Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

NOS2 имеет решающее значение для развития эмфиземы у пациентов с дефицитом Sftpd, но не влияет на гомеостаз поверхностно-активных веществ

NOS2 Is Critical to the Development of Emphysema in Sftpd Deficient Mice but Does Not Affect Surfactant Homeostasis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3897517/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: LK MO ENAV MFB AJG. Выполнены эксперименты: LK MO ENAV MFB CJG PS BH AJG. Проанализированы данные: LK MO ENAV MFB CJG PS AJG. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: ENAV MFB AJG. Написал документ: LK MO ENAV MFB AJG.

Поверхностно-активный белок D (SP-D) обладает важными иммуномодулирующими свойствами. Отсутствие SP-D приводит к индуцибельной NO-синтазе (iNOS, кодируемой геном NOS2), связанному с хроническим воспалением, развитию эмфиземы-подобной патофизиологии и изменениям гомеостаза поверхностно-активных веществ.

Чтобы проверить гипотезу о том, что аномалии, связанные с дефицитом SP-D в структуре и функции легких, являются следствием индуцированного iNOS воспаления, мы сгенерировали двойные нокаутные мыши SP-D и iNOS (DiNOS).

Структурные данные, полученные с помощью стереоизображений на основе конструкции для количественной оценки фенотипа, подобного эмфиземе, и нарушений внутриклеточного поверхностно-активного вещества, были сопоставлены с инвазивными легочными функциональными тестами и воспалительными маркерами, включая маркеры активации альвеолярных макрофагов и по сравнению с SP-D (Sftpd — / -) и iNOS одиночные нокаутные мыши (NOS2 — / -), а также однопометники дикого типа (WT).

У мышей DiNOS были снижены воспалительные клетки в БАЛ, а альвеолярные макрофаги, полученные из БАЛ, показали повышенную экспрессию маркеров альтернативной активации, а также уменьшенное воспаление. Как свидетельствуют увеличенные альвеолярные числа и площадь поверхности, эмфизематные изменения были ослаблены в DiNOS, в то время как нарушения системы поверхностно-активных веществ практически не изменились. Sftpd — / — продемонстрировал изменения собственных механических свойств паренхимы легкого, как показано уменьшенной жесткостью и сопротивлением в своих статических пределах, что можно было бы скорректировать путем дополнительной абляции гена NOS2 в DiNOS.

Связанное с iNOS воспаление в отсутствие SP-D участвует в эмфизематовом ремоделировании, приводящем к потере альвеол и связанных изменениях упругих свойств паренхимы легкого, в то время как нарушения гомеостаза поверхностно-активных веществ опосредуются различными механизмами.

Surfactant Protein D (SP-D) является членом надсемейства сборников и участвует в защите врожденного хозяина с хорошо установленными иммуномодулирующими свойствами [1], [2]. Были выявлены потенциальные механизмы и рецепторы, позволяющие этому белку либо затухать, либо усиливать воспалительные процессы в зависимости от местной среды [3], [4], [5]. У мышей с дефицитом SP-D (Sftpd — / -) развиваются ранний эмфизематозный фенотип, гипертрофия и гиперплазия клеток альвеолярного типа II (клетки AE2) и нарушения гомеостаза поверхностно-активных веществ, такие как альвеолярный липопротеиноз, и увеличение количества пластинчатых тел на один тип II эпителиальные клетки дыхательных путей (ячейка AE2) [6], [7], [8], [9], [10]. Накопление пенных появляющихся альвеолярных макрофагов и перибронхиальных и периваскулярных инфильтратов является типичным находкой, которая предшествует ремоделированию легких [6], [11]. Точные механизмы этой патологии не ясны, хотя заместительная терапия со структурными мутантами SP-D или ингибирование индуцируемой изоформы синтазы оксида азота (iNOS, кодируемой геном NOS2) облегчают определенные аспекты [12], [13], [ 14]. В этих исследованиях установлено, что хроническое воспалительное состояние, связанное с iNOS, связано с дефицитом SP-D.

Аберантная альвеолярная активность макрофагов является компонентом воспаления, которое происходит у мышей Sftpd — / -. Наряду с увеличением iNOS наблюдается усиление производства макрофагов активных форм кислорода (ROS) и хемокинов; что дефицит SP-D приводит к увеличению локального потока окислительно-нитрозативного стресса в дистальном легком [11], [15], [16], [17]. Повышенная активность iNOS наблюдается как в макрофагах, так и в клетках AE2 при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) [18], [19]. Окислительно-нитрозативный стресс регулирует активность транскрипционных факторов, связанных с воспалением, таких как NF-κB [20], чья функция приводит к увеличению активности металлопротеиназ 2, 9 и 12 у мышей Sftpd — / -. Поэтому окислительный стресс может быть ключевым медиатором альвеолярного разрушения и последующим развитием эмфизематного фенотипа у мышей Sftpd — / — [12], [15], [21].

Ранее мы изучали влияние ингибирования iNOS ингибитором 1400 Вт [12]. Эфирный эмфизематный фенотип, который развивается у мышей Sftpd — / -, прогрессивен и зависит от возраста и связан с увеличением экспрессии iNOS. Длительное ингибирование iNOS с 3-недельного возраста уменьшает прогрессирующее воспаление, наблюдаемое у мышей Sftpd — / -. Лечение 1400 Вт уменьшает установленное воспаление, но не липопротеиноз при назначении 8-недельным Sftpd — / — мышам. Кроме того, хотя мы смогли наблюдать изменение экспрессии хемокинов, не было определено, изменило ли ингибирование iNOS структурные и функциональные изменения, связанные с потерей SP-D.

Поскольку патология, связанная внутри мышей Sftpd — / -, является прогрессивной, неясно, в каком возрасте она инициируется. Мы предположили, что ранняя потеря NOS2, ослабленные воспалительные процессы, а также структурные и функциональные изменения, наблюдаемые в результате абляции Sftpd. Мы выбрали генетический подход для дальнейшего решения вопроса о роли NOS2 в ремоделировании легких, связанного с Sftpd, путем разработки модели с двойным нокаутом мыши, дефицитной как у SP-D, так и у iNOS (то есть Sftpd — / — / NOS2 — / — мышей). Используя как морфометрические, так и физиологические конечные точки, данные, полученные с помощью этой модели, указывают на то, что воспаление, связанное с iNOS в отсутствие SP-D, отвечает за эмфизематное ремоделирование, приводящее к потере альвеол и связанным с этим изменениям упругих свойств паренхимы легкого

Генерация мышей Sftpd — / — была ранее описана [6], [8], мышей с дефицитом NOS2 (NOS2 — / -) на фоне C57BL / 6 были приобретены у Jackson Laboratories, Inc. (Bar Harbor, ME). Мыши Sftpd — / — и NOS2 — / — были выведены для получения гетерозиготных мышей для Sftpd и NOS2. Двойные гетерозиготные мыши были скрещены для генерации дикого типа (WT), ноль только для SP-D (Sftpd — / -) или только NOS2 (NOS2 — / -), или оба гена Sftpd — / — / NOS2 — / — (DiNOS) , Мышей WT, Sftpd — / — и DiNOS на фоне C57BL / 6 поддерживали и выращивали на объекте по уходу за животными в Университете Рутгерса (Пискатауэй, Нью-Джерси). Эксперименты проводились в возрасте 12 недель. Все протоколы были рассмотрены и одобрены Институциональными комитетами по уходу и использованию животных Университета Пенсильвании и Университета Рутгерса и придерживались принципов Национального руководства по гигиене и использованию лабораторных животных.

Определено общее количество клеток в BALF, а также клеточный дифференциал. Кроме того, были определены большие (LA) и небольшие (SA) агрегаты поверхностно-активного вещества, общее содержание фосфолипидов в LA и SA, а также метаболиты NO. Использовали RT-PCR, чтобы количественно определить маркеры экспрессии генов.

В возрасте 12 недель 5-6 животных фиксировали инстилляцией дыхательных путей с постоянным гидростатическим давлением 25 см H2O, применяя 1,5% -ную смесь глутаральдегида / 1,5% параформальдеида в 0,15 М HEPES-буфере и дополнительно обрабатывали для ориентированной на дизайн стереологии [22 ].

Стереологическая оценка основана на заявлении ATS / ERS о количественной оценке структуры легких [23] (онлайн-приложение). Для количественной оценки фенотипических изменений была определена площадь поверхности альвеолярного эпителия и числовые и средневзвешенные размеры альвеол [24], [25]. Был определен количественный средний объем альвеол, параметр, отражающий также неоднородность расширения воздушного пространства [26]. Внутриклеточное поверхностно-активное вещество, определенное как общее количество пластинчатых тел в эпителиальных клетках дыхательных путей типа II (AE2), оценивали путем определения количества и размера клеток и объемной доли пластинчатых тел на клетку. Был рассчитан абсолютный объем пластинчатого тела на клетку AE2 и легкое [27].

Легочную механику оценивали на анестезированных мышах, как описано ранее [28], и подробно описано в онлайн-приложении. Коротко механику измеряли с использованием метода вынужденной осцилляции и сопротивления (RL) и эластичности (EL) через эмпирическую модель.

Спектры EL и RL сравнивались между генотипами с использованием теста χ2 Пирсона. Для значительно разных спектров параметры сравнивались с использованием t-теста ученика. Несколько сравнений проводились с помощью одностороннего теста ANOVA и Bonferroni с множественным сравнением. Стереологические данные сравнивались по критерию Крускала-Уоллиса и по коррекции Данна для множественных сравнений. Оценка выполнялась с помощью GraphPad Prism версии 4.00 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). Уровень значимости был р <0,05.

Активация воспаления в легких обычно приводит к увеличению продуцирования NO, главным образом через iNOS. Измерение нитрата, стабильного окислительного продукта NO, внутри BAL может быть использовано в качестве маркера продуцирования NO в легком. Мыши Sftpd — / — увеличивали продукцию NO по сравнению с мышами WT и NOS2 — / — (рисунок 1). У мышей DiNOS увеличение нитратов БАЛ снижается, но не контролируется. Эти данные согласуются с уменьшением производства NO в зависимости от потери iNOS. Однако они подчеркивают, что нитраты BAL могут быть получены из альтернативных источников, поскольку уровень DiNOS по-прежнему выше, чем NOS2 — / -.

Нитраты BAL измеряли NOA как маркер активности NOS. Значения являются средними ± S.E. (n = 6-15). Статистически значимые различия между группами (p <0,05) обозначаются как: * против WT; ξ vs NOS2 - / -; # против Sftpd - / - мышей.

Перобронхиальная и периваскулярная воспалительная инфильтрация, гипертрофия и гиперплазия клеток AE2 и накопление макрофагов в БАЛ происходит у Sfptd — / — мышей. На светло-микроскопическом уровне мыши WT и NOS2 — / — отображают тонкие альвеолярные стенки и соответственно надутые дистальные воздушные пространства без признаков расширения воздушного пространства или накопления воспалительных клеток (рис. 2А). Напротив, мышей Sftpd — / — характеризуются гетерогенными и очаговыми расширениями дистальных воздушных пространств; в то время как промежуточный фенотип воздушного пространства встречается у мышей DiNOS. В этих группах иногда встречались аккумуляции альвеолярных макрофагов и внутриалвеолярного поверхностно-активного вещества. Эти изменения были преимущественно встречены в субплевральных и перибронхиальных областях. В соответствии с величиной расширения воздушного пространства (мыши DiNOS менее выражены, чем Sftpd — / -), накопление макрофагов и поверхностно-активного вещества следовало аналогичной схеме. Эти наблюдения подтверждаются качественной воспалительной оценкой (рисунок 2B).

(A) Типичные микрофотографии участков легкого из WT (верхний левый), NOS2 — / — (верхний правый), Sftpd — / — (нижний левый) и DiNOS (нижний правый) мышей (окрашивание толуидиновым синим). Нормальную структуру легких можно увидеть у мышей WT и NOS2 — / -. В Sftpd — / — дистальные воздушные пространства увеличены и заполнены пенистыми появляющимися альвеолярными макрофагами. Расширение дистальных воздушных пространств, по-видимому, менее выражено в DiNOS по сравнению с Sftpd — / — мышами. (B) Гистологическая оценка воспаления легких. Оценки медианного воспаления определяли путем ослепленной оценки окрашенных участков из каждой группы генотипов, как описано в Online Supplement Methods. Показанные данные являются медианными, n = 7 животных на генотип.

Все больше и больше клеток AE2 наблюдались при гистологическом исследовании мышей Sftpd — / — и DiNOS по сравнению с WT и NOS2 — / -, что указывало на гиперплазию и / или гипертрофию (рисунок 3). На электронно-микроскопическом уровне клетки AE2 мышей Sftpd — / — и DiNOS содержали больше поверхностно-активного вещества, как указано номером пластинчатого тела (рис. 3). В обеих клетках Sftpd — / — и DiNOS время от времени наблюдались гигантские пластинчатые тела. Для дальнейшей характеристики морфологических изменений, связанных с потерей SP-D и iNOS, мы провели серию стереологических анализов (рис. 4 и 5 и табл. 1). Полные стереологические результаты представлены в онлайн-приложении. Что касается общего объема легких V (легких), между генотипами не наблюдалось существенных различий.

Репрезентативные электронные микрофотографии клеток AE2 мышей WT (a), NOS2 — / — (b), Sftpd — / — (c) и DiNOS (d). Профили клеток AE2 в Sftpd — / — и DiNOS больше и, по-видимому, содержат больше пластинчатых тел по сравнению с мышами WT и iNOS — / -.

Гипертрофия клеток AE2 ((тип II)) присутствует в Sftpd — / — и DiNOS в аналогичной степени (A). Увеличение объема пластинчатых тел на легкие V (lb, легкое) (B) не зависит от дополнительной абляции NOS2-гена у мышей с дефицитом Sftpd. Показанные данные представляют собой средние и индивидуальные данные, n = 5-6 животных на генотип. Статистически значимые различия между группами показаны в таблице 3.

Количество альвеол на легкое N (alv, легкое) (A) увеличивается, тогда как средний вес альвеол (alv) (B) уменьшен у мышей DiNOS по сравнению с мышами Sftpd — / -, что указывает на ослабление эмфизема легких из-за дополнительной абляции гена iNOS у мышей с дефицитом Sftpd. Показанные данные представляют собой средние и индивидуальные данные, n = 5-6 животных на генотип. Статистически значимые различия между группами показаны в таблице 2.

Значения указаны как среднее ± S.E. из n = 5-6 мышей на генотип. Сокращения: V = объем, S = площадь поверхности, SV = плотность площади поверхности, N = число, NV = численная плотность, = среднечисленный средний объем, = объемный вес, пар = = альвеолы. Статистически значимые различия между группами (p <0,05) указаны как:

против WT,

против NOS2 — / -,

против Sftpd — / -.

Наши данные свидетельствуют о сохраняющейся гиперплазии и гипертрофии клеток AE2 в легких DiNOS, которые не отличаются от мышей Sftpd — / -. Число AE2 на легкое (N (тип II, легкое), таблица 2, а также средневзвешенный по объему объем ((тип II)) клеток AE2 был увеличен в этих двух группах по сравнению с мышами WT и NOS2 — / — (рис. 4A). Кроме того, нарушения внутриклеточного поверхностно-активного вещества оставались неизменными дополнительной аблацией гена NOS2 у мышей с дефицитом Sftpd (рисунок 4B). Объемная доля пластинчатых тел в клетках AE2 (VV (lb / typeII)) была увеличивалось у мышей DiNOS и Sftpd — / — в равной степени, последовательно приводя к увеличению абсолютных объемов пластинчатых тел на клетку AE2 (V (фунт, тип II)) и во всем легком (V (фунт, легкое)). Общий объем пластинчатых тел на клетку AE2 приблизительно удваивался как у мышей DiNOS, так и у Sftpd — / — по сравнению с WT (таблица 2).

Значения указаны как среднее ± S.E. из n = 5-6 мышей на генотип. Сокращения: V = объем, VV = объемная доля, = среднечисленный средний объем, = объемный взвешенный объем, lb = пластинчатое тело, тип II = AE2. Статистически значимые различия между группами (p <0,05) указаны как:

против WT,

против NOS2 — / -,

против Sftpd — / -.

Что касается параметров, характеризующих эмфизематное изменение структуры легких, наблюдались различия между Sftpd — / — и DiNOS. Поверхностная плотность (SV (альвепи / пар), общая площадь поверхности (Sveve, легкая)) альвеолярного эпителия и общее количество альвеол на легкое (N (alv, легкое)) заметно снижались в Sftpd- / — по сравнению с WT (таблица 1). Группа DiNOS по сравнению с Sftpd — / -, с одной стороны, и WT, с другой стороны, показала увеличенные, но не нормированные значения относительно S (alvepi, легких) и N (alv, легкое), указывающие затухание эмфизематного фенотипа (рис. 5А). Принимая во внимание среднечисленный средний объем альвеол ((alv)), у мышей DiNOS были обнаружены более мелкие альвеолы ​​по сравнению с мышами Sftpd — / -, хотя альвеолы ​​все еще были увеличены по сравнению с к WT (рис. 5B). Эти результаты были подтверждены средневзвешенным объемом альвеол ((alv)), параметр, характеризующий гетерогенность эмфизематозных изменений в легких [29]. Таким образом, дополнительная абляция гена NOS2 улучшенные эмфизематозные изменения в Sftpd — / — мыши, тогда как гиперплазия и гипертрофия AE 2, а также нарушения внутриклеточного сурфактанта оставались неизменными.

Чтобы исследовать эффекты потери SP-D и iNOS на функцию легких, 12-недельные мыши были проанализированы методом принудительной осцилляции. Из этих спектров измерения сопротивления (RL) и эластичности (EL) были проанализированы эмпирической моделью, которая позволяет оценить физиологические параметры (28) (рисунок 6). Эта модель предпочтительна по сравнению с моделью постоянной фазы, которая предполагает, что легкое вентилируется гомогенно [30]; приближение, которое ломается в патологических ситуациях [31]. Это вызывает особую озабоченность у Sftpd — / — мыши, где существует гетерогенность в реструктуризации легкого и измененная биофизика в альвеолах. Средние спектры сравнивались с WT с помощью теста χ2, чтобы определить, есть ли существенное изменение механических свойств. Мыши Sftpd — / — имеют значительно более низкий спектр сопротивления, однако WT, NOS2 — / — и DiNOS существенно не отличаются. Изучение параметров соответствия модели показывает, что низкочастотная часть спектра определяет это изменение (таблица 3). Нет никакой существенной разницы между любым генотипом в параметре b, который определяется высокочастотным поведением; в то время как a / c, который определяется низкочастотными компонентами, значительно ниже в группе Sftpd — / -.

Показаны спектры сопротивления легких (A) и эластичности (B∫) в зависимости от частоты при положительном концевом выдыхаемом давлении (PEEP) 3 см H2O. Каждая точка представляет собой среднее значение 3-6 измерений ± S.E., линии являются эмпирической посадкой [28] с использованием модели, описанной в онлайн-дополнении. Спектры Sftpd — / — значительно отличаются от WT, как определено испытанием χ2 (p <0,05).

Значения приведены в среднем ± S.E. (n = 5-6) для производных параметров из отдельных RL и EL-спектров. Сравнение значимости обозначается (* p <0,001 против WT).

Средний спектр эластичности мышей Sftpd — / — значительно ниже, чем WT, в то время как между WT, NOS2 — / — и DiNOS нет существенной разницы (рис. 6). Единственным параметром, который существенно изменен в генотипе Sftpd — / -, является E0, который представляет собой низкочастотную составляющую легкого. Ни ΔE, которое представляет изменение эластичности с увеличением частоты, или β, которое определяется скоростью изменения жесткости по частоте, демонстрирует любые существенные изменения. Эти данные лучше всего можно объяснить уменьшением жесткости и устойчивости паренхимы у мышей Sftpd — / -; в соответствии со стереологическими наблюдениями за увеличением альвеолярного размера и уменьшенным альвеолярным числом. Более того, эти изменения не наблюдаются у мышей DiNOS, что согласуется с поправкой, наблюдаемой в их стереологии.

Ультраструктурные и физиологические данные предполагали значительное влияние сигнализации iNOS на фенотип легких у Sftpd — / — мышей. Исследование клеток из лаважа легких показывает, что, как сообщалось ранее, наблюдается увеличение числа клеток у мышей Sftpd — / — (рис. 7А). Число клеток значительно ниже у мышей DiNOS. Однако номера NOS2 — / — клеток аналогичным образом уменьшены относительно WT, что означает, что это может быть общий эффект абляции NOS2, а не специфический эффект, связанный с потерей SP-D. Изучение клеточных дифференциалов через пятно Гимзы показывает, что число восстановленных клеток у мышей NOS2 — / — и DiNOS отражается в числах сокращенных макрофагов; в то время как у мышей DiNOS наблюдается небольшое увеличение числа нейтрофилов по сравнению с Sftpd — / — (рис. 7B). Несмотря на сокращение числа набранных макрофагов у мышей DiNOS, большие и пенистые макрофаги, наблюдаемые у Sftpd — / — мышей, все еще наблюдаются (рис. 7C).

Легкие промывали 0,5 мл аликвоты стерильного физиологического раствора до 5 мл. Восстановленные образцы BALF центрифугировали (300 г в течение 10 мин) и осадок клеток осторожно ресуспендировали в 1 мл PBS (с Ca2 + и Mg2 +). (A) Общее количество клеток определяли с использованием счетчика частиц счетчика Z1 (Beckman Coulter). (B) Аликвоты клеток центрифугировали на Thermo Shandon Cytospin-3 при 750 об / мин в течение 3 мин и окрашивали стандартным Diff-Quik для ручного определения клеточных дифференциалов. Клетки были идентифицированы как макрофаги, эозинофилы, нейтрофилы и лимфоциты по стандартной морфологии. Показанные данные: среднее ± S.E., n = 7 животных на генотип. Статистически значимые различия между группами (p <0,05) обозначаются как: * против WT; ξvs NOS2 - / -; # против Sftpd - / - мышей. (C) Типичное окрашивание Diff-Quik цитоспинов из мышей WT и Sftpd - / -, DiNOS и NOS2 - / -.

Одним из возможных объяснений последовательной морфологии макрофагов у мышей DiNOS и Sftpd — / — является то, что абляция гена NOS2 не коррелирует с липопротеинозом, наблюдаемым с потерей гена Sftpd [6], [7]. Анализ жидкости БАЛ для содержания фосфолипидов показывает, что это было частично правильным (Таблица 4). Общее содержание фосфолипидов у мышей DiNOS и Sftpd — / — больше, чем у WT и NOS2 — / -. Однако увеличение содержания фосфолипидов в клетках Sftpd — / — происходит как в малой, так и в крупной суммарной фракции. У мышей DiNOS увеличение в пределах большой частичной доли не изменяется. Напротив, в небольшой фракции агрегата, где содержание фосфолипидов увеличивается примерно в 8 раз до 604 мкг у мышей Sftpd — / -, у мышей DiNOS оно увеличивается только в 6 раз до 465 мкг. Большая суммарная доля БАЛ содержит большую часть поверхностно-активного материала. Эти данные согласуются с аблацией NOS2, снижающей воспалительные эффекты нокаута SP-D, но только минимально влияющие на размеры пула поверхностно-активных веществ.

Содержание фосфолипидов в БАЛ, а также мелкие и крупные агрегатные фракции определяли по методу Бартлетта. Показанные данные являются средними ± S.E .. Статистически значимые различия между группами (p <0,05) указаны как:

против WT,

против NOS2 — / -,

против Sftpd — / — мышей.

Установив, что абляция гена NOS2, по-видимому, не влияет на морфологию клеток AE2 (рис. 3, таблица 1), но уменьшает воспаление клеток в легкие (рис. 7), мы исследовали клеточный осадок из БАЛ для экспрессии воспалительных маркеров (Рисунок 8). Индукция NOS2 сама по себе часто используется в качестве маркера воспалительной активации, как это имеет место у Sftpd — / — мышей. В отсутствие гена NOS2 мы исследовали экспрессию IL-1β как общий маркер активации [32]. Экспрессия IL-1β была значительно увеличена у мышей Sftpd — / -, однако это увеличение было уменьшено вдвое у животных DiNOS. Напротив, PTGS2, который был увеличен у Sftpd — / — мышей, не был изменен потерей NOS2. ARG1, FIZZ1 и CCL2, все из которых являются маркерами альтернативной активации макрофагов [33], увеличиваются с потерей SP-D, и это увеличение увеличивается в DiNOS. Ym1, который наряду с ARG1 был идентифицирован как маркер альтернативной миелоидной активации в мышиных клетках [34], не был существенно изменен в терминах экспрессии складки, однако, примечательно, что исходная экспрессия Ym1 высока в легких (ΔCt) , Эти данные указывают на то, что, как представляется, происходит сдвиг в сигнале воспалительных клеток у мышей DiNOS.

РНК экстрагировали из клеток BAL, выделенных из мышей WT, Sftpd — / -, NOS2 — / — и DiNOS. Генные маркеры определяли количественно с помощью RT-qPCR, как описано. Полученные значения Ct были нормированы на сигналы β-актина и дополнительно проанализированы с использованием метода относительного квантования (ΔΔCt). Данные выражаются как изменение смены (означает ± S.E.M, n = 5-8 в каждой группе). Статистически значимые различия между группами (p <0,05) обозначаются как: * vs WT, ξ vs NOS2 - / -, # vs Sftpd - / -.

Недавно была выявлена ​​важная роль повышенной активности iNOS в эмфизематовом ремоделировании легких у мышей, и этот путь может иметь отношение к ХОБЛ человека [35], поскольку сигаретный дым снижает уровни SP-D в человеческом БАЛ [36], [37]. Кроме того, отсутствие SP-D приводит к опосредуемому iNOS хроническому воспалению у мышей [11]. В этом исследовании мы рассмотрели, устраняет ли абляция гена NOS2 поверхностно-активное вещество и структурные аномалии, наблюдаемые у Sftpd — / — мышей. Ранее мы наблюдали, что переходное ингибирование iNOS уменьшало воспаление у Sftpd — / — мышей без изменения липопротеиноза [38]. Здесь мы видим, что у мышей, лишенных обоих генов, DiNOS, наблюдается снижение воспаления, которое сопровождается коррекцией альвеолярных структурных аномалий. Однако поддерживается гиперплазия клеток AE2, равно как и избыточное продуцирование поверхностно-активного вещества. Примечательно, что изменения функции легких в Sftpd — / — наблюдаются с использованием метода вынужденного колебания [39]. Здесь мы распространили эти наблюдения на эмпирическую модель, которая демонстрирует значительное снижение низкочастотного сопротивления и жесткости легких на статическом пределе у Sftpd — / — мышей. Несмотря на значительные нарушения поверхностно-активных веществ у мышей DiNOS, функция легких полностью восстанавливается. Эти наблюдения подчеркивают важность iNOS для опосредования воспаления, которое происходит у Sftpd — / — мышей, и что эти процессы составляют основу структурных и функциональных аномалий, которые происходят.

Показано, что мышь Sftpd — / — имеет эмфизематный фенотип, в основном на основе качественного гистологического исследования [38], [40], [41]. В этом исследовании мы провели детальный стереологический анализ, чтобы охарактеризовать структурные аномалии, которые происходят у Sftpd — / — мышей. Эти исследования показали, что, хотя нет изменений в общем объеме легких, наблюдается увеличение среднего альвеолярного размера и уменьшение общего количества альвеол на легкое; и, следовательно, общая потеря поверхности альвеолярной поверхности. Эти исследования дают количественную оценку структурных изменений, происходящих у Sftpd — / — мышей, и позволяют измерять патологию.

Абляция гена SP-D приводит к значимому липопротеинозу [42], и в соответствии с этим нарушением мы наблюдаем увеличение объема клеток AE2 и количества хранимого ПАВ (рис. 4), что указывает как на гиперплазию, так и на гипертрофию (Рисунок 3). Кроме того, макрофаги в подкладке легких большие и пенистые, предположительно из-за чрезмерного фагоцитоза липидов. Эти данные свидетельствуют о чрезмерном производстве поверхностно-активного компонента подкладки легких клетками AE2. Однако наибольшее увеличение содержания фосфолипидов происходит в небольшой агрегатной фракции БАЛ, а не в большом агрегате. Эта фракция обычно состоит из не поверхностных активных компонентов, таких как легочные вены, и связана с врожденной иммунной функцией. Поэтому кажется, что потеря SP-D приводит к нарушению как воспалительных, так и поверхностно-активных функций легочного эпителия.

Ингибирование iNOS снижает воспаление, но не липопротеиноз, наблюдаемый у мышей Sftpd — / — [38]. Создание мыши DiNOS наряду со сложной стереологией позволило нам количественно оценить влияние потери функции iNOS на опосредованные Sftpd — / — структурные аномалии. Важно отметить, что потеря гена NOS2 оказывает сходное воздействие на легочные воспалительные маркеры на те, которые наблюдаются при ингибировании iNOS. Показатель воспаления снижается, как и общее количество клеток, и, в частности, количество макрофагов, внутри подкладки легких. Кроме того, производство метаболитов NO падает, хотя и не контролирует уровни, указывающие на важность других источников, таких как nNOS, на уровнях нитрата BAL. Стереологический анализ выявляет нормализацию среднего альвеолярного размера и количества альвеол на количество легких показателей структурной аномалии, наблюдаемых у мышей Sftpd — / — (рис. 5 и таблица 1). Эти изменения проявляются на качественном уровне при исследовании гистологии легкого (рис. 2).

У мышей DiNOS незначительно меняется либо на морфологию AE2, либо на морфологию макрофагов по сравнению с Sftpd — / — (рис. 3 и рис. 7C). Это еще раз отражается на отказе аблации iNOS на уменьшение либо увеличенного количества клеток AE2, либо увеличенного объема поверхностно-активного вещества в легких (таблица 1). Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями, в которых ингибирование функции iNOS в течение двух недель уменьшало воспаление легких, не изменяя профиль поверхностно-активного вещества [38]. Однако содержание фосфолипидов в малой частичной фракции жидкости для подкладки легких снижается в DiNOS (таблица 4), в то время как большая фракция агрегата не подвержена влиянию. Большая агрегатная фракция состоит из поверхностно-активных компонентов фосфатидилхолина, phophatidyl serine и белков поверхностно-активных веществ B & C, тогда как небольшая агрегатная фракция компрометирует некорпоративные липиды и иммунорегуляторные молекулы, такие как SP-A & D [43]. То, что малая агрегатная функция в какой-то степени нормализована потерей NOS2, в то время как большая агрегатная фракция не подвержена влиянию, подчеркивается роль iNOS в качестве медиатора воспаления легких.

Принудительная методика колебаний является общепринятым методом исследования функции легких на уровне органов. Такие данные обычно соответствуют модели с постоянной фазой [44], что позволяет сравнить предложенные физиологические параметры. Мы разработали эмпирическую модель, которая, теряя при этом преимущество предлагаемой физиологической значимости ее параметров, повышает свою точность до неравномерной функции легких [28]. В соответствии с предыдущей работой [39] наблюдение как EL, так и RL-спектров показывает, что у мышей Sftpd — / — значительное изменение функции легких (рис. 6). Анализ параметров демонстрирует снижение низкочастотного сопротивления и эластичность при статическом пределе внутри мышей Sftpd — / — (рис. 6). Эти данные лучше всего объясняются изменением присущих механическим свойствам легкого. Высокочастотная составляющая спектров сопротивления и эластичности существенно не изменяется по сравнению с WT. Изучение стереологии и липопротеиноза дает возможные объяснения этому механическому поведению. Увеличенный средний альвеолярный размер и уменьшенное альвеолярное число, наблюдаемое у мышей Sftpd — / -, могут приводить к уменьшению низкочастотных механических параметров. Определение альвеолярного числа основано на определении связности сети осевых эластичных волокон, участвующих в формировании альвеолярных входных колец [8], [45], [46]. Таким образом, уменьшение альвеолярного числа связано с уменьшением связывания этой сети осевых эластичных волокон, что может привести к размягчению тонкой паренхимы легкого у мышей Sftpd — / — и впоследствии уменьшению эластичности легких в его статических пределах. В то время как измененная функция поверхностно-активного вещества также может приводить к уменьшению «жесткости» легких и снижению низкочастотного сопротивления вследствие изменения паренхиматозного привязывания. У мышей DiNOS существует разрешение структурных аномалий без улучшения профиля поверхностно-активных веществ; и у этих мышей функциональные аномалии, по-видимому, решаются. Таким образом, можно сделать вывод, что изменения, наблюдаемые на уровне органов, наблюдаемые у мышей Stfpd — / -, являются результатом альвеолярной реструктуризации, а не вследствие альвеолярного протеолиза.

Таким образом, эти данные показывают, что повышенная активность iNOS имеет решающее значение для ремоделирования альвеолярной архитектуры и связанных с ней механических свойств паренхимы легких у мышей Sftpd — / -, тогда как нарушения гомеостаза поверхностно-активных веществ не зависят от iNOS. Эти наблюдения можно объяснить сдвигом функции альвеолярных макрофагов в сторону альтернативной активации с противовоспалительными свойствами.

Авторы выражают благодарность Эвелин Яо (Институт анатомии, Бернский университет) и Марита Петр (Институт функциональной и прикладной анатомии, Ганноверская медицинская школа) за отличную техническую поддержку.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *