Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Выращивание колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов в индуцированной мокроте и слизистой оболочке бронхов при астме и ХОБЛ

Granulocyte–macrophage colony-stimulating factor expression in induced sputum and bronchial mucosa in asthma and COPD
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2712140/

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) был вовлечен в качестве важного посредника в патогенезе астмы и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Однако следует уточнить выражение GM-CSF и его рецептора в образцах дыхательных путей при астме и ХОБЛ по степени тяжести заболевания.

Смазка GM-CSF была измерена у 18 контрольных субъектов, 45 субъектов с астмой и 47 пациентов с ХОБЛ. Перечисление клеток GM-CSF + в слизистой оболочке бронхов и пучок гладких мышц дыхательных путей проводили у 29 контрольных субъектов, 36 субъектов с астмой и 10 пациентов с ХОБЛ.

Доля испытуемых с измеримым GM-CSF в мокроте была повышена у пациентов с умеренной (7/14) и тяжелой (11/18) астмой, а у пациентов с ХОБЛ ЗОЛОТО (Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни легких) II этап ( 7/16), III (8/17) и IV (7/14) по сравнению с контролем (1/18) и с легкой астмой (0/13); р = 0,001. Концентрация GM-CSF мокроты коррелировала с эозинофилией мокроты у пациентов с умеренной и тяжелой астмой (rs = 0,41, p = 0,018). Медианный (межквартильный диапазон) GM-CSF + и GM-CSFR + клетки / мм2 подслизистой оболочки был увеличен при тяжелой астме (1,4 (3,0) и 2,1 (8,4)) по сравнению с пациентами с легкой и умеренной астмой (0 (2,5) и 1,1 ( 5)) и здоровых контролей (0 (0,5) и 0 (1,6)), (р = 0,004 и р = 0,02 соответственно).

Полученные данные подтверждают потенциальную роль GM-CSF в астме и ХОБЛ и предполагают, что чрезмерная экспрессия GM-CSF в мокроте и слизистой оболочке бронхов является особой особенностью тяжелой астмы.

Болезни астмы дыхательных путей и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) являются общими и вызывают значительную заболеваемость и смертность во всем мире. Астма влияет на 10% детей и 5% взрослых, и ее распространенность продолжает расти.1 Тяжелая астма составляет около 10% астмы, но особенно важна, поскольку она приводит к изнурительным хроническим симптомам, несмотря на оптимальное стандартное лечение астмы, и способствует половина расходов на здравоохранение, связанных с астмой.1-3 ХОБЛ является одной из основных проблем общественного здравоохранения и будет считаться третьей причиной смерти в 2030 году.4 Оба условия характеризуются обструкцией воздушного потока воспалением дыхательных путей и ремоделированием. Хотя воспалительные профили астмы и ХОБЛ были описаны как перекрывающиеся, 5 астма чаще ассоциируется с Th2-опосредованным эозинофильным воспалением6, тогда как при ХОБЛ нейтрофильное воспаление более преобладает.5 Несколько цитокинов и хемокинов были вовлечены в вождение воспалительной реакции дыхательных путей в астмы и ХОБЛ.

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) является основным регулятором воспалительных клеток миелоидной линии и участвует в астме и COPD.7. Он выделяется рядом структурных и воспалительных клеток, включая эпителий дыхательных путей, дыхательные пути гладкие мышцы (ASM), фибробласты, Т-лимфоциты, тучные клетки, эозинофилы и макрофаги. Недавно было показано, что GM-CSF сигнализируют через тройной рецепторный комплекс (GM-CSFR), состоящий из гексамера 2: 2: 2, состоящего из двух цепочек βc, двух цепей GMRα и двух молекул GM-CSF.8 GM-CSF представляет собой плейотрофический и провоспалительный цитокин, который стимулирует миелопоэз, способствует выживанию и активации лейкоцитов и регулирует иммунитет слизистой оболочки и воспаление частично посредством модуляции Toll-подобного рецептора-49 и нейтрофильной функции.10 Его значение в болезни дыхательных путей подтверждается данными из моделей мыши COPD7 и астмы 11, при которой введение анти-GM-CSF-антител ослабляет нейтрофильный и эозинофильный воспалительный ответ, соответственно. Важно отметить, что при человеческих заболеваниях экспрессия GM-CSF увеличивается в мокроте, бронхоальвеолярном лаваже (BAL) и бронхиальной биопсии при астме.12-17 Напротив, при ХОБЛ отсутствует непосредственное свидетельство увеличения экспрессии GM-CSF в выделениях дыхательных путей или биопсийной ткани. Тем не менее, в культуре секреция GM-CSF клетками мокроты ex vivo увеличивается в ХОБЛ.18 Аналогичным образом, выражается ли увеличение экспрессии GM-CSFR в заболеваниях дыхательных путей, является спорным, причем одно исследование предполагает, что GM-CSFR увеличивается в неатопических, но не атопической астмы.19 Следовательно, необходимо дополнительно определить экспрессию GM-CSF и GM-CSFR в болезни дыхательных путей.

Мы предположили, что экспрессия GM-CSF и GM-CSFR увеличивается при астме и ХОБЛ и связана с серьезностью заболевания. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы измерили концентрацию GM-CSF мокроты и перечислили в слизистой оболочке бронхов количество клеток GM-CSF + и GM-CSFR + при астме и ХОБЛ.

Субъекты были набраны из больничного персонала, общей респираторной и клиники «Сложная астма» в больнице Гленфилда, Лестер, местной первичной медико-санитарной помощи и местной рекламы. Астма определялась в соответствии с действующими в настоящее время руководящими принципами Глобальной инициативы по борьбе с астмой (GINA). Субъекты с астмой имели типичные симптомы и наличие одного или нескольких из следующих объективных критериев: значительная обратимость бронходилататора с объемом принудительного эпиратора за 1 с (FEV1)> 200 мл, концентрация провокаций метахолина, вызывающая 20% -ное падение FEV1 (PC20) <8 мг / мл или амплитуда амплитуды пикового потока, в среднем за 2 недели> 20%. Тяжесть астмы была классифицирована с использованием этапов лечения GINA.20 ХОБЛ был диагностирован и степень тяжести классифицировалась с использованием критериев Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких (GOLD ).21 Субъекты с ХОБЛ, которые продемонстрировали частичную обратимость бронходилататора, не были исключены. Субъекты были набраны в виде трех независимых групп поперечного сечения, для оценки концентрации мокроты GM-CSF при астме и ХОБЛ (группа 1); и GM-CSF и GM-CSFR в проксимальных дыхательных путях при астме (группа 2) и ХОБЛ (группа 3). Субъекты не подвергались обострениям не менее 6 недель. Здоровые средства контроля имели нормальную спирометрию, а некоторые курильщики с> 10-летней историей были включены, чтобы обеспечить сравнение между здоровыми курильщиками и предметами ХОБЛ. Все испытуемые дали письменное информированное согласие, с одобрением исследования комитета по этике Лестершира.

Для всех субъектов были зарегистрированы демографические данные и спирометрия. Субъекты с астмой и здоровым контролем в группах 1 и 2 также прошли тест на ингаляцию метахолином с использованием метода приливного дыхания22 и тестов на кожные заболевания аллергенов для дерматофагоидов птеронисина, пыльцы собак, кошек и трав. Интубация мокроты с использованием инкрементных концентраций небулайзированного гипертонического солевого раствора 3, 4 и 5% каждый в течение 5 мин также выполнялась у всех субъектов в группах 1 и 2,23

В группе 2 пациенты подвергались бронхоскопии, проводимой в соответствии с рекомендациями Британского торакального общества, 24 и биопсии были взяты из правой средней и нижней доли кили. В группе 3 проксимальные образцы дыхательных путей были собраны из хирургических образцов. Все образцы бронхиальной слизистой оболочки фиксировали в ацетоне и внедряли в гликометакрилат, как описано ранее.25

Мочугу отбирали, диспергировали с использованием муколитического дитиотреитола (ДТТ) и обрабатывали для генерирования количества клеток с мокротой, и супернатанты, свободные от клеток, хранили при -80 ° С для последующего анализа, как описано ранее.26

Смазка GM-CSF измеряли с помощью ELISA (Caltag-Medsystems, Buckinghamshire, UK). Нижний предел обнаружения составлял 10 мкг / г мокроты. Анализ GM-CSF был валидирован в соответствии с рекомендациями Европейского респираторного общества для оценки влияния ДТТ и восстановления экзогенного пика с рекомбинантным цитокином.27 Регенерация GM-CSF не влияла на ДТТ, а восстановление экзогенного шипованного GM-CSF было 103% (15%) (n = 4).

Разделы 2 мкм разрезали и окрашивали с использованием моноклональных антител против GM-CSF (клон: BVD2-21C11, Cambridge BioScience, Cambridge, UK), GM-CSFR (клон: 2B7, моноклональное антитело, повышенное до внеклеточного домена GM-CSFR , подарок от доктора Слемана, MedImmune, Grant Park, Кембридж, Великобритания) или подходящие средства контроля изотипа (крысиный иммуноглобулин G2a (IgG2a) (R & D Systems Europe, Abingdon, UK) и мышиный IgG1-клон DAK-Go1 (Dako UK, Cambridge, UK ), соответственно). Число положительных зародышевых клеток было перечислили на мм2 подкожной суставной оболочки бронхов или пучок АСМ слепым наблюдателем, как описано ранее28. 29

Статистический анализ был выполнен с использованием PRISM версии 4. Параметрические данные были выражены как среднее (SEM), данные, которые имели нормальное распределение логов, были преобразованы в журнал и описаны как среднее геометрическое (95% ДИ), а непараметрические данные были описаны как медианные (межквартильные диапазон (IQR)). Односторонний дисперсионный анализ (Kruskal-Wallis для непараметрических данных) использовался для сопоставлений между группами, а также для тестов Tukey и Dunn для межгрупповых сравнений. Для сравнения категориальных данных использовались тесты χ2. Корреляции были оценены коэффициентами ранговой корреляции Спирмена.

Клинические и мокротные характеристики для субъектов в группе 1 показаны в таблице 1. Доля пациентов с измеримым GM-CSF в мокроте была повышена у пациентов с умеренной (7/14) и тяжелой (11/18) астмой, а в тех с COPD GOLD stage II (7/16), III (8/17) и IV (7/14) по сравнению с контролем (1/18) и с легкой астмой (0/13) (p = 0,001). Концентрация GM-CSF мокроты была увеличена у пациентов с ХОБЛ по степени тяжести по сравнению с контрольной группой (p = 0,02 Kruskal-Wallis, p <0,05 для ХОБЛ всех степеней по сравнению с контролем, рис. 1). Аналогичным образом концентрация мокроты GM-CSF была увеличена при тяжелой астме по сравнению с легкой астмой и контрольной группой, а также при умеренной астме по сравнению с легкой болезнью (p <0,001 Kruskal-Wallis, p <0,05 для сравнения между группами, рис. 1). Концентрация GM-CSF мокроты была увеличена у пациентов с умеренной и тяжелой астмой, комбинированной по сравнению с комбинированной ХОБЛ GOLD II-IV (p = 0,004). Концентрация GM-CSF мокроты коррелировала с эозинофилией мокроты у пациентов с болезнью как целая группа (rs = 0,28, p = 0,007), у всех пациентов с астмой (rs = 0,3, p = 0,04) и умеренным и тяжелым заболеванием (rs = 0,41; p = 0,018), но не ХОБЛ. У пациентов с астмой или ХОБЛ не было ассоциации с концентрацией мокроты GM-CSF и прогнозируемым процентом FEV1 (r = -0,26, p = 0,09, r = -0,07, p = 0,7) или отношением FEV1 / FVC (принудительная жизненная емкость) (r = 0,06, p = 0,7, r = 0,1, p = 0,5) соответственно.

Концентрация колониестимулирующего фактора мокроты гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF). Концентрация мокроты GM-CSF в контрольной группе, субъекты с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) (Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни легких (ЗОЛОТО) II-IV), легкая астма (Глобальная инициатива по астме (GINA) 1), умеренная астма (GINA 2-4) или тяжелой астмой (GINA 5). Сравнение между группами по критерию Крускала-Уоллиса p <0,05; p для теста Dunn post hoc для сравнения между группами, как показано.

* Среднее значение (SE). † Геометрическое среднее (95% ДИ).

BD, бронходилататор; FEV1, принудительная выдоха за 1 с; FVC, принудительная жизненная емкость; GINA, Глобальная инициатива по борьбе с астмой; GOLD, Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни легких; ПК, концентрация провокаций; TCC, общее количество клеток.

Примеры клеток GM-CSF и GM-CSFR + в бронхиальной подслизистой оболочке при астме показаны на фиг. 2. Клинические характеристики группы 2 приведены в таблице 2. Были увеличены медианы (IQR) GM-CSF / мм2 подслизистой ткани при тяжелой астме (1,4 (3,0)) по сравнению с пациентами с легкой и умеренной астмой (0 (2,5)) и здоровым контролем (0 (0,5)), (p = 0,004, Kruskal-Wallis, межгрупповые сравнения приведены на рис. 3A). Количество синусоидальных астмы (2,1 (8,4) и 2,4 (5,5)) было увеличено по сравнению с здоровым контролем (0 (1,6) и 0 (0,8)), но не у пациентов с легкой для умеренной астмы (1,1 (5) и 1,2 (2,2)) (p = 0,02 и p = 0,049 соответственно, Kruskal-Wallis, p <0,05 тяжелой астмы против контроля, фиг. 3B, C). Количество клеток GM-CSF + в пакете ASM был очень низким у пациентов с астмой и здоровым контролем.

Примеры гранулоцитарно-макрофаговых колониестимулирующих факторов-положительных (GM-CSF +) и GM-CSF-рецептор-положительных (GM-CSFR +) клеток в подслизистой оболочке и пучке гладких мышц дыхательных путей при астме. Репрезентативные микрофотографии участков бронхиальной биопсии у субъектов с тяжелой астмой, иллюстрирующих контроль изотипа. (A) Крысиный иммуноглобулин 2a (IgG2a), (B) мышиный IgG1, (C) GM-CSF + клетки, присутствующие в подкожной клетке бронхов и (D) GM-CSFR + в подслизистой оболочке (× 400). Клетки GM-CSF / R + подсвечиваются стрелками.

Число гранулоцитарно-макрофаговых колониестимулирующих фактор-положительных (GM-CSF +) и GM-CSF рецептор-положительных (GM-CSFR +) клеток в подслизистой оболочке при астме. Число клеток (A) GM-CSF + и (B) GM-CSFR + в подкожностях бронхов и (C) GM-CSFR + в пучке гладких мышц дыхательных путей при здоровом контроле, у пациентов с легкой и умеренной астмой (Глобальная инициатива по астме (GINA) 1-3) и лиц с тяжелой астмой (GINA 4-5). Сравнение между группами по критерию Крускала-Уоллиса было p <0,05; p для теста Dunn post hoc для сравнения между группами, как показано.

* Среднее значение (SE). † Геометрическое среднее (95% ДИ). ‡ Медиана (межквартильный диапазон).

ASM, гладкие мышцы дыхательных путей; BD, бронходилататор; FEV1, принудительная выдоха за 1 с; FVC, принудительная жизненная емкость; GINA, глобальная инициатива для астмы; GM-CSF, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; GM-CSFR, гранулоцитарно-макрофагальный рецептор колониестимулирующего фактора; ПК, концентрация провокаций; TCC, общее количество клеток.

Не было различий в количестве клеток GM-CSF + или GM-CSFR + в подслизистом или пучке ASM в ткани резекции легких у пациентов с ХОБЛ и контроле с и без значимой истории курения (таблица 3).

* Среднее значение (SE). † Медиана (межквартильный диапазон).

ASM, гладкие мышцы дыхательных путей; BD, бронходилататор; ХОБЛ, хроническая обструктивная болезнь легких; FEV1, принудительная выдоха за 1 с; FVC, принудительная жизненная емкость; GM-CSF, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; GM-CSFR, гранулоцитарно-макрофагальный рецептор колониестимулирующего фактора; ПК, концентрация провокаций.

Мы сообщаем здесь в первый раз, что концентрация мокроты GM-CSF была увеличена при ХОБЛ, независимо от тяжести заболевания, и подтвердили, что при астме концентрация GM-CSF мокроты связана с более тяжелым заболеванием. При астме наши результаты мокроты подтверждались усилением экспрессии GM-CSF и GM-CSFR при бронхиальной биопсии при тяжелой болезни. Поэтому наше исследование подтверждает нашу гипотезу о том, что экспрессия GM-CSF и GM-CSFR увеличивается при астме и ХОБЛ, а при астме связана с серьезностью заболевания.

Несколько строк доказательств подтверждают роль ГМ-КСФ в ХОБЛ. GM-CSF индуцируется наличием возбудителей дыхательных путей 30 31 и, как известно, является важным регулятором активации и выживания ключевых эффекторных клеток при ХОБЛ, а именно нейтрофилом и макрофагом.32 33 Критически нейтрализация GM-CSF на животных моделях ослабляет воспаление дыхательных путей в ответ на курение сигарет.7 Однако на сегодняшний день было малочисленности прямых доказательств увеличения экспрессии GM-CSF в выделениях дыхательных путей. Действительно, концентрация мокроты GM-CSF не увеличивалась у субъектов при обострениях по сравнению с их стабильным состоянием при восстановлении 34, хотя в отличие от высвобождения GM-CSF клетками мокроты в культуре было увеличено.18 In vivo и in vitro GM-CSF быстро интернализовали после связывания с рецептором и, следовательно, вероятно, что измерение мокроты GM-CSF недооценивается с помощью ELISA.7 35 Важно отметить, что концентрация свободного GM-CSF находится под жестким контролем, с измеримыми аутоантителами GM-CSF при здоровом контроле, а также в с заболеваниями.36 Несмотря на это, мы здесь подтвердили измерение GM-CSF в мокроте и обнаружили, что он был увеличен у пациентов с ХОБЛ по всем уровням заболеваемости по сравнению с курением и контролем за курением, хотя отношения не были связаны между концентрацией мокроты GM-CSF и серьезностью заболевания. В образцах резекции мы не смогли подтвердить, что экспрессия GM-CSF или его рецептора была увеличена. Тем не менее, мы изучали только предметы с ХОБЛ с более мягким заболеванием, а у субъектов контроля часто лежал рак легкого, который мог замаскировать различия между ХОБЛ и контрольными состояниями. Поэтому роль GM-CSF в ХОБЛ необходимо дополнительно определить, и в будущих исследованиях необходимо включить анализ бронхиальной ткани при умеренной и тяжелой ХОБЛ.

При астме существует множество данных, поддерживающих роль GM-CSF. В частности, GM-CSF играет ключевую роль в созревании и выживаемости эозинофилов, 37 — ключевая эффекторная клетка при астме. В моделях животных GM-CSF нейтрализация ослабляет воспаление дыхательных путей, а мышечные мыши GM-CSF38 не развивают бронхиальную эозинофилию в ответ на аллерген. В отличие от ХОБЛ при астме имеется несколько сообщений об увеличении экспрессии GM-CSF в выделениях и тканях дыхательных путей.12-17 В частности, повышенная экспрессия GM-CSF мокроты связана с более тяжелым заболеванием12. 13 Мы подтвердили эти более ранние сообщения и обнаружили, что концентрация мокроты GM-CSF была увеличена при умеренной и тяжелой астме, но не при легкой болезни. Кроме того, интенсивность экспрессии GM-CSF мокроты была связана с эозинофилией мокроты. Мы сообщаем здесь впервые, что экспрессия GM-CSF и GM-CSFR также увеличивалась в бронхиальной подслизистой оболочке при более тяжелой астме. Поэтому при тяжелой астме наблюдается генерализованная регуляция в оси GM-CSF / GM-CSFR, что указывает на то, что этот медиатор может играть важную роль при тяжелой астме.

Наш дизайн исследования позволил прямое сравнение концентрации GM-CSF мокроты при астме и ХОБЛ, но не экспрессии в ткани, поскольку образцы были получены с использованием разных методов. Сравнение концентраций GM-CSF мокроты было подорвано относительной нечувствительностью нашего анализа с большим количеством субъектов, концентрация которых была ниже уровня обнаружения нашего анализа. Вероятно, это отразится на быстрой интернализации GM-CSF. Несмотря на это ограничение, мы обнаружили, что мокрота GM-CSF была увеличена как при ХОБЛ, так и при умеренной и тяжелой астме, и, что важно, она была выше при умеренной и тяжелой астме, чем при ХОБЛ. Поэтому, играет ли GM-CSF более важную роль в тяжелой астме, чем при ХОБЛ, требует дальнейшего изучения.

Наше исследование имеет ряд возможных критических замечаний. Это обзорное исследование поперечного сечения. Мы не смогли продемонстрировать связь между экспрессией GM-CSF и функцией легких. Экспрессия GM-CSF связана с продольными клиническими результатами, такими как прогрессирование заболевания, снижение функции легких и обострения, требует дальнейшего изучения. Точно так же мы не можем определить, отражают ли различия между легкой и тяжелой астмой симптомы тяжести заболевания или являются следствием различий в лечении. Таким образом, эффекты кортикостероидов на GM-CSF должны быть полностью выяснены, хотя предыдущая работа предполагает, что экспрессия GM-CSF в ткани ослабляется кортикостероидами.39 Быстрая текучесть GM-CSF in vivo ограничивает интерпретацию экспрессии белка ELISA и иммуногистохимия. Мы не определили клеточный источник GM-CSF или не определили, связано ли увеличение экспрессии GM-CSF с увеличением общего количества проникающих клеток в бронхиальной подслизистой оболочке. Кроме того, экспрессия белка в ткани часто отражает зернистые запасы и может недооценивать экспрессию GM-CSF в клетках, которые высвобождают, а не хранят GM-CSF, такие как Т-клетки. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для подтверждения наших результатов и определения относительной экспрессии GM-CSF в бронхиальной ткани различными типами клеток.

В заключение мы обнаружили, что концентрация мокроты GM-CSF была увеличена при ХОБЛ, независимо от тяжести заболевания и при умеренной и тяжелой астме. Повышенная бронхиальная подслизистая экспрессия как GM-CSF, так и его рецептора была особой особенностью тяжелой астмы. Таким образом, наши результаты подтверждают потенциальную роль ГМ-CSF в астме и, возможно, ХОБЛ. Исследования эффективности терапевтических стратегий, нацеленных на GM-CSF, с нетерпением ждут и будут дополнительно определять функциональную важность GM-CSF при болезни дыхательных путей.

Г-жа Сью Макенна и миссис Беверли Харгадон за клиническую характеристику предметов и г-на Уильяма Монтейро и г-жу Натали Нил за техническую поддержку.

Конкурирующие интересы: Объявлено. CB получил финансирование исследований от AstraZeneca, MedImmune и GlaxoSmithKline, а также консультационные услуги от MedImmune и GlaxoSmithKline. MS и ESC являются сотрудниками MedImmune.

Финансирование: Астма Великобритании, MedImmune, DOH Clinical Scientist award (CB) и Wellcome Senior Clinical Fellowship (CB).

Утверждение этики: исследование было одобрено комитетом по этике Лестершира.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *