Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Посредством изменения иммунной иммуностимы глаз, клетки, полученные из костного мозга, патогенно вносят вклад в пигментную глаукому DBA / 2J

By Altering Ocular Immune Privilege, Bone Marrow–derived Cells Pathogenically Contribute to DBA/2J Pigmentary Glaucoma
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2193785/

Соответствие адреса Саймону У.М. Джон, Медицинский институт Говарда Хьюза, Лаборатория Джексона, 600 Main Street, Бар-Харбор, ME 04609. Телефон: 207-288-6475; Факс: 207-288-6079; E-mail: swmj@jax.org; или J. Wayne Streilein, Исследовательский институт глазков Шепенса, Гарвардская медицинская школа, ул. Станиффорд, 20, Бостон, MA 02114. Телефон: 617-912-7422; Факс: 617-912-0115; E-mail: waynes@vision.eri.harvard.edu

Синдром дисперсии пигмента вызывает выделение пигмента радужной оболочки и часто прогрессирует до повышенного внутриглазного давления и пигментной глаукомы (PG). Поскольку пигмент меланина может обладать адъювантными свойствами и потому, что ген Gpnmb, который способствует дисперсии пигмента у мышей DBA / 2J (D2), экспрессируется в дендритных клетках, мы протестировали гипотезу о том, что окулярные иммунные аномалии участвуют в фенотипах PG. Поразительно, мы показываем, что глаза D2 обнаруживают дефекты нормально иммуносупрессивного микробного окружения глаз, в том числе неспособность водной юморы ингибировать активацию Т-клеток, неспособность поддержать связанное с передней камерой (АС) иммунное отклонение и потерю иммунной защиты глаз. Гистологический анализ демонстрирует инфильтрацию воспалительных лейкоцитов в АС и их накопление в радужной оболочке, тогда как клинические показания воспаления обычно очень мягкие и необнаружимые. Важно отметить, что некоторые из этих аномалий предшествуют клиническим показаниям распространения пигмента, что указывает на раннюю роль в этиологии болезни. Используя химерки костного мозга, мы показываем, что линии лимфогематопоэтических клеток в значительной степени диктуют прогрессирование дисперсии пигмента, способность глаза поддерживать индукцию связанного с AC иммунного отклонения и целостность кровеносного / глазного барьера. Эти результаты предполагают ранее непредвиденную роль в клетках, полученных из костного мозга, и окулярную иммунную привилегию в патогенезе PG.

J.-S. Mo и M.G. Андерсон внесла одинаковый вклад в эту работу.

Пигментный дисперсионный синдром (PDS) * характеризуется отложением аномально освобожденного ирисового пигмента в структурах дренажа передней камеры (AC) и водного юмора (AqH). PDS имеет медицинское значение, так как он очень распространен среди пациентов с глаукомой и общей популяцией (экран населения из 654 кавказцев обнаружил PDS у 2,45% этой популяции, никто ранее не знал об этом состоянии, ссылка 1). Многие случаи (> 35%) прогрессируют для развития повышенного внутриглазного давления (ВГД) и пигментной глаукомы (PG; 2-4). Молекулярные механизмы, вызывающие PDS и определяющие, продвигается ли он к PG, неизвестны. PDS демонстрирует простое наследование в некоторых семействах, но в других он более сложный и появляется спорадический (5, 6).

Мыши DBA / 2J (D2) развивают форму PG с сходством с PDS человека (7). Дисперсия иридиального пигмента у мышей D2 впервые проявляется клинически при 5-6 мес. Через 9-10 мес депигментация радужной оболочки выражена, и увеличение ВГД является общим, что приводит к увеличению AC и глаукоме (7). Депигментирующая болезнь диафрагмы мышей D2 генетически разделяется на два различных фенотипа, дисперсию пигмента радужки (IPD) и атрофию стромы аритмы (ISA), которые вызваны мутациями в генах Gpnmb и Tyrp1 соответственно (8, 9). Предполагается, что TYRP1 участвует в синтезе меланосомального меланина, тогда как GPNMB менее хорошо охарактеризован, но также присутствует в меланосомах (10-12). Поскольку дисперсия пигмента, вызванная мутацией Gpnmb, имеет большое сходство с человеческим PDS, в том числе модель лучевой депигментации радужной оболочки, которая считается отличительной чертой человеческих PDS, мышей D2 являются ценным ресурсом для определения факторов, которые могут способствовать человеческому PG (7, 8, 13) ,

В дополнение к меланосомальному компоненту болезни D2 несколько интригующих наблюдений показывают, что рассеяние пигмента в глазах D2 может включать иммунную дисфункцию. Прежде всего, Gpnmb выражается в некоторых типах дендритных клеток (14, 15), мощный профессиональный APC, обычно проживающий в радужной оболочке (16, 17). Кроме того, TYRP1, а также сам меланин были идентифицированы как антигены, относящиеся к воспалительным заболеваниям глаз (18, 19), а меланин также может проявлять адъювантноподобные свойства (18, 20). Хотя мыши D2 с измененной функцией GPNMB и TYRP1 теоретически могут поддерживать аберрантные иммунные реакции через множество различных путей, роль иммунной системы в дисперсии пигмента D2 ранее не рассматривалась.

Здесь мы проверяем новую гипотезу о том, что окулярные иммунные аномалии способствуют патогенезу дисперсии пигмента у мышей D2. Мы представляем несколько строк доказательств скомпрометированной иммунной защиты глаз, которая сопровождается легкой, но хронической воспалительной реакцией в глазах D2. Важно отметить, что генотип клеток, полученных из костного мозга у мышей D2, определяет наличие или отсутствие заметной дисперсии пигмента, связанной с мутацией Gpnmb с помощью механизмов, связанных с иммунной защитой глаз. Эти результаты показывают, что клетки костного мозга патогенно способствуют аномальной дисперсии пигмента. По имеющимся данным, эти данные свидетельствуют о том, что ранее не подозреваемые иммунные аномалии могут усиливать уровень дисперсии пигмента и, следовательно, увеличивать вероятность развития PDS для PG у людей.

Мышей D2, C57BL / 6J (B6) и B6D2F1 / J (B6D2F1) получали из Лаборатории Джексона. Мышей BALB / c (BALB) получали из животноводческого комплекса Schepens Eye Research Institute. D2 и химеры D2 костного мозга, используемые в исследованиях индукции AqH и AC-ассоциированного иммунного отклонения (ACAID), были поставлены в Лабораторию Джексона в ранее описанных условиях окружающей среды (7,8) и отправлены в Исследовательский институт глазков Schepens для экспериментов. Все животные получали лечение в соответствии с рекомендациями Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в исследованиях. Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Исследовательского института глазков Шепенса или Лабораторией Джексона. При необходимости мышей анестезировали с использованием внутрибрюшинной инъекции кетамина (Ketalar, Parke-Davis) и ксилазина (Rompun, Phoenix Pharmaceutical).

AqH собирали, объединяли (2 мкл / глаз, 6-10 глаз / пул) и центрифугировали при 4000 об / мин в течение 4 мин (21). Концентрацию белка определяли с использованием 1 мкл супернатанта (BCA, Pierce Chemical Co.), а оставшийся супернатант немедленно замораживали при -70 ° С до использования в анализе пролиферации Т-клеток. Осадок после центрифугирования ресуспендировали в 20 мкл PBS и 10 мкл использовали для подсчета клеток с использованием гемоцитометра. Остальные клетки из каждой возрастной группы объединяли, окрашивали Giemsa и подвергали дифференциальному анализу. Профили FACS® AqH собирали путем маркировки объединенного AqH 10 глаз от 6-мульных самцов D2-мышей с конъюгированным mAb.

Конъюгированный mAb, используемый для анализа FACS® препаратов AqH, был против мышиного MHC класса II FITC (M5 / 114, Лабораторная проточная цитометрия Джексона), мышиного CD11b PE (BD Biosciences) и мышиного CD11c APC (BD Biosciences). MAb, используемые для анализа химерных клеток костного мозга, были против мышиного MHC класса I H-2Kd PE (SF1-1.1, BD Biosciences) и мышиного H-2Kb FITC (28-13-3s, The Laboratory Laboratory Flow Cytometry Service). Этикетирование оценивали с помощью многоцветной проточной цитометрии (FACScan ™ или FACScalibur®, BD Biosciences) и анализировали с использованием системы сокращения данных CellQuest 3.3 (BD ​​Biosciences).

Т-клетки были выделены из одноцепочечных суспензий селезенки у наивных мышей BALB с использованием колонны обогащения Т-клеток (R & D Systems). Обогащенные Т-клетки ресуспендировали в бессывороточной среде (SFM). Используя 96-луночную V-образную нижнюю пластину (Corning), 2,5 × 104 обогащенных Т-клеток в 10 мкл SFM и 5 мкл AqH или PBS добавляли на лунку и культивировали в течение 1 часа с последующим добавлением 10 мкл хом- мышь CD3e IgG (2C11, 2,5 мкг / мл, BD Biosciences) в 10 мкл SFM или 10 мкл SFM. Клетки пульсировали 2,5 мкл 20 мКи / мл [3H] тимидина в течение последних 8 ч 48-часовой инкубации (37 ° C, 5% CO2-95% увлажненной воздушной смеси) и включения [3H] тимидина, измеренного в cpm.

OVA вводили (50 мкг в 2 мкл HBSS) в AC одного глаза мышей. Спустя 7 дней эти мыши иммунизировали подкожно 100 мкг OVA, эмульгированным 1: 1 в CFA (общий объем 100 мкл). Положительные контрольные мыши получали подкожную иммунизацию без какого-либо предыдущего воздействия OVA. Через 7 дней 200 мкг / 10 мкл OVA инъецировали внутрикожно в одну ушную ушко, а набухание вводимого уха оценивали через 24 часа с использованием микрометра инженера (Mitutoyo 227-101). Отрицательный контроль получал только интрапиннальные инъекции ОВА. Припухлость уха выражается в виде (24-часовое измерение уха) — (0-ч измерение уха).

После создания надреза в центре роговицы с кончиком иглы 30 г, в АС вводили 3 мкл воздуха, затем 2 мкл суспендированного CT26.WT (104) или Т-лимфомы L5178Y-R (2 × 103 ). Оставшийся 1 мкл воздух служил для уплотнения разреза. Наблюдался рост АС опухолей с использованием биомикроскопа щелевой лампы (21).

Глаза исследовали с помощью биомикроскопа с щелевой лампой и фотографировали с объективом размером 40 ×. Фенотипическая оценка атрофии радужки, дисперсного пигмента и просвечивания проводилась в соответствии с ранее описанными критериями (7, 9). Исследования утечки флуоресцеина использовали мышам внутрибрюшинно, инъецированным 25% флюоресцеином натрия в дозе 0,01 мл на 5-6 г массы тела (Akorn Inc, ссылка 22). В гистологическом анализе использовали окрашенные гематоксилином и эозином участки глаз, зафиксированные в смеси параформальдегида глутаральдегида с фосфатным буфером (7, 9).

Хромы костного мозга генерировали следующим образом: мышей D2 и B6D2F1 мышей 4-8-wk подвергали легочному облучению (1000 рад от источника 137Cs), а затем получали 200 мкл внутривенных инъекций, содержащих 5 × 106 T-клеток, истощенных клеток костного мозга из указанные штаммы донора. Донор-костный мозг был истощен из Т-лимфоцитов с очищенными mAb 10 мкг / мл до CD4 (GK1,5, Лабораторная проточная цитометрия Джексона) и CD8a (53-6,72; Лабораторная проточная цитометрия в Джексоне). Периферическую кровь, полученную из боковой хвостовой вены химер, оценивали с помощью многоцветной проточной цитометрии для определения степени химеризма. Глаза химер анализировали через 3-5 недель.

Официальные полные названия генов (с сокращенными обозначениями белка, используемые здесь в круглых скобках): гликопротеин (трансмембранный) nmb (GPNMB); связанный с тирозиназой белок 1 (TYRP1); трансформирующий фактор роста, бета 2 (TGFβ2); некроз опухолевого некроза (лиганд), член 6 (CD95L); и суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 6 (CD95).

Нормальная AqH сильно иммунодепрессивна и глубоко ингибирует активацию Т-клеток in vitro (23). Мы тестировали AqH из D2 и контролировали мышей BALB для способности подавлять пролиферацию Т-клеток, индуцированных анти-CD3 in vitro (рис.1). Как и ожидалось, AqH из глаз BALB полностью подавляет пролиферацию Т-клеток, тогда как D2 AqH никогда не ингибирует пролиферацию Т-клеток и фактически демонстрирует митогенную активность, демонстрируя существование скомпрометированной внутриглазной иммуносупрессивной среды. Аналогичные результаты были получены с использованием BALB и D2 AqH в концентрациях 3, 10 и 20%. AqH из глаз D2 не обладал иммунодепрессивными свойствами как в течение 2, так и 4 мес, которые фактически предшествуют клинически обнаруживаемой дисперсии пигмента.

D2 AqH не обладает иммунодепрессивными свойствами. Т-клетки добавляли к среде, содержащей AqH в различных концентрациях, как показано здесь для 20% AqH от мышей BALB или D2 указанных возрастов. Клетки стимулировали анти-CD3-антителами в течение 48 ч и анализировали на включение [3H] тимидина в пролиферирующие клетки. Одиночные бассейны AqH использовали для каждого возраста в анализе, каждый пул состоял из 6-10 глаз. Значения представляют собой средние значения cpm ± SEM от трех до шести лунок.

Окулярная иммунная привилегия выражается частично посредством формы зависящей от глаза толерантности, обозначаемой ACAID (24). Инъекция антигенного материала в AC мышей дикого типа индуцирует девиантный системный иммунный ответ, который лишен эффекторов, вызывающих иммуногенное воспаление: Т-клетки, которые опосредуют задержанную гиперчувствительность (DH) и В-клетки, которые секретируют антитела, фиксирующие комплемент. Таким образом, в отличие от антигенов, вводимых подкожно, антигены, вводимые в AC, обычно не приводят к DH после последующего заражения тем же антигеном, независимо от того, встречаются ли они в глазу или в другом месте. Когда окулярная иммунная привилегия скомпрометирована, способность поддерживать ACAID также обычно отменяется. Затем мы исследовали, способны ли глаза стареющих мышей D2 поддерживать индукцию ACAID (рис.2). Как и ожидалось, OVA, введенный в AC контрольных глаз BALB, привел к глубокому нарушению OVA-специфического DH (фиг.2А). OVA, вводимая в AC двухмолекулярных D2-мышей, умеренно нарушала развитие и экспрессию DH (фиг.2B), тогда как инъекция OVA в AC у 4 или 6-мольных D2-мышей полностью не ингибировала OVA -специфический DH (фиг.2, C и D). Эти результаты свидетельствуют о том, что функциональный распад условий, поддерживающих иммунную привилегию, существует в глазах D2 до наступления клинического заболевания.

Дефицитная индукция ACAID у мышей D2. Индукцию ACAID оценивали в старых когортах мышей, как показано здесь для (A) 2-му старых мышей BALB, (B) 2-мольных D2-мышей, (C) 4-мольных D2-мышей или (D ) 6-mo-старые мыши D2. 50 мкг OVA вводили в AC (OVA-AC). Через 1 недель после этого мышей иммунизировали подкожно с помощью OVA plus CFA и вводили интрапиннальные инъекции OVA через дополнительные 7 дней. Реакции DH указывают на увеличенную толщину уха через 24 часа после заражения. Положительный контроль (POS) получил только иммунизацию OVA плюс CFA, вводимый подкожно, но без инъекций OVA в AC. Отрицательный контроль (NEG) были наивными мышами, получавшими только интрапиннальные проблемы. Рассматриваются средние значения набухания на ушах ± SEM (пять мышей на группу). *, значения значительно ниже, чем положительные контрольные (P <0,05, t-критерий Стьюдента).

Хотя иммунодепрессивные свойства AqH и способность поддерживать индукцию ACAID являются надежными следствиями окулярной иммунной привилегии, они не тестируют напрямую, если иммунная привилегия присутствует и неповреждена. Наши следующие эксперименты оценили, сохраняется ли окулярная иммунная привилегия у мышей D2, когда они приобретают IPD.

Врожденную иммунную привилегию можно проверить, исследуя судьбу мышей, получающих инъекции АС сингенных опухолей. TGFβ2, ключевой иммуномодулирующий фактор, конститутивно присутствующий в AqH, блокирует способность CD95L вызывать цитолитическую активность нейтрофилов и высвобождение цитокинов в нормальном AC (25). Таким образом, опухолевые клетки, экспрессирующие CD95L, имплантированные в AC, не уязвимы к разрушению с помощью CD95 + нейтрофилов, и эти реципиенты поддаются прогрессирующему росту опухоли и метастазированию (26). Напротив, при имплантации в непривилегированные сайты опухолевые клетки CD95L + активируют нейтрофилы CD95 + и отвергаются этими врожденными иммунными эффекторами (активированными нейтрофилами), что позволяет выживать реципиента. Для оценки целостности врожденной иммунной защиты глаз у мышей D2 через 2 и 7 мес в АС вводили CD95L + или CD95L-DBA / 2-производные T-лимфомы L5178Y-R опухолевых клеток (фиг.3А). Независимо от возраста, D2-реципиенты CD95L-опухолевых клеток развивали постепенно растущие опухоли, и 100% этих мышей умерли на 18 дней (не изображено). Аналогично, 2-мольные D2-реципиенты CD95L + опухолевых клеток поддавались их опухолям, указывая на то, что врожденная иммунная защита была неповрежденной. Напротив, высокая доля (> 50%) мышей D2 с 7 молями могла содержать внутриглазный рост опухолевых клеток CD95L +, и эти мыши выжили. Таким образом, врожденная иммунная привилегия, по-видимому, неповреждена в глазах 2-му-старых мышей D2, но скомпрометирована 7 мес.

Компромиссная врожденная и адаптивная иммунная привилегия к внутрикамерным опухолевым клеткам у пожилых мышей D2. (A) CD95L + опухолевые клетки вводили в AC двух- и 7-мольных D2-мышей. Процентная доля получателей, выживших через 30 дней, указывается. (B) опухолевые клетки CT26.WT инъецировали в AC двух- и 7-мольных D2-мышей. Процент AC, заполненный опухолью, показан через 11 дней после инъекции опухоли. *, значительная разница (P <0,05, t-тест Стьюдента).

Адаптивная иммунная привилегия может быть проверена путем изучения судьбы гистонормативных опухолевых клеток, вводимых в АС. Окулярная иммунная привилегия проявляется, когда гистонормативные опухоли растут постепенно в ВС, но отбрасываются при имплантации подкожно (27). Для этих экспериментов CT26.WT, химически индуцированная клеточная линия карциномы толстой кишки, полученная от мышей BALB, была выбрана, потому что этот штамм мыши делится с D2 тем же гаплотипом H2, H2
d, но отличается от D2 при множественных локусах малой гистосовместимости. Клетки опухоли CT26.WT инъецировали либо в AC, либо подкожное пространство (положительный контроль для отбраковки) мышей D2 при 2 и 7 мес. В качестве отрицательных контролей клетки CT26.WT аналогичным образом вводили в 2-мольные сингенные мыши BALB. Клетки CT26.WT никогда не образовывали опухоли после инъекции в подкожное пространство мышей D2, хотя они легко образовывали опухоли на этом участке у мышей BALB. Это указывает на то, что системный иммунитет D2-мышей способен обнаруживать и уничтожать гистонормативные опухолевые клетки, помещенные в неиммунный привилегированный сайт. Напротив, клетки CT26.WT образовывали постепенно растущие опухоли в AC 2-молярного D2 (фиг.3B) и мышей BALB. Более того, скорость роста опухоли была сопоставимой в обоих наборах получателей (не показана). Это указывает на то, что глаза двухмалых D2-мышей предлагают адаптивную иммунную защиту для гистосовместимых опухолевых клеток. Тем не менее, опухолевые клетки CT26.WT, которые образовывали опухоли в глазах 7-минных мышей D2, проявляли значительную задержку в начале роста опухоли по сравнению с тем, что наблюдалось у 2-мольного D2 (фиг.3В). Поскольку замедленный рост гистонормативных опухолевых клеток является выражением скомпрометированной иммунной привилегии, этот результат указывает на то, что адаптивная иммунная иммунизация ослабляется в глазах старых мышей D2. Важно отметить, что наши эксперименты по росту опухоли показывают дефицит как в адаптивной, так и врожденной иммунной привилегии у 7-месячных мышей D2, в возрасте, когда дисперсия пигмента радужки является агрессивной.

Считается, что неповрежденный кроветворный / глазной барьер является важным компонентом нормальной иммунной иммунной защиты глаз. Нормальный AqH содержит чрезвычайно низкие уровни белка и лейкоцитов, что указывает на то, что барьеры обычно исключают попадание практически всех белков плазмы и лейкоцитов в глазное микроокружение. AqH от 2-mo-старых глаз D2 содержали едва заметные количества белка, аналогичные уровням, обнаруженным в AqH нормальных глаз BALB. Тем не менее, AqH от 4-му старых D2-мышей содержали слегка повышенные уровни белка, и эти уровни продолжали расти через испытуемые возрасты (фиг.4А). Никакое повышение уровня белка не наблюдалось в AqH у более старых мышей BALB. Мы впервые обнаружили лейкоциты в AqH 6-mo-старых D2-мышей с большим количеством воспалительных клеток, присутствующих в 7 мес (фиг.4В). Преобладающим лейкоцитом, присутствующим в 6 мес, был нейтрофил, тогда как мононуклеарные клетки преобладали в 7 мес (фиг.4С). Ингасированный меланин часто наблюдался в цитоплазме этих мононуклеарных клеток. Анализ FACS® AqH в 6 мес показал, что инфильтрирующие лейкоциты окрашены положительно для CD11b, CD11c и MHC класса II (включая MHC класс II + CD11b + CD11c- и MHC класс II + CD11b + CD11c + фенотипы, не показаны). Эти фенотипы указывают на наличие макрофагов и дендритных клеток. AqH, собранный у 10-месячных мышей D2, содержал еще более высокие уровни белка, но очень мало лейкоцитов, что указывает на то, что внутриглазная воспалительная реакция уменьшилась. Лейкоциты никогда не были обнаружены у AqH мышей BALB в любом возрасте. Эти результаты сильно свидетельствуют о том, что мыши D2 испытывают распад кровяного / глазного барьера на ~ 4 мес, после чего воспалительные лейкоциты проникают в АС. Этот воспалительный ответ поддерживается в течение нескольких месяцев, но уменьшается, так как мыши достигают 10 мес. Ни разу в этот промежуток времени глаза этих мышей не стали красными или не проявляли признаков сильного воспаления.

Нарушение целостности крови / глазного барьера и инфильтрация лейкоцитов глаз D2. AqH, собранный у мышей D2 в указанных возрастных группах, анализировали на: (A) содержание белка, (B) содержание лейкоцитов и (C) долю лейкоцитов, которые были нейтрофилами и мононуклеарными клетками. Значения представляют собой среднее ± SEM из 10 мышей. (D-F) Флуоресцеин вводили внутривенно D2-мышам и оценивали присутствие флуоресцеина внутри и снаружи внутриглазных сосудов. * Указывают артефакты, вызванные отражениями источника света. (D) До 4 месяцев глаза показывают только внутрисосудистый флуоресцеин (тонкие стрелки). (E и F) Через 4 мес глаза показали внесосудистый флуоресцеин, выходящий из-за зрачка (открытые наконечники стрел) и экстраваскулярный флуоресцеин, диффузно окрашивающий строму радужной оболочки. (G-I) Гистологические участки глаз D2, выявляющие маркер лейкоцитов и инфильтрацию радужки. (G) В 3 мес. Диафрагмы D2 кажутся нормальными, а сосудам не хватает маркеров лейкоцитов (тонкая стрелка). (H) Через 5 мес и далее в АС и на передней поверхности радужки присутствуют нейтрофилы (толстая стрелка) и макрофаги (заполненные стрелки). H иллюстрирует маркер лейкоцитов (толстая стрелка), встречающийся в сосуде радужной оболочки. (I) Через 6 месяцев перипупилярная граница радужной оболочки становится утолщенной и состоит из пигментных макрофагов (заполненных стрелками) и нейтрофилов (толстая стрелка). Даже в сильно пораженных глазах, таких как показанное в I, иридиальное утолщение ограничено перипупилярным краем. Оригинальное увеличение: × 630. UD, необнаруживаемый; NEUT, нейтрофилы; МОНО, мононуклеарные клетки.

Чтобы непосредственно оценить функциональную целостность кровеносного / глазного барьера у мышей D2, мы провели флюоресцеиновую ангиографию у мышей длиной 2-7 молей. Как и ожидалось, у контрольных мышей BALB и B6 не наблюдалось никаких признаков утечки сосудистого русла флуоресцеина из интраокулярных сосудов, и до 4 мес не наблюдалось утечки флуоресцеина у мышей D2 (фиг.4D). В D2, старше 4 мес, в некоторых глазах наблюдалась утечка флуоресцеина, попадая в АС из-за диафрагмы (рис.4Е) и от стромы радужной оболочки (рис.4, F). Через 7 месяцев все глаза D2 проявляли утечку флуоресцеина (n = 10 из 10 глаз), что прямо показало, что разрушение кровеносного / глазного барьера сопровождает дисперсию пигмента, что приводит к глаукоме у этих мышей.

Мы исследовали глаза от стареющих мышей D2 для гистологических показаний инфильтрации радужки воспалительными клетками. Через 3 мес мы не обнаружили воспалительных клеток в радужной оболочке или АС у любых мышей D2 (фиг.4G). Тем не менее, к 5 мес, и все более и более на 7 мес, глаза D2-мышей продемонстрировали мягкий, но последовательный воспалительный ответ в переднем сегменте. В 5 и 6-летних глазах, когда клиническое заболевание диафрагмы едва обнаруживается, мононуклеарные клетки и нейтрофилы марминируют вдоль стенок сосудов ирисовой диафрагмы и присутствуют как в радужной оболочке, так и на поверхности радужной оболочки (рис.4Н). Количество этих клеток увеличилось через 7 мес, когда дисперсия пигмента была безудержной, и в это время макрофаги были наиболее распространенным инфильтрирующим лейкоцитом. У этих более старых мышей D2 макрофаги, содержащие меланин, присутствовали в AC и накапливались в строении радужки, особенно на зрачковой границе (фиг.4 I) и в трабекулярной сетке. Эти данные показывают, что инфильтрация лейкоцитов радужной оболочки является ранней особенностью дисперсии пигмента D2.

Депигментация D2 ириса инициируется формой меланосомальной токсичности с мутацией Gpnmb, вызывающей глубокое рассеяние пигмента и мутацией Tyrp1, вызывающей атрофию стромы аритмы, сопровождающуюся мягким рассеиванием пигментных глыб в AC (8, 9). Поскольку глаза D2 нарушают иммунную защиту, а радужная оболочка проникает в лейкоциты, мы тестировали, влияет ли генотип костного мозга на тяжесть пигментной дисперсии, возникающей в глазах, сталкивающихся с ожогами радужки, возникающими в результате мутации Gpnmb и Tyrp1. Костный мозг содержит прародители гематопоэтических линий, заставляя воссозданных реципиентов развивать линии лейкоцитов с клетками донорского генотипа. Чтобы проверить влияние генотипа костного мозга, мы создали D2-мышей с B6D2F1 или D2 (контрольным) костным мозгом и следовали за ними клинически для показаний ирисовой болезни (рис. 5 и 6). Кроме того, мыши B6D2F1 были восстановлены с помощью костного мозга D2. Мыши B6D2F1 имеют морфологию диафрагмы дикого типа и не развивают болезнь диафрагмы после восстановления с помощью костного мозга D2, что указывает на то, что потомство одного костного мозга D2 не способно вызвать заболевание. Как и ожидалось, летально облученные реципиенты D2, воссозданные мозгом D2, развивали дефекты просветления (в результате депигментации радужки), сильную дисперсию пигмента, утолщение зрачковой границы в 6 мес и расширение глаукоматозного AC. Тяжесть и начало этих фенотипов были идентичны немытым D2-мышам (7-9). Напротив, мыши D2, восстановленные с помощью костного мозга B6D2F1, продемонстрировали значительное снижение депигментации радужки. Спасительный эффект костного мозга B6D2F1 привел к поразительно меньшему просветлению, чем у мышей с D2-костным мозгом как у 6 (сравните рис. 5 I с E), так и с 10 моментом (сравните рис. 5 J с F). Эти мыши никогда не развивали утолщение перибупиллярного ириса, обычно наблюдаемое в D2 в 6 мес. При наблюдении в возрасте 10 месяцев эти реципиенты никогда не развивали тяжелую дисперсию пигмента, характерную для IPD (сравните рис. 6 I с F). Важно отметить, что костный мозг B6D2F1 также предотвращал увеличение AC у реципиентов D2 в 10 месяцев (сравните рис. 5 K с G). AC обычно увеличивается при увеличении IOP у мышей D2 в этом возрасте. Отсутствие увеличения AC показывает, что не только болезнь диафрагмы была улучшена у мышей, восстановленных костным мозгом, но также была подавлена ​​глаукоматозная прогрессия к PG.

B6D2F1 костный мозг подавляет депигментацию и увеличение AC. Репрезентативные глаза химерных клеток костного мозга указанных штаммов и возрастов. Глаукома у мышей D2 обычно ассоциируется с пигментно-дисперсионной ирисовой болезнью, что приводит к изменениям в морфологии радужной оболочки. Затем диспергированный пигмент аберрантно осаждается на различных структурах, включая поверхность радужки, линзы и роговицы. Дисперсный пигмент также осаждается в дренажных структурах AqH, что приводит к увеличению ВГД и увеличению AC (пространство между радужкой и роговицей). Две левые столбцы показывают просветляющие виды, анализирующие степень депигментации радужной оболочки глаза, обнаруживаемые как красные области в изображении, где отраженный свет проходит через радужную оболочку. В третьей и четвертой колонках показаны размеры переменного тока и репрезентативные профили FACS®. (A-D) B6D2F1 реципиенты D2-костного мозга не обнаруживают признаков депигментации в любом возрасте и AC нормального размера с близко расположенными роговицей и радужкой (n = 12 мышей при 4 мес, 11 мышей в 6 мес и 8 мышей при 10 мес). (E-H) D2 реципиента развитой диареи диареи D2 и признаков глаукомы после продолжительности курса и степени тяжести, неотличимых от немытых мышей D2. Эти глаза развивались от среднего до тяжелого просвета радужной оболочки глаза и очень увеличенные АС, характерные для мышей с повышенным ВГД. Предполагается восстановление в зависимости от выживаемости мышей после летального облучения (n = 12 мышей при 4 мес, 12 мышей в 6 мес и 8 мышей в 10 мес). (I-L). Болезнь Ирис у D2-реципиентов костного мозга B6D2F1 была значительно подавлена ​​у всех возрастов, о чем свидетельствуют относительно мягкие степени просвечивания и AC нормального размера (n = 12 мышей в 4 мес, 11 мышей в 6 мес и 9 мышей в 10 мес).

B6D2F1 костный мозг подавляет перипупилярное утолщение и сильную дисперсию пигмента. Глаза химерных клеток костного мозга указанных штаммов и возрастов. Показаны показательные глаза от каждой когорты и возраста, количество мышей на когорту такое же, как на рисунке 5. Все изображения взяты из клинического обследования щелевой лампы с широким освещением луча для анализа на наличие дисперсного пигмента в AC и морфология стромы радужки. (A-C) B6D2F1 реципиенты D2-костного мозга поддерживают нормальную морфологию ирисов у всех возрастов. (D-F) Глаза от D2-реципиентов D2-костного мозга проявляют характерную прогрессию заболевания. В 4 мес. Радужная оболочка проявляет морфологию предстательной железы, 6-месячные ириды развивают значительное утолщение, окружающее зрачок (наконечники стрел), и 10-месячные ириды становятся сильно атрофическими. Дисперсный пигмент виден на объективе, а структуры переменного тока (стрелки) и атрофия радужной оболочки выражены, особенно в перипупилярном краю. (G-I) Глаза от D2-реципиентов костного мозга B6D2F1 характеризуются менее выраженным фенотипом. В 4 мес. Ириды не обнаруживают признаков заболевания, у 6-месячных иридов отсутствует выраженное перипупилярное утолщение, характерное для немытых глаз D2, а 10-месячные ириды сохраняют значительную общую целостность и не имеют присутствия большого количества диспергированного пигмента, обычно наблюдаемого на линзы, роговицы и радужки. По перипупилярному краю 6- и 10-моль-иридов мягко атрофируется.

Несмотря на поразительное спасение пигментной дисперсии и утолщение перибулярного ириса, связанное с производным D2 Gpnmb
Мутация R150X (8, 9), генотип костного мозга не влияла на все компоненты заболевания диафрагмы D2. D2, восстановленный с костным мозгом B6D2F1, все еще проявлял небольшую степень просвечивания (рис.5, I и J) и атрофию стромы аритмы (фиг.6, H и I). У этих мышей стромальная атрофия радужной оболочки, связанная с D-образным Tyrp1
b мутация оказалась неизменной.

Чтобы дополнительно охарактеризовать эффект спасения костного мозга B6D2F1 на D2-реципиентах, когорту этих химерных мышей анализировали через 6 мес для иммунного статуса глазного микроокружения и иммунной защиты. В дополнение к облегчению дисперсии пигмента мало что указывало на тип и степень воспаления, обычно наблюдаемую в глазах мышей D2. AqH из химерных D2-реципиентов костного мозга B6D2F1 не содержал лейкоцитов и едва различимых количеств белка, что свидетельствует о том, что кровеносный / глазной барьер не поврежден. Кроме того, глаза химерных мышей легко поддерживали индукцию ACAID (фиг.7А). Тем не менее, были устранены не все зрительные иммунные аномалии, наблюдаемые у мышей D2. AqH от химерных мышей D2, восстановленных с костным мозгом B6D2F1, не способно подавлять пролиферацию Т-клеток, индуцированных анти-CD3 in vitro (фиг.7В).

B6D2F1 костный мозг восстанавливает индукцию ACAID, но не обладает иммунодепрессивными свойствами AqH. (A) В отличие от немытых мышей D2 6-мольные D2-мыши, восстановленные с B6D2F1-мозгом (B6D2F1 → D2), имеют нормальную способность индуцировать ACAID (сравните с фиг.2). Рассматриваются средние значения набухания на ушах ± SEM (пять мышей на группу). *, значения значительно ниже, чем положительные контрольные (P <0,05, t-критерий Стьюдента). (B) Подобно немытым мышам D2, 6-мольные мыши D2, восстановленные с помощью B6D2F1, также содержат AqH, лишенные иммунодепрессивных свойств (сравните с фиг.1). Т-клетки добавляли к среде, содержащей 20% AqH, стимулировали анти-CD3-антителами в течение 48 ч и анализировали на включение [3H] тимидина. Значения представляют собой средние значения cpm ± SEM от трех до шести лунок.

Наши текущие эксперименты документируют фундаментальные новые аспекты дисперсии пигмента у мышей D2. Мы показываем, что глаза D2, предназначенные для развития дисперсии пигмента, и PG имеют множественные аномалии, связанные с иммунной защитой глаз. AqH от пораженных мышей D2 содержит повышенные уровни белка, а их сосуды с ирисовой жидкостью просачиваются флуоресцеиновым красителем, что указывает на пробой в кровяном / глазном барьере. AqH из глаз D2 также содержали лейкоциты (первоначально преобладали нейтрофилы, затем мононуклеарные клетки), отражающие умеренное, но устойчивое воспаление радужной оболочки, обнаруженное гистологическим исследованием. Как врожденная, так и адаптивная иммунная привилегия были скомпрометированы в глазах 7-месячных мышей D2, протестированных с соответствующими проблемами опухолевых клеток. Этот массив результатов подразумевает иммунные аберрации и воспаление в патогенезе дисперсии пигмента у мышей D2.

Хотя приведенные выше результаты предполагают участие иммунных и воспалительных факторов в патогенезе дисперсии пигментов у мышей D2, они не учитывают, являются ли они первичными характеристиками заболевания или вторичными последствиями дисперсии пигмента. Пигмент меланина обладает мощными адъювантными свойствами (20) и усиливает внутриглазное воспаление при экспериментальном аутоиммунном увеите (18). Кроме того, меланосомальные белки сами по себе являются сильно иммуногенными (28, 29). Таким образом, казалось разумным, что рассеянный пигмент может способствовать потере иммунной защиты глаз у мышей D2. Противоречащая этой идее, мы обнаружили, что некоторые иммунные аномалии (отсутствие иммунодепрессивных свойств AqH при 2 мес и изменение индукции ACAID в 2 и 4 мес) существенно предшествуют дисперсии пигмента. Дальнейшее доказательство против этой идеи обеспечивается нашими экспериментами по химерам костного мозга. Эти эксперименты показывают, что восстановление облученных мышей D2 с помощью ядра B6D2F1 спасает известный фенотип дисперсии пигмента (IPD), который вызван мутацией Gpnmb. Однако восстановление костного мозга не спасло фенотип стромальной атрофии радужки, вызванный мутацией Tyrp1. Таким образом, низкие уровни клинически обнаруживаемого, освобожденного пигмента сохраняются в глазах химерных клеток костного мозга. Несмотря на низкий уровень освобожденного пигмента, эти химеры спасаются в отношении: (а) целостности кровеносного / глазного барьера, (б) инфильтрации лейкоцитов в AqH и (c) способности индуцировать ACAID. Это говорит о том, что подавляемые иммунные глазные аномалии, обнаруживаемые на ранней стадии заболевания, не являются вторичными по отношению к дисперсии пигмента.

Результаты наших экспериментов с химерами радиационного костного мозга устанавливают причинную связь между документированными иммунными и воспалительными факторами и патогенезом дисперсии пигмента у мышей D2. Облученные мыши D2, восстановленные клетками костного мозга B6D2F1, не смогли разработать полный диапазон и серьезность дисперсии пигмента, характерной для немытых мышей D2 или облученных мышей D2, восстановленных костным мозгом D2. Мыши D2, восстановленные с костным мозгом B6D2F1, показали значительно меньшую дисперсию пигмента, просвечивание радужки и перипупилярное набухание. Костный мозг содержит прародителей иммунной системы, которые могут объяснять коррекцию иммунных аномалий в химерах костного мозга. Нет никаких доказательств того, что линии, полученные из костного мозга, могут непосредственно спасти присущий дефект в пигментированных клетках радужки. Таким образом, заметное спасение болезни радужки, наблюдаемое у D2-реципиентов костного мозга B6D2F1, указывает на то, что какой-то компонент (ы) подавляемых иммунных глазных аномалий является непосредственно патогенным. Учитывая документированное выражение Gpnmb в некоторых типах дендритных клеток (14, 15) и зависимость ACAID от клеток, положительных для F4 / 80 (преимущественно дендритных клеток и макрофагов, 17, 30-32), мы выдвигаем гипотезу о том, что заметная дисперсия пигмента спасенный здесь путем восстановления костного мозга, может быть следствием отсутствия функции GPNMB в D2 дендритных клетках, у которых есть Gpnmb
Мутация R150X. Будущие эксперименты будут непосредственно проверять эту гипотезу.

Существуют также компоненты окулярного заболевания D2, которые, по-видимому, нечувствительны к генотипу линий происхождения костного мозга. Во-первых, мыши D2, восстановленные с костным мозгом B6D2F1, поддерживали степень трансуммирования и атрофии радужной оболочки, указывающую на фенотип стромальной атрофии радужки, вызванный мутацией Tyrp1. В отличие от GPNMB, TYRP1 считается специфичным для меланоцитов (10, 33) и не документирован в линиях иммунной системы, полученных из костного мозга. Во-вторых, AqH D2-мышей, восстановленных с костным мозгом B6D2F1, оставались неспособными подавлять активацию Т-клеток in vitro. Это может быть результатом либо небольшого процента оставшихся родительских клеток D2, полученных из костного мозга, у этих мышей, либо может отражать последствия нецепочечного типа глазных клеток, которые остаются мутантными в глазах этих химер (возможно, эпителиальные клетки радужного пигмента которые обычно секретируют факторы, которые ингибируют пролиферацию Т-клеток). В любом случае спасение фенотипа IPD, несмотря на продолжающуюся неспособность AqH к подавлению пролиферации Т-клеток, указывает на то, что этой неспособности недостаточно для индуцирования заметной дисперсии пигмента, связанной с IPD.

Факторы, вызывающие PDS человека и заговор, чтобы определить, продвигается ли он к повышенному IOP и PG, неизвестны. Фенотип пигментной дисперсии у мышей D2 включает меланосомы, специализированные органеллы производства меланинового пигмента, содержащие как TYRP1, так и GPNMB. Наши предыдущие исследования показывают, что мутации в Tyrp1 и Gpnmb позволяют цитотоксическим побочным продуктам синтеза меланина оставлять меланосомы в аномально высоких количествах, что приводит к оскорблению меланоцитов, повреждению клеток, депигментации и атрофии радужки (8, 9). Важно отметить, что в текущих исследованиях ясно показано, что генотип клеток, полученных из костного мозга, определяет уровень дисперсии пигмента, связанный с этими меланосомальными оскорблениями, в идентичных глазах. Таким образом, множественные удары могут синергизировать, чтобы либо вызвать, либо усугубить серьезность феномена феномена феномена пигмента, IPD. Один удар возникает из-за осколка меланоцитов, предрасполагающего к высвобождению пигмента, который у мышей D2 возникает из-за генетически обусловленного меланосомального дефекта. Еще один удар возникает из иммунной системы и определяет общий уровень депигментации и ход прогрессирования. Наше обнаружение того, что увеличение AC было ограничено у мышей D2, восстановленных с помощью костного мозга B6D2F1, также указывает на то, что для прогрессирования заболевания к PG необходимы множественные удары.

Синергические взаимодействия между меланосомальными дефектами и иммунной системой могут также способствовать дисперсии пигмента радужки в PDS человека и могут объяснить сложную картину возникновения во многих семействах. Роли оскорблений, вызванных меланосомой, иммунных аномалий и клеток, полученных из костного мозга в PDS человека, не определены. Ультраструктурно аномальные меланосомы присутствуют в радужной оболочке некоторых пациентов с PDS человека (34, 35). Подобные аномалии меланосомы существуют у мышей D2 в возрасте 5 дней после рождения и присутствуют в радужной оболочке (36 и неопубликованные данные). Это говорит о том, что меланосомальные нарушения могут быть связаны как с заболеваниями человека, так и с мышцами. Важно отметить, что форма воспаления, наблюдаемая в глазах D2, является легкой, не содержит покраснения и сильного воспаления. Если он присутствует в PDS человека, подобный мягкий воспалительный ответ может быть субклиническим при рутинном обследовании. Пигментные макрофаги присутствуют в глазах некоторых пациентов с PDS / PG человека (35, 37, 38). Наши текущие исследования показывают, что эти клетки и другие линии, полученные из костного мозга, не должны исключаться в качестве активных участников заболевания.

В заключение мы представляем доказательства иммунных аберраций и устойчивого легкого воспаления в глазах мышей D2 и предлагаем, чтобы аналогичный, и ранее не подозреваемый, набор аномалий мог произойти в PDS человека / PG. PG является относительно ранним началом и трудно лечить форму глаукомы. Наши исследования показывают, что разработка методов лечения для уменьшения количества диспергированного пигмента и / или снижения воспалительных реакций может быть полезна в качестве новых методов лечения, чтобы предотвратить прогрессирование глаукомы.

Мы благодарим М. Ортегу и А. Сноу за уход за животными; M. Pierce за техническую помощь в восстановлении костного мозга; T. Duffy из Лабораторной проточной цитометрической службы Jackson для помощи в анализе FACS®; Д. Руопенана за полезные обсуждения и Дж. Смита за помощь в подготовке рукописи. Экспертная и лабораторная поддержка д-ра Дж. Доэрти очень ценится. Клетки CT26.WT были предоставлены N.P. Restifo (Национальные институты здоровья [NIH], Bethesda, MD) и опухолевые клетки L5178Y-R, полученные из DBA / 2, трансфицированные CD95L, были предоставлены А. Маршаком-Ротштейном (Boston University, Boston, MA).

Некоторая часть этой работы была поддержана грантом NIH EY 05678 и грантом Фонда Глаукомы (как для J.W.Streilein). Научные службы поддержки в Лаборатории Джексона финансируются за счет гранта Национального института рака. S.W.M. Джон является помощником следователя медицинского института Говарда Хьюза.

Сокращения, используемые в этой статье: AC, передняя камера; ACAID, AC-ассоциированное иммунное отклонение; AqH, водный юмор; Мышей BALB, BALB / c; D2, DBA / 2J; DH, отсроченная гиперчувствительность; ВГД, внутриглазное давление; IPD, дисперсия пигмента радужки; ISA, стромальная атрофия радужки; PDS, синдром пигментной дисперсии; PG, пигментная глаукома; SFM, без сыворотки.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *