Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Оценка нейропротекции в сетчатке с помощью DARC

Assessment of neuroprotection in the retina with DARC
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2603274/

В настоящее время оценка эффективности нового препарата в глаукоме основывается на традиционной периметрии для мониторинга изменений визуального поля. Однако дефекты визуального поля не могут быть обнаружены до тех пор, пока не исчезнут 20-40% клеток ганглиона сетчатки (RGCs), ключевые клетки, участвующие в развитии необратимой слепоты при глаукоме. Недавно мы разработали новую, неинвазивную технологию обработки изображений в реальном времени, которая называется DARC (обнаружение апоптозирующих клеток сетчатки), чтобы визуализировать один RGC, подвергающийся апоптозу, самый ранний признак глаукомы. Используя флуоресцентно маркированный аннексин 5 и конфокальную лазерную сканирующую офтальмоскопию, DARC позволяет оценить эффективность лечения, контролируя апоптоз RGC в том же живом глазу с течением времени. Используя DARC, мы оценили различные нейропротективные терапии в моделях животных, связанных с глаукомой, и продемонстрировали, что DARC является полезным инструментом для скрининга нейропротективных стратегий. DARC потенциально обеспечит значимую клиническую конечную точку, основанную на прямой оценке процесса смерти RGC, а не только полезной для оценки эффективности лечения, но также приведет к ранней идентификации пациентов с глаукомой. Клинические испытания DARC у пациентов с глаукомой должны начаться в 2008 году.

Глаукома является основной причиной необратимой слепоты во всем мире, а визуальная потеря связана с гибелью клеток сетчатки (RGC) — отличительной чертой глаукомы. Глаукома обычно связана с повышенным внутриглазным давлением (ВГД), который ранее был замешан как основная причина смерти RGC. Снижение ВГД в настоящее время является единственной клинической терапией, доступной для лечения глаукомы, с прогнозируемой стоимостью в 5 миллиардов долларов ежегодно в Америке в одиночку к 2011 году (Lee et al., 2006). Тем не менее, было показано, что стратегии снижения давления неадекватны в предотвращении прогрессирующего глаукоматозного повреждения (Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group, 1998; Oliver et al., 2002). Это спровоцировало много исследований в стратегиях снижения без ИОП, т. Е. Нейропротективных подходов к управлению глаукомой.

В настоящее время наиболее широко пропагандируются нейропротекторные агенты в предотвращении смерти RGC являются модификаторами глутамата пути, так как это, несколько спорна, участвуют в развитии глаукомы смерти RGC (Dreyer и др, 1996;. Lipton, 2004b; Го и др al., 2006). Мемантин, антагонист NMDA, который имеет одобрение FDA для лечения болезни Альцгеймера (AD), в настоящее время является единственным нейропротективным препаратом в клиническом исследовании (фаза IV) у пациентов с глаукомой (Hare et al., 2004a, b; Greenfield et al., 2005; Yucel et al., 2006). С увеличением ассоциации глаукомы как нейродегенеративного расстройства существует тенденция использовать существующие нейропротективные стратегии, которые были показаны эффективными при заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС) (Lipton, 2001). Действительно, наше недавнее исследование показало, что препараты амилоида-β, используемые для лечения пациентов с АД, также эффективны в профилактике смерти RGC в экспериментальной глаукоме (Guo et al., 2007).

В настоящее время мониторинг эффективности новых лекарств у пациентов с глаукомой зависит от обнаружения изменений визуального поля, что объясняет длительный период наблюдения (5 лет), необходимый для клинического испытания, например, текущее клиническое исследование мемантина. Кроме того, визуальное полевое тестирование не является чувствительным и точным методом обнаружения глаукоматозного повреждения, поскольку, по оценкам, до 20-40% RGC теряются до обнаружения дефектов поля зрения (Kerrigan-Baumrind et al., 2000). Более того, учитывая, что потеря RGC играет ключевую роль в глаукоме с апоптозом RGC, признанным как раннее событие (Quigley et al., 1995; Cordeiro et al., 2004), это было бы фундаментальным шагом вперед, если бы RGC-апоптоз можно было контролировать при оценке терапевтическая эффективность. В настоящее время нет установленной клинической конечной точки для оценки нейропротективных стратегий при глаукоме.

Недавно мы разработали технологию обработки изображений под названием DARC (обнаружение апоптозирующих клеток сетчатки) для обнаружения апоптоза RGC in vivo. В этом обзоре мы сосредоточимся на оценке нейропротективных стратегий в профилактике глаукоматозного апоптоза RGC с DARC. В 2008 году DARC будет проходить клиническое испытание с целью оценки его роли в управлении глаукомой и нейропротективном контроле над наркотиками.

Недавно мы создали новую неинвазивную технологию визуализации в реальном времени для визуализации индивидуального апоптоза RGC in vivo в экспериментальных моделях, связанных с глаукомой. Этот метод, которым мы дали акроним DARC (обнаружение апоптозирующих клеток сетчатки), использует флуоресцентно меченый аннексин 5 и конфокальную лазерную сканирующую офтальмоскопию. Впервые мы смогли визуализировать изменения, происходящие в апоптозе RGC в течение нескольких часов, дней и месяцев in vivo (Cordeiro et al., 2004). Этот метод недавно был продемонстрирован как полезный инструмент для скрининга нейропротективных стратегий в моделях крыс, связанных с глаукомой (Guo et al., 2006, 2007).

Апоптоз играет важную роль как в физиологии, так и в патологии, особенно в глаукоме, где потеря зрения связана с апоптозом и смертью RGC (Quigley et al., 1995; Kerrigan et al., 1997). Апоптоз — это регулируемый процесс клеточного самоубийства, так называемая запрограммированная гибель клеток (PCD), характеризующаяся усадкой клеток, фрагментацией ДНК и конденсацией хроматина с отсутствием воспалительных реакций.

Идея использования аннексина 5 для обнаружения апоптоза была получена из клеточного феномена, впервые описанного Fadok et al. в 1992 году. Они обнаружили, что фосфатидилсерин (PS), представленный во внутреннем листочке плазматической мембраны, подвергается воздействию на поверхности апоптотических клеток и действует как сигнал «съесть меня» для фагоцитов (Fadok et al., 1992). Было также обнаружено, что аннексин 5, белок человека, способен связываться с PS селективно с высоким сродством в присутствии Ca2 + (Koopman et al., 1994). Поскольку экстернализация ПС происходит на ранних стадиях апоптотического процесса, задолго до фрагментации ДНК и ядерной конденсации можно обнаружить микроскопически, аннексин 5 связывается с облученным PS, тем самым идентифицируя ранние стадии апоптоза.

Из-за его свойств аннексин 5 использовался для обнаружения клеток, подвергающихся апоптозу, с использованием меченого флуоресцеином изотиоцианата аннексина 5 (FITC-аннексин 5) (Koopman et al., 1994; Dumont et al., 2001). Этот аффинный анализ аннексина 5 был дополнительно разработан путем маркировки аннексина 5 биотином или несколькими радионуклидами для облегчения различных протоколов для измерения апоптоза как на животных моделях in vitro, так и in vivo (Blankenberg et al., 1998; Vriens et al., 1998; Dumont et. al., 2000; Post et al., 2002; Kenis et al., 2004; Murakami et al., 2004). Доступность 99Tc-меченого аннексина 5, полученного в соответствии с нормами надлежащей производственной практики (GMP), привела к первым исследованиям неинвазивного обнаружения апоптоза у пациентов (Hofstra et al., 2001; Narula et al., 2001; Boersma et al., 2003) van de Wiele et al., 2003; Kietselaer et al., 2004). Было показано, что визуализация с помощью приложе- ния 5 клинически возможна и безопасна для пациентов. Однако эти методы никогда не использовались в глазу.

Используя связанный, но нерадиоактивный подход, мы разработали технологию обработки изображений, которая использует флуоресцентно меченый аннексин 5 с прямой визуализацией сетчатки для обнаружения динамического процесса отдельных клеток, подвергающихся апоптозу (Cordeiro et al., 2004). Это возможно, потому что наличие прозрачных оптических сред в глазу по сравнению с другими органами в организме позволяет непосредственно визуализировать меченые процессы заболевания, как они происходят в глазу. В этой методике используется устройство формирования изображения, такое как конфокальный лазерный офтальмоскоп (cSLO) с аргоновым лазером 488 нм, необходимый для возбуждения введенного аннексина 5-связанного флуорофора и фотодетекторной системы с фильтром отсечки 521 нм для обнаружения флуоресцентного испускаемого света , На сегодняшний день мы используем cSLOs со специализированным программным обеспечением для обработки изображений, чтобы компенсировать движения глаз и улучшать отношение сигнал / шум (von Ruckmann et al., 1995; Wade and Fitzke, 1998).

Для визуализации животных под анестезией удерживают в стереотаксической рамке, а их зрачки расширяются. Видео отсканированных участков сетчатки регистрируют и оценивают для флуоресценции с использованием метода, который мы ранее описали (Fitzke, 2000). Для каждого глаза сетчатый монтаж выполнен из изображений, снятых в одно и то же время. Затем можно подсчитать общее количество апоптозирующих RGC для каждой временной точки in vivo (Maass et al., 2007) (рис.1).

Чтобы оценить чувствительность и точность DARC при мониторинге апоптоза RGC, мы оценили его эффективность in vivo с использованием нескольких различных моделей животных, связанных с глаукомой, и показали, что DARC позволяет визуализировать в реальном времени апоптотические изменения, происходящие в RGCs, в продольном направлении с гистологическими валидациями.

В хорошо зарекомендовавшей себя модели крыс хронической глазной гипертензии (OHT) (Cordeiro et al., 2004; Guo et al., 2005a, b, 2006, 2007) с использованием DARC мы обнаружили, что апоптоз RGC происходит in vivo, что составляет 1 , 15, 13, 7 и 2% от общего количества РГК, с потерями RGC 17, 22, 36, 45 и 60% первоначальной популяции на 2, 3, 4, 8 и 16 недель, соответственно, после хирургического повышение ВГД. В модели транзакции крыс с оптическим нервом мы зарегистрировали апоптоз RGC в 0,3, 1,8 и 4% от общего количества РГК, при этом потери RGC составили 0, 3, 49 и 76% в 0, 3, 7 и 12 дней, соответственно. Изображения DARC также применимы к мышиному глазу (Maass et al., 2007). Наши результаты были получены из большой когорты животных — с минимальной внутри- и интервариабельностью, усиливающей воспроизводимость и повторяемость метода (Cordeiro et al., 2004; Guo et al., 2005a, b, 2006, 2007).

Кроме того, мы разработали модель апоптоза RGC, индуцированного лекарственными средствами, с использованием интравитреального ставроспорина (SSP), неселективного ингибитора протеинкиназы и хорошо известного мощного индуктора нейронового апоптоза (Koh et al., 1995; Belmokhtar et al., 2001; Thuret et al., 2003). Оценка модели SSP с помощью DARC показала, что она генерирует быстрый и обширный апоптоз RGC с пиковыми уровнями, которые визуализируются через 2 часа у крысы, и является полезным инструментом для оценки нейропротективных стратегий с сильными данными, достигаемыми за относительно короткое время ( Cordeiro et al., 2004; Guo et al., 2006).

Глутамат является преобладающей возбуждающей аминокислотой и важным нейротрансмиттером в ЦНС и сетчатке, участвующей в различных физиологических процессах и патофизиологических состояниях. Во время синаптической активности глутамат, вызванный нервными импульсами, высвобождается из пресинаптической клетки в синаптическую щель и затем связывается с глутаматными рецепторами на постсинаптической мембране, чтобы начать внутриклеточные сигнальные каскады. Чтобы обеспечить эффективную сигнализацию, уровни глутамата в синаптической щели должны поддерживаться на очень низких уровнях. Этот процесс регулируется перевозчиками глутамата, которые быстро удаляют избыточный глутамат из внеклеточного пространства через механизм поглощения, связанный с натрием-калием.

Высокие уровни внеклеточного глутамата стимулируют глутаматные рецепторы, позволяя чрезмерный приток Ca2 + в клетки, вызывающие множество внутриклеточных событий в постсинаптических нейронах, что в конечном итоге приводит к гибели нейронов. Это явление известно как экситотоксичность, которая была замечена как важный механизм ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD) и Хантингтона (HD).

Все больше доказательств того, что глутаматная экситотоксичность была вовлечена в смерть RGC при глаукоме, хотя ее точная роль спорна. Смерть RGC, связанная с глутаматом, впервые была представлена ​​в конце 1950-х годов, когда Лукас и Ньюхаус (1957) обнаружили, что подкожная инъекция глутамата выборочно повреждает внутренний слой сетчатки. Десять лет назад Дрейер и др. (1996) сообщили об увеличении концентрации глутамата в стекловидном веществе у пациентов с глаукомой и экспериментальных обезьян-глаукомы, и этот вывод был подтвержден исследованиями с использованием собаки (Brooks et al., 1997) и перепела (Dkhissi et al., 1999). Хотя эти результаты недавно были опрошены другими исследователями (Carter-Dawson et al., 2002; Levkovitch-Verbin et al., 2002; Honkanen et al., 2003; Wamsley et al., 2005), это не исключает экситотоксичность механизма в глаукоме, поскольку существуют определенные трудности в измерении уровней глутамата in vivo (Salt and Cordeiro, 2006).

В дополнение к возможности увеличения высвобождения глутамата из поврежденных РГК в глаукоме, снижение зазора глутамата может также возникать в результате неэффективного поглощения переносчиками глутамата, присутствующими в мембранах нейронов и глиальных клеток. В связи с этим в экспериментальной сетчатке глаза глаукомы наблюдалось значительное снижение перегрузок глутамата GLAST (EAAT1) и GLT-1 (EAAT2) (Martin et al., 2002). Однако, вместо сокращения, сообщалось об увеличении экспрессии GLAST в клетках сетчатки сетчатки Muller с использованием аналогичной модели (Woldemussie et al., 2004), где авторы предложили компенсаторный механизм. Хотя в других исследованиях не было выявлено дефекта, вызванного глаукомой, в механизмах клиренса глутамата сетчатки (Hartwick et al., 2005), специфический глютамат-транспортер GLT-1c, который обычно выражается только фоторецепторами, был идентифицирован в RGCs при экспериментальной глаукоме , и это может указывать на аномалию в гомеостазе глутамата (Sullivan et al., 2006).

Возможно, наиболее эффективным исследованием роли экситотоксичности глутамата в глаукоме является изучение влияния блокирования рецепторов глютамата RGC. Это можно сделать с помощью ионно-связанных (ионотропных) или G-белковых (метаботропных) рецепторов в ЦНС и сетчатке. RGCs экспрессируют множественные подтипы этих рецепторов (Hamassaki-Britto et al., 1993; Brandstatter et al., 1994; Hartveit et al., 1995; Fletcher et al., 2000). Ионотропные (iGlu) рецепторы включают N-метил-d-аспартат (NMDA), α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионат (AMPA) и KA (каинит) подтипы; и среди них были широко изучены NMDA-рецепторы, которые являются наиболее проницаемыми для Ca2 +.

Постсинаптические NMDA-рецепторы представляют собой гетеромерные комплексы ионных каналов, которые состоят из двух NR1 и двух субъединиц NR2, которые могут быть либо типами NR2A, -2B, -2C, либо 2D. NR1 содержит специфический сайт, связывающий глутамат, тогда как NR2 связывается с глицином, который действует как соагонист для активации рецептора. Когда и глутамат, и глицин связываются с рецепторами, клетки деполяризуются, что приводит к высвобождению Mg2 +, который блокирует канал. Открытие канала является переходным в нормальном физиологическом состоянии, позволяя соответствующим количествам внеклеточного Ca2 + и Na + проникать в клетку, чтобы инициировать внутриклеточные сигнальные каскады. Однако чрезмерная экспрессия внеклеточного глутамата заставляет канал оставаться открытым дольше, чем необходимо; в результате чрезмерное количество Ca2 + втекает в клетку, вызывая гибель клеток.

Было показано, что блокирование NMDA-рецепторов специфическими антагонистами является эффективным при уменьшении смерти RGC при экспериментальной глаукоме. Мемантин, неконкурентный антагонист NMDA, является, пожалуй, самым известным глутаматным модификатором и недавно был доказан клинически полезным при лечении умеренного и тяжелого AD (Lleo et al., 2006). Было продемонстрировано, что мемантин является высокоэффективным нейропротективным агентом на различных моделях животных RGC (Lagreze et al., 1998; Osborne, 1999; Kim et al., 2002; WoldeMussie et al., 2002). Применение мемантина значительно увеличивало выживаемость RGC в экспериментальной крысиной глаукоме (WoldeMussie et al., 2002), и аналогичный результат был получен с использованием модели глаукомы трансгенной мыши DBA / 2J (Schuettauf et al., 2002). Кроме того, мемантин показал, что он предотвращает не только структурное повреждение, но и функциональную потерю экспериментальной глаукомы обезьян (Hare et al., 2004a, b). В настоящее время Memantine находится в фазе IV клинического испытания глаукомы, результаты которого с нетерпением ждут.

Используя DARC, мы оценили влияние различных стратегий модуляции глутамата, включая неселективный (MK801) и селективный антагонист NMDA-рецептора (ифенпродил) и метаботропный агонист рецептора глутамата (mGluR Group II, LY354740), в моделях крыс, связанных с глаукомой, в естественные условия. Мы показали, что DARC является полезным инструментом для скрининга нейропротекторной терапии и мониторинга апоптоза RGC в экспериментальной глаукоме (Guo et al., 2006).

Как и мемантин, MK801 является антагонистом NMDA с широким спектром и, как сообщается, защищает нейроны сетчатки от токсичности, вызванной NMDA и давлением (el-Asrar et al., 1992; Chaudhary et al., 1998). Ifenprodil, NR2B-субъединичный селективный антагонист NMDA, специфичен против индуцированной SSP гибели клеток (Williams et al., 2002). LY354740 является высокоэффективным и селективным агонистом метаботропного рецептора II группы (mGluR), который был зарегистрирован как нейропротективен против гибели нейронов, индуцированной NMDA или SSP, у крысиных ЦНС (Monn et al., 1997; Bond et al., 1998; Kingston et al., 1999). Метаботропные рецепторы подразделяются на три группы. Имеются данные о том, что активация mGluRs группы I увеличивает возбуждение нейронов, тогда как активность II и III групп mGluR уменьшает синаптическую передачу; поэтому агонисты группы II и III mGluR и антагонисты группы I могут считаться нейропротективными (Nicoletti et al., 1996). Было обнаружено, что все mGluRs экспрессируются в сетчатке (Hartveit et al., 1995; Shen and Slaughter, 1998; Tehrani et al., 2000; Robbins et al., 2003).

В этом исследовании (Guo et al., 2006) мы впервые оценили влияние каждого отдельного агента на апоптоз RGC в нашей модели SSP. Используя DARC, мы показали, что все методы лечения уменьшали апоптоз RGC дозозависимым образом и что MK801 был более эффективен, чем ifenprodil. Однако, как сообщается, MK801 является нейротоксичным из-за его высокой аффинности к каналу NMDA-рецептора, что вызывает его накопление в каналах и блокирование критических нормальных функций (Lipton, 1993, 2004a). Чтобы свести к минимуму его токсичность, но по-прежнему использовать нейропротекторные свойства, мы также рассмотрели эффект сочетания низкой дозы MK801 с LY354740 и обнаружили, что эта комбинация наиболее эффективна для предотвращения апоптоза RGC по сравнению с одним только агентом, что может быть связано с их различные фармакологические свойства при модулировании глутаматной возбуждающей передачи.

Затем мы применили наиболее оптимальные схемы комбинирования MK801 и LY354740 к модели OHT в разные моменты времени (0, 1 и 2 недели после повышения IOP), и наши результаты DARC показали, что наиболее эффективный момент применения лечения был равен 0 недель (время подъема IOP) (p <0,05, рис.2). Мы полагаем, что это связано с применением модуляторов глутамата во время первичного оскорбления (повышение IOP), что приводит к максимальному ингибированию высвобождения глутамата из первичных поврежденных РГК, что приводит к предотвращению вторичной дегенерации - процесса, в котором RGCs, которые выживают первоначальное повреждение впоследствии повреждается токсическими эффектами первичных дегенерирующих нейронов (Levkovitch-Verbin et al., 2001, 2003; Kaushik et al., 2003). Наши данные DARC сильно поддерживают участие глутамата в глаукоме (Guo et al., 2006; Salt and Cordeiro, 2006).

Алкоголь-белок-амилоид-β (Aβ) является основной составляющей амилоидных бляшек в AD. Aβ представляет собой аминокислотный пептид, полученный из протеолитического расщепления белка предшественника амилоида (APP), трансмембранного белка. Для обработки APP выявлены два пути катаболических путей: неамилоидогенный путь, основанный на активности α-секретазы и приводящий к секреции растворимых форм APP, функционирующий как сигнальная молекула клеточной поверхности для модуляции роста нейритов, синаптогенеза и выживаемости клеток (Li et al. ., 1997; Pastorino and Lu, 2006) и амилоидогенный путь, где активность β- ​​и γ-секретазы приводит к генерации Aβ. Считается, что агрегация Aβ в головном мозге является основной движущей силой нейродегенерации и когнитивного спада, приводящего к деменции (Auld et al., 2002), а нейротоксичность Aβ участвует в нейропатологии AD, хотя ближайшая причина нейродегенератора, ответственного за когнитивные (Hardy and Selkoe, 2002; Pepys, 2006). Было показано, что блокирование амилоидогенного пути APP является многообещающим подходом для предотвращения повреждения нейронов в AD.

Недавно сообщалось, что амилоид-β участвует в развитии апоптоза RGC при глаукоме, демонстрируя аномальную обработку APP с помощью каспазы-3 с повышенной экспрессией Aβ в RGCs у крысы OHT (McKinnon et al., 2002) и DBA / 2J трансгенных мышей (Goldblum et al., 2007). Кроме того, у пациентов с глаукомой у пациентов с глаукомой наблюдались пониженные уровни стеклования по сравнению с контролем, что указывало на отложение Aβ в сетчатке (Yoneda et al., 2005). Дальнейшее доказательство связи между глаукомой и AD возникло из исследований, показывающих, что у пациентов с AD наблюдаются потери RGC и уменьшенная толщина слоя нервных волокон сетчатки (RNFL), связанная с типичными глаукоматозными изменениями, такими как зрительная невропатия и нарушения зрения (Blanks et al., 1996a, b; Parisi et al., 2001; Danesh-Meyer et al., 2006; Iseri et al., 2006; Tamura et al., 2006; Berisha et al., 2007), как это имеет место в PD (Bayer et al., 2002). Это указывает на аналогичные патологические механизмы, включающие Aβ, приводящие к потере RGC как вовлеченные в мозг (Loffler et al., 1995; Vickers et al., 1995; Archer et al., 1998; Johnson et al., 2002).

Используя DARC, мы недавно предоставили дополнительные данные экспериментальной глаукомы, подтверждающие участие Aβ в развитии глаукоматозного апоптоза RGC (Guo et al., 2007). Мы наблюдали значительное увеличение отложения Aβ в слое RGC в OHT-модели по сравнению с контролем, причем Aβ колокализуется до апоптотических RGC. Данные визуализации DARC также показали, что применение экзогенного пептида Aβ индуцирует значительный апоптоз RGC in vivo в зависимости от дозы и времени.

Обнаружение повышенного отложения Aβ в экспериментальной глаукоме и ее индукция апоптоза RGC in vivo свидетельствует о том, что Aβ может быть фактором, опосредующим апоптотические изменения в клетках RGC в нашей модели глаукомы. Чтобы исследовать нашу гипотезу о том, что нацеливание на образование и агрегацию Aβ может уменьшить апоптоз RGC, мы исследовали три различных агента, включая ингибитор β-секретазы (βSI), антитело против Aβ (Aβab) и конго-красный (CR) (Guo et al. ., 2007) (рис.3).

β-Secretase, мембранно-закрепленная аспарагиновая протеаза, ответственна за начальную стадию расщепления APP в амилоидогенном пути, приводящем к образованию Aβ; Таким образом, βSI ингибируют генерацию Aβ с доказательством эффективности in vitro и in vivo в связанных с AD моделях (Citron, 2002; Yamamoto et al., 2004). Было показано, что CR, краситель, обычно используемый для окрашивания гистологически амилоида-β, полностью блокирует агрегацию и токсичность Аβ в культурах нейронов гиппокампа крысы (Lorenzo and Yankner, 1994), и считается, что его ингибирующие эффекты являются результатом интерференции с расщеплением белков Aβ, образованием фибрилл (Lorenzo and Yankner, 1994; Hirakura et al., 1999). Считается, что Aβabs работают не только с блокированием агрегации Aβ (Bard et al., 2000), но также и с увеличением клиренса Aβ в животных животных животных (Vasilevko and Cribbs, 2006) (рис.3).

Наши данные DARC показали, что все три лечения изменяли профиль апоптоза RGC временным образом, задерживая развитие пикового апоптоза RGC, а также уменьшая пиковый уровень апоптоза RGC. Среди них анти-Aβ ab оказался наиболее эффективным в предотвращении апоптоза RGC по сравнению с CR и βSI. Однократное применение Aβab показало длительный эффект до 16 недель после повышения IOP. Для сравнения, у CR появилось более короткое окно защиты RGC и βSI не оказало существенного влияния на глаукоматозный апоптоз RGC (рис.4).

Возможно, самым значительным результатом работы с DARC была комбинированная терапия, нацеленная на три разных аспекта пути Aβ. В сочетании, нейропротективный эффект всех трех агентов (тройная терапия) был значительно улучшен через 3 недели после повышения IOP по сравнению с Aβab отдельно (фиг.5). Комбинированная терапия вызывала максимальное снижение апоптоза RGC (> 80%).

Используя DARC, мы подчеркнули, что Aβ является вероятным медиатором гибели RGC, вызванной давлением, и что нацеливание на несколько стадий пути Aβ может обеспечить потенциальную нейропротективную стратегию в лечении глаукомы.

Коэнзим Q10 (CoQ10) является важным нерастворимым компонентом митохондриальной дыхательной цепи, где он транспортирует электроны из комплексов I и II в комплекс III, с помощью которого получают АТФ. Сообщается, что CoQ10 обеспечивает нейропротекцию, предотвращая гибель нейронов (Papucci et al., 2003). CoQ10 действует как мощный антиоксидант, поддерживая потенциал митохондриальной мембраны и ингибируя генерацию ROS, когда нейрональные клетки подвержены окислительному стрессу (McCarthy et al., 2004; Somayajulu et al., 2005). Было показано, что CoQ10 предотвращает апоптоз RGC в модели транзиторной ишемии, индуцированной давлением, путем минимизации увеличения синаптического глутамата и ингибирования образования MPTP (Nucci et al., 2007). CoQ10 безопасно используется у пациентов с нейродегенеративными нарушениями (Levy et al., 2006; Liu, 2007).

Мы исследовали влияние местного CoQ10 на снижение апоптоза RGC in vivo с использованием нашей модели крысы SSP (Cordeiro et al., 2007). Наши результаты визуализации DARC показали, что CoQ10 на 0,1% значительно снижает SSP-индуцированный апоптоз RGC по сравнению с CoQ10 0,05% и носителем. Наиболее эффективное управление временем было через 1 час после применения SSP. Эффект CoQ10 на предотвращение апоптоза RGC можно объяснить его свойством ингибировать деполяризацию митохондрий, выделение цитохрома c и активацию каспазы-9 (Papucci et al., 2003).

В настоящее время нет хорошего и быстрого метода оценки нейропротекции при глаукоме. Единственный нейропротективный препарат, который подвергся крупномасштабному клиническому испытанию при глаукоме, мемантине, опирался на статус визуального поля как на определенную конечную точку, что привело к дорогостоящему 6-летнему периоду наблюдения — с еще не опубликованным результатом. Мы считаем, что наша недавно разработанная технология визуализации DARC является крупным достижением в этой области, с потенциалом предоставления столь необходимой новой конечной точки при глаукоме. Это подтверждается нашей экспериментальной работой, которая ясно продемонстрировала силу этой технологии при оценке нейропротективных стратегий. Клинические испытания DARC должны начаться в 2008 году, и мы с нетерпением ожидаем результатов.

Aβab
            
              анти-Aβ-антитело

Болезнь Альцгеймера

альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-isoxazolepropionate

белок-предшественник амилоида

мозговой нейротрофический фактор

Конго красный

Коэнзим Q10

конфокальная лазерная офтальмоскопия

обнаружение апоптозирующих клеток сетчатки

изотиоцианат флуоресцеина

перегрузчик глутамата

болезнь Хантингтона

каинит

переходная проницаемость митохондрий

N-метил-D-аспартат

глазная гипертензия

болезнь Паркинсона

фосфатидилсерин

сетчатка ганглиона сетчатки

активные формы кислорода

ингибитор β-секретазы

стауроспорин Aβ: амилоид-β

фактор некроза опухоли-α

Работа была поддержана Wellcome Trust Grant, T.F.C. Frost and Lilly Research Laboratories.

DARC-визуализация in vivo показывает апоптоз клеток ганглиозных клеток (RGC) при установке сетчатки крысы OHT через 3 недели после повышения IOP. Белые пятна представляют собой апоптотические РГК.

DARC выявляет комбинированные эффекты глутаматных модуляторов при уменьшении апоптоза RGC в модели OHT. Аппоз RGC, индуцированный давлением, через 3 недели (А) был значительно снижен путем комбинированной обработки MK801 и LY354740 (B). Администрация по срокам показала, что наиболее эффективное применение для лечения составило 0 недель (время подъема IOP, C).

Путь амилоид-бета (Aβ) и его нацеливание. Аномальная обработка APP вызывает генерацию Aβ, приводящую к гибели нейронов. Используя DARC, мы оценили влияние нацеливания на формирование и агрегацию Aβ на предотвращение глаукоматозного апоптоза RGC ингибитором β-секретазы (βSI), анти-Aβ-антителом (Aβab) и конго-красным (CR).

Изображения DARC in vivo показывают влияние отдельных агентов, включая антитело Aβ (Aβab, A и B), красный конго (CR, C и D) и ингибитор β-секретазы (βSI, E и F) на апоптоз RGC при 3 (A, C и E) и 16 (B, D и F) через несколько недель после повышения IOP. Aβab и CR вызывали значительное процентное снижение апоптоза RGC через 3 недели по сравнению с контролем (G).

Эффекты комбинации Aβ-нацеливающей терапии на апоптоз RGC. По сравнению с контролем без лечения (A), визуализация DARC показывает тройную терапию (C, Aβab + CR + βSI) была более эффективной, чем Aβab отдельно (B) в снижении апоптоза RGC в OHT-модели.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *