Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Дегенерация клеток ганглиозной сетчатки является топологической, но не специфичной для конкретного типа клеток у мышей DBA / 2J

Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2171185/

Переписка с Ричардом Х. Маслендом: masland@helix.mgh.harvard.edu

Используя различные методы двойного и тройного меток, мы переоценили гибель нейронов сетчатки в мышиной модели наследственной глаукомы. Клеточные специфические маркеры и общее количество нейронов не выявили потери клеток в любых нейронах сетчатки, кроме клеток ганглиона. В пределах нашей способности определять типы клеток, группа ганглиозных клеток не была особенно уязвимой или устойчивой к дегенерации. Ретроградная маркировка и окрашивание нейрофиламентом показали, что аксональная атрофия, дендритный ремоделирование и соматическая усадка (по крайней мере, из самых больших типов клеток) предшествуют гибели клеток ганглия в этой модели глаукомы. Регионы гибели клеток или выживаемости излучались из головы зрительного нерва в веерообразных секторах. В совокупности данные предполагают повреждение аксонов в головке зрительного нерва как раннее поражение, а повреждение расслоений аксонов вызывает эту картину дегенерации. Тем не менее, архитектура мышиного глаза, по-видимому, препятствует обычно постулированному источнику механических повреждений в головке нерва.

Сокращения, используемые в этой статье: ChAT, холин-ацетилтрансфераза; ГАМК, γ-аминомасляная кислота; GCL, слой ганглиозных клеток; INL, внутренний ядерный слой; IPL, внутренний плексиформный слой; NOS, синтаза оксида азота; TH, тирозингидроксилаза.

Глаукома приводит к медленному прогрессивному уменьшению популяции клеток ганглиона сетчатки, нейронов сетчатки, которые выступают в мозг через зрительный нерв. Обычно это, но не обязательно, связано с повышенным внутриглазным давлением. Характер механистической связи между высоким внутриглазным давлением и потерей ганглиозных клеток сетчатки не прочно установлен. Хотя изредка предлагалось менее прямое оскорбление, травма головы зрительного нерва, место, где аксоны ганглиозных клеток соединяются вместе, чтобы покинуть земной шар, было главной возможностью. Вообще говоря, это может произойти при сжатии или давлении на аксоны в точке их выхода, но точные патофизиологические события остаются неизвестными (обзоры см. В Quigley, 1987, 1999; Libby et al., 2005b; Whitmore et al., 2005). ).

Мы пересмотрели нервные изменения, которые происходят при повышенном внутриглазном давлении. Мы использовали модель мышиной модели унаследованной глаукомы (штамм DBA / 2J), в которой повышается внутриглазное давление, и ганглиозные клетки вырождаются с асинхронным прогрессирующим курсом, который таким образом напоминает состояние человека (John et al., 1998; Anderson et al., 2002; Libby et al., 2005a). У нас было четыре начальные строки допроса. Во-первых, какие клеточные популяции затронуты? Повреждены ли только ганглиозные клетки сетчатки или повреждены другие нейроны сетчатки? Во-вторых, резистентны ли какие-либо типы ганглиозных клеток сетчатки? Теперь ясно, что мышиные сетчатки, такие как сетчатки млекопитающих (обычно), содержат примерно дюжину различных физиологических типов ганглиозных клеток (Rockhill et al., 2002; Sun et al., 2002a, b; Dacey et al., 2003; Badea и Nathans, 2004; Kong et al., 2005). Предыдущие доказательства у людей обычно интерпретируются как показывающие выборочную потерю больших клеток ганглиона сетчатки (Quigley et al., 1987, 1988). Правильно ли это в модели мыши, и если да, то какой из нескольких типов крупных ганглиозных клеток затронут? В-третьих, существуют ли доказательства вмешательства в аксональный транспорт? Это можно было бы ожидать, если бы аксоны были сжаты в головке нерва, а цитологические признаки блокировки наблюдались у нескольких разных видов (Quigley and Addicks, 1980). Наконец, что можно наблюдать по последовательности вырождения; то есть подробные морфологические события, которые вмешиваются между нормальным состоянием и окончательным вырождением ганглиозных клеток?

У разных видов все эти вопросы были исследованы ранее. Наши причины для их восстановления в два раза. Во-первых, модель мыши позволяет изучать их скоординированным образом, так что взаимосвязанные вопросы могут быть изучены параллельно в одних и тех же сетчатах из естественной, унаследованной модели болезни человека. После того, как все этапы будут описаны у мышей, генетика мыши значительно облегчит характеристики механизмов, влияющих на каждую стадию. Во-вторых, оптическая визуализация и иммуноцитохимические методы эволюционировали в течение последних нескольких лет до такой степени, что нейроны сетчатки могут быть визуализированы с беспрецедентной точностью (MacNeil and Masland, 1998; Gan et al., 2000; Haverkamp and Waessle, 2000; Dacey et. al., 2003). Мы надеялись, что улучшенная резолюция, предлагаемая этими достижениями, даст новые подсказки природе событий, которые происходят во время унаследованной глаукоматозной дегенерации.

В ходе исследования мы обнаружили, что дегенерация ганглиозных клеток неравномерно распределена по поверхности сетчатки. Вместо этого сетчатка часто представлена ​​радиально ориентированными секторами дегенерации. Примечательно, что в случае болезни человека повреждение клеток ганглиев обычно равномерно распределено по всей сетчатке. Ведущая гипотеза приписывает поврежденные пучки аксонов сжатию жесткими коллагеновыми пластинами пластинчатой ​​щебни. Тем не менее, глаз мыши, похоже, не имеет кривизны lamina, предполагая, что в будущем внимание будет сосредоточено на трофической роли глии.

Для каждой сетчатки тяжесть глаукоматозного повреждения оценивали путем сортировки зрительного нерва по ранее зарегистрированной трехточечной шкале (умеренной, умеренной и тяжелой форме, Anderson et al., 2005; Libby et al., 2005a). У слабосложных нервов может быть небольшая степень повреждения аксонов, которая возникает у нормальных глаз мыши в изучаемый возраст, но у них нет признаков глаукоматозного повреждения и они считаются незатронутыми (Anderson et al., 2005; Libby et al., 2005c ). В возрасте 1 года у значительного процента мышей DBA / 2J развилась умеренная или тяжелая глаукома, определяемая по шкале оптического нерва. Из 67 зрительных нервов, которые были исследованы в этом исследовании, у 19 (28%) не было признаков глаукоматозного повреждения, 3 (4%) умеренно умеренно, а у 44 (66%) наблюдались признаки тяжелого заболевания (1 нерв был неохвачен) , Прогресс болезни в левом и правом глазах любой мыши не был сильно коррелирован. Мы определили общее количество клеток в ганглиозном клеточном слое (GCL) в 29 сетчатке (4 из которых были из 3-му-старых контролей DBA / 2J) путем проведения обследований 16 × или 25 × всей сетчатки и подсчета клеток ядра. Как и ожидалось, общее количество клеток хорошо соответствовало классификации зрительного нерва. В незатронутой сетчатке, как и у 3-му-старых животных DBA / 2J, общая плотность клеток в центральных частях сетчатки превышала 9000 клеток / мм2, что хорошо соответствует показанной ранее у нормальных мышей (~8000 клеток / мм2), суживающихся до ~ 3000-4000 клеток / мм2 на периферии (Jeon et al., 1998). В наиболее сильно пострадавших сетчатах мы обнаружили максимальную плотность локальных клеток 6000 клеток / мм2 (рис.1). Интересно, однако, что потеря клеток была неоднородной по всей площади сетчатки. В некоторых случаях один или два квадранта были избавлены от болезни (рис.1B). Это было не редкость, даже в сетчатке с сильно уменьшенным общим количеством клеток ганглиона, чтобы найти небольшие участки сетчатки (рис.1C) или, по крайней мере, небольшие острова, которые были почти нормальными. В наиболее тяжелых случаях общее количество клеток в GCL было уменьшено до такой степени, что, возможно, все остальные клетки были амакриновыми клетками (фиг.1D). Последствия пространственной анизотропии будут рассмотрены ниже. Для начала мы опишем изменения нейронов, которые происходят во время вырождения.

Число нейрональных клеток в GCL. (A-D) Всего клеток в GCL, за исключением эндотелиальных клеток и микроглии, подсчитывали и графовали как карты плотности. Для более легкого сравнения все сетчатки показаны с временной к носовой ориентации (как если бы у них были все правильные глаза). Глубокий разрез верхнего полюса сетчатки (наконечник стрелки) использовался для ориентации во время подготовки. Темно-красный цвет соответствует плотности клеток 10 000 клеток / мм2, как указано в цветовой полосе; районы, показанные серым цветом, не могут быть подсчитаны по техническим причинам. Сетчатка в A (DBA / 2J, незатронутый зрительный нерв) не обнаруживает признаков дегенерации. Сетчатка в В показала умеренную глаукому по шкале оптического нерва; в этом конкретном случае количество клеток в носовой половине сетчатки было значительно уменьшено, тогда как временная половина оказалась нормальной. C и D показывают тяжелую глаукому по шкале нервов. Обратите внимание, что в сетчатке, показанной на С, хотя общая потеря клеток тяжелая, область остается с довольно нормальными номерами клеток. (E) Нейроны в GCL были подсчитаны вдоль назотемпоральной оси и графовали как ячейки на миллиметр в квадрате. Открытые круги, C57BL / 6J (одна сетчатка); черные круги, 3-мо-старый (predisease) DBA / 2J (средний из трех ретинас — SEM); зеленые квадраты, уровень нервной системы DBA / 2J не влияет (средний из трех сетчаток); голубые бриллианты, умеренный уровень нервной системы DBA / 2J (одна сетчатка); красные треугольники, DBA / 2J нервный класс тяжелый (средний из четырех сетчаток). (F) нейронов GCL вдоль дорсовентральной оси (символы такие же, как в E).

Здесь мы первоначально сравнивали вертикальные участки сильно поврежденного DBA / 2J с контрольной сеткой (C57BL / 6J). Уменьшенная плотность клеток в GCL была очевидной, но в остальном сетчатки были неразличимы (рис.2, A и B). В соответствии с этим наше предыдущее сравнение вертикальных участков нескольких сильно поврежденных ретиналей DBA / 2J с сетками молодых мышей DBA / 2J не поддерживает потерю нейронов сетчатки, отличных от ганглиозных клеток в большинстве глаз (Libby et al., 2005a). Эти данные свидетельствуют о большой потере нейронов, кроме ганглиозных клеток, но общая толщина слоев является грубым методом оценки. Поэтому мы окрашивали множество маркеров амакрин и биполярных клеток как в сетчатых сетчатых сетчатах, так и в вертикальных срезах, в качестве хорошо охарактеризованного прототипа использовали холинергический звездчатый тип амакриновой клетки (Masland et al., 1984).

Amacrine клеток у глаукоматозных мышей DBA / 2J. (A) Один конфокальный вертикальный срез через сетчатку мыши C57BL / 6J, окрашенную ядерным красителем TOPRO. Для сравнения, изображения в A-C были взяты в центральной части сетчатки. (B) Вертикальный срез через сетчатку DBA / 2J (тяжелая степень нерва) при тех же условиях. Никакое изменение толщины ни INL, ни фоторецепторов не наблюдается, но обратите внимание на разреженность тел клеток в GCL в B. (C) Иммуноокрашивание для ChAT (зеленый) в вертикальном разрезе мыши DBA / 2J (степень тяжести нерва ) показывает типичные две полосы в IPL и телах звездных звезд в INL и GCL. (D) Проекция максимальной интенсивности стопы из 10 конфокальных секций при размере шага 1 мкм через звездчатую амакриновую ячейку, меченый биолистически с родамин-декстраном. Ячейка показывает характерную радиально-симметричную морфологию. Стрелка указывает на ближайшую ячейку Мюллера. (E и F) Процент ХАТ + амакриновых клеток всех клеток в GCL в центральной (E) и периферической (F) сетчатке. Открытые круги, C57BL / 6J; замкнутые кружки, 3-mo-old DBA / 2J; синие прямоугольники, уровень нервной системы DBA / 2J не затронут; красный треугольник, DBA / 2J нервный класс тяжелый. (G и H) Целая сетчатка (фокус на GCL) от 3-му-старого контрольного DBA / 2J-предшественника, окрашенного для ChAT (G) и клеточных ядер (H). (I и J) Цельная сетчатка из глаукоматозного DBA / 2J (тяжелое животное). Хотя числа клеток amacrine ChAT + starburst в контроле и пораженных животных (135 против 138 в этих двух полях) одинаковы, обратите внимание на очевидное сокращение клеток в GCL в J по сравнению с H. Изображения в G-J являются позицией соответствует. (K) Одиночный конфокальный профиль сетчатки DBA / 2J (тяжелая степень нерва), окрашенная для calbindin 28D (зеленый) и ядра клеток (синий). Стрелки указывают горизонтальные тела ячейки. Обратите внимание на разреженность тел ячейки в GCL во всех панелях. (L) Окрашивание для ГАМК (зеленый). (M) Окрашивание для b-NOS (зеленый). Стрелка указывает тело ячейки b-NOS +. (N) Окрашивание синаптофизина (зеленый). Обратите внимание на интенсивное синаптическое пятно во внешнем плексиформном слое (стрелка) и во всем IPL. (O) для PKCα (зеленый) и CD15 (красный). Секции в К-О — из одного глаза. Бары: (A-C) 50 мкм; (D) 50 мкм; (G-J) 100 мкм; (K-O) 50 мкм.

Сравнение чисел клеток в GCL и числа аксонов в зрительном нерве указывает на то, что> 50% ядер в GCL принадлежат к клеткам, отличным от клеток ганглия; недавняя оценка заключалась в том, что процент клеток ненгаглиона составлял 59 ± 4% от общего числа (Jeon et al., 1998). Мы использовали антитела против холиновой ацетилтрансферазы (ЧАТ) для окрашивания звездчатых амакриновых клеток. Эти клетки существуют в вариантах ВЫКЛ и ВК, а тела клеток последнего находятся в GCL. Амакриновые клетки Starburst не являются единственным типом смещенной амакриновой клетки, но они, безусловно, являются самыми многочисленными и поэтому могут быть использованы в качестве показателя: потеря этих клеток, пропорциональная потере общих клеток в GCL, будет показателем неселективного потеря клеток.

Процент всех клеток в GCL, которые были звездообразными амакриновыми клетками, вычисляли в 4 центральных и 4 периферических полях, каждый из которых состоял из 11 ретиналей (1 из мыши C57BL / 6J, 2 из 3-мольных контрольных мышей DBA / 2J, 3 из незатронутые 1-летние ретинаты DBA / 2J и 5 из ретинанов DBA / 2J с тяжелой глаукомой). Плотность клеток Starburst и процент клеток в GCL (фиг.2, E и F) в незатронутых сетчатах хорошо соответствовали плотности этих клеток в сетчатке мышей C57BL / 6J и у мышей DBA / 2J 3-mo-old ( Jeon et al., 1998). В глаукоматозных сетчатах процент клеток звездообразования заметно увеличивался, что свидетельствовало о селективной потере ганглия над амакриновыми клетками. Кроме того, диаметры ChAT-положительных клеток в GCL измерялись в тех же полях. Не было никаких существенных различий между пораженными и незатронутыми сетчаткой, что указывает на то, что звездообразные амакриновые клетки остаются морфологически нормальными. Это было дополнительно подтверждено тем фактом, что во время нашей маркировки отдельных ганглиозных клеток с флуоресцентными декстранами также иногда помечены некоторые звездообразовательные клетки. Эти клетки отображают характерную морфологию звездообразования (рис. 2 D). Наконец, вертикальные участки сильно пораженной сетчатки, окрашенные для ЧАТ, показали характерную двойную полосу на 40 и 60% внутреннего плексиформного слоя (IPL, рис. 2 C), что, опять же, неотличимо от незатронутых сетчаток.

Чтобы проверить возможность дегенеративных изменений в других нейронах сетчатки, мы исследовали группу других типов амиракеновых клеток, для которых доступны специфические и хорошо охарактеризованные маркеры. Это было сделано у 1-летних мышей DBA / 2J с сильным истощением ганглиозных клеток.

AII amacrine cells — самая большая одиночная популяция амакриновых клеток, образуя обязательный интернейрон в пути от стержневого фоторецептора к сетчатым ганглиозным клеткам. Они представляют собой один анатомический и функциональный тип клетки, который играет ключевую роль в зрении в условиях слабого света (Famiglietti and Kolb, 1975; Strettoi et al., 1992, 1994). У мышей амиакрины AII могут быть окрашены антителами к продукту гена disabled-1. Мы подсчитали плотность клеток в средней периферии от целых креплений двух сильно глаукоматозных глаз до 2,294 ± 94 клеток / мм2, что сопоставимо с ранее опубликованной величиной (Rice and Curran, 2000).

Экспрессия тирозингидроксилазы (TH) характеризует тип широко разветвляющихся дофаминергических амакриновых клеток, которые стратифицируются в субламинах 1 и 3 IPL и, кроме того, посылают межплексические ветви на внешний плексиформный слой (Gustincich et al., 1997). Клетки относительно редки, и их распределение даже по всей сетчатке. Мы измерили плотность клеток TH + в шести полях каждый из трехлетнего контрольного животного и сильно пострадавшего. Числа TH-клеток были очень похожи, с 49,3 ± 5,5 клеток / мм2 для контроля и 48,7 ± 4,7 клеток / мм2 для пораженной сетчатки соответственно. Поскольку эти клетки присутствуют в низких количествах, можно было подсчитать общее количество TH + клеток во всей ткани для двух сетчаток. Мы подсчитали 646 TH-клеток в мыши 2-mo-old DBA / 2J с нормальным нервом и 688 в сетчатке, которая была идентифицирована как тяжелая глаукома с помощью классификации зрительного нерва. Дендриты клеток, включая чрезвычайно тонкие межплексические ветви, были отчетливо различимы в сильно пораженной сетчатке; эти клетки, по-видимому, не пострадали.

Эти измерения показывают, что количественная потеря клеток для тестовых популяций нейронов отсутствовала. В поисках тонких признаков повреждения мы исследовали подробную морфологию нескольких других нейронных популяций с использованием антител против кальбиндина D28, синтазы оксида азота (NOS), гликоконъюгатного эпитопа CD15 и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) в качестве маркеров. Эти антитела характеризуют несколько клеточных популяций нейронов сетчатки и их процессов в IPL (Versaux-Botteri et al., 1984; Kim et al., 1999; Jakobs et al., 2003). Кальбиндин D28 высоко экспрессируется в различных типах клеток во внутреннем ядерном слое (INL) и GCL, а также ярко окрашивает горизонтальные ячейки. Окрашивание Calbindin горизонтальных клеток и клеток в INL оказалось нормальным даже в сильно пораженных сетчатах (рис. 2 K). Иммуноокрашивание для нейротрансмиттера GABA создает нормальный шаблон полос в IPL, в дополнение к маркировке широкоамных амакриновых клеток как в INL, так и в GCL (рис.2 L). Иммуноокрашивание для b-NOS, синаптического маркера синаптофизина и CD15 на вертикальных участках не выявило аномалий (фиг.2, M-O). Наконец, стержневые биполярные клетки, окрашенные антителом против PKCα, оказались нормальными в морфологии (рис. 2 O).

Обнаружение того, что потеря клеток ограничена клетками ганглия, позволяет более точно оценить потерю ганглиозной клетки. Предполагая, что амакринные клетки в этих сетчатах не подвергаются дегенерации и что они обычно составляют 59 ± 4% нейронов в GCL (Jeon et al., 1998), количество фактических ганглиозных клеток в GCL снижается от нормального значение ~9000 ганглиозных клеток / мм2 в центральных частях сетчатки до <1000 ганглиозных клеток / мм2 в центральной сетчатке сильно пораженных сетчаток.

В большинстве половых клеток млекопитающих есть ≥12 различных типов ганглиозных клеток, и каждый из них имеет четкую функцию в зрении (обзор см. В Masland, 2001). Мышь не является исключением из этого правила (Sun et al., 2002a; Badea and Nathans, 2004; Kong et al., 2005). Мы хотели знать, являются ли один или несколько типов ганглиозных клеток резистентными или особенно уязвимыми для дегенерации. Для этой цели мы внимательно изучили серийные изображения с высоким разрешением дендритных и аксоновских структур из 154 клеток ганглия. Клетки визуализировали либо путем фотодинамики in vitro, либо путем биолистической доставки флуоресцентных декстранов с последующей конфокальной микроскопией. Родамин-декстран переносится ретроградно из аксонных мишеней в тело клетки и может быть обнаружен как флуоресцентные гранулы в цитозоле ганглиозных клеток, предположительно включенных во внутреннее отделение. В дополнение к указанию переноса аксонов этот метод может быть использован для визуализации морфологии отдельных клеток. При фотовозбуждении краситель распределяется внутри всей клетки, обнаруживая дендриты и аксоны (Dacey et al., 2003). Поскольку этот метод «обратной фотодинамики» зависит от интактных аксонов и функционирования аксонального транспорта, можно ожидать, что он будет выбирать относительно относительно здоровые клетки. Мы обследовали все клетки, помеченные таким образом (n = 45, из которых 28 пришли из пострадавших сетчаток), чтобы определить, можно ли обнаружить явное преобладание одного или нескольких типов клеток. Это будет свидетельствовать о наличии типов, которые относительно устойчивы к дегенерации. Однако в этой галерее ганглиозных клеток мы обнаружили широкий спектр типов клеток, как это наблюдается в нормальной мыши.

Кроме того, мы использовали генный пистолет для биолистической доставки декстранов, помеченных красителем, в сетчатку. В общей сложности 109 клеток были помечены с использованием меченых генами, родамин- или FITC-мечеными. Из этих клеток 46 были от умеренно до очень сильно затронутых сетчатки, а остальные были из случаев, в которых обнаруживалась незначительная или отсутствующая потеря клеток. Мы не видели доказательств преобладания одного или нескольких типов в пораженных сетчатках, как это имело бы место в случае одного или нескольких устойчивых типов. На рисунке 3 показан ряд примеров ганглиозных клеток в нашем образце.

Галерея типов клеток ганглия встречается в глаукоматозных DBA / 2J. Отдельные ганглиозные клетки были помечены либо биолистической доставкой FITC-декстраном, либо фотодинамикой. Изображения представляют собой проекции максимальной интенсивности 20 конфокальных секций, сделанные с шагом в 1 мкм. Клетки были умеренно или сильно поражены сетчаткой (на основе уровня нерва). Согласно классификации Sun et al. (2002a), клетки будут классифицироваться следующим образом: (A) тип C4; (B) тип A2 внешний; (C) тип C2 внутренний; (D) тип B4; (E) тип C5; (F) тип B2; (G) тип D2 (эта ячейка распределяется); (H) тип A2 внутренний; (I) тип C1; (J) тип C2 внешний; (K) тип C5; и (L) типа A1. Бары, 100 мкм.

Мы также смотрели конкретно на два идентифицированных типа крупных ганглиозных клеток сетчатки. Из-за своей относительной селективности для α-ганглиозных клеток (Drager et al., 1984) SMI32 также может использоваться для оценки предпочтительной уязвимости или резистентности этого конкретного типа клеток, самой большой ганглиозной клетки всех присутствующих в сетчатке мыши (Peichl et al., 1987; Doi et al., 1995; Sun et al., 2002a; Kong et al., 2005). Общее количество ярких меченых клеток SMI32 + было подсчитано в 11 сетчатке у 1-летних животных, 6 из которых были диагностированы как незатронутые по шкале оптического нерва и 1 сетчатка от мыши DBA / 2J до начала заболевания. В контрольном животном мы подсчитали 1058 клеток SMI32 (66,7 клеток / мм2). Аналогичные числа (68, 59,2, 67,1, 56,1, 44,6 и 52,6 клеток / мм2) наблюдались в пяти сетчатке, которые были диагностированы как не затронутые оценкой зрительного нерва. В остальных пяти сетчатах, классифицированных как тяжелая глаукома по шкале оптического нерва, количество клеток SMI32 было снижено до 26,9, 14, 7, 26,8, 9,1 и 19,7 клеток / мм2 соответственно, что уменьшило до 13,6-40,2% число, наблюдаемое у молодого контрольного животного.

Photopigment melanopsin характеризует популяцию больших клеток ганглия сетчатки, вовлеченных в увлечение циркадианными ритмами (Provencio et al., 1998; Berson et al., 2002; Hattar et al., 2002). Антисыворотка против меланопсина использовалась на шести сетчатке в нашем образце, два из которых были диагностированы как сильно затронутые по шкале оптического нерва, и один контроль 2-мя лет. Количество меланопсин-положительных клеток (35,5 клеток / мм2 у контрольного животного) уменьшалось до 12,5 и 7,1 клеток / мм2 в сильно пораженных сетчатах, что соответствовало уменьшению клеток меланопсина в 4,7 и 2,7 соответственно.

Клетки SMI32 и меланопсина относятся к числу крупнейших ганглиозных клеток в сетчатке мыши, и, тем не менее, уменьшение их числа, если вообще возможно, пропорционально меньше, чем падение общего числа ганглиозных клеток, что составляет> 90% в большинстве тяжелые случаи. То, что они не являются по-разному потерянными, говорит о преимущественном повреждении крупных ганглиозных клеток в этой модели глаукомы (действительно, сообщалось, что клетки меланопсина избирательно устойчивы к некоторым причинам дегенерации [Robinson and Madison, 2004]).

Некоторые из клеток пораженных сетчатки имели явно аномальную морфологию (фиг.4, A-F). Хотя их количество варьировалось от сетчатки до сетчатки, они были постоянной характеристикой всех, кроме самых слабо затронутых тканей. Дендриты пораженных клеток оказались подветренными. Видимы только первичные и вторичные дендриты, тогда как ветви более высокого порядка, обычно присутствующие на этих клетках, теряются. Еще одной особенностью этих клеток было появление искаженных дендритов, которые, как представляется, зацикливались и откидывались назад (фиг.4, C и D, стрелки), формы, которые никогда не наблюдаются в нормальных ганглиозных клетках. В самых тяжелых случаях все еще были видны только первичные дендриты — иногда только их проксимальные сегменты.

Пострадавшие ганглиозные клетки, помеченные геномной пушкой или иммуноокрашиванием SMI32. (A и B) Затронутые клетки ганглия показывают потерю дендритов второго и более высокого порядка. Виден только несколько и короткие дендриты третьего порядка (стрелки). (C и D). Эти ганглиозные клетки иногда имеют длинные, извилистые дендриты, которые проходят по спирали через значительную часть IPL, появляясь как петли в проекционном изображении (наконечники стрел). (E и F) В сильно затронутых клетках ганглия видны только тело клетки и проксимальная часть первичных дендритов. (G и H). Поврежденное (G) клеточное тело от больной сетчатки DBA / 2J (тяжелая степень нерва) при высоком разрешении и нормальная клетка SMI32 (H) для сравнения. Показаны окрашивание SMI32 (зеленый), окрашивание ChAT (красный) и окрашивание ядер (синий). (I и J) Те же клетки при меньшем увеличении с дендритами в фокусе. (K и L) Соседние клетки. Обратите внимание на потерю клеток SMI32 + для сильно затронутой сетчатки в F. Bars: (A-F) 100 мкм; (G и H) 20 мкм; (I-L) 100 мкм.

В качестве нейрофиламентного маркера антитело SMI32 визуализирует цитоскелет, который появляется как полотно нитей вокруг ядра клетки (фиг.4 H). В глаукоматозных сетчатах мы наблюдали яркие меченые клетки SMI32, чьи нейрофиламенты плотно конденсируются вокруг ядра. В этих клетках особенно отчетливо проявляется дендритная подребризация (рис.4, G и I), а иногда дендриты вообще не ветвятся.

Тела клеток были усохшими по сравнению с обычными клетками SMI32. Мы измерили диаметры клеток SMI32 в сетчатке сетчатки 3-м, три сетчатки, которые избежали болезни, и шесть сильно затронутых сетчатки. Из каждой из этих 10 сетчаток измеряли 62 отдельных клетки. Средний диаметр клеток SMI32 у контрольного животного составлял 20,52 ± 2,6 мкм. Диаметры в незатронутых сетчатых ретинатах DBA / 2J были сходны с контролем: 19,88 ± 1,97, 20,35 ± 2,46 и 20,1 ± 2,84 мкм соответственно, что не было значительными различиями (P = 0,47). В пяти глаукоматозных сетчатах диаметры были значительно меньше (17,07 ± 2,16, 17,1 ± 2,44, 17,09 ± 1,87, 16,27 ± 2,63 и 15,59 ± 2 мкм соответственно, P <0,001), что соответствует усадке между 17 и 25%.

Шестая сетчатка DBA / 2J имела большую ганглиозную потерю клеток (тяжелая степень нерва), но имела сектор, который остался незатронутым (см. Рис. 10). Диаметры клеток SMI32 измерялись для пораженной и нормальной части этой сетчатки отдельно. В пределах вырожденных и нормальных зон диаметры составляли соответственно 15,8 ± 2,3 и 19,48 ± 2,62 мкм (P <0,001).

Меланопсин-позитивные ганглиозные клетки измеряли у одного 3-мульного контрольного животного и двух незатронутых и двух пораженных сетчатки (в каждом случае измеряли 34 клетки). Диаметры клеток были следующими: контроль, 15,58 ± 1,88 мкм; незатронутые сетчатки DBA / 2J, 15,03 ± 1,87 мкм; и тяжелые ретинаты DBA / 2J, 14,8 ± 2,28 мкм. Это небольшая, но статистически значимая степень усадки (P = 0,0017).

Мы инъецировали семь 1-летних мышей DBA / 2J, одну 2-мульную мышь DBA / 2J и одну мышь C57BL / 6J в двухстороннем порядке в верхние колликулы с родамин-декстраном и позже отображали сетчатки 1 wk (фиг.5 ). Из 13 изученных сетчатки 12 имели клетки ганглия, которые содержали гранулы родамина-декстрана. Четыре из этих сетчатки были нормальными. Остальные девять умеренно пострадали. Как описано в разделе «Типы выживших ганглиозных клеток», многие из ганглиозных клеток имели нормальный ретроградный транспорт и нормальную морфологию в пораженных сетчатке. Напротив, у тех ганглиозных клеток, у которых была аномальная морфология, никогда не было видно гранул родамина-декстрана от ретроградного транспорта, что указывает на то, что ретроградный транспорт был скомпрометирован. Кроме того, аксоны аномальных ганглиозных клеток оказались усохшими. В нормальных ганглиозных клетках аксоны легко видны после ретроградного переноса флуоресцентных индикаторов или (особенно) после окрашивания нейрофиламентов антителом SMI32. В клетках ганглия с реконструированными дендритами аксоны отчетливо видны только вблизи их выхода из сомы; в других местах они были настолько тонкими, чтобы быть практически невидимыми.

Маломощные виды всей сетчатки 1 неделю после инъекции родамина-декстрана в верхний колликулум. Указанная степень тяжести относится к классу оптического нерва. (A) Типичный результат в сетчатой ​​сетчатке DBA / 2J. Большая, смежная часть площади поверхности помечена засыпанными ячейками, которые едва различимы при этом увеличении в виде отдельных белых точек. Бар, 500 мкм. (B) Сетчатка с умеренной глаукомой. Видимо два сектора из многочисленных ярких ячеек (верхний правый квадрант и нижний левый квадрант, верхний) и менее плотные небольшие сектора (нижний правый квадрант). (C) Сетчатка с тяжелой потерей клеток. В нижнем правом квадранте четко видна одна узкая секция меченых ячеек. Плотность засыпанных клеток намного ниже, чем у А и В. Головка зрительного нерва отмечена звездочкой. (D) Вид с высоким разрешением области в коробке, обозначенной буквой C. Закрытые стрелки указывают на аксоны, а открытые стрелки указывают две отдельные засыпанные ячейки, дендриты которых видны даже при этом увеличении. (E) Одна из наиболее сильно затронутых сетчатки в нашем образце. Вряд ли какие-либо засыпанные клетки видны. Тенистая полоска переполненных ячеек начинается с головы зрительного нерва (звездочка) до положения в четыре часа. Другая подобная полоса видна в верхнем левом квадранте (стрелки). (F) Вид с высоким разрешением области в коробке, обозначенной в E. Общее количество помеченных клеток в этом секторе было низким (<30), и большинство клеток не накапливали достаточное количество гранул родамина-декстрана, чтобы выявить их дендритную морфологию. Стрелки такие же, как в E.

Распределение ретроградно меченных клеток было неожиданным. В обычных сетчатке (C57BL / 6J) и в сетчатке у молодого животного DBA / 2J большие смежные части, обычно составляющие ≥50% от общей площади, содержат меченые клетки (вся сетчатка не покрыта, потому что наши инъекции в превосходящий колликулус не покрывает всего поля проекции ганглиозных клеток сетчатки). В сетчатке глаза глаукомы мы обнаружили, что секторы ярких меченых клеток прерваны секторами, в которых нет или только очень немногих помеченных клеток. На фиг.5 показаны четыре примера: А, показывающий незатронутую сетчатку и В, С и Д, демонстрируя повышение степени тяжести. Этот результат не может быть объяснен техникой инъекции, так как волокна в верхнем колликуле не расположены таким образом, а у нормальных животных веерообразная маркировка ганглиозных клеток ретроградным транспортом никогда не наблюдается. Области засыпленных клеток соответствуют областям, где пучки аксонов относительно хорошо сохранены, тогда как немеченые участки также оголены аксонами (рис.6).

Секторы засыпанных клеток соответствуют секторам с относительно большим количеством аксонов. (A) Маломощный вид сетчатки с умеренной глаукомой. Вся гора была окрашена для нейрофиламентного маркера SMI32, который маркирует аксоны и популяцию больших ганглиозных клеток (зеленый). Выделенные квадраты (поля 1-4) и обведенный нерегулярный прямоугольник показывают положение входов более высокой мощности и площади в B и C соответственно. Аксоны и крупные клеточные тела клеток ганглиона SMI32 + показаны зеленым цветом. Стрелки в поле 1 указывают на ячейки SMI32 +. Chac + (starburst) amacrine клетки помечены красным цветом, а ядра клеток окрашены TOPRO (синий). Обратите внимание на выраженную разницу в количестве аксонов, которые можно увидеть, пересекая поля. Плотности клеток в этих полях также варьируются от 7 728 до 7 744 клеток / мм2 в полях 1 и 2 и между 6 352 и 5936 ячейками / мм2 в полях 3 и 4 соответственно. Бар, 100 мкм. (B) Площадь неправильной коробки с A (окрашенная для SMI32) при более высоком разрешении. (C) В той же области, что и в B, но с обратной засыпкой родамина-декстрана. Отдельные клеточные тела едва различимы как красные точки при этом увеличении. Области с большим количеством засыпных клеток соответствуют районам с относительно большим количеством сохраняющихся аксимов SMI32 +. Бар, 500 мкм.

Этот веерообразный образец дегенерации был дополнительно продемонстрирован путем иммуноокрашивания сетчатых ретинай с антителом против SMI32. В нормальных сетчатых полях SMI32-положительные аксоны полностью окружают головку зрительного нерва. При умеренно тяжелом заболевании пучки аксонов заметно истончаются, а в самых крайних случаях аксоны почти полностью потеряны (см. Рис.7 для нормального, фиг.8 для промежуточного элемента, а на рис.9 — для крайнего примера) , SMI32 также показывает, что даже в истощаемых сетчаткой сетчатке редко наблюдается сектор почти нормального вида (см. Рис. 10 для яркого примера).

Цельная незатронутая сетчатка. (A) Обследование с высоким разрешением цельной сетчатки из сетчатки DBA / 2J, которая избегала болезни (невосприимчивость к зрительному нерву), окрашенная для SMI32 (зеленый) и ChAT (красный) и контрастировала с TOPRO (синий). Многочисленные яркие аксионы SMI32 + видны вокруг зрительной нервной головки и хорошо расположены на периферии. Бар, 500 мкм. (B-E) Мощные виды боксированных областей, обозначенных в A. Изображение очень похоже на изображение, наблюдаемое у 3-му-старых DBA / 2J или у мышей C57BL / 6J. Бар, 100 мкм.

Полностью смонтированная глаукоматозная сетчатка с сохраняющимися секторами нормального внешнего вида. (A) Обследование с высоким разрешением цельной сетчатки из умеренно затронутой сетчатки, окрашенной для SMI32 (зеленый) и ЧАТ (красный), и контрастирует с TOPRO (синий). Осенние пучки аксонов, попадающие в головку зрительного нерва, заметно уменьшаются и демонстрируют сектора с относительно высокой плотностью аксона, чередующиеся с секторами, у которых практически нет аксонов. Бар, 500 мкм. (B-E) Мощные виды бокс-зон, обозначенных в A. Bar, 100 мкм.

Цельное крепление сильно пораженной сетчатки с практически отсутствующими ганглиозными клетками. (A) Обследование с высоким разрешением цельной сетчатки из одного из наиболее сильно пораженных глаз в нашем образце, окрашенном для SMI32 (зеленый), ChAT (красный) и контрастируемым с TOPRO (синим). Бар, 500 мкм. (B-E) Мощные виды бокс-зон, выделенных в A. Вряд ли останутся любые ячейки или аксоны SMI32 +. Оставшиеся клетки часто показывают длинные неразветвленные дендриты. Открытая стрелка в D указывает на кровеносный сосуд, который неспецифически помечен вторичным антителом. Закрытая стрелка в B указывает на аномальную ячейку SMI32 +. Стрелки в C указывают оставшиеся аксоны. Обратите внимание, что ячейки ChAT + (красный) не подвержены влиянию. Бар, 100 мкм.

Секторы довольно нормальных ганглиозных клеток могут сохраняться даже при тяжелых сетчатке. (A) Обследование цельной сетчатки, окрашенной анти-SMI32 (зеленый), Чат (красный) и TOPRO (синий). Выделенный квадрат указывает местоположение поля в B. (B) Более высокий вид увеличения. Острая граница между областью, богатой аксоном и клеткой (внизу), и истощенной областью (слева) очевидна. Показатель оптического нерва был серьезен для этого глаза. Бары, 500 мкм.

В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что потеря клеток и изменения в морфологии клеток ограничены клетками ганглия и не влияют на другие клетки во внутренней сетчатке, по крайней мере в этом возрасте у мышей DBA / 2J. Топографические участки ганглиозных клеток сетчатки дегенерируют, тогда как другие области сетчатки сохраняются. В этих регионах ганглиозные клетки подвергаются прогрессированию структурных изменений, которые предшествуют откровенной дегенерации. Как будет обсуждаться, эти закономерности содержат ключи к механизму вырождения.

Вырождение ганглиозных клеток не привело к дегенерации любой из семи популяций амакрин и биполярных клеток, для которых имеются надежные маркеры. С точки зрения синаптической связи это следовало ожидать. У нормальных неглоустойчивых млекопитающих потеря ганглиозных клеток не вызывает дегенерации афферентных нейронов, по крайней мере, в течение продолжительного времени обычного эксперимента (Masland et al., 1984; Lin et al., 2004). Возможно, это потому, что амакрин и биполярные клетки в таких условиях потеряли лишь меньшинство их синаптических мишеней: большинство синаптических выходов амакрин и биполярных клеток находятся на других амакринных или биполярных клетках, а не на ганглиозных клетках. Обратите внимание на контрастность с ситуацией после дегенерации фоторецепторов, где постсинаптические нейроны (горизонтальные и биполярные клетки) почти полностью лишены синаптического входа и происходит большая реорганизация их структуры (Marc et al., 2003).

В рамках нашей техники не было предпочтения к дегенерации какого-либо одного типа сетчатой ​​ганглиозной клетки. Конечно, ограничение состоит в том, что в мыши имеется по меньшей мере дюжина типов ганглиозных клеток сетчатки (Doi et al., 1995; Sun et al., 2002a; Badea and Nathans, 2004; Kong et al., 2005) , а различия между некоторыми из них тонкие. Это затруднит обнаружение небольшой численной разницы между типами. При этом было ясно, что большое разнообразие типов наблюдается даже в сильно затронутых регионах, что среди выживших клеток не было преобладания какого-либо отдельного типа и что не было предвзятости к малым, средним или большим клеткам. Это был вывод, когда все население было опрошено и было подтверждено дальнейшими экспериментами, специально предназначенными для клеток α-типа, окрашенных SMI32 и уникальными меланопсин-иммунореактивными клетками. Клетки SMI32 являются крупнейшими клетками ганглия, присутствующими в сетчатке мыши, а клетки меланопсина находятся в верхних 25% от размера сомы и дендрита. Пропорциональная потеря этих клеток явно не отличалась от потери других типов ганглиозных клеток сетчатки.

Это контрастирует с предыдущими доказательствами того, что крупные ганглиозные клетки избирательно уязвимы в глаукоме человека (Quigley, 1995, 1999). Каково объяснение этой разницы? Более старые исследования человеческого материала, которые обязательно намного менее детализированы, чем те, которые были выполнены здесь, могли бы не учитывать правильные популяции нейронов в GCL сетчатки, которые включают в себя многие смещенные амакриновые клетки. Однако более поздние работы, несомненно, знали об этой проблеме, и это не повлияло бы на оценки ганглиозных клеток, основанные на диаметре аксона (Quigley et al., 1987, 1988). Другая возможность, подтвержденная нашими результатами (рис.4), заключается в том, что кажущаяся потеря больших клеток ганглия фактически является усадкой клеток, так что средняя ганглиозная клетка становится меньше. Такой вывод был сделан (Morgan et al., 2000) из исследований у обезьяны. Ни одно из этих исследований не объяснило бы сообщения о том, что магноцеллюлярные слои бокового тела коленного сустава, которые являются мишенью крупнейших ганглиозных клеток, понесли непропорционально большую потерю антерогравного аксонального транспорта во время экспериментальной глаукомы в модели приматов (Dandona et al., 1991). Помимо различий в видах, конечная возможность заключается в том, что селективная потеря больших ганглиозных клеток на самом деле является временным явлением, в котором крупные ганглиозные клетки поражаются сначала в глаукоме и в небольших клетках ганглия только позже. В нашем исследовании это вполне возможно, потому что мы не интенсивно изучали ранние стадии заболевания, но потребовали бы, чтобы маленькие ганглиозные клетки в конечном итоге догоняли большие дегенерирующие.

Мы ввели маркерные соединения в верхний колликулум, и это позволило нам оценить ретроградный перенос аксонами клеток ганглиона сетчатки. Кроме того, сома и дендритная структура клетки могут быть визуализированы и сопоставлены с клетками, визуализированными другими средствами, такими как иммуноцитохимия или опосредованное клетками заполнение клеток. Мы искали доказательства, сравнивающие временной ход дегенерации с наличием или отсутствием переноса аксонов. Поскольку это было корреляционное исследование, результаты не демонстрируют причинности, но были интересные новые выводы.

С одной стороны, ретроградный транспорт не является общим нарушением, так как многие ганглиозные клетки могут быть успешно заполнены маркерными соединениями ретроградным транспортом из верхнего колликулуса. В не полностью затронутых сетчатке (те, у кого много выживших ганглиозных клеток), они, несомненно, включали нейроны, которым в конечном итоге пришлось дегенерировать. Таким образом, не было доказательств в течение длительного периода, в течение которого ретроградный транспорт скомпрометирован, но сома и дендриты выживают.

С другой стороны, мы наблюдали частично вырожденные клетки, наиболее ярко проявляя окрашивание SMI32. У них были усеченные и неправильно направленные дендриты, усохшие соматы, аномальное накопление нейрофиламентов и исключительно тонкие аксоны. Эти клетки никогда не наблюдались, чтобы их заполняли ретроградным транспортом. Таким образом, провал аксонального транспорта и обобщенная нейропатия происходят более или менее одинаково у этих мышей. Частично вырожденный (возможно, реконструированный — лучший термин) состояние этих ганглиозных клеток представляет определенный интерес. Он, по-видимому, отражает стабильное состояние, в котором клетки упростили свои дендритные беседки, но еще не начали апоптоз. Существует мало цитологических доказательств имманентной гибели клеток: например, дендриты кажутся гладкими, в отличие от их зубчатого или бисероплетения в сильно поврежденных нейронах. Это говорит о том, что клетки подверглись оскорблению, но сохраняют свои основные гомеостатические механизмы (Whitmore et al., 2005). Помимо его биологического интереса к клетке, такое состояние может предоставить возможность для терапевтического спасения при болезни человека.

Из наших результатов и многих других кажется вероятным, что фундаментальное оскорбление после высокого внутриглазного давления происходит на головке зрительного нерва. Если бы повышенное внутриглазное давление само по себе вредно, другие нейроны сетчатки (амакрин и / или биполярные клетки), а также ганглиозные клетки могут быть повреждены. Рассуждая против прямого вредного воздействия давления, это было не так для нескольких популяций амакрин и биполярных клеток, которые мы могли бы пятнать. Кроме того, поскольку внутриглазное давление распределено более или менее равномерно по всему земному шару, клетки ганглиев должны быть повреждены во всей сетчатке, чего не было. Все эти результаты согласуются с тем, что поражение начинается в точке или вблизи точки, где аксоны покидают глаз.

Поразительное открытие заключалось в том, что излучающие веерообразные секторы ганглиозных клеток вырождаются. Секторы имели самую узкую точку вблизи головы зрительного нерва и расширялись по периферии. В пределах вырожденной зоны не было явно видимого центрального периферического градиента; другими словами, дегенерация ганглиозных клеток была более или менее одинаковой по степени тяжести при всех эксцентриситетах в зоне. Эту геометрию трудно отнести к патологии, отличной от фокального оскорбления, к группам соседних аксонов в головке зрительного нерва, которые должны создавать расширяющуюся зону аксонов при их удалении от головы зрительного нерва.

Что может быть это оскорбление? В человеческом заболевании, как и у мыши, потеря ганглиозных клеток ограничена когерентными зонами; это далеко не случайное падение отдельных клеток ганглия (у людей кривые аксонов, когда они излучают от нервной головки, именно это создает дугообразную скотому глаукомы). В случае болезни человека дегенерацию часто связывают с давлением жесткой коллагеновой матрицы пластинчатой ​​криброзы против аксонов зрительного нерва. Поскольку пучки аксонов проходят через отверстия в пластинчатой ​​крибросе, они считаются механически сжатыми в пучках, которые определяются отдельными отверстиями, через которые они проходят между ламинарными пластинами.

Раскопки оптического нерва, признак глаукомы человека, наблюдаются у мышей DBA / 2J (Anderson et al., 2005; Libby et al., 2005a). По аналогии с мышлением о человеческом заболевании мы впервые предположили, что пучки аксонов повсеместно повреждены во время их прохождения через отверстия в пластинчатой ​​криброзе. Нетрудно представить, что пучки аксонов задушены, где они проходят вместе через патологически суженное отверстие. Однако, похоже, что мышь соединительной ткани, присутствующая у приматов, не существует в мыши (май и Лутжен-Дреколл, 2002 г., неопубликованные данные). Это, по-видимому, исключает чисто механическое событие, связанное с пластинками соединительной ткани пластинчатой ​​криброзы, в качестве основы для повреждения пучков аксонов у мыши.

Оптический нерв мыши, тем не менее, поражен, а не жесткой соединительной тканью, оболочкой глиальных клеток, очерчивающей каждый пучок аксонов (Morcos and Chan-Ling, 2000). Возможно, что эти пучки являются физическим субстратом островов щадящего или поврежденного, наблюдаемого при глаукоматозном повреждении (элементарная единица, которая либо повреждена, либо спасена). По-видимому, что-то в поведении залегающих глиальных клеток вызывает повреждение при повышенном внутриглазном давлении (Neufeld, 1999; Morgan, 2000; Neufeld and Liu, 2003). Альтернативно, glia действительно может иметь положительную функцию для пучков аксонов, которые они окружают, защищая конкретные пучки заостренных аксонов от повреждений, вызванных другой причиной. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о повышенном внимании к клеточным биологическим взаимодействиям между оптическими аксонами и окружающими их астроцитами, такими как местные трофические события.

Все процедуры на животных были одобрены нашими Институциональными комитетами по уходу и использованию животных. Для большинства экспериментов использовались 1-летние мыши DBA / 2J. Для контроля с контролем соответствия штамма мы использовали 2-му-старых мышей DBA / 2J (возраст до наступления болезни). В качестве дополнительного контроля использовали мышей C57BL / 6J в возрасте 2 мес и 1 год. Мышей выращивали и выдерживали в лаборатории Джексона с диетой и жилищными условиями, как описано ранее (John et al., 1998). Легко адаптированных мышей анестезировали изофлураном и убивали с помощью i.p. инъекции 100 мг / кг кетамина и 20 мг / кг ксилазина в соответствии с Подкомитетом по исследованию животных по основным рекомендациям Массачусетского больницы. Перед удалением глаза верхний полюс был отмечен низкотемпературным электрическим прижиганием (Aaron Medical Industries). Глазное яблоко было обнажено, и зрительный нерв был разрезан внутрикорпуально острыми ножницами. Глаза были удалены и полупрозрачны вдоль ора-серрата. Верхний полюс был отмечен длинным разрезом. Ретины отделяли от пигментного эпителия и монтировали ганглиозную клеточную сторону вверх по фильтрам Isopore 3 мкм (Millipore), используя меньшие порезы на периферии, чтобы сгладить сетчатку. Все эти манипуляции проводились в растворе оксигенации млекопитающих Рингера. Параллельно мозг животного подвергался воздействию, и лезвие скальпеля использовалось для отсечения мозга параллельно основанию черепа, оставляя оптический хиазм и 1-2 мм вышележащей ткани на месте. Головку погружали в фиксирующий (0,8% формальдегид и 1,22% глутаровый альдегид) в течение 24 часов и промывали в 0,1 М фосфатном буфере и хранили в холодном фосфатном буфере для последующего анализа зрительных нервов.

Биологический перенос красильной связи декстрана или in vitro фотодинамики (Dacey et al., 2003) или их комбинацию использовали для обозначения ганглиозных клеток. Для биолистической маркировки сетчатки получали, как описано в предыдущем разделе, и два или три раунда вольфрамовых пулей, покрытых декстраном, содержащим родамин или FITC (MW 3000, Invitrogen), были обжиганы с использованием системы генных пушек (Helios, Bio- Rad Laboratories) при давлении 120 фунтов на квадратный дюйм. Это устройство было первоначально разработано для введения ДНК или РНК в живую ткань, но ее также можно использовать для доставки других молекул (Gan et al., 2000). Мы использовали фиксируемые декстраны, потому что эти молекулы остаются в клетке, и этикетирование выживает при мягкой обработке моющими средствами. Внесение красителя по этому методу является неселективным. В дополнение к ганглиозным клеткам, другие компоненты GCL, включая смещенные клетки амакрина и ножки Мюллера, помечены. В нашем образце мы идентифицируем клетку как ганглиозную клетку только тогда, когда, по крайней мере, можно было идентифицировать хотя бы начальный сегмент аксона. Маркированный декстраном Rhodamine или FITC покрывали вольфрамовыми пулями 1,1 мкм следующим образом: (а) декстран растворяли в воде при 0,2 мкг / мкл и смешивали с 40-50 мг вольфрамовых пуль; (б) смесь распределяли на слайде микроскопа, сушили и ресуспендировали в абсолютном этаноле; (с) пули обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин и пропускали через поры через 20- и 5 мкм; и (d) добавляли поливинилпирролидон до конечной концентрации 0,005 мг / мл. Это использовалось для покрытия труб Tefzel для разжигания генов в соответствии с инструкциями производителя.

Для фотодинамики in vitro мыши получали двусторонние инъекции в верхние колликулы. Животных анестезировали, а мелкие краниотомии выполняли над превосходящими колликулами. 0,5-1 мкл декстрана, маркированного родамином, инъецировали с использованием стеклянного капилляра, установленного на микроманипуляторе, снабженном держателем микропипетки и подключенного к Picospritzer II (General Valve Corporation). Краниотомии были заполнены Гельфоамом (Upjohn), и кожа была закрыта хирургическими клипами. Через 5-6 дней животные были убиты. Ретины готовили, как описано в предыдущем разделе, и подвергали освещению при 620 нм под оптическим контролем. Когда дендритная морфология клетки была хорошо видна, сетчатки были либо фиксированными, либо подверглись дополнительной маркировке, на этот раз с использованием генной пушки и FITC-меченого декстрана.

Непосредственно после геномной или обратной фотодинамики сетчатки фиксировали в 4% фосфатном буфере PFA / 0,1 М в течение 30 мин и промывали тремя изменениями фосфатного буфера. Отдельные ганглиозные клетки были отображены на конфокальном микроскопе (Radiance, Bio-Rad Laboratories) с использованием объектива (25 × 0,8 Plan-Apochromat; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) и соответствующих настроек масштабирования. Ряд z был взят через каждую ячейку с шагом 1 мкм от границы INL до GCL. Фотографии съемки всего крепления были взяты в 10 × (10 × 0,3 Plan-Neofluar; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.). Ретины были контрастированы с DAPI, и снимки съемки были сделаны на Axioscope (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) с использованием объектива (16 × / 0,5 Plan-Neofluar; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.). Таким образом, покрытие всей сетчатки потребовало ~80 индивидуальных изображений размером 1,315 × 1,033 пикселя, что соответствует окончательному увеличению 55,89.

Серию сквозных фокусировок (размер z-шаг, 1 мкм) изображений каждой помеченной клетки принимали с помощью конфокального микроскопа, снабженного криптоно-аргоновым лазером с использованием объектива 25 × 0,8. Каждое изображение в стеке было сохранено как растровое изображение. Секции, охватывающие дендритную беседку (обычно 10-15 секций, в зависимости от расслоения клетки), были экспортированы в Matlab 6.5 (The Mathworks) и была создана максимальная проекция изображения в стеке изображений. Полученное одно изображение было пороговым с интенсивностью пикселя 40. В некоторых случаях интенсивность и контрастность изображения были скорректированы в Photoshop 7 (Adobe Systems, Inc.). Никакой другой обработки изображений не было.

Антитела против ChAT, TH и PKC были получены из Chemicon. Мышь для борьбы с SMI32 была приобретена у Sternberger Monoclonals. Кроличья поликлональная антисыворотка к меланопсину была подарком от К.-W. Яу (Школа медицины Джона Хопкинса, Балтимор, MD; Hattar et al., 2002). Поскольку сетчатки нужно было сначала исследовать в живом состоянии, а затем после фиксации мышей не могли перфузировать перед экспериментами. Поэтому мы иногда наблюдали неспецифическую маркировку кровеносных сосудов вторичным антителом, используемым для обнаружения mAb против SMI32. Эта маркировка четко отличалась от компонентов нервной сетчатки и не мешала визуализации.

Все опоры инкубировали с первичными антителами в течение 7 дней при 4 ° С, промывали и инкубировали в течение 2 дней с FITC- или родамин-мечеными вторичными антителами (все из лабораторий Jackson ImmunoResearch) и контрастировали с TOPRO-3 иодидом (Invitrogen) , Затем их устанавливали с помощью Vectashield (Vector Laboratories) и оценивали на конфокальном микроскопе. Объект 25 × / 0,8 был использован для проведения обследования всей сетчатки. Они были отображены с ~ 180 одиночных изображений размером 512 × 512 пикселей, что соответствует окончательному увеличению 37 ×. На многих иллюстрациях показаны такие монтажи, которые легко идентифицируются с помощью нескольких разных экспозиций на каждом из отдельных микрофотографий. Хотя более утомительно, чем снимать только несколько снимков с очень низким энергопотреблением, высокое разрешение монтажа позволило в более позднее время восстановить подробную сотовую информацию.

Водяные иммерсионные линзы (C-Neofluar 40 × / 1,2 и C-Neofluar 63 × 1.4, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) использовались для получения изображений с высоким разрешением одиночных клеток. Фильтры излучения были 522DF35 для FITC, 680DF32 для TOPRO-3 и 605DF32 для родамина. Выравнивание по всем каналам было подтверждено путем визуализации 4- и 0,5-мкм флюородов (TetraSpeck; Invitrogen) при настройках, идентичных тем, которые используются для получения изображений.

Амакрин и биполярные клетки оценивали в вертикальных срезах в дополнение к целым креплениям. Для этого сетчатки фиксировали и внедряли в 4% -ную агарозу, а срезы 30-50 мкм разрезали на вибратоме. Секции инкубировали с соответствующими количествами первичного антитела в течение ночи при комнатной температуре и с вторичными антителами в течение нескольких часов. После контрастирования с TOPRO-3 секции были смонтированы и оценены под конфокальным микроскопом, как описано выше.

Все подсчеты и измерения клеток проводились исследователем, не знающим результатов подсчета зрительного нерва (см. Ниже) и наоборот. Полноразмерные снимки сетчатой ​​сетчатки были собраны из отдельных изображений в Photoshop 7. На отдельных изображениях не выполнялась обработка изображений. Эти монтирования использовались для архивирования результатов, подсчета ячеек и создания более низких показателей. Полностью разрешение было покрыто сеткой подсчета 22 × 22 квадратов 20,164 пикселей2, соответствующей 18,225 × 10-3 мм2 на исходной микрофотографии. Количество SMI32-, меланопсин- или ChAT-позитивных клеток и ТОРО-3-окрашенных полных клеточных ядер подсчитывали на квадрат сетки. Клетки ячеек на краю квадрата были включены, если ядрышко было видно. Ядра эндотелиальных клеток легко узнавались по их вытянутой форме и не учитывались. Сырые счета были преобразованы в ячейки / миллиметр2 и отображены в виде двумерной карты плотности с помощью процедуры, написанной в Matlab 6.5.

Точно так же были собраны целые крепления под DAPI. Ячейки клеток в GCL подсчитывались с использованием сетки с более тонким разрешением (36 × 36 квадратов 20,164 пикселей2, что соответствовало 7,744 × 10-3 мм2) и обрабатывались, как в предыдущем абзаце. Средние диаметры иммуноокрашенных клеток определяли из собранных целых опор или из вертикальных секций. Самый широкий диаметр был измерен на цифровых микрофотографиях с использованием SigmaScan (Jandel Scientific). Измерения были проверены на различия с помощью анализа дисперсии с использованием соответствующих подпрограмм Matlab.

Для количественной оценки популяций клеток в большинстве наших исследований использовался прямой подсчет популяций окрашенных клеток поверхности сетчатки. Кроме того, независимая оценка общей тяжести дегенерации ганглиозных клеток может быть получена путем окрашивания оптического нерва. Этот метод не передает топографические различия в дегенерации клеток ганглиона, но значения обеспечивают связь с предыдущей работой и простое резюме общей тяжести дегенерации. Короче говоря, оптические нервы фиксировали в течение ночи на месте, расчленяли свободно, внедряли в пластик и секционировали. Больные и умирающие аксоны были дифференцированы от здоровых аксонов с использованием окрашивания парафенилендиамином, который накапливается у больных и умирающих аксонов (Anderson et al., 2005; Libby et al., 2005c). Эти секции были оценены двумя, а иногда и тремя независимыми слепыми наблюдателями, используя явную шкалу оценки для определения уровня глаукоматозного повреждения для каждого глаза (Libby et al., 2005a). Он разделил континуум глаукоматозного повреждения на три компонента: умеренный, умеренный и тяжелый. Мягкие нервы были оценены как не имеющие глаукоматозного повреждения аксонами и классифицируются как незатронутые. У умеренных нервов было установлено, что от 5 до 50% поврежденных или потерянных аксонов. Суровые нервы оценивались как> 50% урона и / или потери аксонов.

Мы хотим поблагодарить Ричарда Смита и Ларри Уилсона за отличную помощь.

S.W.M. Джон и Р. Х. Масленд являются следователями медицинского института Говарда Хьюза. Р.Х. Масланд является старшим исследователем исследований по предотвращению слепоты.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *