Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Рекомбинантный вирус гриппа, выражающий домен III вируса Западного Нила, вызывает защитные иммунные ответы против вируса гриппа и западного Нила

A Recombinant Influenza A Virus Expressing Domain III of West Nile Virus Induces Protective Immune Responses against Influenza and West Nile Virus
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3082541/

Задуманные и разработанные эксперименты: BEEM GFR. Провели эксперименты: PD PK GA GS LBP. Проанализированы данные: BEEM PK BLH ADO GFR. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: BEEM PD PK LBP GFR. Написал документ: BEEM PK ADO GFR.

Вирус Западного Нила (WNV) продолжает распространяться в США и создает угрозу для остальной части западного полушария. Поскольку методы лечения инфекций WNV недоступны, необходимо разработать безопасные и эффективные вакцины. Здесь мы описываем конструирование рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего домен III гликопротеина E WNV (Flu-NA-DIII), и его оценку в качестве кандидата вакцины WNV в модели мыши. Мышей, получавших FLU-NA-DIII, были защищены от тяжелой потери массы тела и смертности от инфекции WNV, тогда как контрольные мыши поддавались инфекции. Кроме того, было показано, что одна подкожная иммунизация с помощью 105 TCID50 Flu-NA-DIII обеспечивала 100% защиту от заражения. Экспериментальные эксперименты по переносу показали, что защита была опосредована антителами и CD4 + Т-клетками. Кроме того, мыши, вакцинированные с помощью FLU-NA-DIII, разработали защитные титры антител к вирусу гриппа. Был сделан вывод о том, что эта векторная система может быть привлекательной платформой для разработки двухвалентных вакцин против вируса WNV.

Вирус Западного Нила (WNV) относится к роду Flavivirus и поддерживается в энзоотическом цикле с участием птиц и комаров, причем люди и лошади являются «тупиковыми» хозяевами. WNV распространяется в США с 1999 года и заразил более 25 000 человек смертностью до 2% [1]. Особенно пожилые люди подвержены риску развития тяжелых заболеваний и плохого исхода инфекции, что может быть связано с возрастом снижения иммунной функции [2], [3], [4]. Доказано, что вирус движется на юг, подвергая риску миллионы людей в Южной Америке и Карибском бассейне [5], [6]. Несколько вспышек инфекций WNV в Европе показывают, что вирус также может появиться в западноевропейских странах [7], [8], [9], [10]. Эффективные препараты для лечения инфекций WNV недоступны, и поэтому для защиты населения, подверженного риску, необходимы безопасные и эффективные вакцины. Несколько кандидатов на вакцины были протестированы на животных моделях [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Большинство этих вакцинных кандидатов основаны на гликопротеине E (gE), который является мишенью для индукции ответов, нейтрализующих вирусные антитела. Кроме того, gE может быть мишенью для ответов Т-клеток [21]. GE флавивирусов состоит из трех доменов (DI-DIII). DI и DII содержат большинство перекрестно-реактивных В-клеточных эпитопов и DIII большинство типов специфических и нейтрализующих В-клеточных эпитопов [16], [22], [23], [24]. Субъединичные вакцины на основе DIII были оценены и доказали свою эффективность в предотвращении тяжелой инфекции в моделях мыши [11], [12]. Однако высокие дозы рекомбинантного белка DIII необходимы для индукции нейтрализующих ответов антител, что указывает на то, что DIII плохо иммуногенен. Пожилые люди, которым грозит серьезная болезнь WNV, также подвержены риску осложнений, связанных с инфекциями вируса гриппа. Вирусы гриппа являются важной причиной инфекций дыхательных путей, которые ежегодно страдают от 5-10% человеческой популяции с коэффициентом смертности от болезни до 1% [25], [26]. Для профилактики гриппа и его осложнений рекомендуется ежегодная вакцинация групп высокого риска, включая пациентов с хроническим заболеванием, иммунокомпрометированных субъектов и пожилых людей. Поэтому было бы желательно наличие вакцин, которые могли бы защитить как от вирусов WNV, так и от вируса гриппа.

Здесь мы описываем конструирование рекомбинантного вектора вируса гриппа, который экспрессирует DIII белка WNV gE. Мы предположили, что мультимерная экспрессия DIII на рекомбинантных инфицированных вирусом гриппа клетках или его присутствие на векторных частицах увеличит его иммуногенность, что приведет к индукции высоких титров нейтрализующих WNV антител. Использование вируса гриппа в качестве вектора вызывало не только защитный иммунитет против WNV, но и против вектора. Был сделан вывод о том, что использование рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего WNV DIII, является многообещающим подходом, который может обеспечить защиту от обоих вирусов.

Канадскую почку Madin-Darby (MDCK, ATCC, CRL 1708) и клетки Vero E6 культивировали в минимальной основной среде Игла, дополненной незаменимыми аминокислотами, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 2% бикарбоната натрия, 1% HEPES и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (все от BioWhittaker, Вервье, Бельгия).

Был сконструирован рекомбинантный аттенуированный вирус гриппа, который экспрессирует WNV DIII в качестве белка структурной оболочки. С этой целью область, кодирующую DIII, амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием РНК, экстрагированной из инфицированных WNV-NY99 клеток Vero E6. Затем фрагмент длиной 370 пар оснований амплифицировали с использованием праймеров с соответственно рестрикционными сайтами EcoRI и SpeI (Fw: tggaattcATGGAACAACCTATGGCGTCT; Rev: gactagTCAATGATGATGATGATGATGGTCGA) и направленно клонировали в рамку с N-концевой областью нейраминидазы вируса гриппа (NA), мембраны типа II гликопротеина, по существу, как описано для рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP) [27]. Для генерации рекомбинантных вирусов гриппа использовались двунаправленные плазмиды на основе сегментов гена штамма вируса гриппа A / PR / 8/34 [28], [29]. Химерную плазмиду обратной регенерации NA совместно трансфицировали плазмидами, кодирующими PB1, PB2, PA, NP, HA, NS и M1 / ​​M2 вируса гриппа A / PR / 8/34 [27], [28], [29 ], [30] в клетки 293Т, и впоследствии вирус был спасен после прохождения в клетках MDCK. Так как этот вирус не имеет функционального NA, вирус распространялся в присутствии экзогенного NA, полученного из V. cholera (Sigma). Вирус был обозначен как FLU-NA-DIII, а в экспериментах, описанных ниже, использовали рекомбинантный вирус гриппа, выражающий зеленый флуоресцентный белок (FLU-NA-GFP) в качестве отрицательного контрольного вируса [27]. Чтобы характеризовать FLU-NA-DIII, RT-PCR выполняли с наборами праймеров вируса гриппа DIII- и вируса гриппа (по запросу). Идентификация FLU-NA-DIII была дополнительно подтверждена анализом последовательности продуктов ПЦР.

Для подтверждения экспрессии рекомбинантного белка клетки MDCK инфицировали Flu-NA-DIII при MOI 0,01 без добавления экзогенного NA. Клетки фиксировали ледяным метанолом через 20 часов и инкубировали с моноклональным антителом против мыши против гриппа NP (ATCC, клон HB65), поликлональной сывороткой против мыши WNV или мышиным анти-DIII моноклональным антителом (7H2, Bioreliance Corp., Rockville , США). В качестве конъюгата использовали меченый пероксидазой хрена кроличью антимышиный иммуноглобулин (Dako, Glostrup, Дания). Присутствие специфических антигенов было продемонстрировано с использованием 3-амино-9-этилкарбазола (AEC, Sigma) в качестве субстрата в соответствии с инструкциями производителя. Альтернативно клетки собирали и лизировали в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 1 г / л Nonidet-P40, 0,5 г / л натрийдексихолата, 0,1 г / л SDS, 50 мМ Tris.HCl. Белки разделяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле и затем переносили на мембрану Hybond-P на поливинилдихлориде дифторида (Amersham Bioscience, UK). Мембраны инкубировали с моноклональным антителом против мышиного моноклонального антитела мыши мыши или поликлональной сывороткой против WNV мыши и разрабатывали с использованием химиолюминесцентного субстрата в соответствии с инструкциями производителя (ECL, Amersham).

В первом наборе экспериментов группы шестинедельных мышей C57BL / 6 (n = 8 на группу) дважды иммунизировали либо внутризольным (внутри), либо подкожным (sc) путем использования дозы 106 TCID50 очищенных от сахарозы градиентов вирусов гриппа (FLU-NA-DIII или FLU-NA-GFP). Животных иммунизировали в день 0 и 14 и образцы крови собирали на дни 0, 14 и 42. Образцы сыворотки испытывали на присутствие DIII-специфических антител с помощью ELISA и анализа нейтрализации вируса, как описано ранее [12]. Нейтрализующие титры были выражены как обратные к высшему разведению сыворотки, все еще давая 100% подавление цитопатического эффекта. Титрами ELISA были выражены как обратные самые высокие разведения сыворотки, которые привели к оптической плотности выше 0,200. Титрами <50 считались отрицательными на основании значений отсечки, установленных с помощью сывороток от мышей, не инфицированных WNV. Кроме того, сыворотки тестировали на наличие специфических антител к вирусу гриппа. С этой целью сыворотки обрабатывали фильтратом холеры и после термической инактивации готовили двухкратные разведения. Анализ ингибирования гемагглютинации (HI) проводили с использованием стандартного протокола с 1% эритроцитов индейки и 4 HA единиц вируса гриппа A / PR / 8/34, как описано [31]. Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике животных Erasmus MC Rotterdam, Нидерланды.

IFN-γ ELISPOT использовали в качестве индикатора для индукции DIII-специфичных ответов Т-клеток в селезенке. Пластины покрывали в течение ночи 1,5 мкг / лунку антитела против IFN-γ (AN18, Mabtech, Germany). Спленоциты культивировали в три раза с плотностью 2 × 105 клеток на лунку в объеме 150 мкл при 37 ° С и стимулировали 10 мкМ DIII-производного пептида 39f (VNPFVSVATANAKVL). После инкубации в течение 48 часов при 37 ° С в 5% СО2 планшеты тщательно промывали и инкубировали с 1 мкг / мл биотин-конъюгированного антитела против IFN-γ (R4-6A2, Mabtech). Плиты были разработаны путем добавления GABA-меченого-стрептавидина (U-cyTech, Utrecht, Netherlands) в соответствии с инструкциями производителя, и пятна подсчитывались с использованием считывателя ELISPOT (Bioreader 3000, Bio-Sys GmbH).

Для определения диапазона защиты от дозы группы мышей (n = 8) дважды иммунизировали (день 0 и 14) sc с помощью 101, 102, 103, 104 и 105 TCID50 очищенного FLU-NA-DIII или FLU сахарозы-градиента -nA-GFP.

На 42-й день после вакцинации все животные заразились подкожно смертельной дозой WNV-NY99 (1 × 106 TCID50). Мышей всех групп ежедневно наблюдали за болезнью, потерей веса и смертью в течение 14 дней.

Для оценки того, какая рука адаптивного иммунного ответа была ответственна за защиту от заражения заражением, эксперименты с переносимым переносом проводились с использованием сыворотки, очищенных CD4 + Т-клеток и CD8 + Т-клеток, полученных через 4 недели после бустерной иммунизации FLU-NA-DIII или FLU -nA-GFP. Магнитные бусины MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) использовали для разделения фракций Т-клеток CD4 + (L3T4) и CD8a + (Ly-2) из ​​спленоцитов мыши, как указано изготовителем, которые дали очищенные CD3 + CD4 + и CD3 + CD8 + Т-клеточные препараты с <0,5% -ными загрязняющими клетками. Лимфоциты трижды промывали и ресуспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Восемь недельных мышей-реципиентов (n = 5) получали 200 мкл иммунной сыворотки, 5 × 105 CD4 + или 5 × 105 CD8 + Т-клеток по внутриперитонеальному пути. Через четыре часа после передачи животные были заражены с.c. маршрут с 100 TCID50 WNV-NY99, который является смертельной дозой для мышей этого возраста. Через восемь дней после заражения всех мышей умерщвляли, а титры вируса в мозге определяли, как описано ранее [12].

Различия в кривых выживаемости Каплана-Мейера между группами оценивали с использованием теста логарифмического ранжирования. Данные для титров антител к сыворотке и титров вируса в мозге анализировали с использованием двухстороннего теста Стьюдента. Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 4 (Graphpad Software, Сан-Диего, США). Значения P≤0,05 считались статистически значимыми.

Как показано на фиг. 1А, с помощью набора праймеров вируса гриппа M1 был установлен сигнал 1,1 кб с РНК, экстрагированной из запасов вируса FLU-NA-DIII и FLU-NA-GFP, тогда как только набор праймеров DIII приводил к ампликону от 451 п.о. с FLU-NA-DIII. Также анализ нуклеотидной последовательности подтвердил идентичность обоих вирусов.

RT-PCR анализ Flu-NA-GFP и Flu-NA-DIII РНК, экстрагированных из клеток MDCK через 20 часов после инфицирования (A). Ампликон были разделены в 1% агарозном геле. Для амплификации использовали WNV-DIII (дорожки 2 и 3) и вирусы гриппа A (дорожки 6 и 7), специфичные для вируса. Экспресси DIII анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа (B). Вирусные белки в лизатах инфицированных клеток или в обработанных сахарозой очищенных вирусных препаратах разделяли SDS-PAGE и переносили в PDVF-мембраны, которые инкубировали с DIII-специфическим моноклональным антителом 7H2 (верхняя панель) или специфическим моноклональным антителом к ​​вирусу гриппа NP (ATCC , клон HB65, нижняя панель). Экспрессия DIII также подтверждалась иммуно-окрашиванием клеток MDCK, инфицированных FLU-NA-GFP и FLU-NA-DIII (moi = 0,01) с NP- и DIII-специфическими антителами, как указано (C).

Как и ожидалось, рекомбинантный вирус гриппа Flu-NA-DIII не мог распространяться в культуре из-за отсутствия активности NA. Тот факт, что ни один инфекционный вирус не мог быть восстановлен из клеток MDCK, инфицированных Flu-NA-DIII в присутствии трипсина до трех дней после инфицирования, показал, что в рекомбинантном вирусном запасе нет вируса гриппа дикого типа. Увеличение титров Flu-NA-DIII наблюдалось только in vitro после добавления экзогенного NA дозозависимым образом. Минимальная концентрация экзогенного NA, необходимая для оптимального распространения НС-дефицитного Flu-NA-DIII, составляла 0,1 мМЕ / мл. Затем вестерн-блот-анализ, проведенный с клеточными лизатами инфицированных вирусом клеток MDCK и антител, направленных против вируса гриппа NP и WNV DIII, показал, что как FLU-NA-DIII, так и FLU-NA-GFP экспрессировали вирус гриппа NP, который также был обнаружен в (рис. 1В). Напротив, присутствие 15 кДа DIII наблюдалось только в клеточных лизатах, инфицированных FLU-NA-DIII, и очищенных препаратах FLU-NA-DIII. Присутствие GFP в инфицированных клетках вируса гриппа FLU-NA-GFP и очищенных вирусных препаратах было продемонстрировано ранее [27]. Экспрессию DIII также продемонстрировали в инфицированных клетках с помощью метода иммуноокрашивания с использованием WNV-специфических антител (фиг. 1C). Таким образом, был сконструирован ослабленный NA-дефицитный рекомбинантный вирус гриппа, который экспрессирует WNV-DIII и несет DIII в качестве белка структурной оболочки.

Как показано на рисунке 2, как иммунизация i.n, так и s.c с помощью FLU-NA-DIII индуцировала DIII-специфические антитела. Маршрут s.c был более эффективным, чем маршрут i.n, как с точки зрения индукции титрований, нейтрализующих вирус (рис. 2A), так и титров ELISA специфического типа WNV-специфичности (рисунок 2B). На 14-й день несколько меньших титров нейтрализующих антител (диапазон: 20-80) измеряли у мышей, вакцинированных s.c с помощью Flu-NA-DIII, по сравнению с мышами, которые получали ту же вакцину i.n (диапазон: 10-40). У всех животных, получавших Flu-NA-DIII через четыре недели после второй вакцинации, наблюдался четкий ответный ответ, что приводило к статистически значимым различиям между группами, которые были вакцинированы i.n и s.c (P <0,001). Использование FLU-NA-GFP не индуцирует DIII-специфические антитела. Кроме того, иммунизация FLU-NA-DIII индуцировала специфические клеточные иммунные ответы WNV DIII, которые были обнаружены в анализе IFN-γ ELISPOT после стимуляции спленоцитов с помощью DIII-полученного пептида (VNPFVSVATANAKVL), представляющего эпитоп Т-хелпер-клеток (рисунок 2C). В соответствии с ответами на антитела ответ IFN-γ был значительно выше у мышей, вакцинированных s.c по сравнению с i.n. вакцинированных животных (P <0,05). Через четыре недели после второй вакцинации все мыши разработали ответы на антитела против гомологичного вируса гриппа A / PR / 8/34 в анализе HI. После двух иммунизаций либо с помощью FLU-NA-DIII, либо с FLU-NA-GFP мышам, которые получали вакцину по маршрутам i.n и s.c, были разработаны обнаруживаемые титры антител (рисунок 2D). Через четыре недели после второй иммунизации у этих животных были титры HI в пределах от 40 до 160, причем более высокие титры были измерены в группах, которые получали вакцину подкожно.

WNV-нейтрализующие антитела были обнаружены анализом нейтрализации вируса (A) и DIII-специфическими IgG-антителами с помощью ELISA (B) в сыворотке, полученной от мышей, вакцинированных FLU-NA-DIII, т.е. (•) или s.c. (▴) и FLU-NA-GFP i.n. (○) или s.c. (▵) в указанные моменты времени. Стрелки указывают моменты времени вакцинации. Данные выражаются как средние титры на группу (n = 10) ± SD. Сотовые DIII-специфические ответы определяли с помощью анализа IFN-ELISPOT (C). Спленоциты, полученные на 42-й день, стимулировали 10 мкМ пептидом (VNPFVSVATANAKVL), и количество клеток, продуцирующих IFN-γ на 2 × 105 клеток, определяли у мышей, вакцинированных FLU-NA-DIII или FLU-NA-GFP, как указано. Каждый эксперимент выполняли дважды в три раза. Результаты показаны как среднее ± стандартное отклонение. Индукция титров гемагглютинации после иммунизации FLU-NA-DIII и FLU-NA-GFP. Мышей (n = 8) иммунизировали интраназально (то есть) или подкожно (s.c.) с помощью Flu-NA-DIII или FLU-NA-GFP (D).

Для оценки защитной эффективности иммунных реакций, индуцированных FLU-NA-DIII и FLU-NA-GFP, группам из десяти мышей была поставлена ​​под угроза смертельной дозы 106 TCID WNV-NY99 подкожно. Мыши, вакцинированные с помощью FLU-NA-GFP, разработали клинические признаки, характеризующиеся взъерошенным мехом и сгорбившейся осанкой через шесть дней после заражения, потеряли около 20% своего веса тела через восемь дней после инфицирования, а все животные умерли или должны были быть выведены из эксперимента в течение восьми дней после инфицирования (рисунок 3). Потери веса были впервые обнаружены около 6-го дня после инфицирования, что совпало с признаками паралича. Напротив, мыши, вакцинированные с помощью FLU-NA-DIII, теряли вес тела с меньшей скоростью и в конечном итоге восстанавливались после заражения WNV-NY99. Особенно подкожно вакцинированные мыши меньше страдали от инфекции, теряли вес минимально и быстро восстанавливались. Показатели выживаемости составляли 100% и 75% после вакцинации с.кв. и i) с помощью FLU-NA-DIII, соответственно. У вакцинированных мышей FLU-NA-GFP не было защищено от инфекции, что указывает на то, что врожденные иммунные ответы не отвечали за наблюдаемую защиту.

Мышей (n = 8) вакцинировали интраназально с помощью Flu-NA-DIII (•) или Flu-NA-GFP (○) или подкожным путем (▴ и ▵ соответственно). Ежедневные веса каждого животного рассчитывались по сравнению с их соответствующим весом в день заражения, а данные показывались как средний процент исходного веса для каждой группы. Шкалы ошибок представляют стандартную ошибку для всех образцов, доступных в этот момент времени. Впоследствии мышам вводили подкожно 106 TCID50 WNV-NY99 и ежедневно взвешивали. Средний вес тела выражается в процентах от массы тела перед заражением инфекцией (А). Показатели выживаемости мышей после заражения инфекцией WNV-NY99 представлены как кривые выживаемости Каплана-Мейера (B). Разница в выживаемости между вакцинированными мышами Flu-NA-DIII и Flu-NA-GFP была статистически значимой, что было определено с помощью теста логранка. Символы для соответствующих групп такие же, как в панели А.

Экспериментальные эксперименты по переносу проводились для изучения коррелятов защиты. Мышам, которые получали сывороточные, CD4 + или CD8 + Т-клетки, полученные от вакцинированных мышей FLU-NA-GFP, потеряли до 20% от их массы тела и имели титры мозговых вирусов 103,8 TCID50 / грамм ткани. Напротив, передача иммунной сыворотки FLU-NA-DIII наивным реципиентным мышам значительно уменьшала потерю веса и репликацию вируса в головном мозге (P <0,05, рисунок 4 A и B). Аналогичный эффект наблюдался после переноса CD4 + T-клеток, полученных от вакцинированных мышей FLU-NA-DIII (P <0,05; фиг. 4C и D), тогда как передача иммунных CD8 + T-клеток FLU-NA-DIII не вызывала обеспечивают любую защиту от болезней, вызванных инфекцией WNV-NY99 (рис. 4E и F).

Получаемые мыши получали сывороточные (A и B) CD4 + Т-клетки (C и D) или CD8 + Т-клетки (E и F), полученные от мышей, которые были вакцинированы FLU-NA-DIII (закрытые символы) или FLU-NA-GFP (открытые символы) по маршруту (• и ○ соответственно) или sc (▴ и ▵ соответственно) и впоследствии были инфицированы 100 TCID50 WNV-NY99. Потеря массы тела (A, C и E) и титров вируса в головном мозге определяли через 8 дней после заражения заражением (B, D и F). Результаты представляют собой средние значения групп из пяти мышей. Шкала ошибок указывает на стандартное отклонение; * указывает на статистически значимую разницу по сравнению с контрольными группами, получающими сыворотку или Т-клетки от вакцинированных мышей FLU-NA-GFP (определяемых t-тестом). Ежедневные веса каждого животного рассчитывались по сравнению с их соответствующим весом в день заражения, а данные показывались как средний процент исходного веса для каждой группы (A, C, E). Шкалы ошибок представляют стандартную ошибку для всех образцов, доступных в этот момент времени.

Для определения диапазона доз FLU-NA-DIII, способного индуцировать защитный иммунитет после двух иммунизаций, группы мышей иммунизировали диапазоном доз (101-106). Дозы в диапазоне от 101-103 не защищали животных от летальной инфекции (табл. 1). Иммунизация 104 TCID50 FLU-NA-DIII приводила к выживанию 75% (6/8), тогда как 105 и 106 TCID50 FLU-NA-DIII защищали 100% мышей от летальной инфекции. Чтобы выяснить, может ли одна иммунизация обеспечить защиту, мышей иммунизировали один раз либо 105, либо 106 TCID50 FLU-NA-DIII. На 42-й день мышей бросили вызов WNV. Обе дозы приводили к выживанию на 100% после одной иммунизации, тогда как животные, которые получали FLU-NA-GFP, не были защищены.

Н.Д .: Не сделано.

В свете сохраняющейся угрозы WNV в западном полушарии крайне важно наличие безопасной и эффективной вакцины. В настоящем исследовании мы оценили иммуногенность и защитную эффективность рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего DIII WNV в мышиной модели. Эти данные подтверждают, что индуцированные вакциной гуморальные и CD4 + Т-клеточные ответы способствуют защитному иммунитету против заражения вирусом WNV. Защитная роль антител против WNV была продемонстрирована в различных исследованиях [32], [33], [34]. Несколько эпитопов были определены на gE WNV, участвующих в прикреплении клеток, тримеризации и слиянии. Эпитопы, которые индуцируют сильные нейтрализующие антитела, расположены на верхней боковой поверхности DIII, и эти антитела могут эффективно блокировать инфекцию на стадии после входа [35], [36], [37].

В дополнение к DIII-специфическим антителам наши результаты показывают, что DIII-специфичные CD4 + Т-клетки обеспечивают частичную защиту от нейроинвазивного заболевания у мышей, что согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими защитные эффекты gE-специфических CD4 + T-клеток [38], [39]. Здесь мы показываем, что ответы CD4 + Т-клеток, специфичные для эктодомена DIII, были достаточными для обеспечения частичной защиты от инфекции вируса WNV. Механизм, лежащий в основе защитного действия этих CD4 + T-клеток, неясен, но уровни продукции IFN-γ обратно коррелируют с титрами вируса в головном мозге. В нескольких исследованиях показано, что CD8 + Т-клетки играют роль в устранении WNV из инфицированных тканей и защите от летального заболевания [40], [41], [42], [43]. Удовлетворительно переносимые CD8 + Т-клетки, полученные от вакцинированных мышей FLU-NA-DIII, не смогли обеспечить защиту в настоящем исследовании, что можно объяснить отсутствием CTL-эпитопов в DIII, распознаваемых мышами C57BL / 6.

В качестве привлекательных векторов вакцины были предложены ослабленные рекомбинантные вирусы гриппа, поскольку они являются высокоиммуногенными в отсутствие вирулентности [44], [45], [46], [47], [48]. Кроме того, вирусы гриппа с дефицитом NA были предложены в качестве безопасных и мощных кандидатов векторной вакцины [48], [49]. Дополнительным преимуществом использования NA дефицитного вируса гриппа A является то, что его можно использовать в качестве безопасной и эффективной вакцины против сезонного гриппа. Рекомбинантные вирусы FLU-NA-GFP и FLU-NA-DIII индуцировали реакции антител против вируса гриппа A / PR / 8/34. Сывороточные HI-титры ≥40 считаются защитными от гриппа [50], а вакцинация с дефицитом NA-вируса соответствует этим минимальным требованиям. Поэтому предполагается, что использование этих аттенуированных вирусов гриппа обеспечит защиту от заражения гомологичными вирусами.

Было разработано несколько векторных вакцин против WNV [19], [51], [52], [53], [54], [55], большинство из которых были протестированы как кандидатные вакцины для использования человеком. В большинстве этих исследований векторизованные вакцины экспрессировали секретированную форму гликопротеина WNV E, которые вводили дважды либо через внутрибрюшинный, либо подкожный путь и приводили к эффективности 80-100%. В одном из исследований описано введение рекомбинантной вакцины против вируса везикулярного стоматита через интраназальный путь, что привело к 80% выживаемости [54] в соответствии с данными, представленными в этой рукописи. В нашем исследовании впервые описывается использование домена III гликопротеина E WNV с показателями эффективности, аналогичными векторным вакцинам, экспрессирующим полный гликопротеин E WNV.

В этом исследовании использование рекомбинантного вируса гриппа в качестве вектора для доставки WNV DIII приводило к WNV-специфическим иммунным ответам и HI-титрам более 40. Подкожная иммунизация была более эффективной, чем интраназальное введение вакцины, которая также была включена, так как вирусы гриппа, как правило, направлены на дыхательные пути. По-видимому, путь введения повлиял на исход иммунных реакций и защитный потенциал этой кандидатской вакцины, что было продемонстрировано и для других вакцинных препаратов [56], [57], [58]. Уровни специфических антител к вирусу гриппа, которые были индуцированы у всех вакцинированных мышей, показали, что эти животные были защищены от инфекции гриппом A / PR / 8/34.

В совокупности данные, представленные в настоящем исследовании, показывают, что аттенуированный дефицит NA-рекомбинантного вируса гриппа является перспективным кандидатом на двухвалентную векторную вакцину для индукции DIII- и HA-специфических антител, а также с DIII-специфическими Т-клетками. Особенно подкожное введение FLU-NA-DIII вызывало сильные иммунные ответы и обеспечивало существенную защиту от заражения WNV-NY99 у мышей. Дальнейшие исследования продолжаются, чтобы определить, как быстро после иммунизации вакцина эффективна, а уровень и долговечность защиты обеспечивается одной иммунизацией. Дальнейшая оценка этой векторной системы как вирусной вакцины WNV и вируса гриппа A кажется оправданным.

Конкурирующие интересы: ни один из авторов не заявляет о конфликте интересов, кроме Альберта Остерхауса, который является сотрудником (CEO) компании Viroclinics BV (для получения дополнительной информации см. Www.erasmusmc.nl) и Гюнтера Спона, который является сотрудником Cytos Biotechnology , Гус Риммельзваан имеет контакт с Viroclinics BV в качестве консультанта. Указанные конкурирующие интересы не изменяют приверженность авторов ко всем политикам PLoS ONE по обмену данными и материалами.

Финансирование: проект частично финансировался грантом Европейского Союза LSH-2003-1.2.4-5 (COMPUVAC), Viroclinics B.V. и Cytos Biotechnology. Финансисты играли определенную роль в изучении дизайна и решении публиковать, но не играли роли в сборе и анализе данных или подготовке рукописи.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *