Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Старение и курение вносят вклад в протеины поверхностно-активных веществ плазмы и дисбаланс протеаз с корреляциями с обструкцией дыхательных путей

Ageing and smoking contribute to plasma surfactant proteins and protease imbalance with correlations to airway obstruction
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3103485/

Значительное число молодых людей начинают курение в возрасте 13-15 лет, а это означает, что к 20 годам могут произойти серьезные изменения, вызванные курением. Протеины поверхностно-активных веществ (SP) и матриксные металлопротеиназы (ММП) и их тканевые ингибиторы (ТИМП) были связаны с ремоделированием легких, вызванным сигаретным дымом, и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Однако уровень этих белков не был изучен во время старения или у молодых людей с короткими историями курения.

Уровни плазмы SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1 измеряли с помощью EIA / ELISA от молодых (18-23 лет) контролей без курения (YNS) (n = 36), курильщиков (YS) (n = 51), средний возраст / пожилой (37-77 лет) контроль за курением (ONS) (n = 40), курильщики (OS) (n = 64) (FEV1 / FVC> 0,7 у всех пациентов) и пациентов с ХОБЛ (n = 44, 35-79 лет).

Уровень плазмы SP-A увеличивался с возрастом и в старшей группе по отношению к курению и ХОБЛ. Уровни плазма SP-D и MMP-9 не изменялись с возрастом, но были увеличены в ОС и ХОБЛ по сравнению с ОНС. Уровень ТИМП-1 снижался с возрастом, но увеличивался у хронических курильщиков по сравнению с ОНС. Наиболее четкие корреляции могут быть обнаружены между плазмой SP-A и возрастом, годами упаковки и FEV1 / FVC. Анализ кривой рабочей характеристики приемника (ROC) показал, что SP-A является лучшим маркером для выявления пациентов с ХОБЛ и контролем (площадь под кривой ROC 0,882, доверительный интервал 95%, 0,785-0,899, p <0,001).

Возраст имеет значительный вклад в потенциальные маркеры, связанные с курением и ХОБЛ; SP-A, по-видимому, является лучшим фактором в дифференциации ХОБЛ от контролей.

Курение является основным фактором риска развития хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), и прекращение курения является единственным эффективным способом замедления прогрессирования заболевания [1-3]. Молодые люди обычно начинают курение в возрасте 13-15 лет, а это означает, что значительные изменения, связанные с курением, возможно, произошли в течение 10 лет, то есть к тому времени, когда им исполнилось 25 лет, они, возможно, пострадали от повреждения, которое впоследствии перерастет в ХОБЛ. Необходимо разработать чувствительные и специфические маркеры для ранней ХОБЛ, но в настоящее время тесты ненадежны. В этом исследовании мы измерили уровни содержания ПАА поверхностно-активного вещества А (SP-A), белка поверхностно-активного вещества D (SP-D), матричной металлопротеиназы-9 (MMP-9) и тканевого ингибитора матричной металлопротеиназы-1 (ТИМП-1) в молодых и средних лет / пожилых курильщиков и пациентов с ХОБЛ. Выбор этих потенциальных маркерных соединений основывался на предыдущих исследованиях ХОБЛ, то есть на исследованиях, не связанных с гипотезой / протеомикой (SP-A) или гипотезой (SP-D, MMP-9), которые указали, что особенно эти маркеры могут прогнозировать ХОБЛ, его развитие и / или прогрессирование [4-9]. Эти соединения никогда не сравнивались ранее в одном исследовании.

Легочное поверхностно-активное вещество представляет собой смесь фосфолипидов и белков, образованных в основном пневмоцитами типа II [10]. SP-A и SP-D являются членами коллекционного семейства и играют важную и уникальную роль в защите легких от воспаления / окислительного стресса [11,12]. Было обнаружено, что состав и функции поверхностно-активного вещества модулируются курением и / или ХОБЛ [13-16], и большинство исследований в этой области сообщили о повышенных уровнях SP-A в сыворотке пациентов с ХОБЛ [6,8] , Предполагается, что сывороточный SP-D является потенциальным маркером ХОБЛ, способным прогнозировать обострения и ответ на терапию кортикостероидами [17-20]. Было обнаружено, что поверхностно-активные вещества регулируют баланс протеаз / антипротеаз через разные пути, SP-A может даже регулировать продукцию и функцию MMP-9 [21-24]. Одна из наиболее распространенных гипотез в патогенезе ХОБЛ включает дисбаланс между протеазами и антипротеазами [4, 25].

Матричные металлопротеиназы расщепляют компоненты внеклеточного матрикса и фундаментных мембран, а баланс их активности строго контролируется их ингибиторами. Изменения этих протеаз, особенно MMP-9 и его основного эндогенного ингибитора TIMP-1, были тесно связаны с курением и ХОБЛ [4,5,26,27]. Однако мало известно о том, существуют ли возрастные изменения в этих белках у курильщиков и / или ХОБЛ.

Основной целью этого исследования было выяснить, влияет ли курение и старение на уровни и отношения между циркулирующими SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1.

Вторая цель заключалась в том, чтобы определить, будут ли уровни этих маркеров ассоциироваться с демографическими параметрами и значениями функции легких у молодых и средних людей / пожилых курильщиков, а также у пациентов с ХОБЛ по сравнению с контрольными по возрасту. Ни у одного из испытуемых не было каких-либо других воздействий на окружающую среду, все случаи ХОБЛ были недавно диагностированы и не имели других диагностированных заболеваний и не принимали никаких лекарств.

Образцы плазмы собирали у людей среднего возраста / пожилых людей, с которыми связались из отделения легочной медицины, центральной больницы в Лапландии [28] и от молодых курильщиков и некурящих, которые были военными призывниками из Северного командования финских сил обороны [29 ]. Детали этих когорт были описаны в вышеупомянутых исследованиях [28,29]. Основываясь на подробном анкетах с самообслуживанием, все субъекты были свободны от симптомов и считали себя здоровыми, у них не было других воздействий на окружающую среду (таких как вторичный дым, загрязняющие вещества или асбестовые волокна) [28]. В исследование включали молодых здоровых курильщиков (YS), молодых здоровых людей с курением (YNS), здоровых курильщиков среднего возраста / пожилых людей (OS) и здоровых людей с курением (ONS), а также пациентов с стабильная ХОБЛ (этап I-III). Диагноз ХОБЛ был определен в соответствии с Глобальной стратегией диагностики, управления и профилактики критериев ХОБЛ (ЗОЛОТО); FEV1 <80% от прогнозируемого, FEV1 / FVC <70% и эффект бронходилатации <12% [2,30]. Спирометрические значения оценивали по стандартной спирометрии (Medriko M 904, Kuopio, Finland) и финским опорным значениям для спирометрии [31]. Критерии исключения включали аллергию, астму, историю респираторных заболеваний или респираторную инфекцию менее чем за 8 недель до поступления в исследование. Ни у одного из испытуемых не было другого диагностированного заболевания или каких-либо лекарств. Исследование было одобрено Комитетом по этике Центральной больницы в Лапландии (4 июня 2003 года и 31 октября 2006 года), и все участники предоставили письменное информированное согласие.

Образцы плазмы были случайным образом выбраны из когорт, которые представляли различные подгруппы для исследования. Уровни SP-A и SP-D измерялись коммерчески доступными наборами EIA / ELISA (тест SP-A Kokusai-F kit, Sysmex, Kobe, Japan, комплект SP-D набора Yamasa EIA, Yamasa Co., Chiba, Япония), как описаны [6, 32]. Уровни MMP-9 и TIMP-1 определялись коммерчески доступными наборами ELISA (Amersham Biosciences, Cardiff, UK) в соответствии с инструкциями производителей. Пределы обнаружения SP-A и SP-D составляли 1,0 нг / мл и 17,2 нг / мл соответственно, а для MMP-9 и TIMP-1 0,6 нг / мл и 1,25 нг / мл соответственно.

Данные приведены как средства вместе со стандартным отклонением (SD). Все статистические анализы были выполнены с помощью программы SPSS 18.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Анализ дисперсии (ANOVA) и t-критерий для независимых групп использовался для оценки статистических значений между исследовательскими группами. Линейный многомерный регрессионный анализ был использован для изучения независимого эффекта возраста, статуса курения и COPD на SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1. Корреляции между переменными были определены с коэффициентом корреляции Пирсона. Из-за парных сравнений p-значение <0,01 считалось статистически значимым. Уровни SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1 были дополнительно проанализированы для их прогностической способности отличать пациентов с ХОБЛ от контрольных субъектов (YNS и ONS) в соответствии с кривыми рабочих характеристик (ROC).

Характеристики испытуемых приведены в таблице 1. Все молодые и средние и пожилые курильщики и некурящие имели нормальную функцию дыхательных путей в соответствии с критериями ЗОЛОТА (post bronchodilator FEV1 / FVC> 0,7) [30]. В группе ХОБЛ было 15 пациентов со стадией I, 24 пациента со стадией II и 5 пациентов со стадией III ХОБЛ в соответствии с классификацией ЗОЛОТО. Все случаи ХОБЛ были впервые диагностированы и не принимали никаких регулярных лекарств.

Характеристики пациентов

ХОБЛ: хроническая обструктивная болезнь легких; ИМТ: индекс массы тела; FVC: принудительная жизненная емкость; FEV1: объем принудительного выдоха за одну секунду. Данные отображаются как среднее (SD).

Уровень плазмы SP-A возрастал с возрастом у некурящих и курильщиков (p <0,0001 и p <0,0001), соответственно. У молодых некурящих (YNS) среднее значение составляло 22,2 ± 6,0 нг / мл, а у лиц среднего возраста / пожилых людей - 31,4 ± 10,6 нг / мл, соответствующие средние значения в YS составляли 23,0 ± 6,8 нг / мл и ОС 43,3 ± 17,5 нг / мл. Этот последний вывод может быть отчасти связан с более продолжительной историей курения ОС. Сигаретный дым не оказывал существенного влияния на уровни SP-A в молодой возрастной группе с относительно короткими историями курения. В старшей возрастной группе плазма SP-A была выше в ОС по сравнению с ОНС (р <0,0001). Важно отметить, что плазма SP-A также была выше при ХОБЛ (55,4 ± 24,6 нг / мл) по сравнению с ОС (р = 0,009) и ОНС (р <0,0001) (рис. 1А). Линейный регрессионный анализ подтвердил, что возраст (коэффициент регрессии (B) = 6,01, стандартная ошибка (SE) = 2,54, p = 0,019), курение сигарет (B = 0,45, SE = 0,07, p <0,001) и COPD (B = 17,08) , SE = 3,67, p <0,001), независимо от уровня SP-A.

Графы Box-and-whisker SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1 в плазме (A, B, C и D соответственно). Ящики представляют собой от 25-го до 75-го процентиля, сплошные линии внутри ящиков показывают медианные значения, усы — это 10-й и 90-й процентили, а точки представляют собой выбросы. *: p <0,05; **: p <0,01; ***: p <0,001 (между двумя группами, t-тест).

Уровень плазмы SP-D не изменялся с возрастом, то есть средние уровни в YNS и ONS (109,0 ± 62,3 нг / мл и 106,0 ± 41,2 нг / мл) были одинаковыми. Кроме того, не было никакой разницы между YNS и YS. В старшей группе уровни были выше в ОС (156,2 ± 90,2 нг / мл) и ХОБЛ (186,3 ± 101,9 нг / мл) по сравнению с ОНС (р = 0,012 и р <0,0001), но не было существенной разницы между ОС и ХОБЛ (рис. 1В). У пациентов с ХОБЛ были даже более высокие уровни SP-D (B = 64,72, SE = 19,53, p = 0,001), когда они были скорректированы для возраста с линейным многовариантным регрессионным анализом.

Концентрации MMP-9 в плазме были очень похожи в YNS и ONS (47,1 ± 49,1 и 44,4 ± 34,6 нг / мл), и между YNS и YS не было существенной разницы. В старшей возрастной группе уровни были выше в OS (86,5 ± 40,8 нг / мл) по сравнению с ONS (p <0,0001). Уровень ММР-9 был значительно выше при ХОБЛ, чем в ОНС (р = 0,033). Результаты MMP-9 суммированы на рисунке 1C. Линейный регрессионный анализ показал, что оба возраста (B = 0,44, SE = 0,19, p = 0,022) и курение сигарет (B = 26,0, SE = 6,91, p <0,0001) имели независимые эффекты на уровне MMP-9.

Уровень плазмы ТИМП-1 снижался с возрастом (р = 0,03), но между YNS и YS существенной разницы не было. В старшей группе уровни ТИМП-1 были выше в ОС (117,7 ± 18,2 нг / мл) и ХОБЛ (114,9 ± 23,5 нг / мл), чем в ОНС (81,3 ± 26,6 нг / мл, р <0,001 и р = 0,001 ), но не было существенной разницы между ОС и ХОБЛ (рис. 1D). Отношение ММР-9 к ТИМП-1 не менялось с возрастом. Кроме того, существенных различий между YNS и YS не было. В старшей группе соотношение MMP-9 / TIMP-1 было выше в OS (0,79 ± 0,3), чем в ONS (0,28 ± 0,2, p <0,0001), что свидетельствует о значительном дисбалансе протеазы / антипротеазы в пользу протеаз. Кроме того, линейный регрессионный анализ подтвердил независимый эффект курения на ТИМП-1 (B = 16,18, SE = 6,66, p = 0,018) и MMP-9 / TIMP-1 (B = 4,01, SE = 0,15, p = 0,014 ).

На рисунках 2, 3 и 4 показано, как SP-A, SP-D и MMP-9 связаны с возрастными, летальными годами, BMI и легочными функциями в разных исследовательских группах. Наиболее четкие корреляции можно было наблюдать с помощью плазменного SP-A по сравнению с возрастом, годами упаковки и FEV1 / FVC (рисунок 2A-D), хотя некоторые корреляции также могут наблюдаться при SP-D (рисунок 3A-D). Уровень MMP-9 в плазме коррелировал только с возрастными и летальными годами, хотя некоторые незначительные корреляции можно было наблюдать со всеми этими параметрами и ИМТ (рис. 4A-D). Уровни SP-A также коррелировали с SP-D (r = 0,36, p <0,0001).

Связь между уровнями SP-A в плазме и демографическими параметрами, возрастом (A), BMI (B), летучести (C) и FEV1 / FVC% от прогнозируемого (D), у всех испытуемых. ○ = молодые некурящие; ● = молодые курильщики; ◊ = среднего возраста / пожилые некурящие; ♦ = взрослые / пожилые курильщики; ■ = пациентов с ХОБЛ.

Взаимосвязь между уровнями SP-D в плазме и демографическими параметрами, возрастом (A), BMI (B), pack-years (C) и FEV1 / FVC% от прогнозируемого (D), у всех испытуемых. ○ = молодые некурящие; ● = молодые курильщики; ◊ = среднего возраста / пожилые некурящие; ♦ = взрослые / пожилые курильщики; ■ = пациентов с ХОБЛ.

Связь между уровнями MMP-9 в плазме и демографическими параметрами, возрастом (A), BMI (B), летучести (C) и FEV1 / FVC% от прогнозируемого (D), у всех испытуемых. ○ = молодые некурящие; ● = молодые курильщики; ◊ = среднего возраста / пожилые некурящие; ♦ = взрослые / пожилые курильщики; ■ = пациентов с ХОБЛ.

Анализ кривой ROC проводился для оценки чувствительности, специфичности и диагностической точности плазменных SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1. Области под кривой ROC были следующими: для SP-A: 0,845 (95% доверительный интервал (CI), 0,787 до 0,902, p <0,001); для SP-D: 0,734 (95% ДИ, 0,636-0,883, р <0,001); для MMP-9: 0,551 (95% ДИ, 0,450-0,652, p = 0,320) и для TIMP-1: 0,644 (95% ДИ, 0,516-0,813, p = 0,051) (фиг. 5).

Рабочие характеристические характеристики приемника SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1 в плазме (A, B, C и D, соответственно), полученные от пациентов с ХОБЛ, молодых и средних и пожилых курильщиков и контролей. Значения в скобках указывают 95% доверительные интервалы для площади под кривой (AUC).

В настоящем исследовании оценивались уровни SP-A, SP-D, MMP-9 и TIMP-1 в плазме у молодых и средних и пожилых некурящих и курильщиков, а также пациентов с ХОБЛ. Предполагается, что все эти предполагаемые маркеры ассоциируются с ХОБЛ. Когда эти потенциальные параметры были оценены, SP-A оказался наиболее перспективным маркером для ХОБЛ, поскольку его уровни были увеличены после длительного курения, а также при ХОБЛ по сравнению с ситуацией у хронических курильщиков. SP-A также четко коррелировал с возрастом, летучим пакетом и обструкцией дыхательных путей. Однако остается неясным, можно ли использовать SP-A в качестве маркера для ХОБЛ или его развития. Уровни ни одного из этих белков не были изменены из-за курения в группе молодых курильщиков, у которых были относительно короткие истории курения, никаких заболеваний или других воздействий и нормальных значений в спирометрии.

Воздействие плазмы SP-A на курение / COPD согласуется с предыдущими исследованиями, хотя есть много противоречивых результатов. Сообщалось, что уровни плазма / сыворотка SP-A повышаются при ХОБЛ в японской когорте курильщиков и пациентов с ХОБЛ и тромбоэмболиями легких [6]. Эти данные согласуются с другими исследованиями уровней SP-A в циркулирующей крови [33-36]. В недавнем протеомном исследовании легочной ткани было обнаружено, что SP-A является одним из наиболее заметно повышенных пятен при исследовании двумерным электрофорезом, т. Е. Его присутствие в пятнах подтверждается масс-спектрометрией [8]. Имеются некоторые противоположные выводы относительно циркулирующих уровней SP-A у курильщиков и / или ХОБЛ, определенных в сыворотке [20,37], легочной ткани [38] или бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) [15,16,39]. В некоторых из этих исследований SP-A был либо исследован с помощью не количественного иммуногистохимического метода, либо из БАЛ, что является проблематичным из-за его инвазивного характера и коллапса дыхательных путей при ХОБЛ. В очень немногих исследованиях изучалось влияние возраста на уровни потенциальных биомаркеров плазмы, этот отчет был сконцентрирован на этих изменениях, особенно в отношении SP-A, поскольку они могут быть замечательными и должны быть тщательно рассмотрены во всех соответствующих исследованиях ,

Было показано, что генотип и возраст пациентов оказывают влияние на уровни SP-A [40,41], а некоторые аллели SP-A могут увеличить риск развития ХОБЛ [42]. В исследовании Ohlmeier [8] было подтверждено, что SP-A представляет собой SP-A2, но анализ, используемый в настоящем исследовании, как известно, обнаруживает изоформы SP-A1 и SP-A2. Дальнейшие исследования потребуются для исследования долгосрочных изменений уровней SP-A в плазме, а также, если SP-A1 и SP-A2 предсказывают прогрессирование заболевания или же эти изменения связаны только с курением.

SP-D было предложено представить маркер ХОБЛ, особенно предсказывая его обострения [17]. Однако существуют исследования, свидетельствующие о том, что сывороточная SP-D не изменяется [6] у курильщиков / ХОБЛ или что ее уровни в БАЛ снижаются у курильщиков [15,16,43] и пациентов с ХОБЛ [44]. В настоящем исследовании уровни SP-D в плазме не различались между молодыми и пожилыми группами; они не отличались между ОС и ХОБЛ. Эти данные согласуются с нашими предыдущими результатами, не показывающими существенных изменений в SP-D легочной ткани при ХОБЛ [8]. В целом, SP-D обнаружил лишь небольшую изменчивость, возможно, некоторую возвышенность из-за курения, но изменения были меньше, чем у SP-A.

ММП-9 и ТИМП-1 постулируются как связанные с ХОБЛ и его развитием [4,5,26,27]. Именно поэтому MMP-9 и TIMP-1 были включены в настоящее исследование. Это исследование подтверждает предыдущие исследования того, что уровень MMP-9 повышается у пациентов с длительным курением [5, 45], но, насколько нам известно, исследований нет, которые исследовали уровни MMP-9 или TIMP-1 в разные возрастные группы некурящих или курильщиков. Это исследование не обнаружило существенных различий в плазме MMP-9 между YNS и YS, но, как показано ранее, изменения, наблюдаемые в MMP-9 и TIMP-1, в основном были связаны с курением. Эти данные также свидетельствуют о том, что кратковременное курение (менее 10 лет) у молодых здоровых субъектов не приводит к существенному изменению уровней циркулирующей ММР-9 или ТИМП-1. Тем не менее, длительное курение (> 10 лет) увеличило как уровни MMP-9 в плазме, так и MMP-9 / TIMP-1, что, возможно, отражает увеличение системного воспаления, хотя активное ремоделирование в дыхательных путях, очевидно, более заметно. Поскольку существует несколько ММР и ТИМП, только отношение MMP-9 / TIMP-1 не отражает общий баланс протеазы / антипротеазы в легких. Было проведено много исследований по ММР и протеаз / антипротеазному балансу при ХОБЛ, но пока неясно, предсказывают ли эти изменения ХОБЛ в продольном положении.

Слабость этого исследования заключается в том, что в молодой возрастной группе большинство людей были мужчинами. Поэтому мы сравнили результаты между полами в группе среднего возраста / пожилых людей, но не смогли обнаружить существенных различий между полами в отношении уровней SP-D, MMP-9 или TIMP-1. Только уровень SP-A в плазме был значительно выше у женщин старшего возраста / старшего возраста по сравнению с мужчинами (p = 0,012). Это было также кросс-секционное исследование, и поэтому ценность этих белков при ХОБЛ потребует дальнейших перспективных исследований. Это исследование имеет значительные преимущества, т.е. ни один из некурящих или курильщиков не имел других воздействий. Хронические курильщики, страдающие ХОБЛ, не принимали никаких лекарств от ХОБЛ, поскольку они недавно диагностировали ХОБЛ, и ни у кого из них не было никаких других заболеваний или они принимали какие-либо лекарства. Это не исключает существования сердечно-сосудистых или других вовлечений органов, хотя все субъекты считали себя здоровыми [28].

В заключение, уровень SP-A в плазме может быть перспективным маркером для ХОБЛ, он отображает изменения, связанные с возрастом, и демонстрирует значительную возвышенность из-за курения, но проспективные исследования потребуются для разъяснения значимости SP-A, а также потенциальных новых маркеров ХОБЛ. В нашей лаборатории продолжаются два проспективных исследования [28,46], где оцениваются потенциальные маркеры и будут протестированы в течение следующих двух и пяти лет. Эти и другие потенциальные маркеры могут также оказаться важными у молодых курильщиков, особенно при оценке раннего повреждения легких в случаях, когда курение или другие воздействия окружающей среды сочетаются с нарушением развития легких и / или другими аномалиями легкого.

B: коэффициент регрессии; ИМТ: индекс массы тела; CI: доверительный интервал; ХОБЛ: хроническая обструктивная болезнь легких; EIA: иммуноферментный анализ; ИФА: фермент-связанный иммуносорбентный анализ; FEV1: объем принудительного выдоха за одну секунду; FVC: принудительная жизненная емкость; GOLD: Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни легких; MMP: матриксная металлопротеиназа; ОНС: средние / пожилые (старые) некурящие; ОС: пожилые люди / пожилые (старые) курильщики; ROC: рабочая характеристика приемника; TIMP: тканевый ингибитор металлопротеиназы; SD: стандартное отклонение; SE: стандартная ошибка; SP: поверхностно-активное вещество; YNS: молодые некурящие; YS: молодые курильщики.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

HI участвовал в планировании исследования, выполнял часть лабораторного анализа, вместе с PN проводил статистический анализ и интерпретацию данных, составлял таблицы, проводил литературные исследования и участвовал в процессе написания. WM подготовил цифры и участвовал в процессе написания. TT участвовал в наборе и опросе предметов и их характеристиках и отвечал за анализ функции легких. NL участвовал в лабораторном анализе и в процессе написания. PN внесла свой вклад в статистический анализ и интерпретацию данных. HK отвечал за анализ SP-A и пересмотр рукописи. NI вычислил кривые ROC и подготовил цифры. В.К. является главным исследователем, разработал исследование, провел литературные исследования и сыграл важную роль в письменном процессе. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Доступ к этой публикации можно получить здесь:

хттп://ввв.биомедцентраль.ком/1471-2466/11/19/препуб

Тиина Марджома признана за отличную техническую помощь. Эта работа была частично поддержана Фондом финской организации по борьбе с туберкулезом, Фондом Ярджонсона, специальной правительственной субсидией для исследований в области здравоохранения (EVO) Центральной больницы Хельсинского университета и Центральной больницы в Лапландии, Исследовательской программой по интеллектуальному мониторингу здоровья и благополучия ( Tekes IMO) и гранты для научных исследований Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *