Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Статус курения и противовоспалительные макрофаги при бронхоальвеолярном лаваже и индуцированной мокроте при ХОБЛ

Smoking status and anti-inflammatory macrophages in bronchoalveolar lavage and induced sputum in COPD
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3072953/

Макрофаги были вовлечены в патогенез ХОБЛ. M1 и M2 макрофаги представляют собой субпопуляции, демонстрирующие про- и противовоспалительные свойства. Мы предположили, что прекращение курения влияет на гетерогенность макрофагов в легких пациентов с ХОБЛ. Наша цель заключалась в изучении гетерогенности макрофагов с использованием M2-маркера CD163 и выбранных про- и противовоспалительных медиаторов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL) и индуцированной мокроты у курильщиков и бывших курильщиков с ХОБЛ.

114 пациентов с ХОБЛ (72 современных курильщика, 42 бывших курильщика, медиана прекращения курения 3,5 года) изучались в поперечном разрезе и подвергались индукции мокроты (M / F 99/15, возраст 62 ± 8 [средний ± SD] лет, 42 (31 -55) [средний (диапазон)] packyears, post-bronchodilator FEV1 63 ± 9% предсказано, без стероидов за 6 месяцев). БАЛ был собран у 71 пациента. CD163 + макрофаги определяли количественно в БАЛ и цитоспинах мокроты. Про- и противовоспалительные медиаторы измеряли в БАЛ и супернатантах мокроты.

Экс-курильщики с ХОБЛ имели более высокий процент, но меньшее количество CD163 + макрофагов в БАЛ, чем у курильщиков (83,5% и 68,0%, р = 0,04, 5,6 и 20,1 × 104 / мл, р = 0,001 соответственно). Процент CD163 + M2 макрофагов был выше в БАЛ по сравнению с мокротой (74,0% и 30,3%, р <0,001). Уровни BAL M-CSF были выше у курильщиков, чем у бывших курильщиков (571 пг / мл и 150 пг / мл, p = 0,001) и коррелировали с количеством макрофагов CD163 + BAL (Rs = 0,38, p = 0,003). Никаких существенных различий между курильщиками и бывшими курильщиками в уровнях провоспалительных (IL-6 и IL-8) и противовоспалительных (элафиновых и секреторных лейкоцитарных ингибиторов протеинов [SLPI]) в БАЛ и мокроте.

Наши данные свидетельствуют о том, что прекращение курения частично изменяет поляризацию макрофагов in vivo на периферии легкого по отношению к противовоспалительному фенотипу, что не сопровождается уменьшением воспалительных параметров.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) характеризуется прогрессирующим снижением функции легких и аномальной воспалительной реакцией в дыхательных путях, главным образом вызванной сигаретным дымом [1]. Реакция воспаления в малых дыхательных путях при ХОБЛ характеризуется накоплением макрофагов, нейтрофилов, CD8 + -лимфоцитов и В-клеток и связана с тяжести ХОБЛ [2,3]. Прекращение курения — эффективное лечение для снижения снижения функции легких [1]. Тем не менее, воспаление дыхательных путей при бронхиальной биопсии, мокроте и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) пациентов с ХОБЛ (преимущественно) сохраняется через год после прекращения курения [4-6]. Ранее мы показали, что количество макрофагов и нейтрофилов в бронхиальных биопсиях сопоставимо у современных и бывших курильщиков с ХОБЛ [7]. Однако эффекты курения на фенотипы макрофагов при ХОБЛ не полностью понятны.

Макрофаги играют важную роль в врожденном и адаптивном иммунитете и образуют гетерогенную популяцию [8,9]. Макрофаги показывают поляризованные фенотипы, с помощью которых их можно разделить на субпопуляции. Провоспалительные или классически активированные макрофаги (M1) проявляют провоспалительные и цитотоксические свойства и могут искоренить внутриклеточные патогены. Напротив, противовоспалительные или альтернативно активированные макрофаги (М2) проявляют противовоспалительные свойства и участвуют в ремонте [8,10]. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) может генерировать M1 in vitro из моноцитов периферической крови человека, а макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) может генерировать M2 [11]. M1 выделяют провоспалительные цитокины, такие как IL- (интерлейкин) -12 и фактор некроза опухоли (TNF) -α, обладают хорошей антигенной способностью и способствуют иммунитету Th1. Напротив, M2 выделяют противовоспалительные медиаторы, такие как IL-10, проявляют слабую антигенную способность и способствуют развитию T-регуляторных клеток [11-13]. Альвеолярные макрофаги показывают противовоспалительные М2-характеристики [14-16], которые можно отличить от провоспалительных макрофагов с использованием маркеров M2, таких как рецептор CD163 [17,18]. По сравнению с клетками M1 макрофаги M2 имеют высокую фагоцитарность. Фагоцитарная способность альвеолярных макрофагов снижается при курении больных ХОБЛ и улучшается с прекращением курения [19]. Это предполагает фенотипическое изменение и роль гетерогенности макрофагов при ХОБЛ, которая также была предложена, например, прогрессирование опухоли [20], атеросклероз [21] и заболевания почек [22].

Хотя воспаление сохраняется, прекращение курения показывает положительные клинические эффекты [1]. Это говорит о том, что другие механизмы играют полезную роль, например, регулирование поляризации макрофагов. Мы выдвигаем гипотезу о том, что у пациентов с умеренной и тяжелой формой ХОБЛ: i) у бывших курильщиков больше М2 и противовоспалительных медиаторов в БАЛ и индуцированная мокрота по сравнению с текущими курильщиками; ii) М2 и противовоспалительные медиаторы относительно выше в периферических дыхательных путях (как отобранных БАЛ), чем в центральных дыхательных путях (в качестве образцов, полученных путем индуцированной мокроты).

Характеристики и методы пациента были описаны ранее [7,23,24]. Короче говоря, мы изучили 114 клинически стабильных пациентов с умеренной и тяжелой ХОБЛ [GLUCOLD study (Гронинген Лейденский университетский кортикостероид при обструктивной болезни легких)] поперечно. Они были в возрасте 45-75 лет, курили ≥10 packyears и были текущими или бывшими курильщиками (вышли ≥1 месяц). Пациенты с диагнозом астма, дефицит α1-антитрипсина и те, кто использовал кортикостероиды в течение последних шести месяцев, были исключены; им разрешалось использовать бронходилататоры короткого действия. Было получено одобрение комитетов по медицинской этике обоих центров, и все пациенты предоставили письменное информированное согласие [23]. Спирометрия проводилась в соответствии с международными рекомендациями [25]. У всех пациентов была бронхоскопия с БАЛ и индукция мокроты при отдельных посещений.

Фиброоптическая бронхоскопия была выполнена у всех пациентов и обработана с использованием стандартизованного протокола, как описано ранее [7,24,26,27]. Процедура БАЛ была прекращена во время исследования из-за этических соображений, поскольку четыре из 71 пациента испытали серьезное неблагоприятное событие, которое, как полагали, было связано с процедурой БАЛ (плевральная боль, лихорадка, пневмония, кратковременная сердечная ишемия). Индукция мокроты осуществлялась с использованием гипертонических аэрозолей хлорида натрия (вес. / Об. 4,5%) в течение максимальной продолжительности три раза пять минут и обрабатывалась по всему образцу.

БАЛ фильтровали через нейлоновую марлю и центрифугировали в течение 10 минут при 450 * g при 4 ° C. Если макроскопически присутствовали эритроциты, клеточный осадок ресуспендировали в буфере для лизиса (100 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), содержащего 0,83 г NH4Cl, 0,1 г KHCO3 и 0,004 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 7,4) в течение 5 минут и центрифугировали (450 * g, 4 ° C). Осадок клеток ресуспендировали в 0,1% глюкозе (мас. / Об.) В PBS и снова центрифугировали при тех же условиях. Обработка БАЛ и количество дифференциальных клеток проводили аналогично методам, описанным для обработки мокроты, за исключением того, что дитиотреитол не использовался для гомогенизации. Жизнеспособность некемных клеток в БАЛ была сходной у курильщиков и бывших курильщиков (82 ± 12% против 82 ± 9%, р = 0,96).

Мокроту обрабатывали по всему образцу, и все образцы обрабатывали дитиотреитолом 0,1% (DTT, Sputolysin, Calbiochem) [28]. Клеточные супернатанты как БАЛ, так и мокроты хранили при -80 ° С.

Из образцов BAL и мокроты цитоспины центрифугировали на покрытых вершиной стеклах [28]. Образец мокроты считался адекватным, когда процентные плоские клетки составляли менее 80%. После сушки в течение 1 часа цитоспины обертывают в алюминиевую фольгу и хранят при -80 ° C в ожидании иммуноцитохимического окрашивания.

Замороженные цитоспины БАЛ и мокроты доводились до комнатной температуры за один час. Цитоспины БАЛ фиксировали в ацетоне при -20 ° С в течение 10 минут, сушили и эндогенную пероксидазную активность блокировали путем инкубации в метаноле и 0,3% перекиси водорода в течение 10 минут. Цитоспины мокроты фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS 0,9% (мас. / Об.) В течение 1 часа, промывали PBS и активность эндогенной пероксидазы блокировали азидом натрия 0,1% (мас. / Об.) И перекисью водорода 0,18% (мас. / Об.), в PBS в течение 30 минут. Неспецифическое связывание блокировалось в PBS, 1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 5% нормальной сыворотки человека (NHS) в течение 45 минут только для цитоспинов мокроты. Mouse-anti-human CD163 (клон GHI / 61, BD Pharmingen) использовали в качестве первичного антитела для окрашивания макрофагов типа M2 [17] при разведении 1:75 для цитоспинов BAL и 1:50 для цитоспинов мокроты и оба инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Первичное антитело разводили в PBS / 1% BSA для цитоспинов BAL и в PBS / 1% BSA / 1% NHS для цитоспинов мокроты. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированную с пероксидазой хрена пероксидазу (DAKO, Glostrup, Дания) и инкубировали в течение 30 минут, хромоген NovaRed (Vector, Burlingame, CA) в течение 7 минут. Все стадии промывки были с PBS. Все слайды контрастировали с гематоксилином Майера (Klinipath, Duiven, Нидерланды) и затем устанавливали с помощью монтажной среды Pertex (HistoLab, Гётеборг, Швеция).

Мы рассмотрели возможность того, что DTT, используемый для сжижения индуцированных образцов мокроты, влияет на обнаружение CD163. С этой целью мы создали M1 и M2 культурой моноцитов в течение шести дней в присутствии GM-CSF и M-CSF соответственно [11] и обработали эти клетки DTT до анализа на основе FACS экспрессии CD163 и получения цитоспинов с последующим иммуноцитохимическим окрашиванием для CD163.

Два цитоспина на образец окрашивали для дифференциальных подсчетов клеток с May-Grünwald Giemsa (MGG). Дифференциальные подсчеты клеток выражали в процентах от зародышевых клеток, исключая плоскоклеточные клетки. Средний процент плоскоклеточных клеток составлял 7,5% (2,1-13,3%). CD163 + и CD163-макрофаги были перечислены на основе морфологии двумя независимыми опытными исследователями с увеличением 400 × (рисунок 1). Чтобы избежать смещения наблюдателя, слайды кодировались без знания клинических данных. Среднее число CD163 + макрофагов, деленное на общее количество макрофагов, было использовано для расчета процента CD163 + макрофагов. Общее количество CD163 + макрофагов на объем рассчитывали по проценту CD163 + макрофагов, умноженному на общее количество макрофагов. Повторяемость между двумя наблюдателями (LIK и SVW) была хорошей, как измерено коэффициентом внутрикласса (ICC), с двухсторонней случайной моделью и абсолютным соглашением. Для BAL CD163 + и CD163-макрофагов ICC были как 95%; для мокроты CD163 + и CD163-макрофагов ICC составляли 97% и 93% соответственно.

Микрофотография связанного с мембраной окрашивания CD163 на BAL и клетках мокроты. Цитоспин БАЛ показан на левой фотографии и цитоспин мокроты на правой фотографии. Шкала шкалы = 20 мкм

Коммерчески доступные наборы были использованы для обнаружения GM-CSF (Bender Medsystems), M-CSF (R & D-системы), IL-6, IL-8, IL-10 (Sanquin), IL-12 (IL-12 / IL-23p40, R & D) и elafin (HBT) в супернатантах мокроты и BAL. SLPI ELISA была разработана в нашей лаборатории в Медицинском центре Лейденского университета [29]. Абсорбцию измеряли при 450 нм с использованием считывателя Microplate (модель 680, Bio-Rad, Hercules, CA) и программного обеспечения Microplate Manager (версия 5.2.1, Bio-Rad). Нижние пределы обнаружения мокроты составили 300 пг / мл (SLPI), 2,5 нг / мл (элафин), 38 мкг / мл (IL-6) и 400 мкг / мл (IL-8). Нижние пределы обнаружения для БАЛ составляли 150 пг / мл (M-CSF), 0,2 нг / мл (SLPI), 5,5 мкг / мл (IL-6) и 15 пг / мл (IL-8). В BAL и супернатантах мокроты уровни IL-10, IL-12, GM-CSF были ниже нижнего предела обнаружения. Кроме того, elafin и M-CSF были необнаружимыми в БАЛ и супернатантах мокроты соответственно. В случае, если более 10% образцов были ниже пределов обнаружения, значение этих образцов было установлено на нижнем пределе обнаружения (M-CSF и IL-6 в БАЛ).

Представлены средние значения и стандартные отклонения (SD) или медианы с межквартильными диапазонами (IQR). Когда это необходимо, переменные логарифмически трансформировались перед статистическим анализом. Различия между курильщиками и бывшими курильщиками изучались с использованием χ2-тестов, двухсторонних непарных t-тестов и тестов Манна-Уитни. Мы использовали коэффициент корреляции Спирмена (Rs) для анализа корреляций. Для исправления восстановления БАЛ использовалась множественная линейная регрессия. Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения SPSS 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Статистическое значение было выведено при p <0,05.

В общей сложности в исследовании участвовали 114 пациентов с ХОБЛ, 72 курильщика и 42 бывших курильщика, как показано в таблице 1. Все пациенты с наивными стероидами имели умеренную или тяжелую ХОБЛ (этап II-III ЗОЛОТО) на основе среднего (SD) пост-бронходилататор FEV1 из 63 (9)% предсказал и имел среднюю (25-ю и 75-ю процентильную) историю курения 42 (31-55) лет. Общая группа пациентов и невыбранная группа, в которой выполнялась БАЛ, были сопоставимы. Из образцов БАЛ (первые 71 пациент) 62 были пригодны для анализа. 106 из 109 мокроты были пригодны для анализа. BAL и дифференциалы клеток и концентрации клеток представлены на рисунках 2 и 3. Процент и количество макрофагов в БАЛ были значительно выше у курильщиков, чем у бывших курильщиков (95,8% и 74,2%, р <0,001, 34,0 и 7,6 × 104 / мл, p = 0,008 соответственно). Среднее восстановление БАЛ составляло 41 (18)%; вызвавших курение, было выше по сравнению с бывшими курильщиками (45 (16)% и 35 (19)%, p = 0,039 соответственно).

Характеристики пациента для современных и бывших курильщиков с ХОБЛ

Данные представлены как среднее (SD) или медиана (IQR), если не указано иное. Эти характеристики пациента были описаны ранее [7].

pred = предсказано; FEV1 = объем принудительного выдоха за одну секунду; IVC = жизненная емкость вдоха; KCO = коэффициент переноса монооксида углерода.

* p <0,05 по сравнению с курильщиками с ХОБЛ (χ2 тест на половые различия, два хвостатых непарных t-теста для других данных).

Баланс дифференциальных клеток БАЛ выражен в процентах и ​​концентрации клеток пациентов с ХОБЛ. Процент показан на левой панели, концентрации клеток на правой панели. Открытые круги представляют бывших курильщиков, замкнутые кружки представляют нынешних курильщиков. Горизонтальные полосы представляют медиан. P-значения корректируются для восстановления жидкости BAL с использованием множественной линейной регрессии.

Дифференциальные клетки мокроты, выраженные в процентах и ​​концентрации клеток пациентов с ХОБЛ. Процент показан на левой панели, концентрации клеток на правой панели. Открытые круги представляют бывших курильщиков, замкнутые кружки представляют нынешних курильщиков. Горизонтальные полосы представляют медиан.

DTT, используемый для сжижения индуцированной мокроты, не влиял на обнаружение CD163 с помощью FACS и иммуноцитохимического окрашивания (данные не показаны). У бывших курильщиков с ХОБЛ был значительно более высокий процент противовоспалительных CD163 + макрофагов в БАЛ, чем у современных курильщиков (83,5% и 68,0%, р = 0,04 соответственно) (рисунок 4), независимо от восстановления БАЛ. Однако у бывших курильщиков было меньшее количество противовоспалительных макрофагов в БАЛ по сравнению с текущими курильщиками (5,6 и 20,1 × 104 / мл, p = 0,001 соответственно). Процент CD163 + макрофагов был выше в БАЛ по сравнению с мокротой (74,0% и 30,3%, р <0,001 соответственно). У бывших курильщиков был аналогичный процент и количество противовоспалительных макрофагов в индуцированной мокроте по сравнению с текущими курильщиками с ХОБЛ (25,0% и 31,1%, p = 0,89, 10,1 и 6,8 × 104 / мл, p = 0,24 соответственно).

Процент и количество макрофагов CD163 + в БАЛ и индуцированная мокрота у пациентов с ХОБЛ. Процент (левая панель) и количество макрофагов CD163 + (правая панель) в БАЛ и индуцированная мокрота между бывшими курильщиками (открытые символы) и курильщиками (закрытые символы) с ХОБЛ. Горизонтальные полосы представляют медиан. P-значения корректируются для восстановления жидкости BAL с использованием множественной линейной регрессии.

Уровни BAL M-CSF были ниже у бывших курильщиков, чем у курильщиков (p = 0,001) (рисунок 5 и таблица 2). Эта разница не была объяснена различиями в восстановлении БАЛ между обеими группами, ни отношением М-КСФ к противовоспалительным макрофагам. Не обнаружено корреляции между уровнями восстановления и уровнями BAL M-CSF. Противовоспалительный медиатор SLPI в БАЛ обратно коррелировал с выздоровлением. Провоспалительные медиаторы IL-6 и IL-8 в БАЛ были сопоставимы между курильщиками и бывшими курильщиками и не зависели от выздоровления. Не было обнаружено различий в индуцированной мокроте для провоспалительных уровней IL-6, IL-8 и противовоспалительного медиатора elafin. Уровни SLPI, IL-6 и IL-8 в мокроте были выше уровней в БАЛ (все р <0,001). M-CSF был ниже нижних пределов обнаружения в индуцированной мокроте, а элафин не обнаруживался в БАЛ.

Растворимые медиаторы измеряли в БАЛ и индуцировали супернатанты мокроты пациентов с ХОБЛ. Экс-курильщики представлены открытыми символами и курильщиками закрытыми символами. Горизонтальные полосы представляют медиан. P-значения корректируются для восстановления жидкости BAL с использованием множественной линейной регрессии.

Растворимые медиаторы, измеренные в БАЛ, и индуцированные супернатанты мокроты курильщиков и бывших курильщиков с ХОБЛ

Данные представлены как медианы (IQR 25-75-й процентили).

Количество CD163 + макрофагов в БАЛ коррелировало с постинфронкадилятором FEV1 (% предсказано) (Rs = 0,255, p = 0,05) и FEV1 / IVC% (Rs = 0,374; p = 0,004). Никаких корреляций между количеством и процентом CD163 + макрофагов в БАЛ и мокроте, а также количеством упаковок или продолжительностью прекращения курения не обнаружено. Не было найдено никаких корреляций между количеством упаковок или продолжительностью прекращения курения и концентрациями всех растворимых медиаторов в БАЛ и индуцированной мокроте.

BAL M-CSF коррелирует с количеством CD163 + макрофагов в БАЛ (Rs = 0,379; p = 0,003). BAL SLPI отрицательно коррелировал с количеством и процентом макрофагов и положительно коррелировал с количеством и процентом нейтрофилов в БАЛ (все р <0,05). BAL SLPI и количество макрофагов CD163 + коррелировали обратно (Rs = -0,353, p = 0,008). SLPI мокроты коррелирует с количеством и процентом CD163 + макрофагов в мокроте (Rs = 0,377, p <0,001 и Rs = 0,236, p = 0,021, соответственно). И BAL, и IL-8 мокроты коррелировали обратно с процентными макрофагами, но положительно с процентом и количеством нейтрофилов (все p <0,05). Это отношение не было обнаружено для ИЛ-6. Наблюдалась тенденция корреляции между IL-8 мокроты и процентом макрофагов CD163 + (Rs = -0,189, p = 0,061). Процент, но не число CD163 + макрофагов в БАЛ, показал тенденцию к корреляции с мокротой (Rs = 0,267, p = 0,053).

Это исследование впервые показало, что процент макрофагов с противовоспалительными характеристиками типа М2 (как показано экспрессией CD163) значительно выше в БАЛ от бывших курильщиков, чем у курильщиков с ХОБЛ. Кроме того, процент противовоспалительных макрофагов был выше в БАЛ, чем в индуцированной мокроте, что указывает на преобладание этого фенотипа макрофагов на периферии легкого. BAL M-CSF коррелирует с количеством CD163 + макрофагов в БАЛ. Результаты вместе согласуются с гипотезой о том, что прекращение курения вызывает сдвиг фенотипа просветных макрофагов в сторону более противовоспалительного фенотипа, который ограничен периферией легкого. Хотя мы наблюдали более высокий процент макрофагов M2-типа в БАЛ у бывших курильщиков, это не сопровождалось уменьшением воспалительных параметров, таких как нейтрофилы и провоспалительные медиаторы.

Наше исследование показывает, что у бывших курильщиков с ХОБЛ более высокий процент противовоспалительных макрофагов в БАЛ, чем у современных курильщиков. Наши результаты по поляризации легочного макрофага также расширяют предыдущие наблюдения. Во-первых, мы обнаружили, что макрофаги, извлеченные из индуцированной мокроты, имеют меньше противовоспалительных свойств, чем от БАЛ. Предыдущее исследование показало, что индуцированная мокрота пациентов с ХОБЛ содержит большинство провоспалительных макрофагов на основе их экспрессии HLA-DR и способности продуцировать TNFα, в отличие от контрольных субъектов [30]. Однако эти авторы только проанализировали маркеры провоспалительных макрофагов, и большинство пациентов использовали кортикостероиды, которые могли повлиять на фенотип макрофагов [17]. Во-вторых, мы показали, что у бывших курильщиков в БАЛ больше противовоспалительных макрофагов, чем у современных курильщиков. Это согласуется с недавней статьей, свидетельствующей о том, что у курильщиков, не курирующих курильщиков, были более высокие уровни БАЛ-CCL18, хемокин, экспрессируемый альтернативно активированными макрофагами [31]. Более того, предыдущие исследования показали, что противовоспалительные макрофаги обладают более высокой фагоцитарной способностью [8,10]. Поэтому наши результаты согласуются с другим исследованием, демонстрирующим, что альвеолярные макрофаги современных курильщиков с ХОБЛ показывают снижение фагоцитоза по сравнению с бывшими курильщиками [19]. Кроме того, активное курение, но также и наличие ХОБЛ может быть связано с нарушенной фагоцитарной способностью альвеолярных макрофагов (и, следовательно, преобладанием провоспалительных макрофагов) [32-34]. Однако, в отличие от этих и наших выводов, недавнее исследование показало, что курение может усилить дифференциацию макрофагов в противовоспалительный фенотип, поскольку курение сигарет привело к полному альвеолярному макрофагу человека, страдающему ХОБЛ, in vivo, к усиленной экспрессии генов, связанных с М2, и подавление генов M1 [35]. Это исследование включало только 12 пациентов с ХОБЛ с преимущественно ЗОЛОТОЙ стадией I. Возможное объяснение этой очевидной разницы с нашими наблюдениями заключается в том, что направление воздействия курения на дифференциацию макрофагов может определяться тяжести заболевания.

Ранее в нескольких исследованиях оценивали влияние курения на растворимые медиаторы. Мы обнаружили сопоставимые уровни SLPI в БАЛ между текущими курильщиками и бывшими курильщиками с ХОБЛ в соответствии с результатами исследования 25 случаев курения, курения и курения пациентов с ХОБЛ с стадией ЗОЛОТО II-III [36]. Мы не обнаружили различия в IL-6 IL-6 и IL-8 и IL-6 мокроты между текущими курильщиками и бывшими курильщиками с ХОБЛ в соответствии с двумя предыдущими исследованиями [37,38].

Мы считаем, что наше исследование имеет несколько преимуществ. Мы изучили большую когорту хорошо охарактеризованных пациентов с ХОБЛ, в которых были собраны мокрота (n = 114) и БАЛ (n = 71), тогда как предыдущие исследования были меньшего размера [30,31,36,39]. Кроме того, мы изучали пациентов, не подозревающих стероидов, исключая возможные влияния ингаляционной терапии кортикостероидами на экспрессию CD163. Это важно, поскольку в предыдущих исследованиях было показано, что дексаметазон индуцирует экспрессию CD163 на моноцитах и ​​макрофагах in vitro [17]. Цитоспины BAL и мокроты были подсчитаны вручную двумя независимыми исследователями одновременно (LIK и SVW). CD163-макрофаги, а также CD163 + макрофаги были легко распознаны. Повторяемость между наблюдателями была хорошей, измеряемой коэффициентом корреляции внутрикласса (данные не показаны).

При интерпретации наших результатов необходимо учитывать ряд ограничений. Во-первых, это было кросс-секционное исследование, и нельзя исключать, что наша группа бывших курильщиков бросила курить, потому что у них было больше симптомов курения, и у них, возможно, были разные фенотипы макрофагов, прежде чем они ушли. Кроме того, мы не подтвердили статус курения в результате лабораторных испытаний, что соответствует другим исследованиям поперечного сечения [4,5] и, следовательно, не исключает возможности того, что некоторые бывшие курильщики все еще курили. Во-вторых, образцы БАЛ были недоступны из всех предметов нашего исследования из-за этических соображений. Поскольку этого не ожидалось, маловероятно, чтобы был выбран смещение выбора для результатов БАЛ. Тем не менее, значительная разница в противовоспалительных макрофагах в БАЛ была обнаружена между курильщиками и бывшими курильщиками. Дальнейшие исследования необходимы для изучения того, наблюдаются ли наблюдаемые различия в окрашивании CD163 на макрофагах при сравнении текущих или бывших курильщиков без ХОБЛ с некурящими и является ли экспрессия CD163 специфической особенностью ХОБЛ. В-третьих, мы сосредоточились только на маркере CD163 для макрофагов M2, что может привести к упрощению наших выводов. Более того, оказывается, что популяция макрофагов M2 более гетерогенна, чем популяция M1 [9], а субпопуляции M2 не были учтены в нашем анализе. Очевидно, что представляет интерес оценить, может ли использование провоспалительных или других противовоспалительных маркеров (таких как аргиназа или iNOS) подтвердить наши результаты и определить ли связанные функциональные различия. В настоящее время нет общего согласия относительно четко определенных маркеров для макрофагов M1.

В-четвертых, мы обнаружили, что процент CD163 + клеток выше у бывших курильщиков с ХОБЛ, тогда как число CD163 + клеток выше у курильщиков с ХОБЛ. Кроме того, мы наблюдали более высокий процент и количество макрофагов в БАЛ от курильщиков по сравнению с бывшими курильщиками, что, вероятно, является следствием более активного набора моноцитов из кровообращения. Поэтому неудивительно, что курильщики имеют большее количество CD163 + клеток в БАЛ, так как у них больше макрофагов в БАЛ. Мы выдвигаем гипотезу о том, что проценты и цифры предоставляют различную и бесплатную информацию: проценты лучше отражают окружающую среду во время дифференциации, тогда как число клеток является результатом как набора, так и дифференциации. В-пятых, несколько растворимых медиаторов были ниже нижних пределов обнаружения в супернатантах мокроты и БАЛ. Наконец, анализ цитоспинов с использованием иммуноцитохимии является полуколичественным измерением и поэтому может приводить к неверным интерпретациям. Использование, например, Анализ FACS идеально сочетается с функциональным анализом, например. фагоцитарная способность макрофагов, может быть более точной для оценки равновесия между про-и противовоспалительными макрофагами в наших образцах. К сожалению, свежие образцы не были доступны во время этих исследований.

Как мы можем объяснить наши результаты? Макрофаги на периферии легкого у здоровых людей проявляют в основном противовоспалительные характеристики, которые могут быть вовлечены в подавление воспаления в этой области легкого. Наше исследование, а также недавние данные других авторов [19,40] показывают, что противовоспалительная среда может превратиться в провоспалительную среду, когда ХОБЛ развивается у курильщиков. Это согласуется с наблюдением, что уровни IL-10 ниже, а уровни GM-CSF и Matrix Metalloproteinase (MMP) -12 выше в мокроте и БАЛ от пациентов с ХОБЛ по сравнению с здоровыми средствами контроля [39,41,42]. Воспалительные заболевания легких, включая ХОБЛ [43], характеризуются увеличением местного производства GM-CSF, которые могут способствовать развитию провоспалительного фенотипа макрофагов в дополнение к его установленному влиянию на выживаемость нейтрофилов [44]. Макрофаги сохраняют свою пластичность даже при дифференцировке в клетки M1 или M2 и могут переключать свой фенотип в зависимости от наличия соответствующих стимулов [45, 46]. В этом исследовании мы добавляем к области, что прекращение курения может искажать гетерогенность альвеолярного макрофага в отношении более противовоспалительного фенотипа, который характеризуется М2-маркером CD163. Провоспалительные макрофаги являются преобладающим фенотипом в центральных дыхательных путях, что можно объяснить высоким воздействием патогенов и воздействием на окружающую среду по сравнению с макрофагами в периферических дыхательных путях. Более высокий процент и количество нейтрофилов в образцах мокроты соответствуют этому наблюдению. Преобладание противовоспалительных макрофагов на периферии легкого может помочь сохранить эту область, которая является центральной для газообмена, без чрезмерного воспаления.

Наши результаты показывают, что прекращение курения может изменить поляризацию макрофагов с провоспалительным по отношению к CD163, выражающему противовоспалительный фенотип, что может уменьшить воспаление и улучшить восстановление. Наши выводы о положительной связи между лучшей функцией легких и другими противовоспалительными макрофагами M2 соответствуют этому. Мы предполагаем, что сдвиг фенотипа макрофагов способствует дальнейшим клиническим последствиям прекращения курения. Поэтому пластичность фенотипа макрофагов и возможность модулировать этот фенотип могут иметь отношение к лечению хронического воспаления, включая ХОБЛ.

Это исследование показывает, что предыдущее прекращение курения может вносить вклад в противовоспалительный фенотип внутрипросветных макрофагов в БАЛ пациентов с курением ХОБЛ в условиях in vivo. Необходимы дополнительные исследования, чтобы еще больше охарактеризовать этот фенотип и продемонстрировать его влияние на местное воспаление. Кроме того, необходимы исследования для исследования того, ограничены ли они люминальными макрофагами или присутствуют в легочной ткани. Проспективные исследования необходимы, чтобы показать, способствует ли противовоспалительное лечение фенотипу противовоспалительного макрофага in vivo и влияет ли это на лечебные эффекты на воспаление и клинические исходы, такие как снижение функции легких.

Это исследование финансировалось Нидерландской организацией научных исследований (NWO), Нидерландским фондом астмы (NAF), Stichting Astma Bestrijding (SAB), GlaxoSmithKline (GSK) из Нидерландов, Университетским медицинским центром Гронинген (UMCG) и Медицинским центром Лейденского университета ( LUMC).

LIK, TSL, JBS, WT, PJS, DSP и PSH разработали дизайн исследования и эксперименты. DSP и KFR выполняли бронхоскопию. JAS, SVW и LIK отвечали за иммуноцитохимическое окрашивание и подсчет клеток. LIK статистически проанализировал данные. LIK и PSH составили рукопись. SEB, WT, PJS, KFR и DSP, критически пересмотрены, и все авторы одобрили окончательную рукопись.

Авторы благодарны пациентам за сотрудничество в нашем исследовании.

Авторы также благодарны д-ру N.D.L. Savage (Department of Infectious Diseases, LUMC) за помощь в создании макрофагов M1 и M2 из моноцитов крови для проверки достоверности FACS.

Исследовательская группа GLUCOLD состоит из:

Университет Гронингена и Университетский медицинский центр Гронинген, Гронинген, Нидерланды, отдел аллергологии: Х. Ф. Кауфман и Д. де Реус. Отдел эпидемиологии: H.M. Boezen, D.F. Янсен и Дж. М. Вонк. Кафедра патологии: M.D.W. Баренцен, В. Тименс и М. Зейнстра-Смит. Отдел общей практики: A.J. Лютейн, Т. ван дер Молен и Дж. Тер Вин. Отделение пульмонологии: M.M.E. Госман Н.Н. десять Хакен, Х.А. Kerstjens, M.S. ван Маарен, Д.С. Постма, К.А. Вельтман, А. Вербоккем, И. Верхаж и Х.К. Винк-Клустер.

Лейденский университетский медицинский центр, Лейден, Нидерландский департамент общей практики: Г.А. Тиаденс. Отдел медицинского принятия решений: Дж.Б. Снейк-Стробанд и Дж. К. Sont. Кафедра пульмонологии: Дж. Гаст-Строкман, П.С. Хиемстра, К. Янссен, Т.С. Lapperre, K.F. Rabe, A. van Schadewijk, J.A. Schrumpf, J. Smit-Bakker, P.J. Sterk, J. Stolk, A.C.J.A. Тире, Х. ван дер Вина, М.М.Е. Wijffels и L.N.A. Виллемс.

Академический медицинский центр, Амстердамский университет, Амстердам, Нидерландское отделение респираторной медицины: P.J. Sterk.

Университет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия, Т. Мауад.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *