Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Осаждение нерастворимого эластина легочными фибробластами у пациентов с ХОБЛ увеличивается путем лечения вириканской siRNA

Deposition of insoluble elastin by pulmonary fibroblasts from patients with COPD is increased by treatment with versican siRNA
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5238801/

Уменьшенное содержание альвеолярных эластичных волокон является ключевой особенностью легкого ХОБЛ. Несмотря на сохраняющийся эластогенный потенциал альвеолярными фибробластами в легком, страдающем ХОБЛ, восстановление эластичных волокон не происходит, что связано с увеличением уровней хондроитинсульфат-протеогликана, который ингибирует сборку тропоэластина в волокна. В этом исследовании первичные линии клеток фибробластов легких у пациентов с ХОБЛ и не-ХОБЛ были обработаны небольшой интерферирующей РНК (siRNA) против версаля, чтобы определить, может ли нокаутинг версальца восстановить осаждение нерастворимого эластина. Версациновая siRNA-терапия уменьшала экспрессию и секрецию легочных фибробластов как у пациентов с ХОБЛ, так и у пациентов без COPD (P <0,01) и значительно увеличивала осаждение нерастворимого эластина в культурах клеток COPD (P <0,05). Лечение, однако, не оказало существенного влияния на продукцию растворимого эластина (тропоэластина) в культурах ХОБЛ или не-ХОБЛ, поддерживая роль версальца в ингибирующей сборке, но не синтез тропоэластина. Эти результаты показывают, что удаление или нокдаун versican может быть возможной терапевтической стратегией для увеличения осаждения нерастворимого эластина и стимулирования восстановления эластичных волокон в легких ХОБЛ.

ХОБЛ характеризуется необратимой обструкцией воздушного потока в небольших дыхательных путях, 1,2, как считается, в основном обусловлены эмфизематовыми изменениями, в которых происходит потеря эластичных волокон в альвеолярных стенках и последующее разрушение альвеол, что, в свою очередь, приводит к потере альвеолярные насадки на небольшие дыхательные пути. Считается, что это приводит к краху небольших дыхательных путей при истечении срока годности, что затем приводит к обструкции воздушного потока.3 Болезнь продолжается, и механизмы восстановления, по-видимому, в значительной степени блокируются. Наше предыдущее исследование обеспечивает поддержку идеи о том, что потеря механизмов восстановления может иметь важное значение для развития и прогрессирования ХОБЛ. Легочные ткани пациентов, подвергшихся лобэктомии при бронхиальной карциноме, анализировали иммуногистохимически. Некоторые из этих людей (которые были текущими или бывшими курильщиками) имели нормальную функцию легких, в то время как остальная часть была легкой и умеренной ХОБЛ. Мы обнаружили, что содержание эластина было значительно снижено в легочной ткани пациентов с ХОБЛ и в зависимости от объема принудительного выдоха за 1 секунду (FEV1) 4 и, соответственно, а также в зависимости от FEV1, увеличение матрицы протеогликанов. 5 Это актуально, поскольку, как было показано, исповедник препятствует сборке эластичных волокон в культурах фибробластов6 и гладкомышечных клеток7 и в сосудах in vivo7,8. Наши данные о легких согласуются с идеей о том, что пациенты с ХОБЛ имеют уменьшенную емкость для образования новых эластичных волокон, несмотря на способность синтезировать растворимый предшественник эластина тропоэластина.9

Versican — это большой протеогликан хондроитинсульфата (CS) с молекулярной массой> 1000 кДа. Он секретируется многочисленными клетками, включая фибробласты легких, и взаимодействует с различными партнерами по связыванию.11 Существует по меньшей мере четыре изоформы, такие как V0, V1, V2, V3; центральный домен V0 содержит две GAG-связывающие домены, α и β; V1 имеет только GAG-β-домен; V2 имеет только область GAG-α; и V3 лишен обеих областей присоединения GAG.12 Три изоформы, которые обладают цепями GAG (V0, V1 и V2), ингибируют сборку тропоэластина на микрофибриллярный каркас из эластичных волокон путем связывания с EBP. EBP представляет собой рецептор, который сопровождает тропоэластин через гольджи на поверхность клетки, но в присутствии CS-содержащих версальских изоформ или цепей CS только тропоэластин преждевременно высвобождается перед сборкой и сшиванием на микрофибриллярных каркасах.13

В предыдущем исследовании мы сообщали, что паренхима легких у пациентов с ХОБЛ с легкой до умеренной степени прогрессивно увеличивала иммуноокрашивание для versican и соответственно уменьшала иммуноокрашивание для EBP с уменьшением ОФВ1.5. В этом исследовании мы предложили, чтобы повышенные уровни большого CS-содержащие версальские варианты могут объяснить отсутствие ремонта эластичных волокон в легких пациентов с умеренной ХОБЛ.

В последующем исследовании легочные фибробласты культивировали из эксплантов легочной ткани, полученных от 20 пациентов, перенесших операцию по резекции бронхиальной карциномы. Мы обнаружили значительное увеличение экспрессии млекопитающих мексиканской РНК (мРНК) с помощью фибробластов ХОБЛ по сравнению с контролем без ХОБЛ. Секретированные уровни versican также были увеличены в супернатантах от фибробластов COPD по сравнению с контрольными 13. Растворимый эластин также был увеличен в культурах ХОБЛ, но, однако, не было различий между ХОБЛ и контрольными группами на уровнях нерастворимого эластина, что указывает на что повышенная секреция тропоэластина фибробластами ХОБЛ не привела к осаждению эластина, что согласуется с увеличением экспрессии и секреции версиса. Таким образом, Versican может сыграть ключевую роль в поддержании обструктивного состояния и ингибировании восстановления ХОБЛ легкого, препятствуя сборке эластичных волокон. Удаление версальца может предложить новую стратегию стимулирования эффективного ремонта13.

В этом исследовании мы исследовали влияние малой интерферирующей РНК (siRNA) на эластогенез и показали, что нокдаун versican увеличивает осаждение нерастворимого эластина легочными фибробластами у пациентов с ХОБЛ.

В общей сложности 12 линий криоконсервированных и охарактеризованных легочных фибробластов культивировали из тканей легких 12 пациентов, полученных во время операции по бронхиальной карциноме. Шесть пациентов группы без COPD имели нормальную функцию легких (FEV1> 80% и FEV1 / жизненная емкость [VC]> 0,7), а шесть пациентов из группы COPD имели ХОБЛ от легкой до умеренной степени (FEV1 <80% и FEV1 / VC <0,7). Для каждого пациента фибробласты первоначально получали культурой эксплантата из периферических частей резецированной доли, удаленной от опухоли. Все клеточные линии оценивали иммуногистохимически (виментин), чтобы подтвердить, что> 99% клеток были фибробластами. Для экспериментов использовались ячейки проходов 3-5. Исследование было одобрено Региональным комитетом по этике Северной X, Министерством здравоохранения. Письменное информированное согласие на разрешение использовать легочную ткань для исследования было получено до операции.

Все клеточные линии культивировали до слияния в течение 7 дней в 24-луночных планшетах культуральной среды. Измененная среда Игл Дульбекко (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), дополненная 10% фетальной телячьей сывороткой, пенициллином (100 нг / мл) и стрептомицин (100 нг / мл). Конфлуэнтные культуры обрабатывали siRNA следующим образом. Молекулы Stealth siRNA-Lipofectamine® были подготовлены непосредственно перед трансфекцией в соответствии с инструкциями изготовителя (Stealth siRNAs для versican HSS175421, HSS175422, HSS175423 [Thermo Fisher Scientific], предназначенные для всех изоформ). Lipofectamine® (Thermo Fisher Scientific) осторожно смешивали перед использованием и добавляли в соотношении 1: 100 с Opti-MEM® Medium (Thermo Fisher Scientific) без сыворотки. Интерферометрия Stealth ™ также добавляли в ту же среду в соотношении 900 пмоль / 1,5 мл. Комплексный раствор осторожно перемешивали и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование комплекса. Всего в каждую лунку добавляли 0,5 мл комплексного раствора и 1 мл нормальной культурной среды (без сыворотки). Пластину осторожно перемешивали путем качания. Затем клетки инкубировали в течение 24 часов при 37 ° С в инкубаторе CO2, а сложную среду заменяли обычной культуральной средой для этих лунок, продолжавшихся для последующих обработок.

Для каждой из 12 клеточных линий четыре лунки обрабатывали только один раз раствором для трансфекции (на 8-й день), четыре лунки обрабатывали на 8-й день и снова через 1 неделю (на 15-й день) и четыре лунки обрабатывали на 8-й день , 15 и 22. В каждый момент времени две обработанные лунки и дублированные необработанные контрольные лунки собирали через 24 часа после каждой трансфекции (в дни 9, 16 и 23) для анализа экспрессии генов. В то же время среду собирали для определения уровней белка версальца и тропоэластина (растворимого эластина). Чтобы определить влияние обработки siRNA на нерастворимые уровни эластина, дублирующие лунки для каждой из 12 линий обрабатывали три раза в дни 8, 15 и 22, со средними изменениями в дни 9, 16 и 23 и культивировали до 28 дня, чтобы позволить время осаждения эластина.7,8. Как срединный, так и клеточный слои собирали и объединяли для анализа уровней нерастворимого эластина. Дублированные необработанные контрольные культуры для каждой линии также собирали на 28-й день.

экспрессию мРНК версальца и эластина измеряли в режиме обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции SYBR Green в режиме реального времени, как описано ранее.13 Используемые пары праймеров были следующими: эластин 5′-TCT GAG GTT CCC ATA GGT TAG GG-3 ‘(вперед праймер) и 5’-CTA AGC CTG CAG CAG CTC CT-3 ‘(обратный праймер) и versican 1 5′-CCC AGT GTG GAG GTG GTC TAC-3′ (прямой праймер) и 5’-CGC TCA AAT CAC TCA TTC GAC GTT-3 ‘(обратный праймер). Уровни тропоэластина и версальские уровни в супернатанте культуры измеряли с помощью набора человеческих версанов ELISA Kit (Cusabio) и Fastin Elastin Assay (Biocolor) соответственно. Вкратце, для версальских уровней, предварительно покрытое антитело, специфичное для версальца, было предоставлено на микропланшет. Стандарты и образцы пипетировали в лунки, а версальцы были связаны иммобилизованным антителом. После удаления любых несвязанных веществ в лунки добавляли антитело, конъюгированное с биотином, специфичное для версальца. После промывки в лунки добавляли авидин-конъюгированный HRP. После промывки для удаления любого несвязанного авидин-ферментного реагента в лунки добавляли раствор субстрата с цветом, выраженным пропорционально количеству версальца, связанного на начальной стадии. Развитие цвета прекращалось, и измерялась интенсивность цвета. Нерастворимый эластин определяли с помощью анализа Fastin Elastin в соответствии с инструкциями производителя.

Все статистические анализы были выполнены с использованием GraphPad Prism v5.0, и был проведен односторонний анализ дисперсии с последующим post-hoc-тестом Бонферрони, чтобы определить, являются ли различия между группами статистически значимыми. Дублирующие значения для каждой линии клеток в каждый момент времени для всех определений были усреднены, чтобы обеспечить n = 6 для линий COPD и n = 6 для линий без COPD. Различия считались значимыми на уровне P <0,05.

Культуры легочных фибробластов пациентов с ХОБЛ и не-ХОБЛ культивировали в течение 4 недель и лечили на 8, 15 и 22 дни с помощью вирициновой сиРНК. Клетки собирали через 24 часа после каждой обработки для измерения уровня мексиканской мРНК. До первого лечения экспирическое выражение было немного (P> 0,05) выше в фибробластах пациентов с ХОБЛ по сравнению с культурами, не контролирующими ХОБЛ. После первого и второго обработок сиРНК экспрессия в группе ХОБЛ постепенно уменьшалась, но не достигла значимости до третьей обработки (уменьшилась на 24,1%, P <0,01; Рисунок 1). Аналогичным образом, экспрессия в культурах без COPD значительно снижалась после третьего лечения по сравнению с до лечения (P <0,01; фиг. 1).

Уровни Versican в супернатанте культивируемых первичных легочных фибробластов измеряли с помощью иммуноферментного анализа с ферментным связыванием на 9, 16 и 23 дни. Уровни Versican постепенно снижались после первой, второй и третьей ретикулярных обработок siRNA по сравнению с уровнем до лечения (рисунок 2 ), а для обеих групп снижение уровня версальца достигло значимости после третьего лечения (Р <0,05).

Репликация siRNA Versican не оказывала существенного влияния на экспрессию мРНК тропоэластина с помощью ХОБЛ и клеток без COPD (P> 0,05, Рисунок 3) и аналогично из-за изменчивости внутри групп не оказывала существенного влияния на уровни растворимого эластина (тропоэластина) в обеих группах (P> 0,05; фиг. 4) до 23 дней. Линии ХОБЛ, обработанные три раза с помощью сиРНК, на 8, 15 и 22 дни, а затем культивирование до 28 дней, показали значительное увеличение содержания нерастворимого эластина по сравнению с необработанными контрольными средствами (Р <0,05). Нерастворимый эластин существенно не увеличивался в группе, не получавшей COPD (рисунок 5). Среднее увеличение нерастворимого эластина в обработанных культурах пациентов с ХОБЛ составило 28,3% по сравнению со средней базовой величиной.

ХОБЛ характеризуется потерей эластичных волокон в альвеолярных стеной и небольших дыхательных путях, а уменьшение эластина коррелирует с увеличением тяжести заболевания, как измерено FEV1.5. Аналогично, и обратно к содержанию эластина увеличение степени тяжести заболевания связано с увеличением содержания виолончелистов в ХОБЛ легкого. Важно отметить, что изменения в EBP-треке с эластином. Hallgren et al. 14 и Larsson-Callerfelt et al. 15 также сообщали о том, что фибробласты (дистально полученные) из пациентов с ХОБЛ имеют более высокую версию виолончели и предлагают, чтобы повышенные уровни версана могли отрицательно влиять на эластичную отдачу в легких ХОБЛ. Многочисленные экспериментальные исследования продемонстрировали важность версальца с его цепями CS в качестве ингибитора сборки эластичных волокон.6-9 Высокие уровни версальцев, вероятно, играют ключевую тормозную роль в восстановлении легких ХОБЛ, препятствуя образованию новые эластичные волокна и удаление версальца могут предложить новую стратегию стимулирования эффективного ремонта.

В этом исследовании мы показываем, что обработка вирификационной siRNA снижает экспрессию мРНК (p <0,01) и продукцию (P <0,05) в легочных фибробластах пациентов с ХОБЛ и не-ХОБЛ, не оказывает существенного влияния на продукцию растворимого эластина (тропоэластина) в COPD или не-COPD клеточные линии (P> 0,05) и увеличивает уровень нерастворимого эластина при ХОБЛ (Р <0,05), но не клеточных линий без COPD.

В то время как увеличение нерастворимого эластина было умеренным (~ 30%), а также уменьшением секретируемого версальца в культуральной среде (~ 24,1%), эти данные согласуются с ингибированием EBP-опосредованной сборки эластичных волокон версальцем. В этой модели перицеллюлярная CS, как компонент versican, связывается с EBP, неактивным вариантом β-галактозидазы и вызывает преждевременное высвобождение тропоэластина перед сборкой на микрофибриллярный каркас развивающихся волокон.16 Нокдаун versica siRNA уменьшает синтез и секрецию виоланцев, как это произошло как для клеточных линий ХОБЛ, так и для не-COPD, и создает более разрешающую среду на поверхности клетки для сборки эластичных волокон. Отсутствие значительного эффекта, несмотря на изменчивость, на мРНК тропоэластина и растворимого эластина, не противоречит этой модели, поскольку эти меры не обязательно предсказывают нерастворимое содержание эластина в тканях, которое определяется факторами, в том числе скорее, чем синтез, связанный с византинами, а не синтез. В некоторых ситуациях, особенно в эмфизематной легочной ткани9 и в неоинтиме сосудов после баллонной ангиопластики, 17 сообщений о тропоэластине значительно повышается без увеличения осаждения эластина.

Относительно небольшое снижение секретируемого versican (~ 24,1%) согласуется с увеличением нерастворимого эластина и может отражать неэффективность нокдауна siRNA. Снижение версальского сообщения было заметно больше, чем уменьшение секретированного версаля. Уровни сообщений, однако, в широком диапазоне органов и клеток часто не сильно коррелируют с концентрациями белка.18

В других исследованиях сообщалось об эластогенном воздействии интерференции экспрессионизма. Huang et al. 19 сообщали, что ретровирусная сверхэкспрессия versic-антисмысловой последовательности гладкомышечными клетками значительно уменьшала выработку вистанов, индуцировала сплюснутую морфологию, уменьшала пролиферацию и миграцию клеток, увеличивал синтез тропоэластина, увеличивал EBP и, что самое важное, увеличивал осаждение эластичных волокон в длительно- а также in vivo в неоинтиме в модели баллонного катетера поврежденной стенки артерии.19 Аналогичным образом, та же группа обнаружила, что сверхэкспрессия варианта V-образного варианта V3, вариант, в котором отсутствуют цепочки CS и не имеющий больших цепей, вызывает аналогичные изменения7,20 и, в частности, уменьшает количество версальца V0 / V1 в клеточном слое клеток гладкой мускулатуры в культуре и в артериальной стенке, что было обнаружено для облегчения сборки эластичных волокон. Предостережение об использовании эластогенных технологий для восстановления эластина в легких заключается в том, что чрезмерное осаждение нерастворимого эластина может оказать пагубное влияние на расширение легких во время вдоха; таким образом, если показано, что он эффективен, тогда лечение может потребоваться титрование.

Еще одно предупреждение для исследования — источник клеток пациентов с бронхиальной карциномой на стадии, достаточной для хирургической резекции. В то время как фибробласты легких культивировали из паренхимы, полученной на расстоянии от опухолей, опухолевые клетки продуцировали versican21, а версаль может быть увеличен в соседней паренхиме.22 Однако фибробласты были получены у пациентов с ХОБЛ и без них, но все с карциномами. Хотя мы не можем утихать дифференциальные эффекты между группами из-за изменчивости морфологии карциномы или метаболизма между этими двумя группами, основной вывод повышенного нерастворимого эластина в результате нокдауна версальца остается вне зависимости от первоначальных стимулов к секреции версальца паренхимными фибробластами.

Мы сообщаем, что нокдаун siRNA экспрессией версальцев первичными фибробластами легких у пациентов с ХОБЛ ингибирует продукцию versican и усиливает осаждение нерастворимого эластина. Эти результаты свидетельствуют о том, что уменьшение количества больших протеогликанов, которые увеличиваются в легких ХОБЛ, может предложить новую стратегию стимулирования эффективного восстановления эмфизематозного легкого.

Эта работа была поддержана Фондом медицинских исследований Auckland (грант № 1110016). Эта статья посвящена нашему близкому другу и наставнику профессору Питеру Блэку, который внезапно умер в январе 2010 года. Питер сыграл важную роль в концепции и дизайне этого исследования. Его смерть по-прежнему является огромной потерей для нас лично и для исследовательского сообщества ХОБЛ.

раскрытие

Авторы не сообщают о конфликте интересов в этой работе.

Относительная экспрессия мРНК versican культивированными фибробластами легких у пациентов с ХОБЛ (n = 6) и без ХОБЛ (без COPD; n = 6).

Примечания: (A) Необработанные конфлюэнтные культуры от пациентов с ХОБЛ и пациентов без COPD, отобранных на 9-й день, по сравнению с культурами, обработанными siRNA (COPD-T и non-COPD-T). Культуры обрабатывались только один раз в день 8. (B) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD дважды обрабатывались в дни 8 и 15 и день отбора проб 16. (C) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD обрабатывались три раза в день 8, 15 и 22 и день выборки 23. Графы в блоке показывают средние, нижние квартили и верхние квартили значения и диапазоны. Вертикальная siRNA-терапия подавляла экспрессию экспрессии в обеих клетках ХОБЛ и не-COPD (P <0,01).

Сокращения: siRNA, малая мешающая РНК; мРНК, мессенджер РНК.

Версациновые уровни в супернатантах культивируемых фибробластов легких у пациентов с ХОБЛ (n = 6) и без ХОБЛ (без COPD; n = 6).

Примечания: Уровни Versican определяли в супернатантах, собранных через 24 часа после добавления окончательной обработки siRNA, на дни 9, 16 и 23. Репликация siRNA Versican подавляла версальские уровни как в клеточных линиях ХОБЛ, так и вне COPD (P <0,05). (A) Необработанные конфлюэнтные культуры пациентов с ХОБЛ и пациентов без COPD, отобранных на 9-й день, по сравнению с культурами, обработанными siRNA (COPD-T и non-COPD-T). Культуры обрабатывались только один раз в день 8. (B) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD дважды обрабатывались в дни 8 и 15 и день отбора проб 16. (C) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD обрабатывались три раза в день 8, 15 и 22 и день отбора проб 23.

Аббревиатура: siRNA, малая мешающая РНК.

Относительная экспрессия мРНК тропоэластина легочными фибробластами у пациентов с ХОБЛ (n = 6) и без COPD (non-COPD; n = 6).

Примечания: Уровни сообщений определяли через 24 часа после окончательной обработки siRNA за каждый период времени. Графики коробки показаны на рисунке 1. Вертикальная обработка siRNA не оказывала существенного влияния на экспрессию тропоэластина в клеточных линиях ХОБЛ или без COPD. (A) Необработанные конфлюэнтные культуры пациентов с ХОБЛ и пациентов без COPD, отобранных на 9-й день, по сравнению с культурами, обработанными siRNA (COPD-T и non-COPD-T). Культуры обрабатывались только один раз в день 8. (B) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD дважды обрабатывались в дни 8 и 15 и день отбора проб 16. (C) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD обрабатывались три раза в день 8, 15 и 22 и день отбора проб 23.

Сокращения: siRNA, малая мешающая РНК; мРНК, мессенджер РНК.

Растворимые уровни эластина в супернатантах культур фибробластов у пациентов с ХОБЛ (n = 6) и без ХОБЛ (без COPD; n = 6).

Примечания: Уровни растворимого эластина определяли в супернатантах, собранных через 24 часа после окончательной обработки siRNA. Вертикальная siRNA-обработка не оказывала существенного влияния на уровни растворимого эластина в клеточных линиях ХОБЛ или не-ХОБЛ. (A) Необработанные конфлюэнтные культуры пациентов с ХОБЛ и пациентов без COPD, отобранных на 9-й день, по сравнению с культурами, обработанными siRNA (COPD-T и non-COPD-T). Культуры обрабатывались только один раз в день 8. (B) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD дважды обрабатывались в дни 8 и 15 и день отбора проб 16. (C) Необработанные и обработанные ХОБЛ и культуры без COPD обрабатывались три раза в день 8, 15 и 22 и день отбора проб 23.

Аббревиатура: siRNA, малая мешающая РНК.

Нерастворимые уровни эластина в культурах фибробластов легких у пациентов с ХОБЛ (n = 6) и без ХОБЛ (не-ХОБЛ; n = 6).

Примечания. Культуры либо не обрабатывались (ХОБЛ, но и не ХОБЛ), либо лечились (ХОБЛ-Т и не-ХОБЛ-Т) три раза (в дни 8, 15 и 22) с виктерианской siRNA. Все культуры выдерживали в течение 28 дней, чтобы дать время для осаждения эластина до сбора слоев клеток и среды (объединенной) для анализа. Вертикальная siRNA-обработка значительно повышала уровень нерастворимого эластина в клеточных линиях ХОБЛ (P <0,05).

Аббревиатура: siRNA, малая мешающая РНК.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *