Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Защита мышей от летальной проблемы с вирусом гриппа H1N1 2009 года по данным 1918-подобных и классических вакцин на основе свиней H1N1

Protection of Mice against Lethal Challenge with 2009 H1N1 Influenza A Virus by 1918-Like and Classical Swine H1N1 Based Vaccines
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2813279/

Задуманные и разработанные эксперименты: BM RAM RH SS PP CFB AGS. Выполнены эксперименты: BM RAM RH TT SS. Проанализированы данные: BM RAM RH TT SS ENV PP CFB AGS. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: SS ENV CFB. Написал бумагу: BM RAM RH ENV CFB AGS.

Недавняя пандемическая инфекция вируса H1N1 в 2009 году у людей привела к почти 5000 смертей во всем мире. Ранние эпидемиологические данные свидетельствуют о низком уровне инфицирования у пожилого населения (> 65 лет) с пандемическим вирусом и большей восприимчивости у людей моложе 35 лет, что коррелирует с наличием перекрестного реактивного иммунитета у пожилых людей Население. Неясно, какие вирусы могут нести ответственность за эту очевидную перекрестную защиту против пандемического вируса H1N1 2009 года. Мы описываем модель смертельного заражения мыши для пандемического штамма H1N1 в 2009 году, используемую вместе с панелью инактивированных вакцин против вируса H1N1 и моноклональных антител к гемагглютинину (НА) для анализа возможных гуморальных антигенных детерминант ранее существовавшего иммунитета против этого вируса в популяции человека , По анализу ингибирования гемагглютинации (HI) и вакцинации / испытаниям мы демонстрируем, что пандемический вирус H1N1 в 2009 году антигенно подобен вирусам H1N1 человека, которые распространяются с 1918 по 1943 год и на классические вирусы свиней H1N1. Антитела, вызываемые против 1918-подобных или классических вакцин против свиней H1N1, полностью защищают мышей C57B / 6 от летальной проблемы с помощью вируса гриппа A / Нидерланды / 602/2009. Напротив, современные вакцины против H1N1 обеспечивали лишь частичную защиту. Пассивная иммунизация кросс-реактивными моноклональными антителами (mAb), выращенная против белков HA 1918 или A / California / 04/2009, обеспечивает полную защиту от смерти. Анализ мутантных белков-продуцентов mAb, полученных путем отбора вируса H1N1 2009 с этими mAb, указывает на то, что антигенный сайт Sa является одним из сохраненных кросс-защитных эпитопов. Наши результаты на мышах согласуются с серологическими данными, свидетельствующими о высокой распространенности перекрестно-реактивных антител H1N1 2009 года только у пожилых людей, что указывает на то, что прежде инфицирование 1918-подобных вирусов или вакцинация против вируса свиного H1N1 1976 года в США, скорее всего, обеспечит защиту от пандемический вирус H1N1 2009 года. Эти данные обеспечивают механическую основу для защиты, наблюдаемой у пожилых людей, и подчеркивают обоснование включения вакцинации младшего, наивного населения. Наши результаты также подтверждают мнение о том, что свиньи могут выступать в качестве резервуара для животных, где HA вируса гриппа становятся антигенно замороженными в течение длительных периодов времени, что облегчает генерацию пандемических вирусов человека.

Вирусы гриппа A обычно заражают людей всех возрастов и вызывают тяжелые респираторные заболевания у очень маленьких детей и пожилых людей (более 65 лет). Тем не менее, пандемическая инфекция H1N1 в 2009 году наблюдается преимущественно у детей и взрослых (<35 лет), но редко у людей старше 65 лет. Недавние серологические исследования показывают, что пожилые люди несут антитела, которые признают вирус H1N1 2009 года. Это говорит о том, что они могут быть подвергнуты воздействию или вакцинированы вирусом гриппа, подобным вирусу H1N1 2009 года. В этом исследовании мы хотели идентифицировать старый вирус H1N1, который может обеспечить защиту пожилого населения. Используя 11 различных инактивированных вирусов гриппа А, которые были распространены между 1918 и 2007 годами, мы иммунизировали мышей и опросили их смертельной дозой нового вируса H1N1 2009 года. Мы обнаружили, что мыши, вакцинированные человеческими вирусами H1N1, которые были распространены в 1918 году и в 1943 году, были защищены от вируса H1N1 2009 года. Кроме того, вирус свиного происхождения H1N1 1976 года, против которого в 1976 году было вакцинировано около 40 миллионов человек в Соединенных Штатах, защищает мышей от смерти вирусом H1N1 2009 года. Это указывает на то, что люди, несущие антитела против вирусов H1N1, распространенные между 1918-1943 годами и вирусом H1N1 вируса свиньи 1976 года, скорее всего, будут защищены от пандемии H1N1 в 2009 году. Важно отметить, что наши данные подчеркивают важность вакцинации людей в возрасте до 35 лет, поскольку большинство из них не имеют защитных антител против H1N1 в 2009 году и обеспечивают возможный механизм, с помощью которого вирусы пандемии могут возникать из антигенно замороженных вирусов гриппа, содержащихся в популяции свиней.

Вирусы гриппа A (IAV), члены семейства Orthomyxoviridae, вызывают тяжелые респираторные заболевания у людей со средней смертностью 36 000 в год только в Соединенных Штатах [1]. Помимо ежегодных сезонных вспышек, IAV может вызывать частые эпидемии и случайные пандемии у людей [2], [3]. Вакцинация была одним из наиболее эффективных средств защиты от IAV. Вакцина, индуцированная продуцированием антител против гемагглютинина гликопротеина вирусной поверхности (HA), имеет решающее значение для иммунной защиты [4]. HA играет критически важную роль в жизненном цикле вируса, опосредуя связывание вируса с рецепторами, содержащими сиаловую кислоту, на поверхности клеток и слияние вирусных и эндосомных мембран, что приводит к проникновению вируса в клетку-хозяина [2], [5]. Было продемонстрировано, что HA-специфические антитела блокируют IAV-инфекцию, предотвращая связывание и / или слияние рецепторов. Тем не менее, белок HA, обусловленный опосредованным антителом иммунным выбором давлением, подвергается быстрой антигенной эволюции путем накопления мутаций («антигенный дрейф») и посредством генетических реорганизаций сегментов («антигенный сдвиг»). В 20 веке вирус гриппа вызвал три пандемии у людей: 1918 «Испанский грипп» (H1N1), 1957 «Азиатский грипп» (H2N2) и 1968 год «Гонконгский грипп» (H3N2) [6], [7]. В апреле 2009 года Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) Соединенных Штатов Америки объявили об обнаружении нового штамма вируса гриппа у людей. Дальнейшее исследование показало, что этот новый вирус вывел свои гены из вирусов, циркулирующих в популяции свиней. В связи с устойчивой передачей этого нового вируса от человека к человеку во всем мире 11 июня Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) подняла мировой уровень предупреждений о пандемии до этапа 6 (например, продолжающееся глобальное распространение и вспышки на уровне сообщества в разных частях мира ). Все прошлые пандемии и недавняя пандемия IAV H1N1 в свиноводстве 2009 года были вызваны штаммами IAV, несущими антигенно новый сегмент HA в популяциях, иммунологически наивных для этой конкретной НА.

Помимо людей, IAV может заражать различные виды, включая домашнюю птицу, водных птиц, лошадей, свиней, собак и тюленей [8], [9]. Водные дикие птицы считаются природными резервуарами разных подтипов IAV, а свиньи, в дополнение к вирусам вируса гриппа свиньи, считаются «сосудами для смешивания» для генетических реассортаций вирусных сегментов между штаммами вируса птичьего гриппа и вируса гриппа человека [ 8], [10]. Когда-то во время пандемии 1918-20 года IAV H1N1, напоминающий вирус пандемии 1918 года, вводили в популяцию домашней свиньи [11], [12]. До сегодняшнего дня эти вирусы H1N1, называемые классическими свиными H1N1, циркулировали в популяции свиней с относительно скромными изменениями антигенности HA [13]. В отличие от HA антигенного стаза у свиней, потомки вируса 1918 года циркулировали у людей со значительным антигенным дрейфом в HA, пока они не были заменены пандемическим вирусом H2N2 1957 года [4]. В 1978 году вирус H1N1, напоминающий вирус H1N1 конца 1950-х годов, вновь появился в популяции человека [14], [15]. С 1977 года по настоящее время вирусы H3N2 и H1N1 совместно циркулируют у людей. Кроме того, в 1976 году среди солдат на базе армии Форт-Дикс в Нью-Джерси (16), [17] была зарегистрирована вспышка свиного H1N1 IAV (классическая H1N1). Поскольку вирусы H1N1 не распространялись у людей с 1957 года, вспышка в Форт-Диксе вызвала опасения по поводу пандемии H1N1. Поэтому вакцина, основанная на инактивированном вирусе A / NJ / 76 (H1N1), была разработана и введена почти 40 миллионам человек в Соединенных Штатах. Тем не менее, вирус свиней H1N1 1976 года не вызывал пандемии, и никаких инфекций не сообщалось за пределами Форт-Дикс.

Хотя у людей было зарегистрировано несколько случаев заражения свиным IAV, такие инфекции были редкими [18], [19], [20], [21]. Удивительно, но нынешняя пандемия H1N1 в 2009 году оказалась очень эффективной при передаче от человека к человеку по сравнению с предыдущими вирусами гриппа свиней. Помимо отсутствия ранее существовавшего иммунитета против этого вируса у большинства людей, до сих пор неясно, какие вирусные генетические факторы способствуют этой более высокой скорости передачи. Интересно отметить, что недавние эпидемиологические данные указывают на более высокий уровень подтвержденной инфекции H1N1 в 2009 году у лиц моложе 18 лет по сравнению с пожилыми людьми [22]. Предполагается, что некоторые из пожилых людей, возможно, были подвергнуты воздействию вируса, антигенно сходного с 2009 H1N1. Тем не менее, в настоящее время неизвестно, какой конкретный вирус или вирусы, распространенные в прошлом и в течение каких лет, могут быть ответственны за эту кажущуюся перекрестную реактивность сыворотки, сообщаемую у более старшего населения (старше 65 лет) [23], [24] , [25].

В этом исследовании, используя модель смертельной мышиной модели текущего вируса H1N1 2009 года, мы проверили эффективность панели из 11 различных вирусных вакцин, охватывающих период с 1918 по 2009 год. Мы демонстрируем, что мыши, иммунизированные инактивированными вакцинами на основе вируса H1N1 человека с 1918 года до 1943 года или на основе классических вирусов свиней H1N1 обеспечивают полную защиту от смерти против летального заражения вирусом H1N1 2009 года. Напротив, вакцинация мышей инактивированными человеческими вирусами H1N1 человека, выделенных после 1950 года, включая современные вирусы H1N1, предлагала только частичную защиту и приводила к большей заболеваемости из-за заражения вирусом H1N1 2009 года. В соответствии с исследованиями по вакцинации / пробам сыворотки с предварительной пробкой от мышей, вакцинированных в 1918 году, и классические антигены свиней показывают нейтрализацию гемагглютинации вируса H1N1 2009 года. Кроме того, мы выделили анти-НА специфические моноклональные антитела (mAb), которые имеют перекрестную реактивность против H1N1 HA 1918 и 2009 годов. В опытных экспериментах эти mAb обеспечивают полную защиту от смерти вирусом H1N1 2009 года после пассивной иммунизации. Анализ белков-мутантов-побегов, выбранных в присутствии этих mAb, сопоставленных с антигенным сайтом Sa. Вместе эти данные свидетельствуют о том, что новый вирус пандемического вируса H1N1 2009 года обладает большим уровнем антигенного сходства с вирусом 1918 года и этот сайт Sa высококонсервативен в этих двух вирусах. Эти результаты хорошо согласуются с эпидемиологическими данными, свидетельствующими о том, что пожилые люди (возраст> 65 лет) менее восприимчивы к 2009 году H1N1 [24], [25], [26] и данные, полученные в результате двух недавних исследований, которые продемонстрировали высокую распространенность креста — нейтрализующие антитела у людей, родившихся до 1940 года [27], [28]. Взятые вместе, наши наблюдения обеспечивают обоснование защиты, наблюдаемой у пожилых людей, к пандемическому вирусу H1N1 2009 года и большей восприимчивости, наблюдаемой у молодых людей. Таким образом, наши данные показывают, что лица, ранее подвергшиеся воздействию и содержащие антитела против 1918-подобных вирусов H1N1 или классического свиного H1N1, вероятно, будут защищены от вируса H1N1 нового свиного происхождения.

Все процедуры для животных, проведенные в этом исследовании, соответствуют руководящим принципам Комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC), и были одобрены IACUC школы медицины горы Синай.

Клетки эмбриональной почки человека (293T) поддерживали в DMEM, дополненной 10% FBS и 1000 мкг / мл пенициллина / стрептомицина. Клетки Madin-Darby canine почки (MDCK) поддерживали в MEM, дополненной 10% FBS и пенициллином / стрептомицином. Реагенты для клеточной культуры были приобретены у Gibco Life Technologies.

H1N1-вирусы, используемые в этом исследовании, следующие: A / Swine / Iowa / 30 (Sw / 30), A / Puerto Rico / 8/34 -MSSM (PR8), A / Weiss / 43 (Wei / 43), A / Нью-Джерси / 8/1976 (NJ / 76), A / СССР / 92/77 (СССР / 77), A / Houston / 20593/84 (Hou / 84), A / Texas / 36/1991 (Tx / 91) , A / Brisbane / 59/2007 (Bris / 59/07), A / California / 04/2009 (Cal / 09) и A / Netherlands / 602/2009 (Neth / 09). A / Northern Territory / 60/1968 (NT / 68) и A / Brisbane / 10/2007 (Bris / 10/07) использовались в качестве контролей H3N2. Все эксперименты, связанные с вирусами H1N1 2009 года, проводились в условиях биобезопасности 3 (BSL3) для работы на животных и уровня биобезопасности 2 с использованием лабораторных условий BSL3 для работы in vitro в соответствии с рекомендациями Центров по контролю и профилактике заболеваний. Запасы вируса Cal / 09 и Neth / 09, используемые для экспериментов с мышами, были выращены в клетках MDCK. Все остальные вирусы выращивали в 10-летних яйцах при 37 ° С в течение 2-3 дней.

Рекомбинантный вирус гриппа A, переносящий HA / NA из Cal / 09 и внутренние шесть генов из PR8, называемый Cal / 09 6: 2 в напоминании об исследовании, был получен, как описано ранее [29]. Вкратце, клетки 293T трансфицировали восемью амбизными pDZ-векторами, кодирующими 8 вирусных генов и белков, и через 24 ч после трансфекции, супернатант инокулировали в 8-дневные эмбриональные куриные яйца. Аллантоидную жидкость собирали после 3 дней инкубации при 35 ° С. Спасимый вирус был очищен бляшкой в ​​клетках MDCK и повторно выращивался в 10-дневных эмбриональных куриных яйцах.

Все вирусы, используемые для приготовления инактивированных вакцин, выращивали в 10-летних яйцах при 37 ° С в течение 2 дней. После осветления мусора в аллантоидной жидкости низкоскоростным центрифугированием вирусы осаждали на 30% сахарозную подушку центрифугированием при 25000 об / мин в течение 2 часов. Вибрационный осадок ресуспендировали в буфере для бората кальция с рН = 7,0 (143 мМ хлорид натрия, 10 мМ хлорид кальция, 20 мМ бориновой кислоты 2,5 мМ бората натрия) при концентрации 1 мг / мл, рассчитанной по методу Брэдфорда (лаборатории Bio-Rad, Hercules, CA) и вирус был инактивирован формальдегидом (0,9% конечного конц.). Для группы вакцинации Cal / 09 вместо вируса дикого типа использовали Cal / 09 6: 2 (описано выше). Для вакцины на основе вируса 1918 года для вакцинации использовались вирусоподобные частицы (VLP). VLP были получены путем совместного трансфекции HA (A / South Carolina / 1/18) и NA (A / Brevig Mission / 1/18) в клетки 293T, как описано ранее [30]. Выделенные VLP были очищены на 30% сахарозной подушке. Используемые дозы вакцин основывались на количестве общей концентрации белка, измеренной по методу Брэдфорда.

Пандемические H1N1 2009 и 1918 мышиные мышиные mAb были получены совместным исследовательским центром гибридомы в Медицинской школе Mount Sinai, Нью-Йорк, Нью-Йорк. Для генерации H1N1-HA-специфических антител 2009 года 6-недельные мыши BALB / C инфицировали интраназально 5 × 104 БОЕ вируса гриппа Cal / 09. Через четыре недели мышам вводили 2 × 107 pfu Cal / 09 6: 2 внутривенно для увеличения В-клеток, специфичных к Cal / 09 HA. Через три дня после формования селезенку собирали и В-клетки из селезенки сливали с клетками миеломы SP2 / 0 путем добавления полиэтиленгликоля. Супернатанты полученных гибридом тестировали путем иммунофлуоресцентного окрашивания на клетках 293Т, трансфицированных pDZ-HA (Cal / 09). Положительные гибридомы субклонировали и повторно тестировали. Для генерации 1918-вирусных HA-специфических антител мышей иммунизировали путем вакцинации ДНК с помощью pCAGGS-HA вируса гриппа A / South Carolina / 1/18 H1N1, а затем активировали целым инактивированным вирусом, как указано выше. Анализы ингибирования гемагглютинации (HI) использовали для выбора кросс-реактивных антител против гомологичной НА с использованием VLP 1918. 1918 HA-специфичные mAb 6B9 и 39E4 соответствуют изотипу IgG2a, а mAA 29E3 Cal04 / 09 соответствуют изотипу IgG2b. MAb изотипировали с использованием набора IsoStrip (Roche, Indianapolis, IN) и очищали, используя колонку с сефарозой белка A.

Сыворотки мышей были инактивированы с использованием терапии трипсином-тепловым периостатом, как описано ранее [31]. Вкратце, один объем сывороток смешивали с половиной объема трипсина 8 мг / мл (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) в 0,1 М фосфатном буфере, рН 8,2, а затем инкубировали в течение 30 мин при 56 ° С. Образцам давали остыть до комнатной температуры (RT) и смешивали с 3 объемами 0,11 М метакалиевого периодата и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем добавляли три объема 1% глицеринового солевого раствора и смешивали с образцами и дополнительно инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Образцы разбавляли до окончательного разведения 1:10 путем добавления и смешивания 2,5 объемов 85% солевого раствора. HI анализы mAb и сыворотки проводились по стандартным протоколам [30]. Двухкратные серийные разведения сывороток или mAb смешивали и предварительно инкубировали в 96-луночных планшетах в течение 30 мин при 4 ° C с 8 HA единиц вируса на лунку. Добавляли эритроциты Турции до конечной концентрации 0,25% и планшет инкубировали на льду в течение 30 мин. Ингибирование гемагглютинации (HI) титров сывороток определяли как самое высокое разведение, которое проявляло гемагглютинирующую активность. Конкретную активность HI mAb рассчитывали как самую низкую концентрацию mAb, которая проявляла гемагглютинирующую активность.

мутантные мутанты mAb были получены, как описано ранее [32]. Вкратце, вирус Cal / 09 (6: 2) инкубировали с избытком моноклонального антитела в течение 1 часа при комнатной температуре. Смесь вирус-mAb инокулировали в 10-дневные эмбриональные яйца и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов. Вирус (аллантоиновая жидкость), выращенный в этих условиях, собирали и повторно тестировали на потерю активности HI против того же mAb, который использовался для отбора. Мутации в HA, ответственные за побег Ab, идентифицировали путем прямого секвенирования vRNA, полученного RT-PCR.

Мышей BALB / C или C57B / 6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) анестезировали кетамин-ксилаксином и интраназально заражали указанной дозой вируса, разведенной в 50 мкл PBS. Вес тела и выживаемость измеряли каждый день в течение 14 дней. Все мышиные эксперименты проводились в строгом соответствии с институциональными протоколами. Считается, что мыши, у которых более 25% потери веса тела достигли экспериментальной конечной точки и были гуманно подвергнуты эвтаназии.

Легкие инфицированных мышей вырезали в указанные дни после инфицирования и гомогенизировали с использованием механического гомогенизатора (MP Biochemicals, Solon, OH). Вирусные титры в гомогенатах определяли количественно анализом бляшек на клетках MDCK. Каждая точка данных представляет средний титр от 2-3 мышей.

Самки C57B / 6 мышей (9 недель) анестезировали кетамин-ксилаксином и интраназально заражали дозами 5 × 102, 5 × 103, 5 × 104, 5 × 105 или 5 × 106 pfu-вирусом в 50 мкл (n = 5 / группа). Мышей ежедневно контролировали на выживание и потерю массы тела в течение 14 дней после инфицирования (p.i.). Мыши, показывающие более 25% потери массы тела, считались достигшими экспериментальной конечной точки и были подвергнуты эвтаназии. LD50 были рассчитаны методом Рида и Мюнха [33].

Пятинедельную женщину C57B / 6 иммунизировали 15 мкг инактивированного вируса или VLP 1918 путем внутримышечной инъекции в заднюю ногу. Через две недели мышей повышали с таким же количеством инактивированного вируса. Через четыре недели после первоначальной иммунизации мыши были заражены Neth / 09 в дозе, эквивалентной 50 LD50 (7,9 × 105 БОЕС). Выживаемость и потеря массы тела контролировались в течение 14 дней. В момент летального испытания мышам было 9-10 недель.

Моноклональные антитела 6B9 и 39E4 были получены против вируса гриппа A / South Carolina / 1/18 (H1N1) (1918) HA, а моноклональное антитело 29E3 было увеличено против Cal / 09 HA. Девятинедельные мыши C57B / 6 пассивно иммунизировали общим количеством 150 мкг указанного моноклонального антитела (внутрибрюшинно) или 200 мкл поликлональных сывороток от мышей, ранее инфицированных Cal / 09, 24 ч до летального заражения. В качестве контроля вводили mAb (изотип IgG2a), выращенный против несвязанного вирусного белка, Nipah W. Мышам было предложено Neth / 09 в дозе, эквивалентной 50 LD50. Выживаемость и потеря массы тела контролировались в течение 14 дней после заражения (p.c.), и титры вируса легких получали в дни от 3 до 6 п.с.

Все вакцинированные и пассивно иммунизированные мыши одновременно подвергались обследованию. Для сравнения в обоих экспериментах использовалась одна группа контрольных мышей и относилась к элементам «Нет вакцинации» или «Нет Ab», показанным ниже.

Структурные модели для HA Cal // 09 и Bris / 59/07 были сгенерированы с использованием структурного автоматизированного сервера прогнозирования гомологичности моделирования структуры (Swiss-Model) с наилучшими подходящими шаблонами (PDB: 1ruy для Cal / 09 и 1rvx для Bris / 59/07) [34]. Структура 1918 HA была получена из PDB (PDB ID: 2wrg). Окончательные изображения структур HA были получены с использованием Pymol (Delano Scientific) [35].

Для оценки вирулентности и кинетики инфекции новых вирусов пандемического H1N1 у мышей шестинедельные мыши BALB / c и C57B / 6 были инфицированы двумя вирусными изолятами 2009 H1N1 и контролировались на признаки потери веса и выживания. Прививка мышей BALB / c изолятом Cal / 09 вызывала заметное снижение массы тела даже при 103 pfu (~ 13%, рис. 1A), явление, которое обычно не наблюдается с неадаптированными человеческими вирусами H1N1 человека [36]. При инфицировании 5 × 104 pfu 50% мышей достигли экспериментальной конечной точки> потери массы на 25% к 9-му дню (фиг.1C). Оставшиеся мыши продемонстрировали значительную потерю веса к 8-му дню со средним весом 77,5% (фиг.1А). Вирусные легкие титров у этих мышей на обоих днях 2 и 5 были заметно высокими без существенных различий в обоих временных точках (рис.1D). Аналогичные результаты наблюдались у мышей C57B / 6 после инокуляции вирусом Cal / 09. При дозах 103 и 5 × 104 мышей ПФУ показали потери массы тела, сравнимые с потерями мышей BALB / c (фиг.1B). Вирусные титры в легких у мышей C57B / 6 были почти в десять раз выше на 6 день p.i. чем на 3 день п.и. (Фиг.1D), что указывает на активную репликацию вируса. Как и у мышей BALB / c, заражение 5 × 104 pfu приводило к тому, что 50% мышей достигали экспериментальной конечной точки к дню 8 п.и. (Фиг.1C) и средней потери веса 21,8% на 7 день p.i. (Фиг.1В).

(A) Масса тела мышей BALB / c, инфицированных изолятом Cal / 09. Шесть недельных мышей BALB / c инфицировали указанной дозой вируса, а массы тела ежедневно контролировались как показатель заболевания, вызванного вирусом. (B) Изолят Neth / 09 является более патогенным, чем изолят Cal / 09 у мышей. Мышей C57B / 6 инфицировали либо Cal / 09, либо Neth / 602 изолят пандемического вируса H1N1 2009 года в указанных дозах. (C) Сравнение выживаемости мышей BALB / c и C57B / 6, инфицированных вирусами Cal / 04 и Neth / 602. (D) Вирусные титры в легких мышей BALB / c, инфицированных либо 1 × 103, либо 5 × 104 БОЕ изолята Cal / 09. (E) Вирусные титры в легких C57B / 6 мышей, инфицированных либо 1 × 103, либо 5 × 104 pfu Cal / 09, либо 5 × 104 pfu Neth / 09. ND указывает, что данные не определены. Вес тела измерялся каждый день и представлялся в процентах от массы тела до заражения (n = 4 или 5 мышей / группы). Считается, что мыши, у которых более 25% потери веса тела достигли экспериментальной конечной точки и были гуманно подвергнуты эвтаназии. Легкие 2-3 инфицированных мышей были вырезаны, а вирусные нагрузки в гомогенатах измерялись путем проведения анализа бляшек в клетках MDCK.

Чтобы оценить, наблюдается ли сходная вирулентность с другими изолятами пандемии H1N1 в 2009 году, мы инфицировали мышей изолятом Neth / 09. Интересно, что Neth / 09 показала значительно более высокую вирулентность у мышей C57B / 6. При дозе 5 × 104 БОЕ / мл мышам наблюдалась быстрая и значительная потеря веса к 4-му дню (фиг.1В). Все мыши поддавались инфекции или достигли экспериментальной конечной точки к дню 6 п.и. (Фиг.1C) и имели более высокие титры вирусных вирусов, чем те, которые наблюдались с изолятом Cal / 09 в этот момент времени (фиг.1E).

Для дальнейшей оценки патогенеза Neth / 09 мы определили LD50 изолята Neth / 09 у мышей. У девятинедельных самцов мышей C57B / 6 были инфицированы разные дозы вируса (5 × 102, 5 × 103, 5 × 104, 5 × 105 или 5 × 106 БОЕ) и контролировались на потерю веса и выживание в течение 14 дней pi (Фиг.2А и В). Все мыши, инокулированные 5 × 104 БОЕ или выше, поддавались инфекции или достигли экспериментальной конечной точки между днями 4-8 п.и. (Фиг.2А). У мышей, инокулированных 5 × 103 п.о.о., наблюдалось снижение массы тела на 12,2%, а мышей, инфицированных 5 × 102 п.о.о., не наблюдалось значительного снижения веса (фиг.2В). Было определено, что LD50 для Neth / 09 составляет 1,58 × 104 pfu для 9-недельных мышей C57B / 6 (метод Рида и Мюнха [33]). В целом эти данные указывают на то, что изолят Neth / 09 более патогенен у мышей, чем Cal / 09, и поэтому в описанных здесь экспериментах с вызовами изолят Neth / 09 и мышей C57B / 6 использовали в качестве летальной модели для пандемии H1N1 в 2009 году ,

(A, B) Определение LD50 для изолята Neth / 09 у мышей C57B / 6 (n = 5 / группа). Мышей заражали указанными дозами вируса, а их вес тела (А) и выживаемость (В) контролировали в течение 14 дней. (C, D) Повторное заражение мышей с Cal / 09 с Neth / 09 (n = 4 / группа). Шестинедельным мышам C57B / 6 инокулировали PBS (Mock) или изолят Cal / 09 (103 или 5 × 104 pfu). Через 21 день мышам было выделено 1 × 106 БОЕ изолята Neth / 09. Вес тела (C) и выживаемость (D) контролировали в течение 14 дней, как показано на фиг.1.

Затем, чтобы оценить уровень антигенного сходства между вирусами H1N1 2009 года и другими вирусами H1N1, мы выполнили анализы ингибирования гемаглютинации (HI) и эксперименты с пробными испытаниями. Анализ сывороток от мышей, инфицированных Cal / 09, выявил аналогичные уровни активности HI против изолятов Cal / 09 и Neth / 09, что свидетельствует о том, что они являются антигенно очень похожими, несмотря на значительные различия в патогенности у мышей (данные не показаны).

В качестве доказательства принципа и установления того, является ли предварительная инфекция Cal / 09 достаточной для обеспечения защиты от летальной проблемы с антигенно подобным изолятом Neth / 09, мышей C57B / 6 сначала инфицировали Cal / 09 и разрешали сероконвертировать для 21 дней, за которым следовал летальный вызов с 106 БОЕ из Neth / 09 (> 50 LD50). Как и ожидалось, все мыши, ранее инфицированные Cal / 09, выжили (рис. 2D). Мыши, ранее инокулированные 103 pfu Cal / 09, показали уменьшение массы тела на 10%. Тем не менее, все мыши вернули вес к 6-му дню (рис.2C). Никакого значительного изменения веса не наблюдалось в группе 5 × 104 pfu. Напротив, мыши, ранее издевавшиеся над инфицированными, уступили Neth / 09 вызову к 8-му дню (рис. 2D). Вместе это демонстрирует, что Cal / 09 и Neth / 09 являются антигенно очень похожими, и существует перекрестная защита между различными пандемическими штаммами H1N1 в 2009 году.

Недавние серологические исследования показали, что человеческая популяция в возрасте до 30 лет практически не имеет ни одного нейтрализующего антитела против пандемического вируса H1N1 в 2009 году [22], [27], [28], [37]. Однако сыворотки от взрослых старше 35 лет показали различные уровни нейтрализующей активности до пандемического гриппа H1N1 в 2009 году, когда люди, родившиеся до 1940-х годов, демонстрировали наивысшую степень нейтрализующей активности [27]. Чтобы исследовать, могут ли антитела против старых вирусов H1N1 перекрестно реагировать и поэтому обеспечивают защиту от вируса пандемического вируса H1N1 2009 года, мышей C57B / 6 иммунизировали VLP 1918 или различные инактивированные вакцины против вируса H1N1, охватывающие период с 1918 по 2009 год. До летального заражения все мыши тестировали на сероконверсию против гомологичного вируса и обнаружили, что титры антител HI эквивалентны ≥40 (таблица 1). Чтобы проверить, была ли вакцинация любым из других вирусов H1N1 защищена от нового пандемического гриппа H1N1 2009 года, иммунизированным мышам была назначена летальная доза Neth / 09 (50 LD50), а эффективность вакцины была оценена путем оценки потери веса и выживания 14-дневный период pc, а также путем измерения титра вируса в нижнем дыхательном пути (рис.3). В группе без вакцинации (контроле) мышам поддавалась инфекция и достигла экспериментальной точки на 5-й день (фиг.3В). Эта группа мышей показала наивысшие вирусные титры в легких на 3-й и 6-й дни. (Фиг.3С). Поскольку ожидаемая иммунизация с помощью Cal / 09 6: 2 обеспечивала полную защиту от смерти до мышей (рис. 3B). В этой группе наблюдались умеренные уровни заболевания, о чем свидетельствует снижение массы тела (рис.3А). Однако мы не обнаружили инфекционного вируса в легких этих мышей на 3-й или 6-й день. (Фиг.3C, предел ≥10 pfu). Интересно, что инактивированные классические вирусы H1N1 свиней (Sw / 30 или NJ / 76), VLP 1918 и инактивированный человеческий вирус H1N1 человека, выделенный в 1943 году (Wei / 43), предлагали 100% защиту от смерти от пандемии H1N1 в 2009 году. Мыши, вакцинированные VLP 1918 года, выжили и показали потерю веса, сравнимую с потерей веса у вакцинированных животных Cal / 09 6: 2 (фиг.3В и 3А). Мы обнаружили 100-кратное более низкое количество вируса в легких оспариваемых мышей на 3-й день p.c. и никакого вируса на 6 день p.c. Аналогично, у мышей, иммунизированных Sw / 30 или NJ / 76, вирус Neth / 09 был обнаружен только в легких на 3-й день, что указывает на то, что эти две вакцины имели эффективность в снижении вирусной репликации в легких, сравнимой с таковой у 1918 VLPs ( Фиг.3С). Однако в этих группах наблюдалась несколько более высокая потеря массы (~ 18,2%) (фиг.3А). Несмотря на то, что вакцинация Wei / 43 приводила к выживанию на 100%, эти мыши показали гораздо большую и устойчивую потерю веса по сравнению с 1918 вакцинированными VLP, SW / 30 и NJ / 76 вакцинированными мышами, а вирусные титры в легких были высокими на 3-й день и 6-й день, предполагая лишь умеренные уровни ингибирования репликации вируса Neth / 09 (фиг.3А, В и С). Напротив, иммунизация вирусами H1N1 человека, которые распространялись с 1977 по 2007 год, показала лишь частичную защиту от летального противодействия Neth / 09 (рис. 3E). Об этом свидетельствует обширная потеря веса, наблюдаемая у этих мышей (рис. 3D). У мышей, вакцинированных с помощью СССР / 77, Hou / 84, Tx / 91 или Bris / 59/07, наблюдалась только выживаемость 20-60% (рис. 3D и E). Тирезы вируса на третий день п.п. были похожи на контрольные. Тем не менее, на 6-й день вирусные титры были ниже, особенно у вакцинированных Tx / 91 мышей, которые имели примерно в 1000 раз более низкие вирусные титры по сравнению с 3-м днём. (Фиг.3F). В группах, вакцинированных штаммами NT / 68 и Bris / 10/07, вирусы, принадлежащие к подтипу H3N2, летальный вызов, приводили к выживанию 25% или всем мышам, уступающим инфекции, соответственно. В соответствии с повышенной заболеваемостью, наблюдаемой у мышей, вакцинированных Bris / 10/07, потеря веса и вирусные титры также были высокими. Причины низкого титра вируса в группе вакцинации NT / 68 на 6 день p.c. неясны (рис.3F). Тем не менее, эти результаты показывают, что инактивированные вакцины на основе классических вирусов H1N1 свиней и на вирусы H1N1 человека 1918 и 1943 годов защищают от смерти у мышей, инфицированных пандемическим вирусом H1N1 в 2009 году, и предполагают, что они, вероятно, обладают значительным антигенным сходством.

Пять недель назад C57B / 6 иммунизировали 15 мкг указанных инактивированных вирусов или 1918 VLP-вакциной с последующим повышением (15 мкг) через две недели. Через четыре недели после первой иммунизации вакцинированным мышам вводили в осадок изолят Neth / 09 в дозе 50 LD50 (7,9 × 105 pfu). Мышей контролировали на потерю массы тела и выживаемость в течение 14 дней, как на рисунке 1. (A) Масса тела классических свиней H1N1 (Sw / 30, NJ / 76), VLP 1918 и человеческих мышей H1N1 Wei / 43 после заражения Neth / 09 (n = 4 или 5 мышей / группа) (D) Масса тела мышей, вакцинированных современным (с 1977 по 2007 год) Инактивированным вирусом H1N1 или H3N2 после заражения с помощью Neth / 09 (n = 4 или 5 мышей / группы) , (B, E) Выживание мышей, вакцинированных вирусами H1N1 и H3N2 после заражения. (C, F). Вирусные титры у вакцинированных H1N1 и H3N2 мышей на 3 и 6 днях п.с. Каждая точка данных представляет собой средний титр вируса от 2 или 3 мышей. Была использована одна группа контрольных (без вакцины) мышей и включена во все панели для прямого сравнения. Вакцинированная группа Cal / 09 также включена в (A) и (B) для сравнения.

Диапазон титра антител HI из 10 вакцинированных мышей на группу.

HI титры представляют собой самое высокое разведение, которое проявляет ингибирующую активность гемагглютинации.

Затем, чтобы проверить, соблюдалась ли защита, наблюдаемая в 1918-1943 гг. И вакцинированных NJ / 76, с перекрестно-реактивными нейтрализующими антителами в сыворотке крови, мы тестировали сыворотку до заражения вакцинированными мышами для активности HI против разных вирусов H1N1 (таблица 2). Во всех сыворотках с предварительными испытаниями был показан HI титр между 160-2560 и гомологичным вирусом. Как и ожидалось, сыворотки от 1918 VLP, SW / 30 и NJ / 76 вакцинированных животных показали активность HI против обоих пандемических вирусов H1N1 2009 года (HI титр ≥40), что указывает на то, что защита связана с перекрестно-реактивными антителами. Однако, несмотря на полную защиту от смерти от летального испытания Neth / 09, сыворотки от Wei / 43 не показали активности HI против вирусов H1N1 2009 года. Это может указывать на то, что анализ HI менее чувствителен, чем анализ на вызов in vivo для оценки наличия защитных Abs. В совокупности наши результаты показывают, что 1918, SW / 30 и NJ / 76 обладают антигенно подобным эпитопом (ами), которые могут отвечать за перекрестную защиту.

HI титры представляют собой самое высокое разведение, которое проявляет ингибирующую активность гемагглютинации.

Позитивные титры выделены жирным шрифтом для ясности.

HI активность сывороток от мышей, инфицированных Neth / 09, включена для сравнения.

Контрольные — отрицательные сыворотки.

H3N2, используемый в исследованиях вакцинации.

Чтобы дополнительно изучить распространенные возможные эпитопы, разделяемые между вирусами H1N1 1918 и 2009 годов, мы исследовали кросс-реактивность 1918 HA-специфических моноклональных антител с Cal / 09 методом HI. Два 1918 HA mAb, 6B9 и 39E4, показали активность HI против Cal / 09. Кроме того, одно из специфичных к Cal / 09 HA антител (29E3) показало активность HI против Cal / 09 и VLP 1918 (таблица 3). Чтобы оценить, могут ли эти mAb обеспечить защиту (in vivo) против летального Neth / 09, мышам было дано 150 мкг mAb в качестве профилактического лечения за 24 часа до заражения (50 LD50). Для оценки уровня HI-титров в крови до заражения измеряли активность HI в сыворотке пассивно-иммунизированных мышей (таблица 4). Сыворотки от мышей, иммунизированных Ab, выращенных против несвязанного вирусного белка (вирус Nipah W), не проявляли активность HI. У мышей, иммунизированных HA-специфическими моноклональными антителами, были обнаружены значительные уровни HI-титров (HI = 40-320). Мыши, иммунизированные поликлональными сыворотками, показали более низкий титр HI (HI = 20-80, таблица 4). Как и ожидалось, введение контрольного антитела приводило к отсутствию защиты от летального заражения, и все мыши имели высокие титры вируса в легких, эквивалентные тем, которые наблюдались у необработанных мышей (фиг.4). Поликлональные сыворотки от мышей, ранее инфицированных вирусом Cal / 09, использовали в качестве положительного контрольного профилактического лечения, чтобы установить базовый уровень защитных антител in vivo (поли-сыворотка). Мыши в этой группе были полностью защищены от летального испытания и показали снижение титров вируса легкого на 3-й и 6-й день по сравнению с необработанными контрольными группами. Тем не менее, эти мыши показали значительную потерю веса в течение первых 4 дней (фиг.4А, В и С). Лечение 150 мкг 1918 специфических анти-HA моноклональных антител (6B9 и 39E4) также обеспечивало полную защиту от заражения и показало снижение потери веса по сравнению с группой поликлональных сывороток. Обработка методом Cal / 09 специфического моноклонального антитела (29E3) приводила к выживанию на 100% и без потери веса, что свидетельствует о небольшой или вообще отсутствующей заболеваемости у этих мышей. Оценка инфекционного вируса на нижнем дыхательном пути мышей, обработанных всеми моноклональными антителами, выявила снижение вирусных титров по сравнению с контролем, особенно на 3-й день п.п. (Фиг.4С). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что кросс-реактивные моноклональные антитела защищают от летального противодействия Neth / 09, блокируя консервативный антигенный сайт между 1918 и 2009 годами пандемических вирусов H1N1.

Девять недель, мышей C57B / 6 пассивно иммунизировали общим количеством 150 мкг указанного моноклонального антитела (внутрибрюшинный путь) за 24 часа до вирусного заражения. После введения антител мышам вводили в осадок изолят Neth / 09 в дозе 50 LD50. (A) Масса тела пассивно-иммунизированных мышей, которым был поставлен Neth / 09 (n = 5 / группа). (B) Выживание пассивно иммунизированных мышей после заражения с помощью Neth / 09. (C) Вирусные титры в легких в дни 3 и 6 п.с. Вирусную нагрузку в гомогенатах легких определяли количественно, как на фиг.1. Мыши Control (No Ab) те же, что и контрольные на фиг.3, и включены для прямого сравнения.

Конкретную активность HI mAb рассчитывали как самую низкую концентрацию (мкг / мл) mAb, которая проявляла ингибирующую активность гемагглютинации.

n / d: не определено.

HI титры представляют собой самое высокое разведение, которое проявляет ингибирующую активность гемагглютинации.

N / A: Не применимо, n / d: не определено.

Чтобы идентифицировать общий кросс-защитный эпитоп (ы) в HA, мы создали мутантные мутанты mAb вируса Cal / 09 6: 2. Выбывающие мутанты, полученные путем предварительной инкубации вируса Cal / 09 (6: 2) с избытком каждого из перекрестно-реактивных mAb (6B9, 39E4 и 29E3), приводили к потере активности HI против того же mAb. Интересно, что все белки-мутанты-побеги, генерируемые либо с 19-часовыми HA-специфическими mAb, переносили мутации в антигенном сайте Sa (таблица 5, рис.5). Выборочные мутанты, возникшие в присутствии специфического mAb 6B9 и 39E4 1918, содержали мутации G172E (G158E по нумерации H3) и K171E (K157E по нумерации H3) соответственно. Мутанты-побеги, генерируемые путем отбора с помощью специфического mAb (29E3) 2009 H1N1, переносили либо мутацию K171E, либо K171Q, либо K180N (остатки K171 и K180 соответствуют K157 и K166 в нумерации H3). Эти результаты показывают, что все mAb связываются с консервативным антигенным сайтом Sa (фиг.5 и 6).

Выравнивание последовательностей НА с вирусными вирусами H1N1 от СССР / 77, Tx / 91, Bris / 59/07 и 2009 (верхняя панель). Выравнивание последовательностей HA из вирусов 191, Sw / 30, Wei / 43, NJ / 76 и 2009 H1N1 (нижняя панель). Антигенные сайты указаны в цветных заштрихованных коробках и ранее были описаны Brownlee и Fodor [42], используя нумерацию H3, в виде Cb (78-83), Sa (128-129, 156-160, 162-167), Sb ( 187-198), Ca1 (169-173, 206-208, 238-240) и Ca2 (140-145, 224-226).

(A) Представление ленты мономера HA (H1 и H2) трех вирусов. Отдельные антигенные сайты выделяются зелеными эллипсами в мономерах HA. (B) Верхняя панель: вид сверху сверху на тримерные комплексы HA с антигенными сайтами и их различия между вирусами 1918, Cal / 09 и Bris / 59/07. Голубой цвет соответствует консервативным аминокислотам, а красный цвет представляет собой аминокислоты, которые отличаются от 1918 HA. Антигенные участки окрашены в голубой цвет. Нижняя панель: крупный план антигенного сайта Sa в мономерных 1918 и Cal / 04 HAs. Аминокислоты K171, G172 и K180 (K157, G158 и K166 путем нумерации H3), соответствующие мутантным мутационным mAb, показаны желтым цветом.

Нумерация H3 показана в скобках.

Сезонные вирусы гриппа в основном вызывают тяжелые заболевания у очень маленьких детей и у пожилых людей. Тем не менее, инфекции с пандемией H1N1 в 2009 году значительно ниже у людей в возрасте 65 лет и старше, вероятно, из-за иммунитета от предварительного воздействия и / или вакцинации на антигенно подобный вирус гриппа [24], [25], [26]. Используя панель из 11 различных вирусов гриппа с 1918 по 2009 год, мы проверили способность инактивированных вакцин на основе этих вирусов для защиты от пандемического вируса H1N1, смертельно опасного для мыши. Здесь мы показываем, что вакцинация мышей с VLP вируса гриппа человека 1918 и инактивированный человеческий Вей / 43 и классический вирус свиней H1N1 полностью защищает от смерти летальным заражением с пандемией H1N1 в 2009 году. Кроме того, анализ сывороток перед заражением от мышей, вакцинированных этими вирусами, за исключением Wei / 43, проявляет кросс-реактивность против вируса H1N1 2009 года (HI-титр ≥40). Напротив, вакцинация более современными вирусами H1N1 предлагала лишь частичную защиту. Кроме того, пассивная иммунизация с 1918 HA-специфическими моноклональными антителами защищает от вируса H1N1 2009 года, указывая на антигенное сходство между этими вирусами. Кросс-защитное отображение эпитопов показывает, что 1918 HA-специфичные mAb защищают путем связывания с консервативным антигенным сайтом Sa в 2009 году вирусом H1N1. Основываясь на наших данных HI (таблица 2), и поскольку известно, что инактивированные вакцины вызывают защитный гуморальный и минимальный клеточный иммунитет, эта защита, вероятно, опосредована антителами, что также подтверждается отсутствием полной защиты вакцинами на основе H3N2. Наши результаты показывают, что предварительное воздействие вирусов гриппа A человека с 1918 по 1944 год или вакцинация классическим вирусом свиного H1N1 (NJ / 76) обеспечивает значительные уровни перекрестной защиты от нового пандемического вируса H1N1 2009 года и, таким образом, обеспечивает механистическое объяснение более низкого заболеваемость и / или инфекция, наблюдаемые у людей в возрасте 65 лет и старше.

Обычно человеческие вирусы гриппа не демонстрируют существенной репликации у мышей без предварительной адаптации к этому хозяину [36]. Показано, что только несколько вирусов, включая 1918 и высокопатогенные вирусы H5N1, эффективно реплицируются и вызывают тяжелую патогенность [38]. Текущая пандемия H1N1 в 2009 году показывает активную репликацию и патогенез у мышей. Однако, по-видимому, существуют различия в патогенности и передаче изолятов H1N1 2009 года на разных моделях животных [39], [40], [41]. В этом исследовании мы установили летальную модель мыши для пандемического вируса H1N1 2009 года и продемонстрировали различия между вирусами Cal / 09 и Neth / 09 с точки зрения вирулентности мыши. Мыши, инфицированные Neth / 09, показали раннюю и драматическую потерю массы тела и поддались инфекции или достигли экспериментальной конечной точки к 6-му дню (фиг.1B и C, фиг.2A и B). Вирусы Cal / 09 и Neth / 09 были изолированы от людей, проявляющих легкие симптомы верхних дыхательных путей, и их геномы отличаются только в восьми положениях аминокислот [39], [40]. Причины различий в вирулентности мыши между этими двумя изолятами остаются неясными. Несмотря на эти различия, антигенность на основе перекрестной реактивности HI между двумя изолятами вируса аналогична. Это согласуется с недавними сообщениями Всемирной организации здравоохранения, в которых говорится, что все в настоящее время циркулирующие штаммы пандемии H1N1 2009 года являются антигенно подобными (www.who.int).

Хотя на данный момент мы не можем исключить возможность того, что белок NA, по крайней мере частично, способствовал защите, наблюдаемой с инактивированными вакцинами, наши результаты исследований пассивной иммунизации и вакцинации показывают, что вирусы H1N1 человека от или до 1943 года, включая 1918, имеют общий защитный эпитоп (ы) в белке НА. Антигенные сайты вируса гриппа HA были широко охарактеризованы исследованиями картирования эпитопов моноклональных антител [32], [42]. Интересно, что выравнивание последовательностей HA с 1918, Sw / 30, NJ / 76 и 2009 вирусов H1N1 показало высокую степень сходства в известных антигенных сайтах (рис.5, дно). Для дальнейшего понимания антигенной связи между вирусами H1N1 1918 и 2009 годов мы сравнили структуру 1918 HA с предсказанными структурами HA Cal / 09 и Bris / 59/07 (Swiss-Model, фиг.6A). Очевидно, что области глобулярной головки HA, которые содержат известные антигенные сайты, имеют близкое сходство между вирусами Cal / 09 и 1918 (фиг.6A и B). Однако антигенные сайты в Bris / 59/07 HA содержат несколько аминокислотных изменений по сравнению с 1918 HA (о чем свидетельствует большее количество остатков красного цвета, фиг.6B, верхняя панель). Это подтверждается анализом сывороток перед заражением от мышей, вакцинированных VLP 1918 г., которые показывают высокую перекрестную реактивность против вируса H1N1 2009 г. (таблица 2). Несмотря на то, что вакцина Вэй / 43 обеспечила полную защиту от смерти, Вей / 43 HA демонстрирует меньшее сходство последовательностей с H1N1 HA 2009 года в антигенных сайтах по сравнению с 1918 годом, а сыворотки от вакцинированных животных Wei / 43 не проявили перекрестной реактивности с H1N1 в 2009 году вирусов путем анализа HI (фиг.5, таблица 2). В соответствии с нашими выводами, вакцинированные животные Wei / 43 проявили большую заболеваемость и более высокие титры вируса после заражения Neth / 09, чем мышей, вакцинированных Cal / 09 и 1918. Таким образом, Wei / 43, по-видимому, имеет несколько уменьшенный защитный эффект, предполагая, что циркуляция вирусов H1N1 у людей в течение примерно двух десятилетий (после пандемии 1918 года) приводила к достаточному дрейфу, что приводило к значительной потере антигенной перекрестной реактивности. Поэтому можно было бы предсказать, что вирусы H1N1, распространенные в популяции людей за пределами 1950-х годов, практически не защитят от пандемии H1N1 в 2009 году. Хотя существует корреляция между идентичностью последовательности в антигенных сайтах и ​​защитой, возможно, что некоторые изменения в антигенных сайтах могут не способствовать общим изменениям антигенности. В отличие от 1918 года и классических вирусов свиней H1N1, выравнивание H1N1 2009 с H1N1 HA от вирусов, выделенных у людей после 1977 года, показало значительные различия в антигенных сайтах, особенно в сайтах Sa и Sb (фиг.6A, сверху). Это согласуется с нашими результатами, показывающими, что современные вакцины против вируса H1N1 предлагали частичную защиту у мышей против Neth / 09, а выжившие мыши проявляли большую заболеваемость, о чем свидетельствует более драматичная и устойчивая потеря веса (рис. 3D). Интересно, что два из последних вирусов, Tx91 и Hou / 84, показали почти 60% защиты от смерти у мышей до Neth / 09. Однако причины этой лучшей частичной защиты, предлагаемой этими двумя вирусными вакцинами, неясны. Тем не менее аналогичная частичная защита от летальной проблемы ранее была описана для антигенно различных вирусов H1N1 [43]. Механизм этой частичной защиты неясен и предположительно в значительной степени обусловлен иммунитетом против HA [43]. Кроме того, мы не можем полностью исключить возможные роли опосредованного Т-клеточным иммунитетом или анти-NA-специфических антител [44], [45], [46], [47], [48]. Это требует дальнейшего расследования.

Чтобы охарактеризовать антигенное сходство, мы создали mAb против HA вирусов H1N1 1918 и 2009 годов. Интересно отметить, что два 1918 HA-специфичных mAb, 6B9 и 39E4 и один mA / 29E3 с Cal / 09 HA, 29E3, показали активность HI против вируса VLP 1918 и Cal / 09 (таблица 4). Пассивная иммунизация мышей с 1918 HA-моноклональными антителами давала полную защиту от летального испытания Neth / 09 и 100-1000-кратное снижение вирусных титров в нижнем дыхательном пути мышей. Однако мы заметили потерю массы тела, начиная с 4-6 дня и увеличение титров легких на 6-й день, вероятно, из-за уменьшения уровней нейтрализующих антител в сыворотке. В случае поликлональной обработки сыворотки титры HI в крови до заражения были в 4 раза ниже, чем лечение моноклональными антителами. В соответствии с нижним титром HI мы наблюдали начальное снижение массы тела до 4 дней после Neth / 09. Все эти мыши начали восстанавливать вес к 5-му дню. Несмотря на более низкие титры HI в сыворотке перед заражением, у мышей, обработанных поликлональными сыворотками, были титры легких в 1000 раз ниже контрольных мышей. Это может быть связано с действием специфических антител NA, которые, как было продемонстрировано, играют защитную роль [46] и других HA-специфических антител без активности HI. Способность 1918 HA специфических антител нейтрализовать пандемию H1N1 в 2009 году также подтверждает тесную антигенную связь этих вирусов. Действительно, путем генерирования мутантных мутантов антител Cal / 09 мы сопоставили антигенный сайт Sa как перекрестно-реактивный эпитоп (табл. 5 и фиг.6B). В целом, это свидетельствует о более медленных темпах антигенного дрейфа классических вирусов свиней H1N1 с момента их введения в популяцию свиней более 90 лет назад, скорее всего, из-за отсутствия ранее существовавшего иммунитета у большинства этой популяции.

В 1976 году вирус H1N1, тесно связанный с классическими штаммами H1N1 свиней с 1930-х годов, вызвал вспышку гриппа на американском военном объекте в Форт-Диксе в штате Нью-Джерси. После вспышки свиней H1N1 1976 года около 40 миллионов человек в Соединенных Штатах были вакцинированы вакциной NJ / 76. Наше исследование на мышах, согласующееся с предыдущей серологией, проведенной с сывороточными сыворотками [49], показывает, что иммунизация вакциной NJ / 76 защищена от летального заражения пандемией H1N1 2009 года, и поэтому вполне вероятно, что люди, несущие антитела против NJ / 76, будут защищены от H1N1 2009 года. Кроме того, сыворотки взрослых, иммунизированных вакциной NJ / 76, перекрестно нейтрализовали H1N1 в 2009 году [27].

Два последних исследования серологии человека показали высокую распространенность нейтрализующих антител против пандемического H1N1 в 2009 году у людей, родившихся до 1930 года [28], [39]. Наши данные показывают, что иммунизация вирусами H1N1 человека, циркулирующих до 1945 года (например, специфические антитела против 1918 и Вэй / 43), достаточна для иммунной защиты от пандемии H1N1 в 2009 году. Эти данные дают обоснование эпидемиологическим данным, происходящим из разных частей мира, которые указывают на неизменно более высокий уровень инфицирования этим новым вирусом у более молодого населения (менее 35 лет) из-за отсутствия предыдущего воздействия какого-либо из связанные с антигеном вирусы, описанные выше. Таким образом, эти результаты в значительной степени подчеркивают, что усилия по вакцинации и ресурсы также должны быть направлены на это восприимчивое население.

Наши данные согласуются с картиной, в которой отечественные свиньи служили резервуаром для «антигенно замороженного» гемагглютинина H1, полученного из вируса гриппа 1918 года. Значительный дрейф у людей того же вируса H1N1 1918 года привел к отсутствию значительного ранее существовавшего иммунитета против пандемического вируса H1N1 в 2009 году у людей, рожденных после 1940-50-х годов. В связи с этим вирусы свиного гриппа, содержащие гены HA, полученные из более современных вирусов H3 и H1 человека, также установили линии у североамериканских свиней в 1997-1998 и 2003-2005 годах, соответственно [13]. Кроме того, человеческие вирусы H3 установили стабильные линии в популяциях европейских свиней после пандемии 1968 года в Гонконге и все еще циркулируют в виде вирусов-реассортантов H3N2 человека-птичьего гриппа [50]. Возможно, что эти новые вирусы свиней также останутся «антигенно замороженными», что приведет к потенциальным пандемическим вирусам H3 и H1 человека в будущем [51], [52]. Таким образом, наблюдение и сдерживание вирусов свиного гриппа желательно для предотвращения будущих эпизодов пандемии.

Мы хотели бы поблагодарить CDC за предоставление нам вируса гриппа A / California / 04/09 R. Fouchier за предоставление нам вируса гриппа A / Netherlands / 602/09 и Y. Kawaoka за предоставление нам vRNA из A / California / 04/09. Мы хотели бы поблагодарить John Steel и Anice Lowen за растущие запасы изолята A / Netherlands / 602/09. Мы благодарим Tom Moran и MSSM Hybridoma за консультацию и помощь в создании моноклональных антител. Мы хотели бы поблагодарить Ричарда Кадагана и Констанцу Мартинес-Вальдебенито за бесценную и отличную техническую помощь в ходе этого исследования, а также Горького Эстрелу, Уильяма Прессли и сотрудников CCMS в MSSM для содействия исследованиям на животных.

Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов.

Эта работа была частично поддержана CRIP, финансируемым NIAID Центром исследований по патогенезу гриппа (контрактный номер HHSN266200700010C), AI058113 и Центром исследования вирусной иммунитета и антагонизма (NIH 3 U19 AI062623-05S1). Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *