Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Аксоны ганглиозных клеток сетчатки оскорбляют зрительный нерв в начале глаукомы DBA / 2J

Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2373494/

Переписка с Саймоном У.М. Джон: simon.john@jax.org

Здесь мы используем модель мыши (DBA / 2J) для переадресации местоположения оскорблений (я) в ганглиозные клетки сетчатки (RGCs) при глаукоме. Мы локализуем ранний признак повреждения аксонов в богатой астроцитом области зрительного нерва только сзади сетчатки, аналогичной пластинчатой ​​криброзе. В этом регионе сеть астроцитов тесно связана с аксонами RGC. Использование BAX-дефицитных мышей DBA / 2J, которые сохраняют все их RGC, мы предоставляем экспериментальные данные для оскорбления в пределах или очень близко к пластинке в зрительном нерве. Мы показываем, что проксимальные сегменты аксона, прикрепленные к их клеточным телам, выживают до близости пластинки. Напротив, сегменты аксона в пластинке и за глазом вырождены. Наконец, аллель Wlds, который, как известно, защищает от оскорблений аксонов, сильно защищает от глаукомы DBA / 2J и сохраняет активность RGC, как измерено электроретинографией образца. Эти эксперименты дают убедительные доказательства локального оскорбления аксонов в зрительном нерве.

G.R. Howell и R.T. Либби внесла равный вклад в эту работу.

R.T. Настоящий адрес Либби — Университет глаз Рочестерского университета, Медицинский центр Университета Рочестера, Рочестер, Нью-Йорк.

Сокращения, используемые в этой статье: ECM, внеклеточная матрица; GFAP, глиальный фибриллярный кислый белок; H & E, гематоксилин и эозин; PERG, модель электроретинографии; PPD, парафенилендиамин; RGC, ганглиозная клетка сетчатки.

Потеря зрения при глаукоме вызвана дисфункцией и гибелью ганглиозных клеток сетчатки (РГК). Молекулярные пути, которые повреждают РГК в глаукоме, не поняты, и неясно, как и где оскорбляют РГК. Возможно, что отдельные части RGC прямо оскорблены. Сущность данных поддерживает первоначальное оскорбление аксонов RGCs в области щелевой кривизны зрительного нерва, когда они выходят из глаза. Кристаллизация пластинки состоит из перфорированных листов или пластинок из внеклеточного матрикса (ECM, в основном коллагена), которые обеспечивают опору для аксонов при прохождении через заднюю стенку глаза (Anderson, 1969).

Важные исследования у людей и приматов показали, что раннее повреждение RGC связано с дегенеративными изменениями сегмента аксона в пластинчатой ​​криброзе (например, Anderson and Hendrickson, 1974; Anderson and Hendrickson, 1977; Quigley and Anderson, 1976, 1977; Quigley and Addicks , 1980; Quigley et al., 1979, 1980, 1981, 1983). Связи аксонов предлагается быть уязвимыми, поскольку они проходят через поры ламина. Предполагается, что повышенный ВГД вызывает искажение или «поклонение» пластин ECM, что в свою очередь повреждает пучки аксонов механическим напряжением (Quigley et al., 1983). Было предложено также механическое искажение пластин ECM для воздействия на глаукому, воздействуя на кровеносные сосуды (Quigley and Addicks, 1981; Maumenee, 1983; Fechtner and Weinreb, 1994). Было установлено, что местный ущерб на пластине объясняет аномальный перенос аксонов при глаукоме и ее животных моделях (Anderson and Hendrickson, 1974). Важно отметить, что пластины ECM пластинки покрыты астроцитами, которые обеспечивают аксоны нейротрофическими и другими формами поддержки. Таким образом, альтернативная гипотеза предполагает, что повышение IOP каким-то образом изменяет эти глиальные клетки, чтобы они повредили аксоны RGC (Hernandez, 2000). Потеря функций глиальной поддержки также может быть важна для компрометации нейронов (Lappe-Siefke et al., 2003).

В результате рецессивных мутаций в двух генах (Gpnmb и Tyrp1) мыши DBA / 2J развивают повышенную ВГД и глаукому с возрастом (Chang et al., 1999; Anderson et al., 2002). Из-за сходства с заболеванием человека эта глаукома в настоящее время широко используется в качестве суррогатной модели для глаукомы человека (Danias et al., 2003; Libby et al., 2005a; Schlamp et al., 2006; Steele et al., 2006) , Используя мышей DBA / 2J, мы и другие предоставили доказательства, согласующиеся с прямым оскорблением аксонов RGC в зрительном нерве. Во-первых, у BAX-дефицитных мышей DBA / 2J происходит дегенерация аксонов, но выживает RGC somata, что указывает на то, что дегенерация аксонов не является следствием смерти RGC (Libby et al., 2005b). Во-вторых, смерть RGC не является однородной по сетчатке в глаукоме DBA / 2 (Danias et al., 2003; Jakobs et al., 2005; Filippopoulos et al., 2006; Schlamp et al., 2006). Вместо этого RGCs вырождаются в определенных веерообразных участках сетчатки (Jakobs et al., 2005; Schlamp et al., 2006), которые согласуются с повреждением конкретных пучков аксонов в зрительном нерве. Полагают, что веерообразные области потери клеток эквивалентны дугообразным скотомам глаукомы человека. Скотомы аркуаты напоминают поклонников с боковым изгибом и также предполагаются результатом травмы аксона (Shields, 1997). Считается, что разница в ориентации фанатов отражает различные пути, которые аксоны следуют в двух видах.

Хотя это согласуется с оскорблением аксона, текущие данные от людей, приматов и грызунов не позволяют экспериментально продемонстрировать, что аксон оскорблен в пластинке при глаукоме. В общем случае хорошо известно, что первый сайт повреждения нейронов может быть удален от места инсульта (обзор см. Conforti et al., 2007). Например, в перерезанных моторных аксонах сначала возникают нервно-мышечные соединения, которые в нескольких сантиметрах от поражения дегенерируют. Аксоны, непосредственно прилегающие к поражению, остаются нетронутыми в два-три раза дольше, чем отдаленные терминалы (Beirowski et al., 2005). Таким образом, обнаружение первых дегенеративных изменений в зрительном нерве не то же самое, что демонстрирует, что зрительный нерв является участком оскорбления в глаукоме.

Здесь мы используем мышей DBA / 2J для переоценки, если мышечный зрительный нерв имеет пластинку и определить, является ли оскорбление аксонов в пластинке критической в ​​глаукоме. Мы разработали субстраты DBA / 2J, которые имеют специфические мутации или флуоресцентный маркер, что позволило нам оценить важность повреждения аксонов. Кроме того, мы использовали генетически подобранный контрольный штамм DBA / 2J, который не развивает глаукому (Howell et al., 2007). Используя эти ресурсы, мы показываем, что мыши DBA / 2J имеют астроцитарную или глиальную пластинку, но ей не хватает пластин ECM человеческой пластинчатой ​​криброзы. Далее мы приводим доказательства прямого оскорбления аксонов RGC в зрительном нерве и, вероятно, внутри пластинки. Наконец, мы показываем, что медленная аллеля валериановой дегенерации (Wlds) сильно защищает от глаукомы в штамме DBA / 2J. Вместе наши данные дают убедительные экспериментальные данные о том, что важным и ранним событием в глаукоме является повреждение аксонов ганглиозных клеток сетчатки, когда они выходят из глаза через пластинку.

Сообщается, что мыши не имеют пластинчатой ​​криброзы (Tansley, 1956, Fujita et al., 2000; Morcos and Chan-Ling, 2000; May и Lutjen-Drecoll, 2002), но штамм DBA / 2J развивает глаукому с признаками человеческой глаукомы. Учитывая предполагаемое значение ламина в глаукоме, мы переоценили состояние пластинки у пожилых мышей DBA / 2J (11-12 мес). Было высказано предположение, что пластины ECM пластинки становятся более устойчивыми с возрастом (Hernandez et al., 1989). Сначала мы использовали субстрат DBA / 2J, который не развивает глаукому (D2-Gpnmb
+, Howell et al., 2007), что позволило провести первоначальные исследования ламины без каких-либо смешающих эффектов заболевания.

Оптический нерв мыши имеет четко определенную область с надежной сетью глиальных фибриллярных кислых белков (GFAP) -положительных астроцитов (фиг.1 и 2). Астроциты этой области образуют замкнутую сеть глиальных клеток, через которые проходят аксоны RGC, и они тесно связаны с аксонами (рис.2). Эта сеть начинается, когда нерв переходит в склеральный канал, и он простирается назад, заканчиваясь перед миелинизацией большинства аксонов (схематически показано на рисунке 3). В этом регионе нет доказательств наличия коллагеновых пластинок, причем обильный коллаген наблюдается только в стенках кровеносных сосудов (рис.1 и 2). Чтобы отразить эквивалентное местоположение по сравнению с человеческой пластинкой cribrosa, аналогичное расположение глиальных клеток, но отсутствие пластин ECM, мы называем эту область глиальной пластинкой.

У пожилых мышей есть устойчивая глиальная пластинка, в которой отсутствуют пластины ECM. (A-F) Оптические нервы 11-12-месячных мышей DBA / 2J, которые не развивают глаукому (D2-Gpnmb
+) были последовательно секционированы в продольных или поперечных плоскостях. Прочная астроцитарная сетка окружает аксоны, где они выходят из глаза мыши. Астроцитарная сетка (глиальная пластинка, очерченная скобками) отчетливо проявляется в виде обильных ядер, ориентированных под прямым углом к ​​длинной оси зрительного нерва (A и B) и сотовой сети (C и D, наконечники стрел) с обширными процессами, которые окрашивают положительный для GFAP (E и F). В отличие от пластинчатой ​​криброзы зрительного нерва человека (см. Quigley and Addicks [1981]), астроциты мыши не покрывают сеть прочных коллагеновых пластин (G и H). Хотя коллагены хорошо видны в стенках кровеносных сосудов (наконечники стрел), нет сетки окрашивания коллагена, которая отражает астроцитарную сетку. Все представленные поперечные сечения находятся внутри области пластинки. V, сосудов. Разделы окрашивали гематоксилином и эозином (H & E) (A и B, клетки и аксоны розовые, ядра фиолетово-синие); Бодианское пятно (C и D, аксоны бледно-голубые, ядра темно-фиолетово-синие, глиальные клеточные тела и процессы остаются ясными); анти-GFAP с окрашиванием гематоксилином (E и F, тела астроцитов и процессы коричневые, ядра фиолетово-синие); или трихрома Массана (G и H, коллагены окрашиваются в синий цвет). Бары, 50 мкм.

Интимная ассоциация аксонов и астроцитов в глиальной пластине мыши. (A-F) Все электронные микрофотографии находятся в продольной плоскости и от интенсивно GFAP-положительной области, обозначенной скобкой. (B) В этой области пучки аксонов (AX) заключены между столбцами астроцитов (pial columns, PC), которые проходят в рострально-каудальном направлении. Глиняная сетка пластинки (GL) ориентирована под прямым углом к ​​пияльным колоннам. N, ядер астроцитов. (C-E) Аксоны и глии тесно упакованы, а глиальные процессы (E, стрелки) тесно связаны с отдельными аксонами. (F) При более высоком увеличении микрофибриллы (MF) идентифицируют астроцитные процессы, которые легко дифференцируются от аксонов. Никакие коллагеновые пластинчатые структуры не были связаны с астроцитами. (G и H) Конфокальный микроскопический анализ поперечного сечения в той же области также указывает на очень близкую связь между глией и аксонами. Антинейрофиламент (аксоны), зеленый; анти-GFAP (астроциты), красный; DAPI (ядра), синий. V, сосудов. (A), 50 мкм. (B-F) Бары, 2 мкм. (G и H), 20 мкм.

Области зрительного нерва и уровни повреждений. (A) Схема, показывающая области, которые мы определяли как слой нервных волокон, предварительно ламина и ламина (не для масштабирования). Аксоны (розовый) проходят в головку зрительного нерва, проходят через глаз через глиальную пластинку (кросс-хаты, расположенные внутри склерального канала) и становятся миелинизированными за глазом (горизонтальные линии). Ret, сетчатка; V, сосуды; Sc, sclera. (B) Тяжесть глаукоматозного повреждения нерва определялась в ретро-орбитальной части каждого зрительного нерва (Материалы и методы). Каждый присвоенный уровень урона явно отличается от подсчета аксонов. Количество аксонов было следующим: D2-Gpnmb
+ без глаукомы (белый бар) 52074 ± 451 (n = 10), мышей DBA / 2J (черные полосы), без или ранней глаукомы 51862 ± 934 (n = 10), умеренной глаукомы 33283 ± 2199 (n = 15) , и тяжелой глаукомы 5454 ± 1211 (n = 24). Количество аксонов для нервов без раннего повреждения не было статистически иным, чем отсутствие глаукомы D2-Gpnmb
+ элементы управления. Они классифицируются как отсутствие или ранняя глаукома, потому что не наблюдается глаукоматозного повреждения нерва за глазом, но в оцененном возрасте некоторые из глаз должны находиться на ранних стадиях глаукомы. Различия, сравнивающие уровни отсутствия или раннего, умеренного и сильного повреждения, были значительными (P <0,001). (C-J) Репрезентативные изображения D2-Gpnmb + без глаукомы (C и G) и DBA / 2J без или ранней глаукомы (D и H), умеренной глаукомы (E и I) и тяжелой глаукомы (F и J). Очень мягкий возрастной ущерб, подобный тому, который встречается у других неглаукоматозных штаммов мыши, встречается у D2-Gpnmb + штамм (C, стрелка показывает один поврежденный аксон, который мрачно окрашивается с помощью PPD, Материалы и методы). Это возрастное повреждение наблюдается также у зрительных нервов DBA / 2J, которые, как было установлено, не имеют ранней глаукомы (D, стрелка). Утончение слоя нервных волокон (наконечники стрел) проявляется в H & E-окрашенных срезах умеренно затронутых нервов, а тяжелые нервы имеют очевидную потерю слоя нервных волокон и раскопки зрительного нерва (звездочка). Эти изменения являются признаками глаукомы. C-F - полутонкие участки, окрашенные PPD. G-J - пластиковые секции, окрашенные H & E. V, сосудов. Бары, 100 мкм.

Поскольку глиальная пластинка мышей DBA / 2J полностью лишена пластинок ECM, мы использовали комбинацию электронной микроскопии и иммуногистохимии для определения места первоначального повреждения аксонов в этой модели глаукомы. Мы проанализировали аксоны, когда они собираются в слое нервных волокон, проходят через головку зрительного нерва (область преламина) и выходят из глаза через пластинку у мышей, которые были 11-12 месяцев. В эти периоды степень глаукоматозного повреждения зависит от глаз (Libby et al., 2005a). Мы выбрали глаза DBA / 2J, у которых не было обнаруженной глаукомы. Некоторые из этих глаз должны находиться на ранних стадиях заболевания и классифицируются как не имеющие ранней глаукомы (рис.3, а также материалы и методы).

У мышей DBA / 2J без или ранней глаукомы поврежденные сегменты аксона (разбухшие области с дезорганизацией аксоновского содержимого и накопление органелл и нейрофиламентов) были легко идентифицированы в глиальной пластине (рис.4). Поврежденные области аксонов похожи на дистрофические нейриты, о которых сообщалось в других условиях (рис.4, F-H) (Vickers, 1997). В изученных глазах дистрофические нейриты не были обнаружены в слое нервных волокон и были редкими в области преламина. В соответствии с предыдущими сообщениями нейрофиламенты накапливались в поврежденных сегментах аксона (рис.4, I и J). Поврежденные сегменты аксона представляли раннее поражение глаукомы, а не только возрастные изменения, потому что они были намного менее обильными в D2-Gpnmb
+ глаза (рис.4, K и L). В некоторых глазах дистрофические нейриты наблюдались только в пластинке, и во всех глазах они были наиболее многочисленными в пластинке (рис.4, К и L).

Ранний повреждение аксонов RGC происходит на пластинке. Аксоны RGC анализировали на предмет глаукоматозного повреждения в разных местах, когда они распространяются через сетчатку и выходят из глаза. Повреждения оценивали в слоях нервных волокон (НФЛ), преламиновой и глиальной областях зрительного нерва. Все мыши были 11 месяцев и не имели ранней глаукомы, основанной на анализе ретро-орбитального зрительного нерва. (A-C) D2-Gpnmb
+ никаких контролей глаукомы, аксоны были здоровыми и имели нормальную морфологию во всех местах на основе электронной микроскопии. Были обнаружены только редкие поврежденные аксоны. Это редкое возрастное повреждение происходит у старых мышей различных штаммов, у которых не развивается глаукома. (D-F). Аксоны мышей DBA / 2J, ориентированных на возраст и пол, с ранней глаукомой не отличались от контролей при любом внутриглазном положении, поскольку они простирались от тела клетки до пластинки. Однако на глиальной пластинке были легко обнаружены дистрофические нейриты (F, стрелки). (G и H) Дистрофические нейриты (стрелки) состояли из набухших и поврежденных сегментов аксона, содержащих накопление органелл, включая набухшие митохондрии (наконечник стрелы). (I и J). Из-за накопления и дезорганизации содержимого аксонов дистрофические нейриты также были обнаружены с использованием комбинации как нефосфорилированных (Smi32), так и фосфорилированных (Smi34) нейрофиламентных антител (зеленый). Они были видны как аномально большие и яркие пятна, поврежденные области аксона (стрелки) в пластине. Хотя дистрофические нейриты, помеченные каждым антителом (не изображены), мы использовали комбинацию, чтобы максимизировать интенсивность окрашивания. GFAP-положительные астроциты показаны красным цветом. (K и L). Подсчет дистрофических нейритов указывает на то, что первый участок морфологического повреждения интраокулярного аксонов RGC встречается в пластинке. Среднее число дистрофических нейритов (DN) на EM-поле в lamina было значительно выше у мышей DBA / 2J без или ранней глаукомы по сравнению с отсутствием глаукомы D2-Gpnmb
+ элементы управления (K, левая панель, P <0,001, t тест, n = 8 глаз на генотип). Это наглядно демонстрирует, что дистрофические нейриты являются частью процесса глаукомы, а не только возрастных изменений. Сравнивая указанные области, число дистрофических нейритов было самым высоким в пластине (Р <0,001). (L) Нейрофиламент и окрашивание GFAP использовали для оценки сериальных сечений зрительного нерва, простирающихся от слоя нервных волокон на поверхности сетчатки и в пластину. Подсчет нейрофиламентных дистрофических нейритов подтвердил результаты ЭМ. Значения для отдельных глаз DBA / 2J показывают, что в этом возрасте некоторые глаза находились на ранней стадии глаукомы со значительно более дистрофическими нейритами, чем контрольные мыши (P <0,001, сравнивая область пластинки DBA / 2J с D2-Gpnmb +; n = 9 на генотип). (A-H), 2 мкм. (I-J), 20 мкм.

Чтобы дополнительно определить местоположение первоначального повреждения аксонов и дать возможность оценить чувствительность целых внутриглазных аксонов от их клеточных тел к глиальной пластине, мы разработали субстрат мышей DBA / 2J, которые экспрессируют CFP в их RGC (D2.Thy1-CFP, Материалы и методы). Поскольку хорошо известно, что аксональные компоненты накапливаются в областях повреждения аксонами, мы полагали, что аксональный CFP будет вести себя одинаково и позволить готовую визуализацию поврежденных сегментов аксона. Аналогичный подход был использован другими (Beirowski et al., 2005).

Целостность аксонов оценивалась от RGC somata до ламины конфокальной микроскопией (фиг.5). В глазах, у которых не было или ранней глаукомы (фиг.3), соматы были легко обнаружены и не имели явных аномалий. Однако в тех же глазах на отдельных аксонах в глиальной пластине присутствовали дискретные и очаговые опухоли (рис.5). Эти опухоли характеризовались очень интенсивным сигналом CFP. Некоторые из этих аксонов имели тяжелые опухоли, которые были похожи по диаметру на дистрофические нейриты (> 2 мкм, намного больше, чем большинство немиелинизированных аксонов в этой области здорового нерва). Однако подавляющее большинство поврежденных аксонов было менее сильно изменено при мягких опухолях, которые были немного больше, чем обычные аксоны (рис.5B). В глазах с ранней глаукомой повреждение аксонов было локализовано на глиальной пластине и редко встречалось в слое преламины или нервных волокон (рис.5). Этот урон отсутствовал у молодых мышей DBA / 2J и увеличился в степени тяжести при прогрессировании глаукомы. Эти результаты подтверждают, что первое морфологическое повреждение окулярной части аксона RGC происходит на глиальной пластине.

Раннее очаговое повреждение аксона происходит в глиальной пластине. Чтобы обеспечить чувствительное обнаружение повреждения аксонов по всему аксону от сомы до ламины, мы проанализировали глаза D2.Thy1-CFP (материалы и методы). Для согласованности с предыдущими изображениями CFP-положительные аксоны являются псевдоцветными зелеными. (A) Схема, демонстрирующая расположение в головке зрительного нерва представленных изображений преламина и ламины (одиночная фокальная плоскость), которые являются одним и тем же глазом для каждого уровня урона. В области прегламина сосуды видны как темная область в центре нерва. В пластине сосуды проходят от центра к краю нерва. (В) В 11-месячном глазе с отсутствием или ранней глаукомой (рис.3), повреждение аксонов было обнаружено как высокофокальное набухание отдельных аксонов в пластине. Как сообщалось ранее для содержания аксонов, CFP накапливается в опухолях, делая их ярко флуоресцентными (наконечники стрел). Набухания не присутствовали в других областях внутриглазного аксона. (C-K) Показаны типичные примеры областей преламина и ламины в глазах с разной степенью глаукомы. (C, F и I) Никакого глаукоматозного повреждения не было обнаружено ни на одном уровне в предглаукомных молодых глазах (n = 4). (D, G и J). Очевидные аксонные вздутия были очевидны именно в пластинке глаз, которая находилась на ранних стадиях глаукомы. Первоначально эти глаза классифицировались как не имеющие ранней глаукомы, основанные на анализе зрительного нерва из-за глаз (рис.3), но у 5/8 было обнаружено раннее повреждение в пластинке. (E, H и K). На умеренных стадиях глаукомы повреждение аксонов распространялось на части аксона как в области преламины, так и на слое нервных волокон, а некоторые аксоны имели сильно аномальную морфологию. Сжатые изображения ламины представляют собой сжатый пакет Z всей области ламины, который может быть отображен в смонтированных образцах (невозможно было изображение самой задней пластинки). Все изображения были собраны с использованием идентичных условий. Бары, 20 мкм.

Впоследствии мы использовали мышей D2.Thy1-CFP с ранней глаукомой для анализа аксонов RGC, простирающихся за глазом от глиальной пластинки до верхнего колликулуса (см. Рис. S1, доступный по адресу http://www.jcb.org/cgi/content /full/jcb.200706181/DC1). В этих глазах мягкие опухоли были самыми многочисленными в пластинке и по существу отсутствовали во всех других местах. Этот вывод также согласуется с ранним оскорблением аксонов в глиальной пластине. В отличие от распределения мягких повреждений в пластинке, ретробульбарном оптическом нерве и во всех регионах, изученных за глазом, наблюдались сильно поврежденные сегменты аксонов с опухолями подобного размера с дистрофическими нейритами (рис. S1). Подсчет этих больших опухолей показал, что их число одинаковое как на пластинке, так и на ретробульбарном оптическом нерве (неопубликованные данные). Тяжелое набухание не было равномерным вдоль каждого затронутого аксона, но происходило фокально (рис. S1). Эта картина характерна для дегенерации аксонов при других заболеваниях и после индуцированного повреждения (Beirowski et al., 2005; Coleman, 2005). Валлерианская дегенерация представляет собой процесс, который приводит к быстрой дегенерации всего сегмента аксона, дистального к поражению (Waller, 1850; Beirowski et al., 2005; Coleman, 2005). В целом, наши данные свидетельствуют о том, что аксоны оскорблены в разной степени внутри пластинки глаза во время ранней глаукомы. Некоторые аксоны страдают от серьезного оскорбления, которое, как представляется, приводит к быстрой валерианской дегенерации, в то время как многие другие аксоны страдают меньшим оскорблением, что приводит к более мягкому повреждению, которое недостаточно для индуцирования валерианоподобной дегенерации дистального аксона (по крайней мере первоначально) ( см. Whitmore et al., 2005).

Мы и другие показали, что потери RGC в сетчатке мышей DBA / 2 происходят на региональном уровне (Danias et al., 2003; Jakobs et al., 2005; Schlamp et al., 2006). В соответствии с этим потеря аксонов была неравномерной в пластинке, но происходила в отдельных областях, которые варьировались от нерва до нерва (рис.6, A-F).

Дегенерация аксона регионализована в пластинке и соответствует веерообразным потерям RGC в сетчатке. (A-F) Сжатые изображения стопки Z через пластинку нервов DBA / 2J с увеличением уровня глаукоматозного повреждения (нейрофиламенты, зеленый цвет, положительный гелий GFAP, красный). Потеря / выживание Axon четко разделена на разные области зрительного нерва и не распределяется случайным образом. (G и H) сетчатка и соответствующая область ламины глаза с умеренной глаукомой. Дискретные веерообразные области потерь RGC проявляются в сетчатке (пунктир «V», G) и, по-видимому, соответствуют двум регионализованным областям потери аксонов в пластине (пунктирные коробки, H). Это согласуется с локализованным повреждением аксонов внутри пластинки, что приводит к появлению в форме веретенообразных узоров RGC в сетчатке, но нельзя было однозначно следить за областью потерь аксонов через всю головку зрительного нерва. Бары, 50 мкм.

Если местные оскорбления аксонов определяют RGCs, которые вырождаются, региональная потеря / выживание аксонов в ламине должна соответствовать регионам потери / выживания RGC в сетчатке. Таким образом, мы сравнили картину потери / выживания РГК и связанных с ними аксонов в сетчатке с рисунком в пластине. В глазах с ранней или умеренной глаукомой, дискретные области потери аксонов в глиальной пластине, по-видимому, соответствовали различным регионам потерь RGC в сетчатке (рис.6, G и H). Кроме того, в глазах D2.Thy1-CFP с умеренной или тяжелой глаукомой мы смогли проследить аксоны от RGC, выживших в веерообразных областях сетчатки до головы зрительного нерва и в пластинку, где они образовывали отдельные пучки (рис.7 ). Таким образом, аксоны, выживающие в отдельных областях пластинки, соответствуют веерообразным секторам РГК, выжившим в сетчатке. Эти результаты согласуются с последовательностью событий, в которых локализованные оскорбления в глиальных пластинах повреждают пучки аксонов и приводят к веерообразным узорам RGC-потерь в сетчатке. Несмотря на то, что эти результаты показывают, что гибель аксона и клетки связана друг с другом, они сами по себе не могут отличить, какие именно причины.

Аксоны из выживших RGCs отслеживают дискретные области в глиальной пластине и многие другие аксоны, которые выживают в глазу, теряются в пластинке. Доказательство прямой зависимости между характером выживания / потери RGC в определенных областях зрительного нерва и сетчатки. D2.Thy1-CFP-меченые аксоны были найдены из RGC, выживших в отдельных веерообразных областях сетчатки в отдельные локальные области в глиальной пластине. Установленная ткань была оптически разделена конфокальным микроскопом, начиная с поверхности сетчатки и захватывая изображения с интервалом 0,5 мкм от слоя нервных волокон до глиальной пластинки. (A) Сжатый пакет Z сетчатки и ее зрительного нерва. Псевдоцветные (зеленые, желтые, синие и красные) аксоны с правой стороны перемещаются из веерообразных областей сетчатки в отдельные области в глиальной пластине. Выжившие аксоны слева (псевдоцвет в белом) перемещаются из сетчатки, но заканчиваются прямо перед пластиной, что ясно показывает, что некоторые аксоны, которые выживают в глазу, теряются в пластинке. (B) Схематическое обозначение положений оптических секций, показанных на других панелях. (C и F) Сжатый пакет Z с контуром зрительного нерва на глиальной пластинке, обозначенной пунктирным кольцом (C, псевдоцвет, F, необработанный оттенок серого). (D и G) Однослойное изображение в слое нервных волокон. (E и H) Однослойное изображение в глиальной пластине с нервом, обозначенным пунктирным кольцом. Пунктирная линия указывает, что кровеносные сосуды поступают в зрительный нерв на этом уровне. Бары, 100 мкм.

Демонстрируя, что раннее повреждение аксонов происходит в глиальной пластине, и что картина потери / выживания аксонов в зрительном нерве соответствует потере / выживанию РГК в сетчатке, прямо не проверяет утверждение о том, что аксоны оскорблены в пластинке. Первый сайт дегенерации не является надежным показателем того, где нейрон был первоначально оскорблен (Conforti et al., 2007). Кроме того, возможно, что региональные закономерности смерти RGC при глаукоме происходят вследствие какого-либо другого фактора (ов), который не понимается.

Для экспериментального тестирования, если в глиальной пластине у мышей DBA / 2J происходит осевое аксонирование, мы разработали исследование, основанное на хорошо устоявшейся картине дегенерации аксонов и выживаемости аксонов, которая возникает в ответ на прямое и фокальное повреждение аксонов в периферической нервной системе , В периферической нервной системе прямое и очаговое повреждение аксонов приводит к дегенерации всей длины дистальной части аксона, которая отделена от тела клетки поражением. Дистальный аксон быстро вырождается на валлеровской вырожденности (Waller, 1850; Stoll et al., 2002). Напротив, проксимальная часть аксона, прикрепленная к телу клетки, может выжить до близости озона аксона до тех пор, пока тело клетки выживет. Аналогичным образом, в одном из сообщений с использованием пересеки зрительного нерва предполагалось, что проксимальные интраретинальные аксоны выживают до тех пор, пока RGC somata не выродится (Anderson, 1973). Поскольку все RGC somata выживают бесконечно у BAX-дефицитных мышей DBA / 2J (Libby et al., 2005b), мы рассуждали о том, что проксимальный аксон может выживать до близости любого фокального аксона, даже в глазах с тяжелой глаукомой. Соответственно, степень проксимальной выживаемости аксонов может выступать в качестве маркера для определения местонахождения аксоновского оскорбления.

Во-первых, мы тестировали, если проксимальные аксоны RGC выживают до места инсульта в D2.Bax
— / — мутантные мыши. Внутриглазничные зрительные нервы 3-мольного D2.Bax
— / — (BAX-дефицитный) и D2.Bax
+ / + (BAX-достаточные) мыши были измельчены как можно дальше позади глаз. Эти мыши были слишком молоды, чтобы иметь глаукому. В D2.Bax
+ / + глаза, RGC somata и их аксоны вырождены по всей их длине. Напротив, в D2.Bax
— / — глаза, проксимальный аксон выжил за глазом и до близости оскорбления в течение 30-60 дней после раздавливания (см. Рис. S2). Таким образом, в этих неуглоустойчивых глазах степень выживания аксона была надежным показателем места оскорбления аксонов зрительного нерва.

Во-вторых, мы определили степень выживаемости проксимального аксона в глаукоме. Мы использовали D2.Bax
— / — мышей, выбранных для того, чтобы иметь> 95% ретро-орбитальную потерю аксонов. Чтобы сопоставить время анализа проксимального аксона с экспериментом по раздаче, мы включили мышей, которые развили эту тяжелую потерю ретро-орбитальных аксонов в предыдущие 30-60 дней (материалы и методы). У этих мышей проксимальные аксоны выживали от тел RGC до близости переднего края глиальной пластинки внутри глаза. Напротив, подавляющее большинство сегментов аксонов в пластине выродилось, а дистальные к пластине всегда вырождались (рис.8, рис. S3). В этом исследовании представлены экспериментальные данные о серьезном озоновом аксоне, возникающем внутри или очень близко к ламине в зрительном нерве при глаукоме DBA / 2J. Вместе с демонстрацией того, что первый идентифицируемый урон многим аксонам находится в пластинке, этот эксперимент убедительно указывает на то, что на ранней стадии глаукомы на пластинке возникает оскорбление.

Аксоны выживают до ламина у BAX-дефицитных мышей с тяжелой глаукомой. (A-I) показаны типичные изображения из EM-анализа аксонов RGC, идущих от слоя нервных волокон (NFL) к пластине. (A-C) Control 12-mo-old D2-Gpnmb
+. Плотно упакованные аксоны (AX) присутствуют в слое нервных волокон, который покрыт внутренней ограничивающей мембраной и опорными плитами клеток Мюллера (*, А). Аксоны продолжаются в упорядоченной форме через область преламина и в пластинку. (D-F) Мышечная мышца DBA / 2J с возрастом и полом с тяжелой глаукоматозной потерей аксонов за глазом. В слое нервных волокон (D) остается только несколько поврежденных и опухших аксонов. Клетки Мюллера являются гипертрофированными и заполняют большую часть области. Их цитоплазма, прилегающая к внутренней ограничивающей мембране, утолщена (*). В области преламина (E) аксоны в основном отсутствуют и заменены утолщенными глиальными процессами. Активированные астроциты многочисленны (ядер астроцитов, N). На пластинке (F) крупные глиальные процессы заменили практически все аксоны. (G-I) Возраст и секс D2.Bax
— / — (BAX-дефицитная) мышь с тяжелой потерей аксонов за глазом. В слое нервных волокон (G) аксоны выживают, но кажутся опухшими. Цитоплазма клеток Muller (*) не является гипертрофической. В области преламина (H) большинство аксонов нетронуты, но обнаруживаются большие набухания (стрелки). Напротив, в lamina (I) практически все аксоны теряются, а глии очень гипертрофированы. Урон по существу тот же, что и в (F). (J-L) Нейрофиламентная маркировка подтверждает выживаемость аксонов в непосредственной близости от пластинки в D2.Bax
— / — мышей. Показаны нейрофиламентные аксоны (зеленые) в продольных участках зрительного нерва. У молодой мыши DBA / 2J (J) аксоны четко собираются в слое нервных волокон на внутреннем краю зрительного нерва и продолжают проходить к пластинке. В 10-месячной мыши DBA / 2J с тяжелой потерей аксонов за глазом (K) аксоны полностью отсутствуют из слоя нервных волокон и всего зрительного нерва. Напротив, у 10-летней BAX-дефицитной мыши DBA / 2J (L) с тяжелой потерей аксонов за глазом аксоны продолжают двигаться вдоль сетчатки и выживают до близости пластинки (в пределах известной ретракции расстояния после локального оскорбления, рис. S3, Kerschensteiner et al., 2005). Как было замечено ЭМ, происходит резкая потеря аксонов на пластинке. Несмотря на выживание аксонов до аламины, головка зрительного нерва все еще реконструирована (раскопана), и поэтому морфология напрямую не сравнима с контролем. Важно отметить, что эта картина выживания аксонов до ламины дает убедительные экспериментальные данные для прямого оскорбления аксона в этом месте в этой унаследованной глаукоме (см. Рис. S3 для изображений с увеличенным увеличением J и L). (A, D и G), 2 мкм. Все остальные стержни EM, 500 нм. (J-L), 75 мкм.

Для дальнейшей оценки роли аксонального повреждения в глаукоме мы разработали штамм мышей DBA / 2J с аллелем Wlds (D2.Wlds, Materials and methods). Ген Wlds преимущественно защищает аксоны от дегенерации, вызванные аксональной травмой (Lunn et al., 1989; Perry et al., 1990, 1991; Ribchester et al., 1995; Mack et al., 2001). Поскольку гетерозиготность Bax (Bax
+/-) защищает RGC somata в глаукоме DBA / 2J, мы также определили, наследует ли Wlds и Bax
— мутации были бы полезными (рис.9).

Wlds глубоко защищает от глаукоматозного повреждения. (A) Распределение IOP мышей каждого генотипа сильно перекрывается. Ящики показывают верхний и нижний квартили, а бары показывают крайности, включая выбросы. Осевая линия каждого алмаза является средней, а верхняя и нижняя точки каждого алмаза представляют собой 95% доверительные интервалы среднего значения. Мыши с единственной копией гена слияния Wlds являются гемизиготными (Hemi). При 9 и 12 мес не наблюдалось существенных различий в IOP (ANOVA) между нейрозащитными мышами Wlds (см. Ниже) и мышами любого другого генотипа. В 10,5 мес мышей дикого типа (WT) было необычно высокое перекосы их ВГД по сравнению с типичными значениями в этом возрасте (см. Anderson et al., 2005; Libby et al., 2005a), а их ВГД был значительно выше чем мыши из всех других генотипов (P <0,04 для всех сравнений). Этот перекос не учитывал снижение потери аксонов у мышей Wlds. Это ясно, потому что (1) было значительное перекрытие между всеми генотипами, и (2) распределение IOP мышей Wlds было чрезвычайно сходным (P = 0,7) с Bax +/- гетерозиготных мышей (Het), аксоны которых не были защищены (см. Ниже). (B) Защита аксонов у мышей Wlds. Распределение повреждений зрительного нерва у мышей указанных генотипов показано в два важных момента времени (Материалы и методы). Аллель Wlds значительно спасает аксоны от глаукоматозной дегенерации в возрасте 12 месяцев (P <0,0001, хи квадрат, сравнивающий Wlds Hemi с их однопометниками WT). Важно отметить, что Wlds увеличило количество глаз без видимой глаукомы. Бакс +/- гетерозиготность не давала защитного эффекта по сравнению с мышами дикого типа (справа). Хотя это и не является статистически значимым, в D2.WldsBax существует большая степень защиты +/- двойные мутанты (справа), по сравнению с одиночными мутантами Wlds (слева). Количество анализируемых глаз для каждого генотипа в 10,5 мес было обычно ≥40, но 20 для D2.Bax +/- гетерозиготы. В 12 месяцев обычно ≥63 глаза изучались для каждого генотипа, но 21 для D2.Bax +/- гетерозиготы. (C-F) Wlds сохраняет аксоны RGC и морфологию зрительного нерва, как видно из полутонких участков. Большинство диких (C) и D2.Bax +/- нервы (E) имели тяжелую глаукому с очень значительной потерей аксонов (см. Рис.3) и обширные глиальные рубцы. Напротив, большинство D2.Wlds (D) и D2.WldsBax +/- нервы (F) не имели или ранней глаукомы, при этом <5% поврежденных аксонов (рис.3) и никаких признаков глиальной гипертрофии или рубцевания. (G) Axon рассчитывает для случайно выбранного образца нервов DBA / 2J и D2.Wlds без или ранней глаукомы (n = 6 для каждого генотипа). Средние значения статистически не различаются (P = 0.235), и ни один из нервов D2.Wlds не уменьшил количество аксонов. Поскольку УЛД более чем удвоил количество глаз без или ранней глаукомы, половина этих подсчитанных глаз была спасена. (H-J) Сетчатые сетчатки, показывающие, что в защищенных глазах Wlds RGC somata выживают (H, предглаукома, I, тяжелая глаукома, J, нет или ранняя глаукома). (K) Это было подтверждено путем подсчета клеток RGC-слоя в глазах без или ранней глаукомы. Опять же, половина глаз D2-Wlds была спасена, и ни у кого не было числа клеток ниже диапазона значений дикого типа (n = 10 каждый генотип, P> 0,1). Как и ожидалось, у мышей дикого типа и D2.Wlds с серьезным повреждением зрительного нерва большая часть РГК была потеряна. Изображения сетчатки показаны из согласованной области верхней периферической сетчатки. (L) Несмотря на глубокое спасение, умеренная степень соматической усадки (~ 10%) наблюдалась в глазах D2.Wlds без обнаруживаемой глаукомы. Усадка, как представляется, происходит в основном на ячейках разных размеров (см. Рис. S4). (M) Wlds сильно сохранили амплитуду PERG, меру активности RGC, у случайно выбранных мышей (количество глаз = 16, 14, 18 для D2-Gpnmb +, DBA / 2J и D2.Wlds соответственно). Бары, 100 мкм.

Клинические исследования с 6-12 месяцев (материалы и методы) показали, что начало, скорость прогрессирования и тяжесть вызывающего глаукома ирисовой болезни не различались между мышами с любым из испытуемых генотипов. В IOP оценивали ключевые возрасты, связанные с глаукомой DBA / 2J (Libby et al., 2005a), а распределение IOP у мышей с каждым генотипом сильно перекрывалось (рис.9).

Оценка тяжести поражения зрительного нерва в двух важных временных точках (Libby et al., 2005a) показало, что мутация Wlds оказывает сильное защитное действие на выживаемость аксонов зрительного нерва (рис.9B, слева). В возрасте 12 месяцев 68% глаз дикого типа (59/86) имели тяжелую глаукому. Для сравнения, только 33% глаз D2.Wlds (27/81) имели тяжелую глаукому. Также в 12 месяцев мутация Wlds более чем удвоила количество мышей без обнаружимой глаукомы (от 22% дикого типа [19/86] до 49% Wlds [40/81]). Количество аксонов подтвердило защиту (рис.9).

В дополнение к серьезности повреждения зрительного нерва мы оценили количество RGC soma. Wlds хорошо известен для прямой защиты аксонов, но не сота (Glass et al., 1993; Deckwerth and Johnson, 1994; Deshmukh et al., 1996; Deckwerth et al., 1998; Ikegami and Koike, 2003; Adalbert et al., 2005). RGC somata выжили в глазах D2.Wlds, аксоны которых были избавлены (рис.9). Хотя соматы были спасены, они не были полностью защищены, так как средний диаметр сома уменьшился на ~ 10% (рис.9). RGC somata в основном отсутствовали в глазах D2.Wlds с сильной потерей аксонов, что указывает на то, что Wlds не могут защитить сому от смерти, если аксон вырождается.

Чтобы более чувствительно оценивать защитные эффекты Wld против дисфункции RGC при глаукоме, мы оценили реакцию RGCs с использованием модельной электроретинографии (PERG) (Porciatti et al., 2007). Ответ PERG хорошо документирован, чтобы требовать активности RGC (см. Porciatti, 2007). Для определения эффектов глаукомы на PERG мы оценивали 10-11-месячных мышей DBA / 2J с каждым этапом глаукомы. Для контроля за возможными эффектами пигментно-дисперсионной болезни радужной оболочки на PERG мы также оценивали конгенный штамм мышей B6, которые имеют те же мутации Tyrp1 и Gpnmb, что и мыши DBA / 2J, и развивают ту же самую степень ирисовой болезни, но устойчивы к ВГД и не развивается глаукома (Anderson et al., 2006). PERG не был изменен болезнью диафрагмы (рис. S5 A), но был серьезно нарушен глаукомой (рис. S5B). Фактически, PERG оказался очень чувствительным к глаукоме и был нарушен на ранней стадии заболевания до обнаруживаемой потери аксонов. Wlds сильно защищали активность RGC и сохраняли PERG до неглазурных контрольных значений у случайно выбранных мышей длиной 10-12 молей (рис.9).

Предполагается, что кривизну ламины зрительного нерва имеет решающее значение при глаукоме, способствуя повреждению аксонов RGC. В конфликте с этим мышей, как сообщается, не хватает пластинчатой ​​криброзы, но развивается глаукома с поразительным сходством с болезнью человека. В этой статье мы переоцениваем анатомию зрительного нерва старых мышей, и мы даем убедительные экспериментальные данные для прямого оскорбления аксонов RGC в глиальной пластине в мышиной модели глаукомы.

Во-первых, мы показываем, что у пожилых мышей DBA / 2J есть устойчивая сеть астроцитов в зрительном нерве, где она выходит из глаза. Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями (Morcos and Chan-Ling, 2000; Ding et al., 2002; May и Lutjen-Drecoll, 2002; Petros et al., 2006). В человеческой пластинчатой ​​крибросе также существует сеть астроцитов, а астроциты покрывают пластинки ECM (Anderson, 1969; Hernandez et al., 1987). У мышей, однако, ECM-пластинки отсутствуют, что приводит к концепции, что мышечный зрительный нерв не имеет пластинчатой ​​криброзы (Fujita et al., 2000; Morcos and Chan-Ling, 2000; May and Lutjen-Drecoll, 2002). Вместо этого, основываясь на наших представленных данных и отражая как сходства, так и отличия от человеческой кривизны lamina, мы предлагаем, чтобы мыши имели глиальную пластинку. Это подразумевает сохранение хотя бы некоторых функций, так как расположение глиальных пластин и пространственное расположение астроцитов сходны у двух видов.

Различные исследования согласуются с прямым оскорблением аксонов RGC в зрительном нерве при глаукоме, но текущие данные не позволяют экспериментально продемонстрировать, что аксон оскорблен в пластине при глаукоме (введение). Здесь мы показываем, что первое видимое повреждение внутриглазной части аксона RGC происходит в глиальной пластине мышей DBA / 2J, где обнаруживаются как дистрофические нейриты, так и более мягкие аксональные набухания. В отличие от недавнего исследования, мы не заметили, что повреждение было скорее локализовано вокруг входа в основные кровеносные сосуды (май и Миттаг, 2006), которые проникают в нерв у переднего края глиальной пластинки.

Поскольку у RGC-соматоидов с дефицитными BAX мышами DBA / 2J выживают прямые повреждения аксонов (Libby et al., 2005b), мы могли бы использовать их глаза, чтобы проверить, что опечатка возникает в пластинке в глаукоме. В периферической нервной системе прямое и очаговое повреждение аксонов приводит к дегенерации всей длины дистальной части аксона, которая отделена от тела клетки поражением. Дистальный аксон быстро вырождается на валлеровской вырожденности (Waller, 1850; Stoll et al., 2002). Напротив, проксимальная часть аксона, прикрепленная к телу клетки, может выжить до области озона аксона, пока тело клетки выживает. Если бы это было верно для аксонов RGC у BAX-дефицитных мышей DBA / 2J, то точка, в которой выживают проксимальные аксоны, будет находиться в непосредственной близости от отек глаукомы.

Используя BAX-дефицитных мышей, мы показываем, что проксимальный сегмент аксона, простирающийся от тела клетки, выживает до близости глиальной пластинки в глаукоме DBA2J, но более дистальный аксон полностью дегенерирует. Это говорит о том, что аксоны RGC оскорбляются внутри или очень близко к глиальной пластине. Альтернативно, при рассмотрении только одного эксперимента, возможно, что первичное оскорбление относится к телу клетки, что приводит к постепенному отмиранию аксона от мозга к телу клетки. В этом случае проксимальные аксоны выживут в нервную головку, если они будут дифференциально поддерживаться неизвестными факторами в этом месте. Рассуждая против этого альтернативного объяснения, проксимальные аксоны RGC выживают за глазом и до области оскорбления у BAX-дефицитных мышей после поражения зрительного нерва. Таким образом, по крайней мере после раздавливания, аксоны выживают в области оскорбления и не просто вырождаются в глаз, пока не достигнут благоприятной среды. Вместе с нашей демонстрацией, что первый идентифицируемый урон многим аксонам находится в пластинке, и что существует веерообразная картина смерти RGC, что легко объясняется повреждением пучков аксонов в зрительном нерве, эти данные дают убедительные экспериментальные данные для раннего оскорбления в lamina.

Важно отметить, что у мышей DBA / 2J, которые являются диким типом для Bax, многие аксоны выживают на поверхности сетчатки и в зрительном нерве, но внезапно заканчиваются на пластинке (рис.7). Поскольку дегенерация аксонов асинхронна, это говорит о том, что клетки клетки RGC и их проксимальные аксоны выживают в течение значительного времени после дегенерации дистального аксона, отделяющего их от мозга.

При глаукоме предполагается, что повреждение фокального аксона в пластинке приводит к быстрой валерианской дегенерации дистального аксона (Quigley et al., 1983; Whitmore et al., 2005). Хотя наши исследования показывают, что это верно для некоторых аксонов, способ оскорбления отдельных аксонов и затем вырождения может различаться даже в пределах отдельных глаз (в зависимости от тяжести осевого аксона, см. Whitmore et al., 2005). Более серьезные оскорбления могут привести к почти полной раздробленности сегментов проксимального и дистального аксонов и последующей быстрой валерианской дегенерации дистального аксона (Conforti et al., 2007; Whitmore et al., 2005). Более мягкие оскорбления могут обеспечить большую функциональную связность между сомой, проксимальным аксоном и сегментами дистального аксона и дегенерацией через более медленный процесс отмирания аксонов. Наши данные свидетельствуют о том, что большинство поврежденных аксонов испытывают более мягкие оскорбления на ранней стадии глаукомы DBA / 2J. Большинство поврежденных аксонов проявляли только незначительные вздутия в пластинке (рис.5, рис. S1 и связанный текст в результатах). В соответствии с более мягкими оскорблениями многих аксонов в глаукоме DBA / 2J, недавнее исследование продемонстрировало позднее гибель аксонов в этой болезни (Schlamp et al., 2006).

Хотя наши данные сильно поддерживают глиальную пластинку как ключевой сайт оскорбления аксонов RGC в глаукоме DBA / 2J, они не исключают дополнительных мест оскорбления или раннего повреждения. Возможно, что несколько частей RGC оскорблены глаукомой. Как микроглия, так и олигодендроциты могут опосредовать повреждение в разных местах (Tezel and Wax, 2004; May and Mittag, 2006; Nakazawa et al., 2006). Изменения в синапсах RGC в сетчатке и головном мозге наблюдались на ранней стадии глаукомы, а дендритные изменения были самыми ранними наблюдаемыми аномалиями в модели приматов глаукомы (Morgan et al., 1998; Weber et al., 2000; Whitmore et al., 2005; Gupta et al., 2007; Stevens et al., 2007). Тем не менее, специфические закономерности смерти RGC при глаукоме легко объясняются критическим озоновым аксоном в пластинке зрительного нерва.

При глаукоме характер осевого аксона в пластине четко не определен. Пластины ECM пластинчатой ​​криброзы предполагают механическое повреждение аксонов в глаукоме, и предлагается индивидуальная изменчивость структуры пластин для модуляции тяжести глаукомы (Quigley et al., 1983). Наши экспериментальные данные сильно поддерживают осевое оскорбление глиальной пластинки мышей DBA / 2J, но на пластинке этих мышей отсутствуют пластины ECM в возрасте, когда развивается глаукома. Это показывает, что пластины ECM не нужны для оскорбления аксона в пластине. Хотя возможно, что пластины ECM могут модулировать повреждение в глаукоме человека (поскольку нерв намного больше), эти результаты сильно фокусируют внимание на других компонентах пластинки, таких как астроциты. Астроциты обеспечивают ключевые функции поддержки нейронов, которые могут быть потеряны при глаукоме (Newman, 2004; Jakobs et al., 2005; Perea and Araque, 2006). Альтернативно, активированные астроциты могут непосредственно повреждать аксоны в пластинке (Johnson et al., 2000; Morgan, 2000).

Поскольку важное оскорбление повреждает аксон RGC при глаукоме, нейрозащитные меры, направленные на аксон, могут быть полезными. Мутация Wlds может существенно замедлить дегенерацию аксонов. Аксоны у мышей Wlds могут проводить действия потенциалов и высвобождать нейротрансмиттеры до 3 недель после перерезки (Crawford et al., 1995; Ribchester et al., 1995; Mack et al., 2001). Wlds является защитным даже при заболеваниях, которые не связаны с механической перерезкой (Perry et al., 1991; Ferri et al., 2003; Samsam et al., 2003; Mi et al., 2005). Wlds также могут защищать синапсы, но в отличие от защиты аксонов, которая сохраняется у старых мышей, ее благоприятное воздействие на синапсы существенно уменьшается с возрастом (Gillingwater et al., 2002).

Здесь мы показываем, что мутация Wlds сильно защищает от глаукомы DBA / 2J со значительной защитой как аксонов, так и сомати в возрасте 12 месяцев. Известно, что мутация Wlds защищает от прямого повреждения аксоном в аналогичных возрастных группах, но ни один эксперимент не выявил прямое защитное действие на сому или синапс в этом возрасте (Glass et al., 1993; Deckwerth and Johnson, 1994; Deshmukh et al., 1996, Deckwerth et al., 1998; Gillingwater et al., 2002; Ikegami and Koike, 2003; Adalbert et al., 2005). Несмотря на глубокий защитный эффект Wld
с, это не полностью предотвратило усадку RGC somata. Мягкая усадка может отражать степень трофической депривации в результате постоянного, частичного снижения переноса аксонов (Deshmukh et al., 1996; Deckwerth et al., 1998). В предыдущих исследованиях Wlds не полностью предотвратил повреждение, а скорее затормозил дегенерацию (Coleman, 2005). Дальнейшие исследования необходимы для оценки продолжительности его защиты при глаукоме DBA / 2J, но наши предварительные исследования предполагают постоянную защиту до 15 месяцев. Не все глаза Wlds были защищены от глаукомы, предполагая, что степень оскорбления может различаться в отдельных глазах и / или уровень белка WLDS может быть близок к порогу для защиты. Имеются некоторые свидетельства того, что увеличение экспрессии Wlds обеспечивает большую степень защиты (Mack et al., 2001). Будущие эксперименты будут оценивать, имеют ли мыши, гомозиготные для Wlds, еще большую степень защиты по сравнению с оцененными здесь гемизиготами.

В дополнение к защите аксона и сомы мутация Wlds предотвратила серьезное снижение PERG (по крайней мере, до 12 месяцев). Мы обнаружили, что PERG снижается в начале глаукомы DBA / 2J и до потери аксонов. Значительно уменьшенный PERG может не отражать дисфункцию аксона, потому что PERG сохраняется на высоких уровнях даже в глазах с RGCs, которые сильно повреждены и отсоединены аксонами после аксотомии (у мышей, которые чрезмерно экспрессируют BCL2 (Cenni et al., 1996; Porciatti, 2007). мы не можем упускать из виду роль сегмента проксимального аксона в поддержании PERG (ожидается, что проксимальный аксон выживет у мышей, экспрессирующих BCL2), ясно, что нормально функционирующие связанные аксоны не требуются для PERG. Таким образом, суровое снижение PERG (Porciatti, 2007). Дальнейшие исследования необходимы для определения характера компрометации (ов) RGC, приводящей к снижению PERG, и независимо от того, предшествует ли оно аксоному оскорблению в возможно, что это раннее повреждение является необходимым условием для повреждения аксонов в пластине. Альтернативно, повреждение аксонов может быть полностью независимым процессом.

Все эксперименты проводились в соответствии с заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии об использовании животных в офтальмологических исследованиях. Мышей поддерживали, как описано ранее (Libby et al., 2005a).

Исходный аллель Tg (Thy1-CFP) 23Jrs (Feng et al., 2000) был скроен с мышами DBA / 2J в течение 20 поколений для создания субстрата DBA / 2J.Tg (Thy1-CFP) 23Jrs / Sj (здесь D2. Thy1-CFP). Оригинальный аллель Wlds (Lunn et al., 1989; Mack et al., 2001) был перекрещен в DBA / 2J для создания штамма DBA / 2J.BOla-Wld
s / Sj (D2.Wlds). Первоначальная оценка особей Wlds и дикого типа (nonWlds) была у N5, при этом большинство мышей анализировали в более высоких поколениях (до N10). Для генерации подсетей сегрегации мышей для Wlds и Bax
— аллели (Libby et al., 2005b), D2.Bax
+/- гетерозиготу (N16) скрещивали с мышью D2.Wlds, а двойные мутанты были выбраны для дальнейшего обратного скрещивания. Первоначальная оценка D2.WldsBax
— двойные мутанты и их одиночные мутанты или однопометники дикого типа были у N6, при этом многие мыши анализировались в более высоких поколениях (до N12). Мы выпустили D2-Gpnmb
+ штамм, как было недавно описано (Howell et al., 2007). Для PERG мы использовали контрольный штамм C57BL / 6J-Tyrp1b.GpnmbR150X, который развивает ту же болезнь диафрагмы, что и мыши DBA / 2J, но устойчив к развитию высокого уровня ВГД и глаукомы (Anderson et al., 2006).

Глаза и внутричерепные части зрительных нервов обрабатывались, как сообщалось ранее (Smith et al., 2002). Нервы окрашивали парафенилендиамином (PPD), который различает однократно поврежденные аксоны, что позволяет чувствительно обнаруживать повреждение аксонов. Было установлено, что нервы имеют один из трех уровней повреждения, которые легко различимы при подсчете аксонов (фиг.3) (Anderson et al., 2005; Libby et al., 2005a, b). Для эксперимента Wlds и Bax два исследователя в масках назначили одинаковый уровень урона 91% нервов (360 из 399). 39 нервов, которым были назначены разные уровни урона, отличались только на один уровень. Третий маскарадный исследователь оценил эти 39 нервов и всегда соглашался с одним из исходных уровней урона. Использовался наиболее часто назначаемый уровень. Представительские изображения были сделаны на микроскопе Olympus BX50.

Глаза с прикрепленными ретробульбарными нервами были расчленены с орбиты и зафиксированы 4% PFA в 0,1 М фосфатном буфере, как описано выше (Smith et al., 2002). Квадратный блок ткани (1 мм × 1 мм, состоящий из зрительного нерва, фланкирующей сетчатки, хориоида и склеры) был вырезан из фиксированного заднего сегмента с использованием лопасти скальпеля Supersharp. Ткань была встроена в парафин и сериально секционирована либо продольно, либо в поперечном сечении. Для большинства глаз каждая пятая секция была окрашена, а для подмножества глаз каждая секция была окрашена, чтобы обеспечить полный анализ анатомии и диаграммного представления нерва, как на фиг.3. Гистохимические пятна включали гематоксилин и эозин (H & E) , Бодиан и трихром Массона (Луна, 1968). По меньшей мере 10 нервов анализировали с каждым из этих пятен как для DBA / 2J, так и для D2-Gpnmb
+ мышей (11-12 мес.). Разделы были отображены на микроскопе Olympus BX50.

Используемыми антителами были антинейрофиламенты (Smi-32 и Smi-34, Covance, 1: 500) и анти-GFAP (Sigma-Aldrich, 1: 500). Вторичными антителами были либо Alexafluor 488, либо 594 (Invitrogen). Ядра были противопоставлены DAPI (Sigma-Aldrich). Разделы были проанализированы на конфокальном микроскопе Leica SP5. Конкретное расположение в головке зрительного нерва определяли путем окрашивания каждой пятой секции с помощью антител Smi-32, Smi-34 и GFAP для определения ориентиров и расположения основных кровеносных сосудов (схематически показанных на фиг.3). Дистрофические нейриты сильно окрашивались для Smi-32 / Smi-34 (использовались в комбинации для максимального окрашивания) и имели больший диаметр (≥2 мкм), чем самые крупные немиелинизированные аксоны в пластине нормального нерва. Дистрофические подсчеты нейритов выполнялись с использованием объектива 40 × с 3-кратным цифровым зумом. Для каждой интересующей области (слой нервных волокон, преламина, ламина или ретрозамина) из каждого глаза дистрофические нейриты вручную подсчитывались в секции толщиной 5 мкм, охватывающей всю область зрительного нерва.

Оптические нервы собирали, как описано выше. Ткань и срезы обрабатывали, как описано ранее (Smith et al., 2002). Весь нерв был последовательно отрезан в продольном направлении следующим образом. Несколько толстых участков (1 мкм) были разрезаны с последующим ~ 60 тонким участком (60 нм). Это начальное сечение (толстые и тонкие секции) было обозначено как «уровень 1.». Затем был вырезан еще один набор толстых и тонких срезов и был помечен как уровень 2. Разделение таким образом проходило по всему нерву. Толстые участки были использованы для определения местоположения самой центральной части зрительного нерва, которая включала полную ширину склерального канала и центральной сетчатой ​​артерии. В большинстве случаев от двух до четырех толстых / тонких секционных наборов (центральных наборов уровней), которые включали эту область. Количество тонких срезов на сетку варьировалось, но обычно составляло не менее 12. Вся сетка была отсканирована и выборочно сфотографирована. Для любого глаза, при определении анатомии были рассмотрены по крайней мере два центральных уровня и две разные решетки с каждого уровня. Поэтому для конкретного нерва отсканировали и сфотографировали 24-48 секций. Нервы исследовали на 10 мышей DBA / 2J без или ранней глаукомы (как описано выше), 10 D2-Gpnmb
+ мыши, 6 мышей DBA / 2J с тяжелой глаукомой и 6 D2-Bax
— / — мышей с тяжелой глаукомой. Все мыши были ~ 11-12 лет. Вся электронная микроскопия проводилась на микроскопе JEOL-JEM1230.

Для подсчета дистрофических нейритов использовались фотографии увеличенного размера 4000 ×. Это увеличение включало ~90% ткани, содержащейся в одном отверстии сетки размером 200 меш. Графы были выполнены для восьми DBA / 2J и восьми D2-Gpnmb
+ мышей. Для каждой мыши было подсчитано двадцать 4 000 × полей для каждого слоя слоя нервного волокна, преламина и ламины (рис.3).

Глаза D2.Thy1-CFP рассасывались свободно и фиксировались в 4% PFA. Оптический нерв был обрезан, чтобы оставить ~ 100 мкм прикрепленным за глазом. Передний сегмент, линза и большинство склеры, хориоидов и РПЭ удалялись до того, как сетчатка была установлена ​​на слайде. Конфокальный микроскоп Leica SP5 использовался для визуализации флуоресценции CFP. Расположение в головке зрительного нерва определялось с использованием положения центральных сосудов сетчатки в качестве ориентиров (рис.6).

Чтобы оценить аксоны RGC от глаза к мозгу, каждый глаз тщательно удаляли с проксимальной частью прикрепленного оптического нерва и фиксировали в 4% PFA и устанавливали на плоскость, как описано выше. Внутренний орбитальный зрительный нерв, который простирался от места разреза до костной орбиты (называемый ретро-пластинчатым нервом), рассекали и фиксировали в 4% PFA. Мозг был расчленен из черепа, при этом остальная часть зрительного нерва (ретро-орбиталь до верхнего колликулуса) прикреплена. Ретро-орбитальная часть зрительного нерва (вплоть до хиазма) была удалена для оценки глаукоматозного повреждения. Мозг, включая зрительный нерв и оптический тракт от хиазма до верхнего колликулюса, фиксировали в 4% PFA и подвергали криосфере. Для каждой мыши пять участков 20 мкм из каждой области были проанализированы на предмет повреждений. В поперечном сечении анализировали слой нервных волокон, пластинку, ретро-пластинку и хиазм, а также начало оптического тракта и верхнего колликулуса в продольном разрезе. Таким образом оценивали глаза и нервы у трех мышей D2-CFP (9,5 мес) (пять глаз с «нет» или «ранняя» глаукома, одна с «умеренной» глаукомой).

Глаза фиксировали на месте с 4% PFA и рассекали, оставляя зрительный нерв и кольцо склеры вокруг прикрепленной головки зрительного нерва. Затем зрительный нерв разрезали непосредственно за склерой с помощью лезвия скальпеля. Вся ткань инкубировали в течение 10 дней с первичными антителами (SMI-32 и анти-GFAP) и в течение 4 дней с флуоресцентными вторичными антителами. Ядра были контрастированы с TOPRO3 (Invitrogen). Ткань была смонтирована в плите из 4% агарозы между двумя покровными стеклами, так как сетчатка и поперечное сечение зрительного нерва могли быть отображены на конфокальном микроскопе Leica SP5.

Исследование щелевой лампы (Anderson et al., 2002) и измерения IOP (John et al., 1997; Savinova et al., 2001) были такими, как описано ранее. По меньшей мере 40 мышей каждого генотипа оценивали в возрасте 9, 10,5 и 12 месяцев.

Чтобы определить, выживают ли аксоны RGC до места инсульта в D2.Bax
— / — мутанты, контролируемая раздавка выполнялась, как описано ранее (Li et al., 1999; Libby et al., 2005b). Глаза собирали через 30 и 60 дней после процедуры, гарантируя, что окно смерти клеток уже прошло.

В нашей колонии ~70% мышей с тяжелой глаукомой в возрасте 10 месяцев развивали ее по сравнению с предыдущим месяцем (~ 30 дней, см. Libby et al., 2005a). Таким образом, большинство мышей с тяжелой глаукомой в возрасте 10 месяцев утратили большинство своих аксонов в течение предыдущих 30 дней. Аналогичным образом, большинство 11-месячных мышей с тяжелой глаукомой потеряли свои аксоны в течение предыдущих 60 дней. Таким образом, в терминах дегенерации аксонов наш анализ выживаемости проксимальных аксонов у мышей 10-11-месячного возраста (четыре иммуногистохимии 10-месячного возраста, шесть 11-месячных ЭМ) соответствует времени нашего аналогичного анализа после сокрушения зрительного нерва , где все мыши потеряли дистальные аксоны за предыдущие 30-60 дней. После демонстрации того, что проксимальные аксоны, расположенные очень близко к пластинке у 10- и 11-месячных мышей с тяжелой глаукомой, мы оценили некоторые глаза в возрасте 13 месяцев (четыре глаза, пластиковые участки, окрашенные H & E), чтобы определить, было ли больше спина проксимального аксона. Наконец, мы проанализировали три глаза в возрасте 19 месяцев. Все приведенные числа относятся к Bax
— / — мышей. Было проанализировано сходное количество контролируемых по возрасту элементов управления DBA / 2J.

Нейсслевые сетчатки мышей DBA / 2J или D2.Wlds были плоскими и восемь репрезентативных изображений (по два для каждого квадранта сетчатки) были взяты в 40 × и импортированы в SigmaScan (Jandel Scientific). Квадрат 120 × 120 мкм помещался в центр каждого изображения. Было измерено каждое тело клетки (RGCs и amacrine клетки, исключая эндотелиальные клетки) либо внутри квадрата, либо пересекая его верхнюю или правую границу, в общей сложности ~ 600 сомов. Сома (в μm2) из ​​двух групп (5 DBA / 2J и 10 D2.Wlds сетчатки) сравнивали с использованием u-теста Манна и Уитни.

Образец электроретинографии измеряли, как сообщалось ранее (Porciatti et al., 2007). Мыши из нашей колонии были отправлены «в масках» в Университет Майами. Полнополевая вспышка ERG использовалась в качестве контроля на всех мышах (сигнал внешней сетчатки, на который не влияли клетки ганглиона сетчатки), и он не отличался существенно между контрольными и глаукоматозными мышами DBA / 2J.

Дополнительный материал в Интернете можно найти по адресу: http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200706181/DC1. На рисунке S1 показана оценка повреждения зрительного нерва от сетчатки к высшему колликулюсу у мышей D2-CFP. На рисунке S2 показано, что проксимальные аксоны выживают до места окуляра зрительного нерва в D2.Bax
— / — мышей. На рисунке S3 показано, что проксимальные аксоны выживают до пластины в D2.Bax
— / — мышей. На фиг.54 показано, что соматическая усадка у мышей D2.Wlds не ограничивается несколькими классами сомального размера, но встречается более широко. На рисунке S5 показано, что PERG сильно нарушается в начале глаукомы DBA / 2J.

Мы благодарим Л. Уилсона, А. Белла и И. М. Космы за техническую помощь с экспериментами Дж. Торранса за подготовку фигуры и Дж. Кокса, П. Фуерста, С. Наира и Х. Чжу за критическое чтение рукописи , Мы также благодарим Лабораторию Лаборатории Лаборатории Джексона, включая П. Фингера, Дж. Миллера и Б. Мортимера за техническую помощь.

Научные вспомогательные услуги субсидируются основным грантом Национального института рака (CA34196). Эта работа была частично поддержана EY017169 (R.H. Masland), F32EY014515 (R.T. Libby) и Национальными институтами здравоохранения RO3 EY016322 и P30-EY14801 (V. Porciatti). Р.Х. Масланд является старшим исследователем исследований по предотвращению слепоты. S.W.M. Джон является следователем медицинского института Говарда Хьюза.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *