозиции IOP глаза WT увеличились пропорционально вдвое больше, чем Aca23, увеличиваясь в длину на 18% и в носовой височной ширине на 13% (как p <0,001, тест Манна-Уитни). У 4-месячных контрольных зрительных нервов среднее число аксонов RGC не различалось в Aca23 и WT (46,905 ± 7,592, 43,628 ± 11,162 соответственно, p = 0,43, тест Mann-Whitney, n = 37 и 29). При хронической глаукоме у мышей Aca23 средняя потеря аксонов составляла всего 0,57 ± 17%, тогда как мыши WT потеряли 21 ± 31% (средняя потеря: 1% против 10%, n = 37, 29, p = 0,001, мультивариантная модель корректировка для положительного интегрального воздействия ВГД).

Мутация Aca23 в коллагеном 8α2 является первым дефектом гена, который обнаруживает изменение восприимчивости к экспериментальной глаукоме, уменьшая потери RGC, возможно, из-за различий в механическом поведении склеры. Детальное исследование специфических изменений состава склеральной соединительной ткани и ответов на хроническое повышение ВГД в этом штамме могло бы привести к новым терапевтическим целям для нейропротекции RGC.

Глаукома является второй ведущей причиной слепоты во всем мире [1], а факторы риска для открытой угловой глаукомы (ОАГ), ее наиболее распространенной формы, включают структурные особенности глаза, такие как большая осевая длина, более тонкая центральная роговица и более крупная оптическая диаметр диска [2]. Некоторые из этих факторов риска явно связаны с структурами соединительной ткани в глазу. Существует 14 хромосомных локусов и мутаций из трех генов, которые были идентифицированы среди первичных пациентов с ОАГ: миоцилин (MYOC), optineurin (OPTN) и повторный домен WD 36 (WDR36) [3]. Патогенетический путь, с помощью которого эти мутации действуют, подробно не уточняется. Как более высокое среднее IOP [4], так и большая флуктуация IOP [5] увеличивают повреждение OAG, связанное с напряжением, создаваемым IOP, на головке зрительного нерва (ONH). Сопротивление, связанное с IOP в роговице и склере, передается ONH на его периферии [6], которое, как считается, непосредственно связано с гибелью клеток сетчатки (RGC) апоптозом [7]. Связь между активацией вредных процессов с помощью индуцированного IOP стресса и смерти RGC представляет собой важную область для разработки новых методов лечения.

Чтобы использовать силу генетики мыши в выяснении патогенеза глаукомы, были разработаны многочисленные модели с экспериментальным повышением IOP [8-17], спонтанным увеличением IOP [18-20] или спонтанной смертью RGC [21,22]. Глаза млекопитающих, в том числе мыши, которые подвергаются экспериментальному увеличению ВГД, имеют нейронные, глиальные и связанные с ними изменения тканей, которые фенотипически сходны с глаукомой человека [23-25]. Кроме того, снижение ВГД замедляет прогрессирующую потерю РГК как при глаукоме животных, так и в человека [26, 27]. В то время как мышиные глаза различаются деталями анатомии ONH у приматов, они делят место повреждения глаукомы и избирательной смерти RGC. Jakobs et al. [28] продемонстрировали, что астроциты в мышином ONH имитируют структуру коллагеновой пластинчатой ​​криброзы в глазах приматов / человека, потенциально перенося напряжение склеральной стенки на аксоны и капилляры ONH. Склера мыши имеет коллагены, эластин и общее молекулярное содержание, сходное с человеческой склерой [29], хотя его толщина и диаметр в 10 раз меньше, чем у человеческих глаз [30].

Коллаген 8 представляет собой короткоцепочечный коллаген, обнаруженный во внеклеточной матрице нескольких тканей, включая мембрану Десцемета в роговице [31-34], склеру и зрительный нерв [35-37]. Дефекты в коллагеном 8α2 связаны с ранней формой дистрофии роговицы Фукса [38,39]. Дупликация соответствующей мутации для дистрофии Фукса у мышиного гена реплицирует аномалии эндотелия роговицы и мембраны Descemet, наблюдаемой у пораженных людей [40]. Целевой нокаут как коллагена 8α1, так и 8α2 у мышей дает более тонкую, чем нормальная роговица, и увеличенная глубина передней камеры [41]. Наведенная мутация в коллагеном 8α2, приводящая к обмену аминокислот G257D, влияя на высококонсервативный остаток глицина в коллагеновом домене, продуцировала более тонкую роговицу и увеличивала передние камеры у мышей, гомозиготных по дефекту (мышь Aca23) [42]. Острота зрения была нормальной, а гистология сетчатки и зрительного нерва была нормальной.

Мы предположили, что глаза мыши со склеральными аномалиями, приводящими к увеличению осевой длины, будут дифференциально восприимчивыми к повреждению глаукомы. Мышь Aca23 имеет как более длинные, так и более широкие, чем обычные глаза, и служила проверкой этой гипотезы. Имеются некоторые свидетельства того, что как тонкая роговица, так и дефекты коллагена 8 могут быть связаны с ОАГ человека. Исследование окулярной гипертензии показало связь между более тонкой центральной роговицей (CCT) и частотой OAG [43]. Была обнаружена ассоциация между missense мутациями в гене коллагена 8α2 и более тонким CCT у пациентов с глаукомой человека [44]. Исследование широкого распространения генома жителей Сингапура также обнаружило потенциальную связь между более тонким CCT и вариантом в гене коллагена 8α2 [45]. Поэтому мы тщательно изучили мышиный глаз Aca23, со старением и после индукции хронического повышения ВГД с помощью инъекции микрошариков полистирола в переднюю камеру.

Все животные лечились в соответствии с заявлением ARVO по использованию животных в исследованиях офтальмологических исследований и зрения, используя протоколы, одобренные и контролируемые Комитетом по уходу и использованию животных Университета Джонса Хопкинса. Мышей B6 дикого типа (WT) получали из Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Мутантные мыши Aca23 были выделены у гетерозиготных мышей Aca23 из лаборатории Drs. Пук и Гроу [42]. Aca23 спермы оплодотворенных ооцитов WT B6 in vitro. Потомство, которое было гетерозиготным по мутации Aca23, было сшито для продуцирования мышей, гомозиготных по мутации и сопоставимым по возрасту средствам подстилки WT. Мыши были генотипированы праймерами, направленными на сайт мутации, с использованием термоциклера PTC-225 (MJ Research, Waltham, MA). Продукты полимеразной цепной реакции расщепляли с использованием рестрикционного фермента Hpy188III и анализировали электрофорезом на 2% -ном агарозном геле для подтверждения наличия мутантной мутации G257D (Gly to Asp) (Aca23) в гене коллагена 8A2. Мы изучили 425 контрольных глаз и 67 глаз глаукомы у мышей WT B6 и 209 контрольных глаз или 37 глаз глаукомы от мутантов Aca23.

Для инъекций передней камеры для получения глаукомы мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией общей анестезии, 50 мг / кг кетамина, 10 мг / кг ксилазина и 2 мг / кг ацепромазина. Кроме того, при использовании общей анестезии была предусмотрена дополнительная местная анестезия — 0,5% пропаракаина гидрохлорида глазных капель (Akorn Inc., Buffalo Grove, IL). В протоколе инъекции (метод 4 + 1) [11] мы ввели 2 мкл шариков диаметром 6 мкм, затем 2 мкл шариков диаметром 1 мкм (Polybead Microspheres®; Polysciences, Inc., Warrington, PA), а затем 1 мкл вязкоупругого соединения (10 мг / мл гиалуроната натрия, Healon, Advanced Medical Optics Inc., Santa Ana, CA) через стеклянную канюлю, отводимую до диаметра наконечника 50 мкм, соединенную полиэтиленовой трубкой с шприцем Гамильтона (Hamilton, Inc ., Reno, NV). Мы оцениваем конечную концентрацию в виде 3 × 106 шариков на 1 мкл для 6 мкм гранул и 1,5 × 107 шариков на 1 мкл для 1 мкм гранул.

Измерения ВГД для впрыскиваемых бисером животных были завершены перед инъекцией, через 10 мин после инъекции, 3 дня, 1 неделя и еженедельно, чтобы пожертвовать через 6 недель после инъекции. Для измерений ВГД мышей анестезировали путем ингаляции изофлурана с помощью RC2-контроллера грызунов (VetEquip, Inc., Pleasanton, CA) [11]. Инструмент подавал кислород из прикрепленного резервуара, смешанного с изофлураном, доставляя животное 2,5% изофлурана. Измерения ВГД проводились с использованием тонометра TonoLab (TioLat, Inc., Хельсинки, Финляндия), регистрируя среднее значение 6 показаний с оптимальным классом изменчивости.

Животные с индуцированной глаукомой не подвергались инфляционному тестированию. Они получали внутрибрюшинную инъекцию общей анестезии до жертвоприношения с помощью обескровливания с последующей внутрисердечной перфузией с 4% параформальдегидом в 0,1 М натрийфосфатном буфере (рН = 7,2). Ориентация глаза была отмечена прикосновением на верхней роговице, а зрительные нервы были удалены на 1,0 мм, дистальнее земного шара. Глаза были надуты до 15 мм рт.ст. иглой, соединенной с заполненным жидкостью резервуаром. Длина и ширина измерялись цифровым суппортом (мгновенный считывающий цифровой суппорт, Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Длина была измерена от центра роговицы до положения, которое было временным до введения зрительного нерва в склеру. Назально-временная ширина и верхняя-нижняя ширина были измерены в наибольшем измерении на экваторе, на полпути между роговицей и зрительным нервом.

Для животных, подвергнутых инфляции, были введены внутрибрюшинная общая анестезия и местная анестезия и проведены заключительные измерения ВГД. Глаза были энуклеированы, а ориентация поддерживалась прикосновением. После того, как глаза были помещены в 0,1 М натрийфосфатный буфер (pH = 7,2), жир и мышь были удалены, а нерв был отрезан на 1,0 мм позади земного шара. Затем нерв фиксировали погружением в 4% параформальдегида в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН = 7,2). Измерения глаз проводились до тестирования инфляции с использованием цифрового суппорта, как указано выше. После завершения инфляционного тестирования глаза фиксировали погружением в 4% параформальдегида в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (pH = 7,2).

Метод измерения инфляции был ранее описан подробно [46]. Короче говоря, глаз приклеивался к крепежу у лимба и накачивался через инъекцию солевого раствора под давлением. Коррекция цифрового изображения (DIC) использовалась для определения края склеры, как видно из превосходного вида, простирающегося от светильника до зрительного нерва как на носу, так и во времени (рис. 1). Координаты для ряда местоположений вдоль склеры были получены из DIC при базовом давлении (недеформированная конфигурация) и после смещения, вызванного инфляцией (деформированная конфигурация). Мы предположили, что склеру можно описать как вращающийся эллипсоид, где ось вращения была определена как линия, соединяющая центр ОНН с держателем, меридиональное направление было определено спереди назад по склеральному краю, а направление окружности было определено параллельно экватору. Предположение о осесимметрии было необходимо для расчета результирующего ответа деформации и напряжения от 2D-положения и смещения края склеры. Для расчета результирующих напряжений мы смоделировали деформированную склеру как тонкую оболочку, способную поддерживать постоянные мембранные напряжения через толщину склеральной стенки. Эти допущения позволили нам оценить результирующие напряжения от ONH и крепления от приложенного давления и деформированных радиусов кривизны с использованием статического равновесия. С другой стороны, штаммы рассчитывались непосредственно из смещений DIC.

Схема расположения склеры. На этом рисунке показана схема левого глаза, подвергнутого инфляции, где Rk указывает на маркировку областей. Позиции точек вдоль склерального края вычислялись для исходного изображения (эталонная конфигурация) и для последующих изображений (деформированных конфигураций) в декартовой системе координат (e1, e2). Ось вращения была определена как ось, проходящая через центр зрительной нервной головки (ONH), параллельный оси ONH.

В испытании на инфляцию использовались энуклеированные, незафиксированные целые мышиные глаза, приклеенные цианоакрилатом к приспособлению. Передняя камера была соединена через иглу и трубку 30 калибра с программируемым коллектором преобразователя-насоса и погружена в забуференный фосфатом физиологический раствор при 22 ° C. Подготовка позволила провести анализ заднего 2/3 земного шара. Видеокамера CCD, прикрепленная к рассекающему микроскопу, смотрела на глаза превосходно, записывая изображения края склеры каждые 2 с, которые были обработаны программным обеспечением DIC [47], чтобы извлечь 2D-поле смещения выбранных точек вдоль края склеры. Ошибка измерения смещения была рассчитана ранее как ± 0,46 мкм. Это включало вклад неопределенности в калибровку расстояния по пикселям, ± 0,36 мкм и присущую погрешности корреляции DIC ± 0,1 мкм [46]. Чтобы охарактеризовать нелинейное, зависящее от времени поведение материала, тестирование началось при контрольном давлении P0, определяемом для каждого глаза как минимальное давление, при котором склера больше не сморщилась, как правило, 6-8 мм рт.ст. Образец сначала подвергался двум циклам загрузки-выгрузки от Р0 до 30 мм рт.ст. со скоростью 0,25 мм рт.ст. / с. Давление возвращали в P0 и выдерживали в течение 10 минут после каждой разгрузки, чтобы обеспечить полное восстановление перемещений. Затем проводили тест удерживания рампы со скоростью 0,25 мм рт.ст. / с от P0 до 30 мм рт.ст. Образец выдерживали при 30 мм рт.ст. в течение 30 мин до того, как давление было возвращено в P0 в течение периода восстановления 20 мин. Настоящий анализ был применен к загрузочной части первого цикла загрузки-выгрузки. Мы успешно провели тесты на инфляцию 31 глаза Aca23, 23 контрольных глаза WT B6, сопоставимые с глазами Aca23 (17 и 18 месяцев, соответственно) и 21 глаз 4-месячных мышей B6. Были неудачные тесты на инфляцию, не включенные здесь, на дополнительные 7 глаз Aca23, 8 контрольных глаз с контролем WT B6 и 13 глаз 4-месячных мышей B6. Неудачные тесты на инфляцию имели очевидную утечку из канюли, глаз, которые отделились от прибора, или технический отказ от завершения протокола.

Для расчета ответной реакции деформации напряжений использовались две разные системы координат: (1) декартова система координат (e1, e2), где e2 была осью вращения (рис. 1 и рис. 2) криволинейной системой координат, s, после склерального края (рис. 2А, В). Штаммы в меридиональном направлении (рис. 2А), параметризованные углом Φ и в окружном направлении, параметризованные углом θ (рис. 2B), были измерены из поля смещения DIC с использованием предположений о тонкой оболочке вращения. Для того, чтобы получить аналитическое описание склеры края, эллипсы были приспособлены к координатам опорного изображения, принятому на базовом давлении и к координатам деформированных изображений, полученных на срок до 7 последующих шагов давления. Координаты деформированных положений x (s) были заданы:

Схема для склерального анализа. Схемы для склерального анализа указывают меридиональное и окружное направления с углами Φ и θ соответственно и радиус кривизны недеформированного меридиана с R2. A: Превосходный вид склеры с криволинейными координатами (Φ), который используется для определения точки вдоль склерального края. B: задний вид склеры, указывающий два основных направления, используемые для расчета напряжений и напряжений. C: Превосходный вид недеформированной (сплошной линии) и деформированной (пунктирной линии) склерального края, указывающий недеформированное положение, X (s), деформированное положение, x (s), вектор смещения u (s) и диаметры d и D деформированных и недеформированных сечений в s соответственно.

где Х (з) координаты точек в декартовой системе координат в опорном изображении, и (с) представляет собой соответствующий вектор смещения (фиг.2С). Эксперименты измеряли декартовы компоненты смещения u1 и u2. Для определения деформаций компоненты смещения были установлены на полином четвертого порядка в зависимости от параметра, представляющего угол против часовой стрелки от главной оси установленного эллипса (представленного), используя полифит функции Matlab. Аналитические смещения использовались для расчета компонента деформации Грина-Лагранжа в меридиональном направлении следующим образом:

Меридиональный штамм EΦ описывает удлинение склеры в переднем и заднем направлениях.

Круговые деформации рассчитывались по отношению деформированного диаметра d к недеформированному диаметру D, как указано в (рис. 2C), используя предположение о осесимметрии:

Для расчета результирующих напряжений в окружном и меридиональном направлениях мы предположили, что вдали от ОНН и приспособления компоненты напряжения сдвига и деформации были пренебрежимо малы по сравнению с нормальными компонентами и что эффекты градиентов напряжения от изгиба также были незначительными. Это позволило моделировать склеру как тонкую оболочку с постоянными мембранными напряжениями по толщине [48]. Меридиональные и круговые результирующие напряжения тонкой оболочки вращения, подвергнутые внутреннему давлению, р, можно определить из равновесия как:

где r2 — радиус кривизны деформированного меридиана, а r1 — поперечный радиус кривизны, аналитически рассчитанный из деформированных позиций (представленных). Оценки напряжений и деформаций были рассчитаны с точностью до 8 точек, расположенных в областях 2 и 3 (рис. 1), а затем усредненные для получения кривой напряжения с одним напряжением для региона 2-3; была рассчитана отдельная кривая зависимости деформации напряжения для области 4. Мы использовали отношения Eθ / EΦ и nθ / nΦ, чтобы описать механическую анизотропию ткани.

Среди глаз с успешными инфляциями мы смогли применить анализ к 29 глазам Aca23, 22 контрольным глазам WT B6, сопоставимым по возрасту с глазами Aca23 (соответственно 17 и 18 месяцев) и 20 глазами 4-месячных мышей B6 , 4 оставшихся успешных инфляции не могут быть проанализированы из-за плохого полиномиального соответствия данных о смещении или из-за плохих корреляций DIC на представляющих интерес шагах давления.

Для оценки повреждения RGC мы оценили потерю аксонов в поперечном сечении зрительного нерва методом количественной выборки [49,50]. После первоначальной фиксации альдегида оптический нерв удаляли и фиксировали в 1% тетроксиде осмия, дегидратировали в спирте и окрашивали 1% уранилацетатом в 100% этаноле в течение 1 часа. Нервы были встроены в эпоксидную смолу, а для измерения площади каждого зрительного нерва в цифровом виде были отображены поперечные сечения 1 мкм. Затем было сделано пять снимков размером 40 × 40 мкм, случайно выбранных 100 × изображений (камера Cool Snap, программное обеспечение для анализа метаморфоза, Molecular Devices, Даунингтон, штат Пенсильвания), включающая 9% общей площади нерва. Маскированные наблюдатели отредактировали неассональные элементы из каждого изображения для оценки истинной плотности аксонов. Средняя плотность аксонов / мм2 умножалась на отдельную площадь нерва для оценки числа аксонов. Экспериментальные глаза сравнивались со средним числом аксонов в объединенных, дружественных нервах глаз, чтобы учесть процентную потерю аксонов.

Сетчатые целые основания из Aca23 и WT фиксировали 4% параформальдегидом, промывали в буфере, затем инкубировали в течение ночи в 1: 500 анти-β-тубулине (Covance, Inc., Princeton, NJ). Вторичное антитело AlexaFluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) использовали для определения первичного антитела. Ядра окрашивали дигидрохлоридом 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, Invitrogen) во время конечной забуференной фосфатом солевым раствором перед тем, как покрыть с помощью DAKO флуоресцентной монтажной среды (DAKO, Carpenteria, CA). Образцы были отображены с помощью Meta Confocal Microscope Zeiss LSM 510 (Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY). Четыре изображения размером 40 × были взяты в верхней и во временной сетчатке. Ручная количественная оценка RGC, идентифицированная как положительная для β-тубулина, а также все клетки уровня RGC, помеченные DAPI, выполнялась маскируемым образом с использованием программного обеспечения для анализа метаморфоза (Molecular Devices).

Сообщается, что мышиный глаз Aca23 имеет нормальную сетчатую структуру [42]; однако мы провели гистологию на поперечных сечениях сетчатки, чтобы проверить наличие и нормальную толщину всех слоев сетчатки. Мы проанализировали гистологию сетчатки 4 глаз от 4 животных каждого генотипа: 4 WT обработанных сетчатки, 4 WT необработанных сетчатки, 4 обработанных Aca23 сетчатки и 4 не обработанных сетчатки сетчатки Aca23. После перфузии животных и энуклеации глобусов мы фиксировали 16 сетчаток в 4% параформальдегиде в течение 24 ч, затем в 2% глутаральдегида / 2% параформальдегида в течение 24 ч. Они были встроены в эпоксидную смолу, разрезали на 1 мкм срезы, окрашивали 1% толуидинового синего и исследовали с помощью световой микроскопии.

Параметры, которые были измерены и сопоставлены, включали ВГД в начале и во время хронической глаукомы, включая средний уровень ВГД и IOP-облучение во времени (положительный интеграл = площадь под кривой ВГД по времени в обработанном глазу, которая превышала площадь под кривой ВГД по времени в контрольном глазу), осевой длины и ширины, количества тел и аксонов RGC и параметров тестирования инфляции. Средние значения сравнивались с использованием параметрических статистических тестов для данных, которые были нормально распределены, и медианных значений с непараметрическим тестированием для тех, чьи распределения не прошли тестирование на нормальность. Многовариантные модели регрессии использовались для корректировки некоторых сравнений для переменных, представляющих интерес, включая возраст, статус глаукомы и деформацию. Непараметрическое тестирование ANOVA использовалось для сравнения данных результирующего штамма стресса среди 3 групп мышей, которые прошли тестирование на инфляцию.

Гомозиготы Aca23 имели средний IOP = 13,0 ± 3,9 мм рт.ст. (n = 122 мышей от 4,0 до 20,6 месяцев). В регрессионной модели IOP был значительно выше у более старых животных (p = 0,03, r2 = 0,037, [IOP] = 11,86 + 0,12 * [Возраст, месяцы]). Точно так же животные WT однопометника B6 имели среднее значение IOP = 13,0 ± 3,6 мм рт.ст., что аналогично и значительно возрастало с возрастом (p = 0,04, r2 = 0,043, n = 100 мышей от 4,0 до 21,4 месяца, уравнение регрессии: [IOP] = 11,92 + 0,12 * [Возраст, месяцы]). Не было различий в ВГД между мышами Aca23 и WT (регрессионная модель, регулирующая возраст, p [диагноз] = 0,9, p [возраст] = 0,003, n = 222). Исходные измерения ВГД для животных в эксперименте по инъекции бусинок не показали существенных различий между генотипами или группами лечения (таблица 1). В предыдущем отчете мы продемонстрировали, что тонометр TonoLab точно считывается по сравнению с манометрически определяемым IOP, как у обычных мышей, так и у мышей с тонкой расширенной роговицей [51].

Никаких существенных различий между генотипами или между соседними глазами в исходном IOP, все p≥0,3, t-тест.

Puk et al. [42] продемонстрировали, что 11-недельные мыши Aca23 имеют более длинные передние камеры и более длинные глаза, чем мыши WT B6. Мы сравнили мышей Aca23 и WT B6 с точки зрения осевой длины и ширины как в носочно-временном меридиане, так и в верхнем-нижнем меридиане. Некоторые глаза фиксировали перфузией и накачивали до 15 мм рт.ст. иглой, расположенной в передней камере перед измерением. Другие глаза были измерены незафиксированными. Некоторые из них также подвергались воздействию хронического экспериментального повышения ВГД путем инъекции шариков. В многопараметрической модели осевая длина была значительно более длинной у более старых животных, дольше в Aca23, чем WT, и дольше после воздействия глаукомы, но не была связана с методом фиксации (таблица 2, r2 = 0,58, данные из 227 мышей). В аналогичной модели ширина носоглоточного глаза была значительно больше у старых мышей, у мышей Aca23 после глаукомы и после инфляционного тестирования и фиксации перфузии (значения р: <0,0001, 0,0003, <0,0001, 0,02 и <0,0001 соответственно , r2 = 0,42). Аналогично, верхняя и нижняя ширина также была значительно более продолжительной по возрасту, у мышей Aca23 и после глаукомы (p <0,0001, 0,04, <0,0001 соответственно, r2 = 0,39), но не была связана с тем, было ли проведено тестирование инфляции и к используемому методу фиксации (оба 0,4).

Коэффициент, стандартная ошибка (SE) и вероятность (p) из модели многомерной регрессии.

Мыши Aca23 в возрасте 4 месяцев были на 12,2% длиннее и на 7,3% шире, чем WT, и в среднем на 17 месяцев они были на 16,4% длиннее и на 2,6% шире, чем у дикого типа (таблица 3, длина Aca23-WT и разности ширины p <0,0001; t-тест). От 4 месяцев до 17 месяцев Aca23 глаза увеличились на 9,7% и на 3,9% шире (носочно-временные). Мыши WT выросли на 5,7% дольше и на 8,6% больше в течение того же возраста. У более старых мышей Aca23 длина и ширина были значительно выше, чем у мышей WT (p <0,0001 и 0,002, t-тест).

WT = дикий тип, SI = верхний-нижний, NT = носочно-временный, SD = стандартное отклонение, N = количество глаз, мм = миллиметры.

Три группы мышей были подвергнуты инфляции, 29 глаз 21 мыши Aca23 в среднем возрасте 17 месяцев, 22 глаза 17 WT B6-мышей в среднем возрасте 18 месяцев и 20 глазах 20 WT B6-мышей в среднем возрасте 4 месяца. Разница в возрасте между двумя более старыми группами была незначительной (p = 0,2, тест Манна-Уитни). При анализе использование одного глаза на мышь или оба глаза, когда они были протестированы, не изменило сделанные выводы.

В более поздней (R2-3) склеральной области штамм значительно увеличивался как в периферическом, так и в меридиональном направлениях с увеличением IOP (как p <0,0001, ANOVA). У животных Aca23 было меньше напряжения, чем у молодых животных WT на всех этапах давления, проанализированных от 10 до 30 мм рт.ст. в круговом и меридиональном направлениях (p <0,001, ANOVA, фиг. 3A, B). Глаза Aca23 также имели значительно меньшую периферическую деформацию, чем пожилые животные WT от 10 до 26 мм рт.ст. (все p <0,05; Рисунок 3A) и значительно меньше меридионального штамма, чем более раннее WT при 10 и 30 мм рт. Ст. (P <0,05, ANOVA; Рисунок 3B). Во всех 3 группах животных в этой области периферический штамм значительно превышал меридиональную деформацию при более низком ВГД, но разница была снижена при более высоком IOP (p <0,01, ANOVA).

Результат стресса — штамм Aca23, согласованный по возрасту WT и более молодой WT в двух разных регионах и в двух разных направлениях. График напряжений и штаммов в Aca23 (черный), ориентированный на возраст WT (синий) и более молодой WT (красный) глаз от тестирования на инфляцию. Данные анализировались из области 2-3 в окружном направлении (А) и меридиональном направлении (В). Аналогично, данные анализировались из области 4 в окружном направлении (C) и меридиональном направлении (D). В области 2-3 глаза Aca23 имели значительно более низкую деформацию, чем возрастной и младший WT при нескольких уровнях давления в периферическом и меридиональном направлениях. В Районе 4 глаза Aca23 показали значительно более низкое напряжение, чем обе группы WT в окружном, но не меридиональном направлении. Для статистического анализа см. Результаты.

В области R2-3 результирующие стрессы значительно повышались с увеличением IOP (p <0,0001, ANOVA), но не было никаких существенных различий между 3 группами в значениях стресса (Aca23 по сравнению с более молодым или старше WT, или моложе по сравнению с более старым WT) ,

В более передней (R4) склеральной области штамм значительно увеличивался по окружности и меридионально с увеличением IOP (Kruskal-Wallis ANOVA p <0,0001; Рисунок 3C, D). Глаза Aca23 имели значительно более низкую деформацию, чем сопоставимые по возрасту, более старые WT по периметру на 4 из 7 анализируемых этапов давления (от 14 до 26 мм рт.ст., p <0,01, ANOVA Bonferroni скорректировано, Рисунок 3C). Глаза Aca23 также имели более низкую деформацию по окружности по сравнению с более молодыми глазами WT на 6 из 7 анализируемых этапов давления (10-30 мм рт.ст., p <0,001; Рисунок 3C). Не было существенных различий между Aca23 и старшим или молодым WT в меридиональном штамме (рис. 3D). Окружность и меридиональный штамм не отличались друг от друга значительно в ответ на увеличение ВГД, и это сравнение анизотропии существенно не отличалось от единицы в Aca23, старше WT и более молодых животных WT (ANOVA p = 0,9). Штамм не отличался между молодыми и пожилыми животными WT в периферических или меридиональных направлениях (все p> 0,05, ANOVA, рис. 3C, D).

В R4 достоверные значения стресса значительно увеличивались с увеличением IOP как по окружности, так и по меридиональному (все p <0,0001, ANOVA), но не сильно отличались между Aca23 и старше WT, Aca23 и более молодым WT, а также между молодыми и пожилыми WT.

Хроническая глаукома была индуцирована, и ее влияние было измерено у 37 Aca23 и 30 WT мышей, начиная с 3,5-4,4 месяцев, в течение 6 недель после инъекции шариков в жертву. Контрольные глаза Aca23 были значительно длиннее, чем они были широкими (p <0,0001, таблица 3), тогда как в контрольных глазах WT (p> 0,05, тест Манна-Уитни) не было значительной разницы в ширине. У мышей глаукомы Aca23 длина глаза 9% и ширина 7% по сравнению с необработанными глазками (p <0,05, <0,01), тогда как мыши WT росли пропорционально в два раза больше, увеличивая длину на 18% и ширину (носоглоточный) на 13 % (оба р <0,001, тест Манна-Уитни). После 6 недель глаукомы не было существенной разницы в длине или в носовой височной ширине между мышами Aca23 и WT (как p> 0,05).

ВГД увеличивали в каждом глазке, вложенном в шарик, в один или несколько временных точек в обеих группах Aca23 и WT. Средние различия ВГД между инъецированными и сочетанными глазами в течение шестинедельного эксперимента показаны на рисунке 4 без существенных различий, за исключением двух недель, когда группа Aca23 имела более высокую среднюю разницу IOP. Оцененное кумулятивное облучение IOP не было существенно различающимся между Aca23 и WT со средним положительным интегральным IOP 109 ± 127 мм рт.ст. (Aca23) и 88 ± 79 мм рт.ст. (WT) и медианным положительным интегральным IOP = 59 и 64 мм рт.ст. — дней, соответственно (p = 0,99, тест Манна-Уитни).

График повышения ВГД в течение 2 недель после лечения с помощью инъекции шариков. Средняя внутриглазная разность давлений (мм рт. Ст.) Между инъекционным глазом и сопутствующим глазом в разное время после инъекции для мышей Aca23 (синий) и дикого типа (красный). Значительно более высокое среднее различие IOP в 14 дней в группе Aca23 по сравнению с диким типом (* p = 0,005, тест Манна-Уитни); другие периоды времени не имели значимой средней разницы ВГД между штаммами (все р> 0,06). Площадь под кривой (положительный интегральный IOP) для двух групп существенно не отличается (см. Раздел «Результаты»).

У 4-месячных мышей количество аксонов в необработанных глазах составляло 46 905 ± 7 592 в Aca23 и 43 628 ± 11 162 в WT (p = 0,43, тест Манна-Уитни, n = 37 и 29 соответственно). У 8 старших мышей Aca23 в возрасте 16-18 месяцев число аксонов составляло 51 285 ± 16 106 (p = 0,33 по сравнению с Aca23 4 месяца до Aca23 16-18 месяцев, тест Манна-Уитни).

После 6 недель глаукомы мыши Aca23 потеряли 0,57 ± 17% аксонов, а WT потеряли 21 ± 31% (средняя потеря: 1% (Aca23) против 10% (WT), n = 37, 29, соответственно; ). Большие потери аксонов у мышей WT были значительными (р = 0,005, тест Манна-Уитни, р = 0,001, регулирование многовариантной регрессии для положительного интегрального воздействия IOP). Типичные изображения сечений зрительного нерва как из генотипов, так и из обоих условий лечения показаны на рисунке 5.

WT = дикий тип, SD = стандартное отклонение.

Потеря Axon в поперечном сечении зрительного нерва. Репрезентативные изображения сечений зрительного нерва, окрашенных толуидиновым синим. A: Необработанный нерв животного WT не показывает повреждений. B: В течение шести недель после внутрикамерного введения микрошариков аксоны RGC демонстрируют значительную потерю аксонов. C: Необработанный Aca23-нерв напоминает кожу необработанного животного WT. Однако после инъекции микрошаридов (D) обработанный Aca23 нерв не оказывает подобного повреждения поврежденному WT ​​нерву (C). (шкала шкалы = 30 мкм).

В качестве подтверждения мер по снижению уровня аксонов для повреждения RGC мы подсчитали тела RGC, идентифицированные антителами против β-тубулина, на всех сетчатке сетчатки в 4 сетчатке WT и 4 сетчатки от мышей Aca23, половина с экспериментальной глаукомой и половина от других контрольных элементов , В этих сетчатах было перечислено 2625 клеток. Среднее количество клеток, идентифицированных в RGC-слое контрольных ретинай Aca23 в выбранных областях, составляло 256 ± 53, а в контроле WT-сетчатки было 227 ± 28 (p = 0,3, t-тест). Медианное снижение клеток клеток RGC, меченных β-тубулином, составляло 17% в глазах Aca23 и 50% в сетчатке WT (p <0,0001, t-тест). Соответствующая медианная потеря аксонов для глаз, у которых были проанализированы сетчатки, составляла 17% у Aca23 и 41% у WT-нервов, что демонстрирует превосходное согласие между потерей тела клетки RGC и потерей аксонов (рис. 6).

Потеря RGC в сетчатке. Репрезентативные изображения слоя RGC сетчатки сетчатки, окрашенных DAPI (синий) и анти-β-тубулина (зеленый). A: необработанная контрольная сетчатка WT с ядрами всех клеток, включая RGC, амикрины и другие, помеченные синим цветом с DAPI. Цитоплазма, дендриты и аксоны RGC, помеченные зеленым цветом для тубулина. B: Глаукома сетчатки животного WT с существенной потерей RGC. C: Необработанная контрольная сетчатка Aca23 похожа на необработанную WT. D: Aca23 сетчатки после глаукомы, показывающая одну из сетчатки с умеренной потерей RGC по сравнению с необработанными Aca23 (C) или WT (B), но меньше, чем у обработанной WT (B). (шкала шкалы = 20 мкм).

Мы подготовили поперечные сечения сетчатки, чтобы подтвердить нормальную гистологию сетчатки как в глазах Aca23, так и в WT. Наблюдалась нормальная структура сетчатки и нормальная толщина слоев сетчатки в обеих группах в глазах без глаукомы с помощью фазовой контрастной микроскопии (рис. 7). Глаукомы, обработанные глазом, имели только уменьшение слоя RGC и слоя нервных волокон, но никаких признаков истончения срединной сетчатки, которые могли бы возникнуть, если бы произошел крупный сосудистый компромисс и внутренняя ишемическая атрофия сетчатки.

Ретинальная архитектура Aca23 и WT. Репрезентативные поперечные изображения сетчатки мышей Aca23 и WT до лечения. У сетчатки Aca23 (A) нет различий в толщинах слоя сетчатки от WT (B, окрашенных толуидиновым синим, шкала шкалы = 20 мкм).

Мыши Aca23 потеряли значительно меньшее количество РГК с хронической глаукомой, чем их однопометники WT, со средней потерей примерно в два раза меньше, чем у WT. Мы планируем дальнейшие подробные исследования, чтобы определить причины этой разницы в восприимчивости к повреждению глаукомы. Представляется вероятным, что разница заключается в изменении структуры или поведения окулярных соединительных тканей у этих мышей. На исходном уровне глаза Aca23 были длиннее и шире, чем WT. Наша первоначальная гипотеза заключалась в том, что при всех вещах в осевом направлении более длинные глаза будут демонстрировать больший ушиб глаукомы. Эта гипотеза была основана на том факте, что человеческая глаукома более распространена и более быстро прогрессирует у лиц с более длинными глазами и глазами с более тонкими роговицами [2]. Теоретически, склеральный стресс был бы больше при данном ВГД в большем глазу, чем в меньшем глазу. Ясно, что это упрощенное понятие не относится к ситуации в глазу Aca23. Фактически, данные по инфляции показали, что глаза Aca23 имеют меньшую нагрузку при аналогичном напряжении, чем контрольные мыши в склере. Кроме того, хотя они увеличивали как длину, так и ширину при хроническом повышении IOP, увеличение было пропорционально менее половины, чем у мышей WT. Эти тенденции противостоять стрессу и проявлять меньшую фиксированную деформацию можно интерпретировать, чтобы показать, что более жесткий ответ на ВГД был защищен от потери RGC.

Недавно мы завершили аналогичные эксперименты, которые сравнивают потери RGC при хронической глаукоме между альбиносом CD1 и пигментированными мышами B6. Мыши CD1 последовательно увеличивают повреждение при одном и том же воздействии ВГД по сравнению с B6. При тестировании на инфляцию эти два штамма также демонстрируют значительные различия в поведении склеры на исходном уровне, а поведение инфляции стало более жестким в обоих штаммах после хронической глаукомы. До глаукомы наиболее существенным различием между глазами CD1 и B6 была анизотропия реакции инфляции между меридиональным и периферическим направлениями. В обоих штаммах перипапиллярная склера утончалась, но они резко отличались в реакции остальной части склеры. В CD1 наблюдается равномерное склеральное истончение, но фактическое утолщение склеры в B6 после 6 недель глаукомы. Мы планируем изучить подробный ответ склеры в глаза Aca23, CD1 и WT B6, чтобы определить молекулярные изменения, лежащие в основе этих различий в восприимчивости. Первоначальные протеомические анализы предполагают активное ремоделирование, вызванное хронической глаукомой, в пути, связанные с трансформацией фактора роста β (неопубликованные).

Сообщалось о жесткости ONH и склеры в моделях глаукомы животных и в живых и посмертных глазах человеческой глаукомы. Zeimer et al. [52] сообщили, что ОНГ был более жестким в глазах глаукомы человека и что эффект был хуже с большим повреждением РСК. Coudrillier et al. [53] сравнивали 24 нормальных и 11 пар глаукомы посмертных человеческих глаз с помощью инфляционных испытаний, определяя, что склера глаукомы была толще и имела более жесткий меридиональный ответ и более медленные круговые скорости ползучести в перипапиллярной склере, чем нормальные глаза. Тестирование живых человеческих глаз косвенными методами также предполагает, что глаза глаукомы имеют более жесткие ответы [54,55]. Тем не менее, пока не определено, имеют ли глаза глаукомы человека признаки, интерпретируемые как более жесткие до повреждения, или, если их явно большая жесткость является результатом болезни. Girard et al. [56] изучил 9 глаз глаукомы обезьяны, определив, что жесткость увеличилась при умеренном поражении глаукомы, хотя ответ был переменным. Roberts et al. [57] смоделировал ОНН-поведение у 3 глаз обезьян глаукомы с использованием объемных фракций соединительной ткани. Они предположили, что склеральное усиление при глаукоме может несколько усилить ОНН за счет повышенной нагрузки, переносимой в склеру. Данные экспериментальной глаукомы обезьяны и мыши предполагают, что большая жесткость является эффектом глаукомы. Является ли большее или меньшее соответствие склеры в исходном состоянии изменением восприимчивости глаукомы, является важной областью для будущих исследований. Мы должны иметь в виду, что, кроме того, ответ склеры на хронически повышенный ВГД может быть таким же важным или, более того, чем исходное состояние тканей. Можно рассматривать склеру, чтобы изменить ее механическую жесткость. Этот подход может представлять собой новое направление лечения глаукомы, уменьшая напряжение, вызванное IOP в ONH.

Сниженная восприимчивость к повреждению глаукомы, вызванная мутацией Aca23, может быть связана с особенностями, отличными от изученных. В разработке предполагается, что коллаген 8α2 является фактором развития капилляров. Потенциально мутация может привести к изменению питательной поддержки RGC и их аксонов в сетчатке и ONH, которая защищает эти нейроны от повреждений. Предложена экспрессия коллагена 8α2 в астроцитах зрительного нерва [36,37]. Это повышает вероятность того, что положительный эффект мутации опосредуется посредством глиальных взаимодействий с RGC. Пример синдрома Марфана указывает на необходимость мыслить творчески, когда мутации в структурных генах изучаются как факторы восприимчивости к заболеванию. Дитц и его коллеги [58] определили, что мутация в фибриллине, которая приводит к протеинным изменениям соединительных тканей в этом расстройстве, не влияет на изменение молекулярной структуры самого фибриллина, а путем изменения сигнальной последовательности для трансформации фактора роста β. В результате трансляционная терапия в настоящее время тестируется, чтобы ингибировать перегрузку этого пути. Потенциально, эффект мутации коллагена 8α2 можно оповестить с помощью механизмов, отличных от простых изменений в молекулярной структуре.

Очевидно, что мышь Aca23 демонстрирует значительные структурные изменения в окулярных соединительных тканях. Больший глаз и более тонкая роговица не являются очевидным результатом воздействия другого уровня ВГД, так как эти глаза незначительно отличаются от контроля по этому параметру. Фенотип также не является различием только в роговице, так как ширина земного шара на экваторе существенно отличается от контроля. Нет никаких различимых различий в количестве RGC на исходном уровне, судить по подсчетам аксонов или анатомии сетчатки. Эта мышь является лишь одним из нескольких штаммов, которые мы идентифицировали, в том числе с генетическими изменениями в эластине и фибромодулине, которые приводят к большему, чем обычные глаза. Будет интересно сравнить, как эти различные модели реагируют на хроническую экспериментальную глаукому.

Мы подтвердили прошлые исследования возрастных эффектов у мышей [11] в отношении их различных особенностей, включая ВГД и размер глаз. У обоих мутантов и мышей WT, изученных здесь, наблюдался небольшой рост ВГД с возрастом. Савинова и др. [59] изучали возрастные эффекты на ВГД у разных мышей, используя другую методику измерения, не обнаруживая ни изменения, ни снижения у некоторых видов. Мышечный глаз продолжает удлиняться до одного года и относительно стабилен после этого (представлен). Интересно, что мы обнаружили, что толщина склеры в штамме WT B6 возрастает до одного года, но затем существенно уменьшается на второй год жизни. Следует учитывать особенности, связанные с возрастом, в моделях глаукомы животных.

Мы признаем, что некоторые аспекты настоящего исследования заслуживают дальнейшего изучения. Исследования инфляции, проведенные здесь, не учитывали местную толщи склеры. Недавно мы разработали методы измерения этого для включения в более сложную, конститутивную модель поведения инфляции. Могут быть различия в восприимчивости к экспериментальной глаукоме по возрасту. Дальнейшие исследования мышей Aca23 в разное время могут быть информативными.

Таким образом, мутация, индуцированная в гене коллагена 8α2, вызвала больший глаз и изменила биомеханическое поведение при тестировании инфляции. Эти мыши были значительно менее восприимчивы к потере RGC в экспериментальной модели глаукомы. Изучение роли окулярных соединительных тканей в этой и других генетически измененных моделях мыши может привести к пониманию патогенеза и новых терапевтических направлений.

Эта работа была частично поддержана грантами исследований PHS EY 02120 и EY 01765 (Dr. Quigley и грант Института Wilmer), грантом исследования G2010042 от Американского фонда помощи здоровью (д-р Нгуен) и неограниченной поддержкой от Saranne и Ливингстон Косберг, и от Уильяма Т. Форрестера.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *