Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Изменения хемилюминесценции цельной крови пациентов с ХОБЛ, получавших Hypoxen®, и эффекты фуллеренов C60 на хемилюминесценцию крови

Changes in chemiluminescence of whole blood of COPD patients treated with Hypoxen® and effects of C60 fullerenes on blood chemiluminescence
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3560587/

Дизайн исследования

Сбор данных

Статистический анализ

Интерпретация данных

Подготовка рукописи

Поиск литературы

Сбор средств

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является воспалительным заболеванием, связанным с образованием реакционноспособных видов кислорода (ROS). Целью этого исследования было оценить влияние лечения Hypoxen® и влияние HyFnC60 на продукцию ROS в крови пациентов.

Получение ROS в крови оценивали с использованием измерения хемилюминесценции (CL) с помощью CL-усилителей: люминол (LM), LM + зимозан (ZM) или люцигенин (LC) в присутствии или в отсутствие гидратированных фуллеренов (HyFnC60), добавляемых к крови в низких концентрациях ,

У всех пациентов с ХОБЛ в фазе ремиссии с рецептом Hypoxen® LM-зависимый CL (LM-CL) с ZM и LC-усиленным CL (LC-CL) уменьшался после лечения. Параметры CL и эффекты HyFnC60 на них зависели от состояния крови. Добавление HyFnC60 к крови уменьшало рассеяние данных и помогло улучшить дискриминацию между различными группами пациентов. Используя анализ дискриминатора, мы обнаружили наиболее важные временные точки в кинетических кривых CL для классификации пациентов в группах (например, пациентов с ХОБЛ до и после лечения Hypoxen®, кровь пациентов с различной чувствительностью к концентрации HyFnC60).

Мониторинг CL без разбавленной цельной крови у пациентов с ХОБЛ может быть использован для оценки эффективности гипоксина в комплексной терапии. Добавление HyFnC60 к крови повышает чувствительность метода.

Бронхолегочная система зависит от баланса кислорода во всем теле, поэтому бронхообструктивное заболевание или повреждение паренхимы легкого неизбежно приведет к развитию более или менее глубокой гипоксии в зависимости от тяжести заболевания. Одним из таких заболеваний является ХОБЛ, которая характеризуется ограничением воздушного потока и продолжительным хроническим воспалением, которые нарушают архитектонику бронхов и паренхимы легких [1]. Считается, что некоторые заболевания, такие как сердечно-сосудистые заболевания, остеопороз, кахексия и анемия, являются системными последствиями ХОБЛ [2,3].

Ключевым механизмом патогенеза ХОБЛ является воспаление, которое возникает в ответ на воздействие токсических веществ, которое приводит к воспалению, что способствует секреции слизи, фиброзу и разрушению альвеолярных стенок. Кроме того, генетические факторы [4], иммунная система, окислительный стресс и аномальная экспрессия репаративных процессов способствуют развитию и поддержанию ХОБЛ.

В настоящее время роль окислительного стресса рассматривается как важный дополнительный фактор, способствующий заболеванию [5,6]. В условиях гипоксии и воспаления, характерных для ХОБЛ, к генерации ROS участвуют различные клетки, представленные радикалом супероксидного аниона, перекисью водорода, гидроксильным радикалом и другими высокореактивными химическими соединениями. Реакции, в которых появляется ROS, могут контролироваться с использованием чувствительных люминометров, если к реакционным системам добавляются хемилюминесцентные зонды, в частности LM или LC.

ROS очень химически реактивны и их необходимо контролировать, чтобы предотвратить повреждение. Система контроля обычно известна как антиоксидантная система. В этом исследовании мы использовали Hypoxen®, который является перспективным новым антиоксидантом и антигипоксантом, который демонстрирует замечательный защитный эффект ROS у пациентов с ХОБЛ и, по-видимому, имеет очень мало противоречий.

Целью настоящего исследования было сравнить уровень ROS в неразбавленной цельной крови 3 групп добровольцев: пациентов с ХОБЛ до лечения Hypoxen®, пациентов с ХОБЛ после лечения Hypoxen® и пациентов, страдающих острой атакой. Статистически значимое снижение содержания ROS в крови наблюдалось после лечения Hypoxen® ХОБЛ. Мы также обнаружили, что добавление HyFnC60 в цельную кровь обычно изменяет интенсивность CL, вырабатываемой в крови, а также уменьшает рассеяние данных между параллельными зондами.

Это было открытое, нерандомизированное проспективное исследование эффективности Hypoxen®, включая пациентов с ХОБЛ (стадии III и IV ЗОЛОТО). Критерии включения: возраст ≥40 лет, курение ≥20 упаковок в год, объем выдоха за 1 секунду (FEV1) <50%, FEV1 / принудительная жизненная емкость (FVC) <70% от прогнозируемой, стабильной ХОБЛ, никаких изменений в лечении , и без обострений ХОБЛ. Терапия ХОБЛ включает лечение β2-агонистом и / или антихолинергическим и / или ингаляционным кортикостероидами.

Исследование было одобрено Комитетом медицинской этики больницы (Московская городская клиническая больница № 23 * Медсантруд *), и все пациенты дали информированное согласие.

Пациенты (60 человек), участвовавшие в исследовании, принимали Гипоксен® 250 мг (750 мг в сутки) в течение 2 месяцев. Гипоксиновая терапия была добавлена ​​к стандартной терапии стабильной ХОБЛ.

Hypoxen® (полидигидроксифенилентилосульфонат натрия) (фиг. 1).

Оценки эффективности были основаны на спирометрической оценке функции легких. Пациенты имели FEV1 и FVC с помощью спирометра (Master Screen Pneumo, Erich Jaeger GmbH, Германия). Насыщенность кислородом (SaO2) оценивалась пульсоксиметром (Beijing Choice Electronic Tech Co., LtdJ., Китай). Мы использовали тест на оценку ХОБЛ (КПП) для измерения влияния ХОБЛ на пациентов (http://www.CATestonline.org). Тесты функции легких, SaO2 и CL были сделаны в первый и последний день исследования (двухмесячное лечение Hypoxen®).

Пациенты с острым приступом ХОБЛ были вовлечены в исследование в качестве сравнительной группы. Мы сравнили уровень CL в крови у пациентов со стабильной ХОБЛ и обострением ХОБЛ. Измерение проводилось только один раз в обеих группах пациентов. Пациенты с обострением ХОБЛ не принимали Hypoxen®. Терапия острого приступа ХОБЛ включала антибактериальное лечение и / или кортикостероиды (в / в), мукоактивную обработку (за исключением N-ацетилцистеина), β2-агониста с помощью распылителя (таблица 1).

Сводная статистика представлена ​​в виде пропорций [с 95% доверительными интервалами (CI)] или средствами [со стандартными отклонениями (SD)]. Неизменяемые ассоциации между периодом времени и переменными были исследованы с использованием 2-образных t-тестов.

Кровь пациентов с ХОБЛ была получена венозной пункцией и была стабилизирована гепарином 0,1 мл (1000 МЕ) / 10 мл крови. Кровь была получена между 9.00 и 10.00 а. м. и использовался ровно через 3 часа после экстравазии. В течение этого периода он содержался в пластиковых пробирках при 20-25 ° C.

Цельная неразбавленная кровь CL была зарегистрирована после добавления в кровь либо LC (зонд для супероксидного радикального аниона), либо LM (зонд для нескольких ROS). Маточный раствор LM получали растворением его в ДМСО до концентрации 0,02 М. Исходный раствор ЖХ получали растворением его в физиологическом растворе до концентрации 0,02 М. Оба добавляли к цельной крови до конечной концентрации 0,1 мМ. В случаях, когда респираторный всплеск индуцировался в крови с помощью ZM, последний добавляли в кровь для получения конечной концентрации 0,5 мг / мл, через 5 минут после добавления LM. Добавки (по 10 мкл каждый) добавляли к 0,2 мл крови в 1,5 мл пробирки для испытаний полиэтилена Эппендорфа.

Исходное решение HyFnC60 (1 мМ) было предоставлено G.V. Андриевский. Последовательные десятичные разведения HyFnC60 проводили в физиологическом растворе и каждое последующее разведение перемешивали в вихревом шейкере в течение 5 секунд. Разбавления по 5 мкл HyFnC60 добавляли в кровь за 1 мин до добавления LM или LC. В качестве контроля в кровь вместо HyFnC60 добавляли 5 мкл физиологического раствора.

CL из крови регистрировали с использованием единственного фотонного счетчика «Biotox-7a» (Россия) (рис. 2), оснащенного фотоумножителем с фотокатодом S-11 с максимальным откликом (чувствительностью) в диапазоне длин волн 400-500 нм и окно диаметром 5 см. Фотоумножитель был развернут горизонтально и зарегистрировал поток фотонов с боковой поверхности пробирок кровью. Кинетику CL регистрировали из неразбавленной цельной крови без или в присутствии HyFnC60 в течение 5-15 мин. Результаты автоматически загружались на компьютер в формате ASCII. Интенсивность CL выражалась как количество импульсов в секунду. Все операции выполнялись при тусклом освещении.

Обработка результатов и вычислений выполнялась с использованием пакетов программного обеспечения Microsoft® (США) — Microsoft Office 2003 — Excel 2003; статистическая многофункциональная программа Statistica V.5.0 и V.6.0. Дискриминантный анализ (DA), раздел многомерного статистического анализа, использовался для интерпретации межгрупповых различий, классификации и анализа результатов, полученных в изученной группе пациентов.

Не было различий в возрасте, курении и характеристиках лечения между стабильными и обостряющимися пациентами с ХОБЛ. Пациенты с обострением ХОБЛ имели более низкие FEV1, FEV1 / FVC, SaO2 и CAT, чем пациенты со стабильной ХОБЛ (p <0,05).

Мы не обнаружили изменений FEV1 (L и% от прогноза), FEV1 / FVC (% от прогноза) и SaO2 до и после приема Hypoxen® (таблица 2).

Данные (рис. 3) показывают снижение одышки, увеличение активности на дому, улучшение чувства уверенности и увеличение энергии у пациентов после приема Hypoxen®. Мы не находили никакого влияния на кашель, слизь, чувство стеснения в грудной клетке и сон (p> 0,05).

Мы обнаружили статистически значимое снижение общего показателя CAT после терапии Hypoxen® (18,3 ± 9,3 против 15,2 ± 9,0 [p = 0,0002]).

Измерялась и анализировалась динамика CL всей венозной крови всех пациентов. Также была оценена динамика клинических симптомов у всех пациентов с ХОБЛ во время лечения гипоксином. В каждом случае измерение интенсивности CL проводилось на не менее чем 3 образцах неразбавленной крови пациентов с ХОБЛ. Типичная кинетика CL в крови у 2 пациентов до лечения после лечения Hypoxen® с различной интенсивностью CL представлена ​​на рисунке 4, 5.

Параметры CL крови зависят как от состояния здоровья пациентов, так и от свойств крови конкретного человека, отражающих иммунитет пациента. Поэтому интенсивность CL крови значительно варьировала от пациента к пациенту. Однако после лечения Hypoxen® CL интенсивность крови была ниже, чем у пациентов до применения Hypoxen®, как правило, независимо от интенсивности CL (рис. 4, 5).

После обработки пациентом пациента Hypoxen® и пациента R. FEV1 повышались до 130 и 120 мм соответственно. Пациент P. SaO2 увеличился с 95% до 97%. Напротив, пациент R. SaO2 уменьшился с 95% до 93%. Оба пациента улучшили переносимость упражнений от 2 до 3 баллов в анкете SAT. Добавление HyFnC60 к крови пациентов с ХОБЛ до и после лечения Hypoxen® изменило LM-амплифицированный CL-ответ на ZM и LC-CL (Рисунок 6). Интересно, что HyFnC60 в низких (10-6 М) и особенно ультранизких (10-19 М) концентрациях резко уменьшал LM- и LC-CL крови после лечения Hypoxen®, усиливая контраст между группами пациентов до и после лечения.

Во многих случаях пациентов, страдающих острым приступом, как LM-зависимый CL, так и особенно LC-CL крови был довольно высоким. Добавление 10-6 М или 10-19 М HyFnC60 в кровь обычно ослабляло CL (рисунок 7). Интересно, что HyFnC60 в концентрациях 10-7 М и 10-11 М не оказывал никакого влияния на кровь CL.

Чтобы применить DA ко всем экспериментальным данным, усредненные данные о кинетике CL для всех пациентов были построены на графиках. На рис. 8 показана усредненная кинетика крови пациентов с ремиссией до лечения гипоксином® и после лечения, а также крови пациентов в состоянии острой атаки. На рисунке 9 показана кинетика CL крови пациентов в присутствии 10 -6 M HyFnC60 (рис. 9A) и 10-19 М HyFnC60 (рисунок 9B). На этих графиках мы видим разницу между кинетикой CL крови до и после лечения и в состоянии острой атаки, а также последствиями HyFnC60 по параметрам CL.

Мы сравнили интенсивность CL в выбранных временных точках (143 с, 260 с, 772 с, 804 с, 860 с, 907 с, 951 с, 1094 с, 1110 с, 1150 с), соответствующих максимальной разности интенсивности от CL между группами, и применяется DA для этих временных точек. Результаты такой обработки данных могут быть представлены в виде коэффициентов классификационной функции для каждой группы пациентов в табличной форме.

Коэффициенты переменных для дискриминантной функции были рассчитаны с использованием Statistica V.6.0. Была разработана линейная функция классификации для пациентов из разных групп. Линейная функция:

Функция называется канонической дискриминантной функцией с неизвестными коэффициентами βi. Здесь dkm — значение дискриминантной функции для m-го объекта в группе k; xikm — значение дискриминантной переменной xi для m-го объекта в группе k. С геометрической точки зрения дискриминантные функции определяют гиперповерхность в p-мерном пространстве. В частном случае p = 2 это прямая линия и p = 3 плоскость [7].

Таким образом, оценка интенсивности CL крови всех испытуемых пациентов до и после лечения позволила нам выбрать временные точки во время процесса регистрации CL.

Например, функции дискриминации для групп пациентов с ХОБЛ до (1), после (2), следующие:

где значения интенсивности X143, X260, X1150 — CL в соответствующих временных точках.

Также были рассчитаны функции дискриминации для 3 групп пациентов с ХОБЛ (до и после лечения гипоксином® и при острой атаке) (рисунок 10). Здесь вероятность дискриминации между 3 группами составляла 54%. В присутствии 10-6 М или 10-19 М HyFnC60 в крови вероятность дискриминации между 3 группами увеличилась до 77% и 64% соответственно. Таким образом, добавление HyFnC60 в низких и ультранизких концентрациях к крови пациентов для оценки параметров LM, LM + ZM и LC-CL помогает улучшить дискриминацию между группами пациентов с ХОБЛ.

Применение этих классификационных функций ко всему набору экспериментальных данных измерения CL цельной крови пациентов до и после лечения Hypoxen® позволило оценить вероятность включения пациентов в определенную группу, что составляет 72%. Принимая во внимание, что все число пациентов, чья кровь использовалась для измерений CL, составляла всего 30, эта вероятность довольно высока. Если измерение CL проводилось на крови в присутствии 10-6 М или 10-19 М HyFnC60, вероятность дискриминации между 2 группами увеличивалась до 83-84%.

На рис. 8 показана усредненная кинетика крови пациентов с ремиссией до лечения гипоксином® и после лечения, а также крови пациентов в состоянии острой атаки. На рисунке 9 показана кинетика CL крови пациентов в присутствии 10 -6 M HyFnC60 (рис. 9A) и 10-19 М HyFnC60 (рисунок 9B). На этих графиках мы видим разницу между кинетикой CL крови до и после лечения и в состоянии острой атаки, а также последствиями HyFnC60 по параметрам CL.

Недавние оценки показали, что у взрослых> 15% потребляемого кислорода превращается в РОС в условиях покоя и гораздо больше, когда их активность высока [8]. Процесс одноэлектронного восстановления кислорода, в котором генерируется энергия электронного возбуждения, непрерывно происходит в человеческой крови [9]. Ранее мы показали, что LM-CL из неразбавленной цельной крови пациентов с стенокардией значительно превосходит уровень крови здоровых доноров, и его интенсивность уменьшается в ходе успешного лечения [10].

В этом исследовании было показано, что лечение Hypoxen® значительно снижает вероятность интенсивного LM + ZM- и LC-индуцированного производства ROS во всей неразведенной крови пациентов с ХОБЛ in vitro. В многочисленных параллельных измерениях CL показано, что без лечения Hypoxen® и без добавления продукции HyFnC60 ROS сравнительно более интенсивно в цельной крови. 10-6 М и 10-19 М концентрации HyFnC60 были использованы в исследовании, поскольку они имели наиболее статистически значимое влияние на скорость производства ROS. Интересно отметить, что только 10-19 M HyFnC60 добавили в кровь пациентов без лечения Hypoxen® заметно пониженное производство ROS (более чем на 50%, рис. 5). Обработка Hypoxen® способствовала еще более низкому производству ROS, чем в последнем случае. Добавление HyFnC60 в кровь in vitro в концентрации 10-6 М заметно усиливало эффект Hypoxen® и 10-19 M, что привело к увеличению производства ROS почти до нулевого уровня. Эти данные относятся как к LM + ZM, так и к LC-зависимой генерации ROS. Вышеприведенные данные были получены у пациентов с хроническим ходом ХОБЛ. Такая же картина эффекта HyFnC60 без лечения Hypoxen® наблюдалась с кровью пациентов, перенесших острую атаку, за исключением того, что концентрация HyFnC60 в 10-6 М имела больший эффект на снижение продукции ROS, чем 10-19 М. Сравнивая рис. 5 и рис. 6, очевидно, что скорость генерации ROS более чем в два раза интенсивнее в случае острой атаки, чем в хроническом случае. HyFnC60 на 12% эффективнее в случае острой атаки.

Недавно были описаны специфические антиокислительные свойства HyFnC60 [11]. Фуллерены представляют собой замкнутые сферические многогранники, полностью построенные из трех скоординированных атомов углерода. Фуллерен C60 является наиболее стабильным соединением с 12 пентагональными и 20 гексагональными кольцами [12,13].

Фуллерены нерастворимы в воде, но они могут быть гидратированы без их модификации или использования детергентов. Этот метод позволяет нам производить подлинное решение фуллеренов, в которых каждая молекула С60 покрыта довольно толстой устойчивой водяной оболочкой, которая может состоять из нескольких слоев воды [14,15]. Молекулы фуллеренов в препаратах HyFnC60 не могут непосредственно взаимодействовать с любыми другими молекулами помимо воды водных оболочек, и считается, что их множественные биологические эффекты, включая антиоксидантные эффекты, связаны со структурированной водой, которая представляет собой уникальный биологически активный агент [16].

В настоящее время накоплено много данных о потенциальном использовании фуллеренов в медицине и биологии [17]. Гидратированные фуллерены (HyFnC60) в низких концентрациях вызывают неспецифические антибактериальные, противовирусные и противовоспалительные эффекты и нейропротективный эффект при алкоголизме [18]. Особый интерес представляют исследования, в которых изучалось влияние гидратированных фуллеренов на раковые образования [17]. Как показано, никакой токсичности не было прослежено в течение всего периода экспериментов [19].

В присутствии HyFnC60 эффект Hypoxen® стал более ясным, и 3 группы исследованных пациентов оказались более дискретными, по данным DA. Таким образом, HyFnC60 помогает лучше идентифицировать различия между группами изученных пациентов.

Многочисленные исследования подтвердили антиоксидантную активность фуллеренов. Антирадикальные свойства фуллеренов обычно объяснялись прямым растрачиванием свободных радикалов клеткой углерода фуллерена. Однако последние исследования показывают, что многочисленные эффекты HyFn при широком спектре процессов, происходящих как in vivo, так и in vitro, могут быть связаны как с их способностью делать водную среду, в которой эти процессы идут более упорядоченными, так и одновременно модулировать окислительно-восстановительных реакций, которые непрерывно протекают в водных системах [20]. Ранее было показано, что антиоксиданты могут функционировать в очень низких концентрациях [21], предположительно через структурирование воды, что согласуется с данными этого исследования.

Обработка Hypoxen® пациентов с ХОБЛ приводила к значительному чередованию LM-ZM-зависимых и LC-CL цельной крови пациентов. Это согласуется с заявленной сильной антиоксидантной активностью Hypoxen®. HyFnC60, добавленный в кровь in vitro, усиливал эффект, вызванный Hypoxen®, который был дан in vivo. Более того, HyFnC60 снизил значения стандартного отклонения данных. Интересно, что не все исследованные концентрации HyFnC60 в равной степени влияли на скорость образования ROS — лучший эффект на DA между различными группами пациентов был вызван HyFnC60 в концентрациях 10-6 М и 10-19 М.

Мы благодарим Г.В. Андриевский, доктор технических наук, старший научный сотрудник лаборатории. биомедицинского тестирования для наноматериалов, ISMA, НТЦ «Институт монокристаллов» НАН Украины, для обеспечения решения HyFnC60. Расследование частично финансировалось Закрытым акционерным обществом «Корпорация Олифен», г. Москва.

Источник поддержки: ведомственные источники

Гипоксиновая структура.

Оборудование для регистрации нерасщепленной цельной крови CL (Biotox-7a).

Изменения в клинических параметрах пациентов до лечения Hypoxen® и после него.

(A) люминол и люминол + зимозан и (B) люцигенин зависимый CL (случай высокой интенсивности) нерасщепленной крови до и после лечения Hypoxen® (пациент P.). 1 — до лечения Hypoxen®, 18.08.09; 2 — после лечения Hypoxen®, 06.10.09.

(A) люминол и люминол + зимозан и (B) люцигенин зависимый CL (случай низкой интенсивности) нерасщепленной крови до и после лечения Hypoxen® (пациент R.). 1 — до Hypoxen®, 23.10.09; 2 — после лечения Hypoxen®, 29.12.09.

Эффекты HyFnC60 на люминол и люминол + -циосман- (A) и люцигенин- (B) зависимый CL нерасщепленной крови пациента с ХОБЛ T. при действии HyFnC60. 1 — до лечения Hypoxen®, 15.10.09, нет HyFnC60; 2 — 1 + HyFnC60 (10-19 М); 3 — после лечения Hypoxen®, 22.12.09, нет HyFnC60; 4 — 3 + HyFnC60 (10-6 М); 5 — 3 + HyFnC60 (10-19 М).

Эффекты HyFnC60 на люминол и люминол + зимозан- (A) и люцигенин- (B) зависимую хемилюминесценцию нерасщепленной крови пациента с ХОБЛ T-v. страдая острой атакой. 1 — нет HyFnC60; 2 — HyFnC60 (10-19 М); 3 — HyFnC60 (10-6 М).

Изменения в динамике средних значений интенсивности CL цельной крови у 30 пациентов с ХОБЛ до (2) и после (3) терапии Гипоксеном® и при острой атаке (1)

Изменения в динамике средних значений интенсивности CL цельной крови у пациентов с ХОБЛ до (2) и после (3) терапии гипоксином® и при острой атаке (1) в присутствии HyFnC60: (A) — 10 -6 М; (B) — 10-19 M.

Измеренные параметры изменялись в группе пациентов с ХОБЛ до и после лечения Hypoxen® и при остром приступе на 54% без HyFnC60 (1-й бар). В присутствии HyFn (10-6 и 10-19 М) в крови этих пациентов — на 77 и 64% (2-й и 3-й бары). Кинетические CL-параметры крови пациентов с ХОБЛ до и после лечения Hypoxen® можно различить с вероятностью 72, 85 и 83% (соответственно 4, 5 и 6 баров). Результаты 5-го бара были получены в присутствии 10-6 М HyFnC60, 6-й — 10-19 М HyFnC60.

Характеристики пациентов с ХОБЛ.

п<0.05;

LABA — вдыхаемый b2-агонист длительного действия; ICS — вдыхаемый кортикостероид; IA — ингаляционные антихолинергические средства.

Измерения функции легких, результаты SaO2 и данные опроса CAT у пациентов со стабильной ХОБЛ.

п<0.05.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *